UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU DEPARTAMENTO DE FÍSICA E BIOFÍSICA
“ESTUDOS ESTRUTURAIS DA TOXINA BTHTX-II DO VENENO DE
BOTHROPS JARARACUSSU.”
Henrique Barcellos Campanelli
Orientador: Professor Dr. Marcos Roberto de Mattos Fontes
Co-Orientador: Rafael Junqueira Borges
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU DEPARTAMENTO DE FÍSICA E BIOFÍSICA
“ESTUDOS ESTRUTURAIS DA TOXINA BTHTX-II DO VENENO DE
BOTHROPS JARARACUSSU.”
Henrique Barcellos Campanelli
Orientador: Professor Dr. Marcos Roberto de Mattos Fontes
Co-Orientador: Rafael Junqueira Borges
Botucatu-SP
2014
Monografia referente à
Agradecimentos
À m inha mãe , Ma ria Ân ge la , po r todo apo io du ran te o pe río do de gradua ção e todo amo r e ca rinho.
Ao meu irm ão, Rodo lpho , po r semp re esta r à d ispo sição pa ra con ve rsa s e in centivo pe lo estudo e min ha formação.
À Priscila po r e sta r com igo no s momento s mais felize s e dif íce is dessa caminh ada.
Ao meu co -o rien tado r, Rafael, po r toda a juda científica e e scla recimentos sob re qua lque r dú vida du ran te a in icia ção científ ica. Agrade ço também pe la a juda me smo do e xte rio r pa ra conclu são do traba lho e por fim pe la am iza de criad a du rante todo esse tempo de ap rend izado.
À meu o rientado r, Ma rco s, pe la opo rtun ida de de ap rende r, pelo tempo d isp osto pa ra conve rsa s escla recedo ra s e in centivo pe la vida a cadêm ica.
À todo s do meu labo ra tório , qu e me a guen ta ram du ran te 1 ano e meio, Fáb io, Ca rlos, And réa , Natá lia , Gu ilhe rme, L ino e Th ia go e o s e ncontro s cien tíficos que me au xilia ram durante todo meu p ro jeto.
À todo s compa nhe iros da minha jornada unive rsitária prin cipalme nte, Gu sta vo, Luiz, Johan , Mathe us, Gio vann i, Ra van e Bruno .
À tod os que de a lguma mane ira me in cen tiva ram e me a juda ram a conclu ir ma is uma fase .
À Pró -reito ria de Pe squ isa pe la bolsa co nced ida du ran te grand e pa rte da in icia ção.
Resumo
O estudo do veneno de se rpente s do gê ne ro B o t h r o p s p ossui um
impacto sign ificativo em todo con te xto d a Amé rica La tina . Especificamente no Bra sil, e xiste uma grande d ive rsida de de se rpente s desse gêne ro que é responsá ve l pe la maior pa rte dos acide ntes of íd ico s cu jo ún ico tratamen to d isp on ível é a aplica ção de soro anti of íd ico , po rém o me smo n ão neutra liza o dano m iotó xico já cau sado . Esse veneno é constitu ído po r uma sé rie de compostos, prin cipa lmente pro te ína s, sendo a s fosfolipa ses A2 (PLA2s) a s
ma is abundan tes e uma das respo nsá ve is pe la ne crose muscu la r.
As fosfolipa ses A2 são p e quena s e e stá veis prote ín as (massa mole cu la r
ap ro ximad a de 14 kDa ) que p romo vem a h id ró lise da ligação é ste r s n-2 de
fosfolip íde os na inte rface b ilip íd ica d e mice las, ve sícula s e membrana s, liberando lisofosfolip íde os e ácido s gra xo s atravé s de um mecan ismo depe ndente de cá lcio. As PLA2s po ssuem uma vasta a ção fa rmacoló gica e
nem todas são re lacion adas a sua a tividade cata lítica de man eira que a compre ensão do s e xatos m ecan ismos não fo i tota lmente e lucidad a. Essas to xinas pod em ser classificada s como PLA2s e PLA2s homó lo ga s, na qua l a
forma homólo ga não possu i a tividade ca talítica m as ap resenta capacidade m iotó xica acentuada e sua at ividade e stá re la cionad a com se u e stado o ligomé rico em d íme ro.
A p rote ína BthT X-II é a se gunda p rote ína ma is ab undan te do ve neno de
B o t h r o p s j a r a r a c u s s u e é uma PLA2s com ativid ade catalítica mu ito redu zida
ou ine xisten te e a lta atividade m iotó xica. Recentemente, BthT X -II foi apon tada como uma PL A2s semelhan te às PLA2s homó lo ga s, já que a re gião
impo rtante para a catá lise é de so rdena da e ap resenta e strutu ra dimérica. Po rtanto, o ob je tivo d esta Mono grafia é o estudo oligomé rico da BthTX -II em solu ção a tra vé s da s té cn ica s de Flu orescência e DLS pa ra au xilia r no s e studo s de compo sto s que venham a complemen ta r o soro antiof íd ico e redu zir o efeito mione crótico comum do s a cidente s bo tró pic os.
Lista de Tabelas
Tabela 1. Espalhamento de Luz Dinâmico(DLS) da BthTX-II na presença de HEPES ... 28
Tabela 2. Espalhamento de Luz Dinâmico(DLS) da BthTX-II na presença de Citrato de Sódio ... 29
Lista de Figuras
Figura 1: Processo de Cromatografia por Exclusão Molecular. (A) Desenho esquemático de um grânulo com uma ampliação de microscopia eletrônica. (B) Esquema de moléculas difundindo pelos poros do grânulo. (GE HealthCare Gel Filtração, Princípios e Metodos)... 16
Figura 2:SDS-PAGE band profile of the Thermo Scientific PageRuler Plus Prestained Protein Ladder. Imagens de 4-20% de Tris-Glicina, gel SDS-PAGE... 19
Figura 3: Cromatograma referente a purificação de 12mg veneno Bothrops jararacussu em
tampão Formato de Amônio ( pH 3,5 em concentração 50mM.)... 23
Figura 4: Gel de Eletroforese SDS-PAGE das frações obtidas na purificação da
cromatografia por Exclusão Molecular da Bthtx-II em Formato de Amônio pH 3,5 e concentração de 50 mM... 24
Figura 5: Cromatograma referente a purificação de 12 mg de veneno de Bothrops jararacussu em tampão Bicarbonato de Amônio (pH 8,1 e concentração 50
mM)... 25
Figura 6: Gel de Eletroforese SDS-PAGE das frações obtidas na purificação da cromatografia por Exclusão Molecular da Bthtx-II em Bicarbonato de Amônio pH 8,1 e
concentração de 50 mM... 25
Figura 7: À esquerda cromatograma referente ao veneno em Bicarbonato de Amônio e à direita, veneno em Formato de Amônio... 26
Figura 8: Cromatograma de Fase Reversa (RPC) referente ao pico de PLA2s das
cromatografias por exclusão molecular em concentração de 10mg/mL... 27
Figura 10: Gráfico da intensidade da emissão da luz do Triptofano estimulado da Bthtx-II x comprimento de onda da luz em nanômetros, das amostras em Citrato de Sódio pH 5,2 (verde) e HEPES pH 7,5 (vermelho)... 31
Sumário
1-Introdução... 9
2-Objetivos... 13
Objetivo geral... 14
Objetivo específico... 14
3-Metodologia
... 15Veneno liofilizado... 16
Cromatografia por exclusão molecular... 16
Eletroforese... 17
Cromatografia por fase reversa... 19
Espalhamento dinâmico de luz (DLS)... 20
Espectroscopia de fluorescência ... 21
4-Resultados
... 22Purificação... 23
Estudos oligoméricos da BthTX-II... 27
5-Discussão
... 326-Conclusão... 36
9
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Serpentes são répteis tetrápodos que perderam os apêndices locomotores e a cintura escapular, são amniotas (que nascem de ovos amnióticos) e estão incluídas na ordem Squamata, junto com os lagartos. A primeira serpente a possuir um aparato inoculador de veneno foi da família Colubroidea, o que quer dizer que uma serpente pode ser venenosa e não peçonhenta (Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos-Botucatu/SP 2014. Centro Virtual de Toxicologia).
As serpentes venenosas e peçonhentas causam os chamados acidentes ofídicos ou ofidismo, que é o envenenamento decorrente da inoculação de toxinas através do aparelho inoculador de serpentes. Um recente estudo estima que o número de acidentes ofídicos no mundo em um ano é de, pelo menos, 420 mil envenenamentos – dos quais, 20 mil evoluem em morte (Kasturiratne et al., 2008).No Brasil, o estudo de
serpentes peçonhentas de maior interesse em Saúde Pública é de três gêneros pertencentes à família Viperidae: Bothrops (Bothrops, Bothropoides, Bothriopsis, Botrocophias e Rhinocerophis), Crotalus e
Lachesis. As serpentes do gênero Bothrops são estudadas em particular, pois estão distribuídas em mais de
60 espécies em todo território brasileiro, em diversos ambientes (i.e., beira de rios e igarapés, áreas litorâneas e úmidas, agrícolas e periurbanas, cerrados e áreas abertas) e são responsáveis por 80% dos acidentes ofídicos no país (Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos-Botucatu/SP 2014. Centro Virtual de Toxicologia).
As serpentes do gênero Bothrops causam acidentes ofídicos que têm como principais sintomas
inchaço e dor na região da picada, às vezes com manchas arroxeadas (edemas e equimose) e sangramento pelos pontos da picada, gengiva, pele e urina. Pode haver complicações como grave hemorragia em regiões vitais, infecção e necrose na região da picada e insuficiência renal (Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos-Botucatu/SP 2014. Centro Virtual de Toxicologia).
O tratamento mais utilizado contra o envenenamento por serpentes é a administração intravenosa de um soro antiofídico que, apesar de ter diminuído a mortalidade pelo envenenamento, não atua tão bem contra mionecrose. A maior incidência do acidente ofídico ocorre na área rural com trabalhadores adultos jovens do sexo masculino (Brasil., 2010; Gutiérrez, Theakston e Warrell, 2006).
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Os venenos de serpentes contém um grande número de proteínas com atividade tóxica. Dentre as enzimas do veneno de serpentes do gênero Bothrops, as PLA2s são seus principais constituintes e uma das
principais responsáveis pela mionecrose local no acidente ofídico em humanos, que não é eficientemente neutralizada pelo soro antiofídico. Essas proteínas são pequenas enzimas, com massa molecular de aproximadamente 14 kDa, estáveis e cálcio dependente, que promovem a hidrólise da ligação éster sn-2 de
fosfolipídios e ácido graxo (Schaloske e Dennis, 2006). Elas fazem parte de uma família de enzimas separadas em 15 grupos e subgrupos, que inclui as denominadas PLA2 secretadas, encontradas em venenos
de serpentes da família Viperidae. As fosfolipases possuem duas regiões que se conservam que são de extrema importância para a atividade catalítica das PLA2s: rede catalítica que compreende os resíduos
His48, Asp49,Tyr52 e Tyr99 e um loop de ligação de cálcio que compreende os resíduos Tyr28, Gly30 e Gly32 (Ward, De Azevedo Jr. et al., 1998).
Os ácidos graxos liberados na hidrólise das fosfolipases podem funcionar como segundo mensageiros, estocagem de energia e ocasionar a liberação de agentes que são potentes mediadores de inflamação (Schaloske e Dennis, 2006; Berk e Stump, 1999; Gijon e Leslie, 1999; Austin e Funk, 1999; Bingham e Austen, 1999). Além do papel fundamental no metabolismo de lipídios, essa enzima está relacionada na liberação de ácido araquidônico, que é um precursor de lipídios bioativos que podem participar de uma variedade de ações como regulação do sono e percepção da dor, o que leva a um alvo de estudos de grande interesse na medicina.
As PLA2s, além da atividade catalítica, apresentam neurotoxicidade, miotoxicidade,
cardiotoxicidade, atividade hipotensiva, capacidade hemolítica e edematogênica, ação anticoagulante e efeitos na agregação plaquetária (Kini e Evans, 1989; Rosenberg, 1990; Gutiérrez e Lomonte, 1997; Andriao-Escarso, Soares et al., 2000; Braud, Bon et al., 2000; Valentin e Lambeau, 2000; Andriao-Escarso,
Soares et al., 2002; Soares, Sestito et al., 2004; Kini, 2005).
Em 1984, estudos identificaram um subgrupo referente às fosfolipases A2 do gênero Bothrops com
base em uma mutação do resíduo 49 da sequência de aminoácidos. Essa mutação é a substituição natural de um aspartato (Asp) por uma lisina (Lys), sendo assim determinadas Asp49-PLA2s, fosfolipase clássica, e
Lys49-PLA2s ou fosfolipase homóloga. As toxinas podem ser diferenciadas pela atividade biológica: PLA2s
catalíticas e PLA2s homólogas não catalíticas porém miotóxicas. (Dos Santos et al 2009).
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da catálise. Nos últimos anos, varias pesquisas em estrutura de PLAss clássicas e homólogas foram
realizadas; contudo, foram insuficientes para elucidar as principais diferenças farmacológicas entre elas.
A proteína alvo de estudos durante essa iniciação científica, a Bthtx-II, é classificada como uma fosfolipase clássica (Asp49-PLA2s) miotóxica. Essa proteína foi isolada a partir do veneno da serpente
Bothrops juraracussu, que possui sua estrutura elucidada e assim composta por 122 aminoácidos e peso
molecular de aproximadamente 14 kDa (Correa et al., 2008). Ainda que a Bthtx-II seja uma Asp49-PLA2s,
sua atividade catalítica foi apontada como baixa ou nula (Dos Santos et al., 2011) e sua estrutura quaternária
mostra-se análoga à estrutura das fosfolipases homólogas (Correa, Marchi-Salvador et al., 2008). Assim, os
estudos de conformação oligomérica são de extrema importância para a compreensão do mecanismo de ação das PLAss e podem auxiliar no desenvolvimento de inibidores que complementem o soro antiofídico e
13
14 2.1 Objetivo geral
Como objetivo geral do trabalho, temos a análise de conformação oligomérica da proteína BthTX-II para entender seus mecanismos de ação e, para um futuro próximo, estudar ligantes que ajudem na criação de antídotos que estabilizem e neutralizem com maior eficácia a ação do veneno de serpentes do gênero
Bothrops.
2.2 Objetivos específicos
Através de um novo protocolo de purificação desenvolvida no laboratório de biologia molecular, melhorar a separação da proteína BthTX-II.
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16 3.1 Veneno Liofilizado
A liofilização é o processo de desidratação de uma amostra por sublimação sem que a água passe pelo estado líquido. Isso ocorre com as amostras congeladas e introduzidas em um equipamento de vácuo onde a temperatura aumenta gradativamente, o que permite que a fase sólida passe para a fase gasosa sem que passe pela fase intermediária, pois quanto menor a pressão menor o ponto de vaporização da amostra. As soluções desidratadas por esse processo são facilmente reidratadas utilizando o tampão escolhido, pois o processo faz com que o pó resultante possua poros microscópicos criados pelos cristais de gelo sublimados.
O veneno utilizado no experimento foi da espécie Bothrops jararacussu, fornecido pelo Centro de
Extração de Toxinas Animais (CETA), lote JÇU 07/13 da data 30/09/2013; foram fornecidos 3.000 mg do veneno liofilizado para os estudos.
3.2 Cromatografia por Exclusão Molecular
A cromatografia por exclusão molecular separa moléculas com relação ao seu tamanho enquanto passam por uma matriz sólida formada por partículas esféricas, porosas, inertes e estáveis. Portanto, as amostras, que devem estar em equilíbrio com a fase móvel, não interagem com a matriz, o que significa que essa técnica possui uma grande vantagem já que podem ocorrer variações nas condições das amostras.
Figura 1: Processo de Cromatografia por Exclusão Molecular. (A) Desenho esquemático de um grânulo com uma ampliação de microscopia eletrônica. (B) Esquema de moléculas difundindo pelos poros do grânulo. (Extraído de GE HealthCare
Gel Filtração, Princípios e Métodos).
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O processo de separação da BthTX-II por exclusão molecular foi realizado em um cromatógrafo AKTA purifier da Amsterdam Pharmacia Biotech, utilizando uma coluna Superdex 75 10/300 GL com volume de aproximadamente 24 mL, sua resina é formada por um polímero de agarose e dextran que possui uma faixa de separação ótimo de 3 kDa à 70 kDa ideal para a proteína estudada (14 kDa em seu estado nativo). A amostra para a realização do experimento continha 12 mg de veneno da serpente Bothrops
jararacussu bruto e liofilizado diluído em 250 μL de Bicarbonato de Amônio na concentração de 50mM e
pH 8,1, mesma solução tampão utilizada para a corrida na cromatografia. Antes de injetar a amostra no cromatógrafo, as mesmas passaram por um centrifugação durante 10 minutos a 10000 rpm e a fração utilizada não continha precipitações. Um superloop de 200 uL foi utilizado para o experimento e injetado
esse volume da amostra no equipamento. As frações foram eluídas com um fluxo de 0,5 mL/min e coletadas em microtubos no intervalo de 0,5 mL. A pressão máxima da coluna é de 1,8 MPa. A mesma cromatografia por exclusão molecular descrita acima para o tampão de Bicarbonato de Amônio foi realizada para o tampão Formato de Amônio com a concentração de 50 mM e pH 3,5 e a amostra de 12mg de veneno da mesma serpente foi diluída em 250 μL de Formato de Amônio, o mesmo utilizado na cromatografia.
O programa utilizado para a realização do experimento foi o UNICORN 4.12. A leitura dos dados é feita com radiação ultravioleta no comprimento de onda de 280 nm, acarretando um gráfico de absorção da radiação pelo tempo/volume de eluição. .
3.3 Eletroforese
A eletroforese é uma técnica amplamente difundida em biologia molecular, utilizada para separação de macromoléculas com intuito de verificação de pureza, análise da população da amostra com relação ao tamanho das moléculas desnaturadas e separação de macromoléculas com base na mobilidade eletroforética. A mobilidade está relacionada com o comprimento, conformação e carga da molécula.
A técnica utilizada no trabalho foi a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) com SDS (dodecil sulfato de sódio), que é um detergente com a finalidade de linearizar as proteínas conferindo uma carga negativa para as mesmas resultando em um fracionamento por tamanho aproximado durante a eletroforese.
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Para a análise do tamanho molecular das frações obtidas na cromatografia por exclusão molecular e identificar a proteína BthTX-II dentre os componentes do veneno, foi utilizado um gel de eletroforese SDS-PAGE. A eletroforese foi realizada em poliacrilamida a 13% (m/v) para a migração de proteínas e, durante a corrida do gel de eletroforese, foi utilizado um tampão para o eletrodo de Tris-Glicina 1x. O gel de separação de acrilamida foi preparado utilizando um tampão Tris-HCl pH 8,8 e SDS 1%. Já o gel de empacotamento de acrilamida a 4% foi preparado utilizando um tampão Tris-HCl pH 6,8 e SDS 0,1%. As amostras utilizadas no gel de eletroforese são fervidas durante 10 minutos a 100°C, além da adição do SDS e β-mercaptoetanol para certificar-se de que as moléculas estão desenoveladas. A adição de SDS nas amostras se dá na proporção 2:1 (volume de amostra:SDS), assim cada poço era composto por 20uL de amostra a 10mg/mL e 10uL de SDS 1%, num total de 30uL por poço.
Em um dos poços da técnica de eletroforese foi colocado o marcador de massa molecular PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder #SM1811/2; as bandas e tamanho molecular do marcador podem ser observadas na figura abaixo.
Figura 2:SDS-PAGE band profile of the Thermo Scientific PageRuler Plus Prestained Protein Ladder. Imagens de 4-20% de Tris-Glicina,
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A corrida foi realizada com o equipamento da Bio-Rad, Power Pack Basic, com 70V e após corrido, o gel foi corado com Coomassie Brilliant Blue e descorado em ácido acético e, por fim, foi digitalizado para
documentação dos dados.
3.4 Cromatografia por Fase Reversa
Cromatografia por fase reversa é uma técnica de purificação que utiliza uma fase estacionária hidrofóbica e uma fase móvel polar, consequentemente as moléculas hidrofóbicas na fase móvel tendem a adsorver à fase estacionária e as moléculas hidrofílicas tendem a ser eluídas primeiro.
Foi utilizado o cromatógrafo AKTA Purifier da Amsterdam Pharmacia Biotech e a coluna de fase reversa Supelco Analytical coluna #135941-02. Essa coluna suporta uma pressão máxima de 35 MPa e uma recomendação do fabricante da utilização de um fluxo entre 0,1 e 1,2 mL. A capacidade da coluna com relação à concentração de amostra não deve exceder 9 mg de proteína no total injetado e o volume total da coluna é de 1,66 mL. A fase móvel dessa cromatografia utiliza como solvente polar o ácido trifluoracético à 0,1% em gradiente de concentração que variou de 0% até 100%.
Foram utilizadas amostras dos picos de BthTX-II separadas na cromatografia por exclusão molecular e concentradas até 10 mg/mL. Essas frações foram filtradas e centrifugadas; em seguida, foram injetados 100 uL de amostra no cromatógrafo utilizando um loop de 100 uL.
O programa de análise de dados também foi, como na cromatografia por exclusão molecular, o programa UNICORN 4.12 com o gráfico formado por um eixo referente à absorção da luz ultravioleta a 280 nm e outro eixo referente ao volume de eluição/frações.
3.5 Espalhamento de luz dinâmico
O espalhamento de luz dinâmico (DLS) mede a intensidade da dispersão da luz pelas moléculas em solução, que é chamado de coeficiente de difusão translacional que está relacionado com o raio hidrodinâmico da molécula determinado pela equação de Stokes-Eistein:
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O DLS mede, então, o tamanho e a distribuição das moléculas de proteínas em uma solução.
O experimento afere a polidispersidade das moléculas na solução, ou seja, mede os diferentes estados oligoméricos da amostra, se ocorre agregação ou se há somente uma forma oligomérica.
O equipamento foi ajustado para a temperatura de 4°C, 10°C, 18°C, 25°C e 37°C e realizadas 100 aquisições de dados de espalhamento para cada temperatura. A polidispersidade observada no experimento não deve ser muito alta, pois atrapalha a resolução na análise, podendo mascarar o verdadeiro resultado. Um alto valor de polidispersidade (por exemplo, acima de 15%) indica a mistura de conformações oligoméricas ou agregação proteica.
As medidas de DLS foram realizadas com o equipamento Dynopro Titan da Wyatt Technology Corporation, que utiliza uma cubeta de quartzo negro. Utilizou-se amostras de BthTX-II diluídas em tampão básico/neutro HEPES pH 7,5 numa concentração de 1,8 mg/mL centrifugadas e filtradas como uma das amostras e BthTX-II diluídas em tampão ácido Citrato de Sódio pH 5,2 em uma concentração de 1,5 mg/mL filtrada e centrifugada como segunda amostra.
3.6 Espectroscopia de fluorescência
Os experimentos de espectroscopia de fluorescência (Espectroscopia de Absorção e as medidas de Espectroscopia de Fluorescência do Estado Estacionário) foram realizados em parceria com Prof. Dr. Roberto M. Fernandez, do Departamento de Física e Biofísica da UNESP Botucatu, e com doutorando Wallance M. Pazim e Prof. Dr. Amando S. Ito, do Laboratório de Fotobiofísica do Departamento de Física da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP) na Universidade de São Paulo.
Para espectroscopia de absorção foi utilizado o equipamento espectrômetro Amersham Ultrospec 2100 pro, onde medidas podem ser realizadas em intervalos de comprimento de onda entre 190 nm a 900 nm, com largura de banda de 3 nm e intervalos de absorbância de -3,0 a 3,0.
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As medidas de espectroscopia de fluorescência do estado estacionário foram realizadas no fluorímetro Hitachi F-7000, que possui uma lâmpada de xenônio de 150 W como fonte de radiação de excitação, podendo varrer um intervalo de comprimento de onde que varia entre 200 nm a 750 nm. Para as medidas de anisotropia do estado estacionário, como no caso desse projeto, foi adicionado um filme polarizador no feixe de excitação e de emissão.
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23 4.1 Purificação
A purificação do veneno de Bothrops jararacussu é realizada através de diferentes estratégias. A fim
de otimizar o protocolo de purificação da proteína BthTX-II, realizamos comparação da purificação do veneno desta serpente por duas diferentes estratégias de cromatografia por exclusão molecular, em tampão 50 mM formato de amônio pH 3,5 e bicarbonato de amônio pH 8,1. O cromatograma referente ao primeiro tampão (Figura 3) indica que há separação entre diferentes frações, visto que há separação entre os picos. As amostras foram eluídas e separadas a cada 500uL, assim foram separados os picos para análise em eletroforese.
Figura 3: Cromatograma referente a purificação de 12mg veneno Bothropsjararacussu em tampão Formato de Amônio (
pH 3,5 em concentração 50mM). Seta aponta pico referente à BthTX-II.
Para análise do conteúdo de cada uma das frações da purificação em formato de amônio, foi realizado gel eletroforese SDS em 33 amostras referentes a diferentes frações dos picos e uma amostra do veneno em seu estado bruto diluído no mesmo tampão para comparação. As amostras foram divididas em 4 géis e adicionado marcador como referência. Foi possível observar que as PLA2s são o constituinte proteico
mais concentrados já que as bandas referentes a aproximadamente 15kDa são mais intensas semelhante ao primeiro protocolo de purificação (Homsi Brandeburgo., 1988). As PLA2s estão presentes entre o volume de
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Portanto, tendo em vista o veneno bruto e a intensidade da coloração é possível afirmar, por técnica de eletroforese, que existe uma grande porcentagem de fosfolipase em relação aos outros componentes.
Figura 4: Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS das frações obtidas na purificação da cromatografia por Exclusão Molecular da Bthtx-II em Formato de Amônio pH 3,5 e concentração de 50 mM. As setas mostram os picos de fosfolipases. Figura (A) gel referente às frações eluídas entre 0 mL à 8,5 mL, figura (B) gel referente às frações eluídas entre 9 mL à 13 mL, figura (C) gel referente às frações eluídas entre 13,5 mL à 18 mL e figura (D) gel referente às frações eluídas entre 19 mL e 20 mL + veneno bruto.
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Figura 5: Cromatograma referente a purificação de 12 mg de veneno de Bothrops jararacussu em tampão Bicarbonato de Amônio (pH 8,1 e concentração 50 mM). Seta aponta o pico referente à fosfolipases.
O gel de eletroforese abaixo foi realizado seguindo os passos adotados no experimento anterior. Assim avaliamos 33 amostras referentes aos picos do cromatograma e incluído marcadores de peso molecular e amostra do veneno bruto.
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Comparando os experimentos realizados com diferentes tampões ocorre uma melhora na resolução do cromatograma quando o tampão utilizado foi bicarbonato de amônio. O tempo de eluição é praticamente o mesmo nos diferentes ambientes como foi observado em cromatografia e comprovado em gel de eletroforese.
Figura 7: (A) Cromatograma referente ao veneno em Bicarbonato de Amônio e (B) cromatograma referente ao veneno em Formato de Amônio. As setas apontam os picos de fosfolipases.
Após a realização da cromatografia por exclusão molecular, foi separado os picos referentes a aproximadamente 15 kDa (PLA2s) e concentrados com auxilio de um centricon a 10000 rpm para em mais
uma etapa de purificação, cromatografia de fase reversa.
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Figura 8: Cromatograma de Fase Reversa (RPC) referente ao pico de PLA2s das cromatografias por exclusão molecular em concentração de 10 mg/mL. B é a porcentagem de Acetonitrila.
Após a realização da cromatografia de fase reversa, o pico alvo foi submetido a espectrofotometria de massa, no Laboratório Nacional de Biociências (Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais-Campinas/SP). Segundo resultado de espectrofotometria de massa, a amostra é composta majoritariamente (90%) pela proteína BthTX-II, contendo, 2,7% de proteína semelhante a PLA2 homóloga BthTX-I, 8,6%
lectinas do tipo C e 0,7% de serinoprotease.
4.2 Estudos Oligoméricos da BthTX-II
A BthTX-II foi cristalizada por nosso grupo em solução precipitante de citrato de sódio pH 5,6 (PDB id: 2OQD) e observado um dímero na unidade assimétrica do estudo cristalográfico (Côrrea et al, 2008).
Posteriormente, desta vez em estudo de espalhamento de raios-X com proteína em solução, dímero foi observado em solução de TRIS HCl pH pH 7,0 (Murakami et al, 2008). Em paralelo, o co-orientador dessa
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observado em unidade assimétrica. Portanto realizamos estudo estrutural em solução da BthTX-II através de espalhamento de luz dinâmico e espectroscopia de fluorescência utilizando os mesmos tampões em baixa concentração, 50 mM, para avaliar se mesmo resultado é observado em solução.
As tabelas seguintes mostram o comportamento da molécula em solução no experimento de espalhamento de luz dinâmico em cinco diferentes temperaturas: 4°C, 10°C, 18°C, 25°C e 37°C nas duas condições explicitadas na metodologia. O experimento de DLS estima a massa molecular da proteína a partir da medida do raio hidrodinâmico da molécula (Rh) em determinada temperatura.
Tabela 1: Resultados obtidos por espalhamento de luz dinâmico (DLS) de 1,8 mg/mL da proteína Bthtx-II em tampão HEPES pH 7,5. A proteína foi filtrada e centrifugada.
Medida Rh %PD Massa Molecular
kDa %Massa Temperatura °C 1 2 3 4 5 1,7 1,8 1,7 1,8 3 7,6 30,8 15,5 22,8 96,4 12 14 12 14 45 100 99,9 99,4 98,8 100 4 10 18 25 37
A primeira medida foi realizada a 4°C e obtivemos 7,6% de polidispersidade o que confere um bom resultado pois há uma predominância de uma população na amostra. À 4°C a proteína estudada possui um raio hidrodinâmico de aproximadamente 1,7 nm, pressupondo um tamanho molecular de 12 kDa em praticamente 100% da massa que compõe a amostra. Em seguida foram feitas aquisições à 10°C e obtivemos uma polidispersidade de 30%. À 10°C a proteína, pelo experimento, possui aproximadamente 1,8 nm de raio hidrodinâmico o que equivale aproximadamente a 14 kDa à proteína, em 99,9% da massa total da amostra. A terceira medida foi realizada a 18°C obtendo uma polidispersidade de 15,5%, dispondo à proteína um raio hidrodinâmico de 1,7 nm ,ou seja, 12 kDa, em 99,4% do total de massa da amostra. 25°C é a quarta temperatura utilizada para medidas da proteína o equipamento mediu um Rh de 1,8 nm o que é
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Relacionando todos os dados obtidos acima é possível dizer que a proteína encontra-se em estado monomérico quando em solução HEPES pH 7,5 em concentração 50mM.
Tabela 2: Resultados obtidos por espalhamento de luz dinâmico (DLS) de 1,5 mg/mL da proteína Bthtx-II em tampão Citrato de Sódio pH 5,2. A proteína foi filtrada e centrifugada.
Medida Rh %PD Massa Molecular
kDa %Massa Temperatura °C 1 2 3 4 5 2,5 2,8 2,7 2,9 2,6 22,8 38,4 41,6 45,9 29,4 29 37 35 41 30 99,7 99,7 99,7 99,3 99,4 4 10 18 25 37
Foi realizado o mesmo experimento de DLS com a proteína em um tampão diferente, Citrato de Sódio pH 5,2 como descrito acima, onde foram realizadas 5 medidas em diferentes temperaturas com 100 aquisições de resultados para cada medida.
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oligomerização da proteína devido ao Rh maiores que para a conformação monomérica (aproximadamente 1,8 nm - tabela 1) e valores elevados de polidispersividade
A BthTX-II foi submetida a outro experimento de análise com relação ao estado oligomérico que ela se encontra, em diferentes ambientes assim como em DLS, que foi a espectroscopia de fluorescência. Foram testadas as duas condições, HEPES pH 7,5 e Citrato de Sódio pH 5,2, a concentração de proteína de 3,5 mg/mL e 4,7 mg/mL respectivamente. Foi incidido uma luz com comprimento de onde entre 300 nm e 500 nm, pois compreende faixa de absorção do Triptofano.
Figura 9: Gráfico de Anisotropia da Bthtx-II x comprimento de onda da luz em nanômetros, das amostras em Citrato de Sódio pH 5,2 (preto) e HEPES pH 7,5 (vermelho).
É possível notar que há um sinal de resposta um pouco maior da proteína em HEPES podendo estar relacionado com o fato de a proteína em HEPES possuir uma população majoritariamente monomérica, com o triptofano em ambiente polar. A resposta dada pela proteína em tampão Citrato de Sódio é menor, mostrando que a população da proteína nesse tampão é de monômeros e dímeros conforme sugeridos pelos dados de DLS.
31
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33
A proteína BthTX-II é purificada através de diferentes estratégias (Homsi-Brandeburgo, M. I., L. S. Queiroz, et al., 1988; Andrião-Escarso SH., Soares AM., et al., 2000; Cintra, A.C.O., Marangoni, S.,
Oliveira., et al., 1993). Usualmente, os venenos de serpentes eram purificados por cromatografia de exclusão
molecular seguida de troca iônica. A utilização da fase reversa - que é a técnica de cromatografia com maior resolução - como segunda etapa de purificação melhora a separação da BthTX-II, porém pode modificar o estado oligomérico da proteína e até mesmo se desenovelar total ou parcialmente a mesma. No caso desta proteína não ocorreu o desenovelamento já que a mesma conserva sua estrutura, como observado por experimentos cristalográficos realizados em nosso laboratório. Como primeira etapa de cromatografia, testamos dois tampões diferentes utilizados anteriormente por Homsi-Brandeburgo e colaboradores (Homsi-Brandeburgo, M. I., L. S. Queiroz, et al., 1988): formato de amônio pH ácido e bicarbonato de amônio em
pH neutro. Conforme resultados de gel SDS-Page e cromatogramas (Figuras 3 a 7), concluímos que a segunda opção é a ideal.
A técnica de DLS em batch não tem resolução suficiente para separar monômeros e dímeros de moléculas com massa molecular de cerca de 14 kDa. Porém, no caso desta mistura de estados monoméricos e diméricos, pode ser claramente observado um pico largo que é expresso pelo alto valor de polidispersidade. Polidispersidade inferior a 15% pode ser considerada como amostra monodispersa e, abaixo de 30%, a polidispersidade é moderada (Gloria E. O. Borgstahl., 2007). A BthTX-II em 50 mM de HEPES pH 7,5 a 4°C apresenta polidispersidade de 7,6%, um raio hidrodinâmico de aproximadamente 1,7 nm, isto é, população monodispersa em monômeros (tamanho molecular de 12 kDa). Em demais temperaturas, a polidispersidade aumenta, mas não ultrapassa o valor de 30%, que é caracterizado como contendo parte moderadamente polidispersa (Gloria E. O. Borgstahl., 2007), e mantém mesmo raio hidrodinâmico, com exceção de a 37°C. Portanto, concluímos que em tampão HEPES pH 7,5 pode-se observar monômeros. Em 50 mM de citrato de sódio pH 5,2, BthTX-II não está tão estável, observamos menor polidispersidade em 4°C; contudo, os valores de raio hidrodinâmico em todas temperaturas são mais altos e picos mais largos, o que corresponde à mistura de estados oligoméricos da proteína (majoritariamente monômeros e dímeros) e amostra polidispersa.
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monômero e em dímero, no caso do monômero o desvio entre os dados é baixo, χ2(chi2) de 1,1, no dímero é alto, 4,7. Mesmo procedimento foi realizado com tampão citrato de sódio, porém nenhuma das sobreposições foi satisfatória já que χ2 são todos superiores a 2. Este fato corrobora com os dados de alta
polidispersidade do DLS indicando mistura de estados oligoméricos
Posteriormente ao artigo estrutural da BthTX-II de Côrrea e colaboradores (Correa et al, 2008),
nosso grupo apontou um dímero mais compacto como biológico com base nas análises do algoritmo PISA (dos Santos et al., 2010), programa este que prediz provável estrutura quaternária usando empacotamento
cristalino e termodinâmica (E. Krissinel., K. Henrick., 2007). Utilizando dados de SAXS e dados cristalográficos, pode-se comparar o volume teórico de Porod do monômero (17030 Å3), dímero
cristalográfico (33530 Å3), dímero cristalográfico compacto gerado pelo programa PISA (21380 Å3) e o
experimental da BthTX-II em citrato de sódio a 1 mg/mL (23189.6 Å3) e a 5 mg/mL (25585 Å3), concluímos
que neste último tampão há provavelmente uma mistura entre monômeros e dímeros. Inferir proporção de cada um não é possível, contudo o aumento da concentração de proteína aumenta a quantidade de dímeros, desde que o valor para 5 mg/mL seja maior que para 1 mg/mL.
A BthTX-II é capaz de formar dímeros quando em tampão citrato de sódio demonstrado em nossos estudos de espectroscopia de fluorescência e DLS, confirmados por SAXS. Mesmo resultado em solução foi obtido em gel SDS-PAGE em condições não desnaturantes (Dos Santos et al, 2011) e em experimentos de
espalhamento de raios-X em que proteína foi analisada em tampão TRIS HCl pH 7,0 (Murakami et al,
2008). Diferentemente, observamos em tampão HEPES pH 7,5 BthTX-II em estado monomérico
35
A B C
Figura 11. Modelos cristalográficos da BthTX-II. Em A, estrutura dimérica do PDB 2OQD. Em B, estrutura dimérica mais compacta sugerida pelo programa PISA. Em C, estrutura monomérica.
Estudo utilizando técnicas de espectroscopia de fluorescência e a proteína BthTX-I, proteína mais abundante do veneno de Bothrops jararacussu, uma PLA2s homóloga, sugere que a proteína em pH baixo
perde a oligomerização, ou seja, a proteína se encontra na forma monomérica em tampão ácido, e também perde sua atividade (A. H. C. de Oliveira et al., 2001). Diferente ao trabalho e à proteína anterior,
observamos BthTX-II monomérica em tampão neutro e em diferentes populações oligoméricas entre monômeros e dímeros em tampão ácido. É possível realizar essa observação através dos resultados obtidos em espectroscopia de fluorescência nesse trabalho, onde o sinal de resposta de anisotropia é menor em citrato de sódio pH 5,2 em comparação aos resultados obtidos da proteína em HEPES pH 7,5.Essa interpretação do sinal está relacionado com a posição do Triptofano responsável pela emissão do sinal, e é dependente do ambiente em que o Trp está. Quando em estado monomérico o Trp está em ambiente polar e na sua forma dimérica, apolar.
Tabela 3: Especificidade dos experimentos e resposta em relação a proteína BthTX-II em tampões de pH Básico, Neutro e Ácido.
Experimento Especificidade Estado oligomérico da BthTX-II em pH
básico/neutro
Estado oligomérico da BthTX-II em pH ácido
DLS
Espectroscopia de fluorescência
SAXS
Polidispersidade / Estado oligomérico Estado oligomérico /
Ambiente do Trp
Estado oligomérico
Monômero
Monômero
Monômero
Monômero e Dímero
Dímero
36
37
Foi possível concluir que a purificação da proteína BthTX-II por cromatografia de exclusão molecular utilizando tampão Bicarbonato de Amônio pH 8,1 em concentração 50 mM seguida de uma cromatografia de fase reversa com gradiente de acetonitrila de 0-100% possui uma resolução na separação da proteína maior do que a encontrada quando utilizado o processo de cromatografia de exclusão molecular seguido de uma cromatografia de troca iônica.
Os estudos de DLS e espectroscopia de fluorescência realizados neste trabalho em conjunto com o resultado obtido pelo laboratório na técnica de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) sobre o estado oligomérico da proteína indicam que a BthTX-II possui uma população monodispersa e monomérica quando em tampão básico/neutro e em diferentes populações oligoméricas, monômeros e dímeros, em tampão ácido.
38
39
A . H . C . d e O l i v e i r a . , A p H I n d u c e d D i s s o c i a t i o n o f t h e D i m e r i c F o r m o f a L y s i n e 4 9 -P h o s p h o l i p a s e A 2 A b o l i s h e s C a 2 + - I n d e p e n d e n t M e m b r a n e D a m a g i n g A c t i v i t y . B i o c h e m i s t r y 2 0 0 1 .
A n d r i ã o - E s c a r s o S H . , S o a r e s A M . , e t a l . M y o t o x i c p h o s p h o l i p a s e s A ( 2 ) i n B o t h r o p s s n a k e
v e n o m s : e f f e c t o f c h e m i c a l m o d i f i c a t i o n s o n t h e e n z y m a t i c a n d p h a r m a c o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f b o t h r o p s t o x i n s f r o m B o t h r o p s j a r a r a c u s s u. B i o c h i m i e . p . 7 5 5 - 6 3 . 2 0 0 0
A n d r i a o - E s c a r s o , S . H . , A . M . S o a r e s , e t a l . S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n a c i d i c p l a t e l e t a g g r e g a t i o n i n h i b i t o r a n d h y p o t e n s i v e p h o s p h o l i p a s e A ( 2 ) f r o m B o t h r o p s j a r a r a c u s s u s n a k e v e n o m . B i o c h e m P h a r m a c o l , v . 6 4 , n . 4 , p . 7 2 3 - 3 2 . 2 0 0 2 .
A u s t i n , S . C . e C . D . F u n k . I n s i g h t i n t o p r o s t a g l a n d i n , l e u k o t r i e n e , a n d o t h e r e i c o s a n o i d f u n c t i o n s u s i n g m i c e w i t h t a r g e t e d g e n e d i s r u p t i o n s . P r o s t a g l a n d i n s O t h e r L i p i d M e d i a t , v . 5 8 , n . 5 - 6 , p . 2 3 1 - 5 2 . 1 9 9 9 .
B e r k , P . D . e D . D . S t u m p . M e c h a n i s m s o f c e l l u l a r u p t a k e o f l o n g c h a i n f r e e f a t t y a c i d s . M o l C e l l B i o c h e m , v . 1 9 2 , n . 1 - 2 , p . 1 7 - 3 1 . 1 9 9 9 .
B i n g h a m , C . O . , 3 r d e K . F . A u s t e n . P h o s p h o l i p a s e A 2 e n z y m e s i n e i c o s a n o i d g e n e r a t i o n . P r o c A s s o c A m P h y s i c i a n s , v . 1 1 1 , n . 6 , p . 5 1 6 - 2 4 . 1 9 9 9
B o r g s t a h l G E . H o w t o u s e d y n a m i c l i g h t s c a t t e r i n g t o i m p r o v e t h e l i k e l i h o o d o f g r o w i n g m a c r o m o l e c u l a r c r y s t a l s . M e t h o d s M o l B i o l . P . 1 0 9 - 2 9 . 2 0 0 7
B R A S I L . M i n i s t é r i o d a S a ú d e . S e c r e t a r i a d e V i g i l â n c i a e m S a ú d e . D e p a r t a m e n t o d e V i g i l â n c i a E p i d e m i o l ó g i c a . I n : D o e n ç a s I n f e c c i o s a s e P a r a s i t á r i a s : G u i a d e B o l s o . 7 . e d . B r a s í l i a , D F : M i n i s t é r i o d a S a ú d e . p . 2 8 – 3 1 . 2 0 0 8
B R A S I L . M i n i s t é r i o d a S a ú d e . S e c r e t a r i a d e V i g i l â n c i a e m S a ú d e . D e p a r t a m e n t o d e V i g i l â n c i a E p i d e m i o l ó g i c a . I n : D o e n ç a s I n f e c c i o s a s e P a r a s i t á r i a s : G u i a d e B o l s o . 7 . e d . B r a s í l i a , D F : M i n i s t é r i o d a S a ú d e , p . 4 3 1 – 4 3 7 . 2 0 1 0
C e n t r o d e E s t u d o s d e V e n e n o s e A n i m a i s P e ç o n h e n t o s - B o t u c a t u / S P , C e n t r o V i r t u a l d e T o x i c o l o g i a . D i s p o n í v e l e m : < h t t p : / / w w w . c e v a p . o r g . b r / > . 2 0 1 4 .
40
C o r r e a , L . C . , D . P . M a r c h i S a l v a d o r , e t a l . C r y s t a l s t r u c t u r e o f a m y o t o x i c A s p 4 9 -p h o s -p h o l i -p a s e A 2 w i t h l o w c a t a l y t i c a c t i v i t y : I n s i g h t s i n t o C a 2 + - i n d e -p e n d e n t c a t a l y t i c m e c h a n i s m . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , v . 1 7 8 4 , n . 4 . p . 5 9 1 - 9 . 2 0 0 8 .
D o s S a n t o s , J . I . , C . A . F e r n a n d e s , e t a l . T h e i n t r i g u i n g p h o s p h o l i p a s e s A 2 h o m o l o g u e s : r e l e v a n t s t r u c t u r a l f e a t u r e s o n m y o t o x i c i t y a n d c a t a l y t i c i n a c t i v i t y . P r o t e i n P e p t L e t t , v . 1 6 , n . 8 , p . 8 8 7 - 9 3 . 2 0 0 9 .
D o s S a n t o s , J . I . , A . M . S o a r e s , e t a l . C o m p a r a t i v e s t r u c t u r a l s t u d i e s o n L y s 4 9 - p h o s p h o l i p a s e s A ( 2 ) f r o m B o t h r o p s g e n u s r e v e a l t h e i r m y o t o x i c s i t e . J S t r u c t B i o l , v . 1 6 7 , n . 2 . p . 1 0 6 - 1 6 . 2 0 0 9 .
D o s S a n t o s J . I . , S a n t o s - F i l h o N A . , e t a l . C r y s t a l l i z a t i o n a n d p r e l i m i n a r y X - r a y
c r y s t a l l o g r a p h i c s t u d i e s o f a L y s 4 9 - p h o s p h o l i p a s e A 2 h o m o l o g u e f r o m B o t h r o p s p i r a j a i v e n o m
c o m p l e x e d w i t h r o s m a r i n i c a c i d . A c t a C r y s t a l l o g r S e c t F S t r u c t B i o l C r y s t C o m m u n . p . 6 9 9 -7 0 1 . 2 0 1 0 .
E . K r i s s i n e l . , K . H e n r i c k . I n f e r e n c e o f m a c r o m o l e c u l a r a s s e m b l i e s f r o m c r y s t a l l i n e s t a t e . J M o l B i o l . p . 7 7 4 - 9 7 . 2 0 0 7 .
G i j o n , M . A . e C . C . L e s l i e . R e g u l a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e a n d c y t o s o l i c p h o s p h o l i p a s e A 2 a c t i v a t i o n . J L e u k o c B i o l , v . 6 5 , n . 3 . p . 3 3 0 - 6 . 1 9 9 9 .
G u t i e r r e z , J . M . , J . N u n e z , e t a l . S k e l e t a l m u s c l e d e g e n e r a t i o n a n d r e g e n e r a t i o n a f t e r i n j e c t i o n o f b o t h r o p s t o x i n - I I , a p h o s p h o l i p a s e A 2 i s o l a t e d f r o m t h e v e n o m o f t h e s n a k e B o t h r o p s j a r a r a c u s s u. E x p M o l P a t h o l , v . 5 5 , n . 3 . p . 2 1 7 - 2 9 . 1 9 9 1 .
G u t i é r r e z , J . M . e B . L o m o n t e . V e n o m p h o s p h o l i p a s e A 2 e n z y m e s : s t r u c t u r e , f u n c t i o n a n d m e c h a n i s m . R . M . K i n i . C h i c h e s t e r : W i l e y . p . 3 2 1 - 3 5 2 . 1 9 9 7 .
H o m s i - B r a n d e b u r g o , M . I . , L . S . Q u e i r o z , e t a l . F r a c t i o n a t i o n o f B o t h r o p s j a r a r a c u s s u s n a k e
v e n o m : p a r t i a l c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n a n d b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f b o t h r o p s t o x i n . T o x i c o n , v . 2 6 , n . 7 , p . 6 1 5 - 2 7 . 1 9 8 8 .
K a s t u r i r a t n e e t a l . T h e G l o b a l B u r d e n o f S n a k e b i t e : A L i t e r a t u r e A n a l y s i s a n d M o d e l l i n g B a s e d o n R e g i o n a l E s t i m a t e s o f E n v e n o m i n g a n d D e a t h s . 2 0 0 8 .
41
K i n i , R . M . E x c i t e m e n t a h e a d : s t r u c t u r e , f u n c t i o n a n d m e c h a n i s m o f s n a k e v e n o m p h o s p h o l i p a s e A 2 e n z y m e s . T o x i c o n : o f f i c i a l j o u r n a l o f t h e I n t e r n a t i o n a l S o c i e t y o n T o x i n o l o g y , v . 4 2 , n . 8 , p . 8 2 7 – 8 4 0 . 2 0 0 3 .
K i n i , R . M . S t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s a n d m e c h a n i s m o f a n t i c o a g u l a n t p h o s p h o l i p a s e A 2 e n z y m e s f r o m s n a k e v e n o m s . T o x i c o n , v . 4 5 , n . 8 . p . 1 1 4 7 - 6 1 . 2 0 0 5 .
L O M O N T E , B . ; G U T I É R R E Z , J . M . P h o s p h o l i p a s e s A 2 F r o m V i p e r i d a e S n a k e V e n o m s : H o w d o T h e y I n d u c e S k e l e t a l M u s c l e D a m a g e ? A c t a C h i m . S l o v . , v . 5 8 , p . 6 4 7 – 6 5 8 , 2 0 1 1 .
M u r a k a m i M . T . , L o u r e n z o n i , M . R . , e t a l . B i o c h e m i c a l a n d s t r u c t u r a l i n v e s t i g a t i o n s o f B o t h r o p s t o x i n - I I , a m y o t o x i c A s p 4 9 p h o s p h o l i p a s e A 2 f r o m B o t h r o p s j a r a r a c u s s u v e n o m .
P r o t e i n P e p t L e t t . p . 1 0 0 2 - 8 . 2 0 0 8
P e r e i r a , M . F . , J . C . N o v e l l o , e t a l . T h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f b o t h r o p s t o x i n - I I , a n A s p - 4 9 m y o t o x i n f r o m B o t h r o p s j a r a r a c u s s u ( J a r a r a c u c u ) v e n o m w i t h l o w p h o s p h o l i p a s e A 2 a c t i v i t y . J
P r o t e i n C h e m , v . 1 7 , n . 4 , p . 3 8 1 - 6 . 1 9 9 8 .
R o s e n b e r g , P . H a n d b o o k o f t o x i n o l o g y . W . T . S h y e r e D . M e b s . N e w Y o r k : D e k k e r 1 9 9 0 .
S c h a l o s k e , R . H . e E . A . D e n n i s . T h e p h o s p h o l i p a s e A 2 s u p e r f a m i l y a n d i t s g r o u p n u m b e r i n g s y s t e m . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , v . 1 7 6 1 , n . 1 1 , p . 1 2 4 6 - 5 9 . 2 0 0 6
S o a r e s , A . M . , W . P . S e s t i t o , e t a l . A l k y l a t i o n o f m y o t o x i c p h o s p h o l i p a s e s A 2 i n B o t h r o p s m o o j e n i v e n o m : a p r o m i s i n g a p p r o a c h t o a n e n h a n c e d a n t i v e n o m p r o d u c t i o n . I n t J B i o c h e m
C e l l B i o l , v . 3 6 , n . 2 . p . 2 5 8 - 7 0 . 2 0 0 4 .
