Universidade de São Paulo
FFCLRP - Departamento de Física
MARINA RIBEIRO BATISTUTI
Classificação de fungos através da espectroscopia no
infravermelho por transformada de Fourier
MARINA RIBEIRO BATISTUTI
Classificação de fungos através da espectroscopia no
infravermelho por transformada de Fourier
Dissertação apresentada à Faculdade de
Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo, como
parte das exigências para a obtenção do
título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração:
Física aplicada à Medicina e Biologia.
Orientador:
Luciano Bachmann.
Versão corrigida
Versão original disponível na
ii
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
FICHA CATALOGRÁFICA
Batistuti, Marina Ribeiro
Classificação de fungos através da espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier / Marina Ribeiro Batistuti; orientador Luciano Bachmann. Ribeirão Preto - SP, 2012.
174 f.:il.
Dissertação (Mestrado - Programa de Pós-graduação em Física aplicada à Medicina e Biologia) - Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, 2012.
1. FTIR. 2. Espectroscopia. 3. Fungos. 4. Análise
Nome: Batistuti, Marina Ribeiro
Título: Classificação de fungos através da espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier
Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
Aprovado em: / / .
Banca Examinadora
Prof. Dr. : Instituição:
Julgamento: Assinatura:
Prof. Dr. : Instituição:
Julgamento: Assinatura:
Prof. Dr. : Instituição:
Agradecimentos
Aos meus pais Paschoal eCristina pela educação, incentivo, apoio e amor
incondicional. Vocês foram e sempre serão a minha base, os que me ensinaram o Caminho que devo andar. Obrigada Pai pela inspiração e direcionamento, mesmo que sem essa intenção, na carreira docente. Obrigada por ser como pai e como professor um exemplo para mim. Obrigada Mãe por tudo que você representa para mim, todo exemplo, todo consolo, todo carinho, toda paciência e todo o amor.
Aos meus irmãos GuilhermeeNícolas obrigada por todo companherismo,
toda amizade e todas as briguinhas aos finais de semana. Amo vocês!
Ao meu amor David por me acompanhar nessa caminhada, pela apoio,
compreensão e imensa paciência em todos os momentos. Obrigada por me ouvir, me entender e me dar ânimo para continuar. Obrigada pela ajuda durante a escrita e formatação deste trabalho, pois sua ajuda foi fundamental. Obrigada por todo amor e carinho!
Ao Prof. Dr. Luciano Bachmann agradeço imensamente por ter me aceito tanto como aluna de mestrado como ter me orientado durante todos os anos de iniciação científica. Obrigada por todo conhecimento transmitido, por todas as oportunidades oferecidas, pela constante paciência, pelas críticas que me fizeram crescer, pela confiança depositada que me fez ter responsabilidade pelo trabalho e pelas decisões tomadas. Obrigada pela amizade, pelos cafés e por todas conversas que me fizeram crescer profissionalmente. À você, sempre serei grata e sei que sempre poderei contar!
Aos alunos e professores do grupo de Fotobiofísica, muito obrigada! Em
especial, àLeilapela sua amizade e parceria. Por toda paciência e ajuda, por todos
conselhos e desabafos, por todo conhecimento dividido! AoFabrício pela parceria
dia-a-dia, pela correções feitas nesse trabalho, pelas dicas e críticas, pela amizade e
v
por sempre poder contar com sua ajuda! Ao Neto, meu irmão, por estar sempre
presente me alegrando. Obrigada por poder dividir com você não só o conhecimento científico, mas dia-a-dia todas as risadas, momentos de alegria e aflição.
Ao Prof. Dr. Gilberto Úbida Leite Braga, colaborador deste trabalho. Agradeço por abrir as portas do seu laboratório, por todo conhecimento e toda
ajuda. Agradeço em especial aLudimilae aGabipor toda paciência e toda ajuda
nos experimentos. Agradeço aoHenrique, aSandrinhae aoGuilhermepor toda
amizade construída esses anos, todos os almoços e cafés juntos. Por todas risadas e momentos de descontração que dividi com vocês.
Aos funcionários e técnicos do Departamento de Física que sempre estiveram presentes para sanar minhas dúvidas e me ajudar, em especial à secretária Nilza M. L. Marino por sempre ser tão solícita e paciente.
À minha amiga-irmãPaulinha por dividir comigo não só um apartamento,
mas todas as dúvidas e crises da pós-graduação e fora dela também, por sempre
me ouvir e me aconselhar. Aos amigos mais chegados que irmãos que
imerecidamente são tantos que nem posso citar, mas vocês sabem que são! Obrigada pela amizade, pelos suporte, por todos os aniversários e surpresas, todas as caronas, todos os almoços de domingo juntos. Por tudo que aprendi e sempre aprenderei com vocês. Por tornar essa caminhada mais leve e alegre!
À Capes pela bolsa fornecida.
Louvo àDeuspela vida de cada pessoa acima. Louvo àDeuspela conclusão
Resumo
BATISTUTI, M. R. Classificação de fungos através da espectroscopia no
infravermelho por transformada de Fourier. 2012. 174 f. Dissertação (Mestrado - Programa de Pós-graduação em Física aplicada à Medicina e Biologia) - Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto - SP, 2012.
A identificação de isolados dentro de algumas espécies de fungos filamentosos
são de interesse médico, agrícola e industrial. Dentro do gênero Metarhizium, por
exemplo, a identificação de espécies vêm sendo constantemente modificada devido a análise genética. Nesse contexto, o desenvolvimento de novas estratégias para a identificação rápida e confiável de microrganismos de maneira geral, e de fungos especificamente, é desejável. A espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) tornou-se amplamente difundida na medicina e biologia por fornecer rapidamente informações capazes de caracterizar bioquimicamente uma amostra. Assim, o objetivo desta pesquisa foi utilizar a espectroscopia de FTIR para a
caracterização e classificação de linhagens e de espécies dos gêneros Aspergillus e
Metarhizium, além da comparação entre diferentes metodologias para classificação.
Foram selecionadas duas espécies do gênero Aspergillus: Aspergillus nidulans
(ATCC 10074);Aspergillus flavus (ATCC 1410) com conídios verde e branco, obtidas
da ATCC "American Type Culture Collection"(Manassas, VA), e seis espécies do
gênero Metarhizium: Metarhizium acridum (ARSEF 324); Metarhizium acridum
(ARSEF 3391); Metarhizium acridum (ARSEF 7486); Metarhizium anisopliae
(ARSEF 5749); Metarhizium brunmeum (ARSEF 1095) e Metarhizium brunmeum
(ARSEF 5626), obtidas da "USDA-ARSEF collection of Entomopathogenic Fungal
vii
Cultures"(U.S. Plant, Soil and Nutrition Laboratory, Ithaca, NY). O cultivo de
todas as espécies foi feito em laboratório. As espécies A. nidulans ATCC 10074
e M. acridum ARSEF324 foram usadas para avaliar a influência da luz e do pH do meio de cultura sobre o crescimento dos fungos. Os valores de pH do meio estudados variaram ente 5 e 8. Para obter os espectros de absorção, os conídios foram delicadamente retirados e depositados sobre o cristal de ATR do espectrêmetro do FTIR. Os espectros foram normalizados vetorialmente e subdivididos em quatro
intervalos: 910-1178 cm−1
, 1178-1490 cm−1
, 1490-1790 cm−1
e 2810-2990 cm−1
. Parâmetros espectroscópicos como o deslocamento do pico de absorção e as razões entre áreas sob as bandas foram calculadas para todos os espectros coletados. O teste
estatístico t-Student foi aplicado a estes parâmetros para diferenciar as amostras.
Ambas as análises foram realizadas pelo programa Origin 8.5. A análise de
componentes principais e agrupamento foram realizada usando o programaMinitab
16. As técnicas utilizadas para análise foram capazes de diferenciar as amostras de Aspergillus crescidas na presença e na ausência de luz, mas não foram capazes de
diferenciar as amostras deMetarhizium. Dentre os valores de pH do meio de cultura
foi possível apenas a diferenciação do pH 8. O A. flavus com conídios brancos e
verdes foram diferenciados entre si assim como entre eles e osA. nidulans. Entre as
espécies foi possível obter a classificação de acordo com a taxonomia através da região
espectral 1178-1490 cm−1
. As quatro metodologias foram consideradas adequadas para análise dos espectros de absorção, entretanto o deslocamento de pico e a razão entre as áreas são viáveis apenas para um número pequeno de amostras enquanto o PCA e o cluster são viáveis para um número grande de amostras.
Abstract
BATISTUTI, M. R. Fourier transform infrared spectroscopy applied to
fungi classification. 2012. 174 f. Dissertation (M.Sc. - Postgraduate program in Physics applied to Medicine and Biology) - Faculty of Philosophy, Sciences and Literature, University of São Paulo, Ribeirão Preto - SP, 2012.
The identification of isolates within some species of filamentous fungi has
medical, agricultural and industrial interest. Within the genus Metarhizium, for
example, species identification is being constantly changed due to genetic analysis. In this context, the development of new strategies for the rapid and reliable identification of microorganisms in general, and specifically of fungi is desirable.
Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) has become widespread in medicine and biology by providing information quickly able to biochemically characterize a sample. The aim of this research was to use FTIR spectroscopy for
characterization and classification of strains and species of the genera Aspergillus
and Metarhizium and compare different methods for classification.
We selected two strains of the genusAspergillus: Aspergillus nidulans (ATCC
10074), Aspergillus flavus (ATCC 1410) with green and white conidia, obtained
from ATCC "American Type Culture Collection"(Manassas, VA), and six strains of Metarhizium: Metarhizium acridum (ARSEF 324); Metarhizium acridum (ARSEF
3391); Metarhizium acridum (ARSEF 7486), Metarhizium anisopliae (ARSEF
5749); Metarhizium brunmeum (ARSEF 1095) and Metarhizium brunmeum
(ARSEF 5626), obtained the "USDA-ARSEF collection of Entomopathogenic Fungal Cultures "(U.S. Plant, Soil and Nutrition Laboratory, Ithaca, NY).
The cultivation of all species were made in the laboratory. The species A.
ix
nidulans (ATCC 10074) and M. acridum (ARSEF 324) were used to evaluate the influence of light and pH of the culture medium on the growth of fungi. The pH values of the medium studied ranged between 5 and 8. To obtain the absorption spectra, the conidia were gently removed and deposited on the ATR crystal of FTIR spectrometer.
The absorption spectra were vector normalized and divided in four ranges:
910-1178 cm−1
, 1178-1490cm−1
, 1490-1790cm−1
and 2810-2990cm−1
. Spectroscopic parameters as the displacement of the absorption peak and the ratios of the areas under the bands were calculated for all spectra collected. The statistical test t-Student was applied on these parameters to differentiate the samples. Both
analyzes were performed by the program Origin 8.5. The principal component
analysis and cluster analysis were performed using Minitab 16.
The techniques used for analysis were able to differentiate samples of Aspergillus grown in the presence and absence of light, but it was not possible to Metarhizium. Among the pH of the culture medium was only possible to
identify the pH 8. The A. flavus with white and green conidia were differentiated
among themselves and between them and the A. nidulans. Among the strains of
the same specie it was possible to obtain the correct classification according to
the taxonomy through spectral region 1178-1490 cm−1
. The four methods were considered appropriate for the analysis of absorption spectra, however displacement of the absorption peak and the ratios of the areas are feasible for a small number of samples and the multivariate analysis are feasible for a large number of samples.
Lista de Figuras
1.1 O espectro eletromagnético apresentado em função do comprimento
de onda, da frequência e do número de onda. Cada intervalo
está correlacionado com a região ou tipo de radiação e o processo que nela ocorre. UV refere-se ao Ultravioleta, EPR a Ressonância
paramagnética eletrônica e RMN a Ressonância magnética nuclear. . 5
1.2 O espectro eletromagnético é constituído por duas componentes
que se propagam através de uma onda senoidal. A radiação
eletromagnética está representada pelos campos perpendiculares: E
(elétrico) e B (magnético) e pelo comprimento de onda λ. . . 5
1.3 Modelo clássico da interação da radiação eletromagnética com uma
molécula diatômica. Quando o vetor campo elétrico, E , da radiação
incidente se acoplar com o momento de dipolo, p, a molécula A-B
vibrará e a energia da radiação incidente será absorvida pela molécula. Quando a molécula não possui momento de dipolo permanente (A-A)
não haverá acoplamento elétrico nem absorção de energia. . . 7
1.4 O modelo clássico de um rotor linear rígido ilustra as interações
rotacionais da molécula (A-B) com a radiação eletromagnética. . . . 8
1.5 Representação do perfil de energia de uma molécula diatômica como um oscilador harmônico, onde a energia pelo deslocamento apresenta
o perfil de uma parábola simétrica ao eixo Ex. . . 9
1.6 Níveis quantizados de energia. . . 10
1.7 Diagrama representativo os níveis quânticos de energia vibracional (V) e rotacional (J) de uma molécula diatômica como o CO. . . 11 1.8 Função energia potencial anarmônica apresenta níveis de energias
definidos ao invés de contínuos. . . 12
xi
1.9 Ilustração dos modos vibracionais para uma moléculas triatômica não-linear. Os itens i e ii correspondem a estiramentos simétricos e assimétricos respectivamente, enquanto o iii corresponde a uma flexão. 14 1.10 Ilustração do interferômetro de Michelson. A fonte S emite o feixe de
radiação que é dividido, metade é transmitido para o espelho móvel e a outra metade para o espelho fixo. Ambos os feixes são refletidos e então transmitidos para o detector. . . 16 1.11 Ilustração do interferograma uma fonte de radiação monocromática
(i) e policromática (ii). . . 17
1.12 Ilustração esquemática do aparelho de FTIR. A fonte S emite o
feixe de radiação, este passa pelo interferômetro de Michelson, pela
amostra e pelo detector. O interferograma obtido é transformado no
espectro de absorção através da transforamada de Fourier. . . 18
1.13 Ilustração da técnica ATR. O feixe de radiação atravessa o cristal até a interface cristal-amostra, onde ocorre a reflexão interna total. . . . 19 1.14 Exemplo da derivada de segunda ordem do espectro de absorção
no intervalo de 910-1178 cm−1
. Na parte inferior do gráfico está o espectro de absorção e na parte superior sua segunda derivada. É possível observar que cada ponto de mínimo da derivada segunda ordem corresponde a um pico de absorbância do espectro. . . 21 1.15 Interpretação geométrica da análise de componentes principais para
p =2. . . 26 1.16 Ilustração dos procedimentos hierárquicos aglomerativos e divisivos. . 28
xii
3.2 Espectro do meio de cultura usado para o crescimento dos
fungos.Destaque na região de 900-1200cm−1
para melhor visualização.
O espectro apresenta picos em 3300cm−1
, 1630cm−1
e de 900 a 1200 cm−1
. . . 40 3.3 Estrutura da dextrose. . . 40 3.4 Imagem microscópica dos conídios retirados pelo procedimento usado
neste trabalho. . . 42
3.5 Espectro de absorção de uma amostra do fungosAspergillus nidulans
(ATCC 10074) crescido na ausência de luz. O espectro foi subdividido
em três regiões: região I (910-1178cm−1
), região II (1178-1490cm−1
),
região III (1490-1790 cm−1
) e a região IV (2810-2990 cm−1
). . . 43 3.6 Um exemplo do resultado gerado pelo ajuste de picos através do
programa Origin 8.5 para o intervalo I do espectro de absorção do
A. nidulans com 12 bandas determinadas pela derivada de segunda ordem. . . 46
4.1 Espectro de absorção no infravermelho do Metarhizium acridum(ARSEF 324) crescido na ausência de luz. Este espectro é típico para todas as amostras de fungos deste trabalho e apresenta as principais bandas
de absorção e suprime a região de 1800-2600 cm−1
. . . 48 4.2 Quatro comparações diferentes entre os grupos amostrais.No item
a comparou-se a espécie A. nidulans (ATCC 10074) crescida na
presença e na ausência de luz. No item b a mesma espécie foi comparada variando o valor do pH do meio de cultura. No item
c as espécies A. nidulans (ATCC 10074) e a M. acridum (ARSEF
324) foram empregadas para comparação entre dois gêneros diferentes ao qual cada um deles pertence. O item d faz a comparação entre
xiii
4.3 Espectro médio de absorção no infravermelho da espécie de fungo Aspergillus nidulans (ATCC 10074) crescido na presença e na ausência de luz. O espectro apresenta-se subdividido nas quatro regiões de interesse que já foram previamente definidas. A análise
será realizada baseando-se nessas quatro regiões. . . 52
4.4 Espectros de absorção no infravermelho da espécie A. nidulans com crescimento na presença e na ausência de luz. Os espectros
apresentam-se subdivididos nos intervalos a) 910-1178 cm−1
, b)
1178-1490 cm−1
, c) 1490-1790 cm−1
e d) 2810-2990 cm−1
com
suas respectivas derivadas de segunda ordem. Destacam-se os
deslocamentos de picos do primeiro e segundo intervalo. . . 53 4.5 Análise das componentes principais aplicada a espécie A. nidulans
(ATCC 10074) com crescimento na presença e na ausência de luz para os quatro intervalos do espectro de absorção. Nos intervalos I e II apresentados em (a) e (b) a distribuição dos postos varia em torno de eixo de PC 1. No intervalo III, em (c), a distribuição dos pontos varia em torno do eixo de PC 2. No intervalo IV mostrado em (d) não há distinção dos grupos já que os pontos se encontram sobrepostos. 65 4.6 Ilustração do ciclo sexual e assexual da espécie A. nidulans na
ausência e na presença de luz respectivamente. A partir da hifa, o fungo pode ter dois desenvolvimentos diferentes dependendo do
estímulo recebido. Fonte: adaptado de [22]. . . 67
xiv
4.8 Espectros de absorção no infravermelho da espécie M. acridum com crescimento na presença e na ausência de luz. Os espectros
apresentam-se subdivididos nos intervalos a) 910-1178 cm−1
, b)
1178-1490 cm−1
, c) 1490-1790 cm−1
e d) 2810-2990 cm−1
com suas respectivas derivadas de segunda ordem. Destaca-se os deslocamentos de picos do primeiro e segundo intervalo. . . 69 4.9 Análise das componentes principais aplicada a espécie M. acridum
(ARSEF 10074) com crescimento na presença e na ausência de luz para os quatro intervalos do espectro de absorção. Em todos os quatro intervalos observam-se a dispersão e sobreposição dos pontos onde não é possível diferenciá-los através do PCA. . . 79 4.10 Espectros de absorção do meio de cultura sem a inoculação dos fungos
preparado com diferentes valores de pH. Observa-se que os espectros de absorção do meio de cultura não sofrem variações em função dos valores de pH. . . 82 4.11 Espectros de absorção no infravermelho da espécie A. nidulans
(ATCC 10074) crescidos em meios de cultura com diferentes valores de pH. Os espectros apresentam-se subdivididos nos intervalos a)
910-1178 cm−1
, b) 1178-1490 cm−1
, c) 1490-1790 cm−1
e d) 2810-2990 cm−1
com suas respectivas derivadas de segunda ordem. Destacam-se os deslocamentos de picos do primeiro intervalo em função do aumento do pH. . . 83
4.12 Destaque para o intervalo I de 910-1178 cm−1
xv
4.13 Análise das componentes principais aplicada a espécie A. nidulans (ATCC 10074) com crescimento em meios de cultura com diferentes valores de pH. Nos intervalos I e II observa-se grande dispersão dos pontos com apenas os pontos referentes ao pH 8 agrupados. Nos intervalos III e IV todos os valores de pH apresentam-se dispersos e sobrepostos. . . 96 4.14 Espectros de absorção no infravermelho da espécie M. acridum
(ARSEF 324) crescidos em meios de cultura com diferentes valores de pH. Os espectros apresentam-se subdivididos nos intervalos
a) 910-1178 cm−1
, b) 1178-1490 cm−1
, c) 1490-1790 cm−1
e d)
2810-2990 cm−1
com suas respectivas derivadas de segunda ordem. Destaca-se a extrema semelhança entre todos os espectros de absorção independente do valor de pH. . . 100 4.15 Análise das componentes principais aplicada a espécie M. acridum
(ARDEF 10074) com crescimento em meios de cultura com diferentes valores de pH. Observa-se a sobreposição dos pontos nos quatro intervalos, não sendo possível a identificação dos grupos. . . 106 4.16 Espectros de absorção no infravermelho da espécie A. flavus (ATCC
1410) com conídios verdes e brancos crescidos nas mesmas condições. Os espectros apresentam-se subdivididos nos intervalos a) 910-1178 cm−1
, b) 1178-1490 cm−1
, c) 1490-1790 cm−1
e d) 2810-2990 cm−1
com suas respectivas derivadas de segunda ordem. . . 109
4.17 Análise das componentes principais aplicada a espécie A. flavus (ATCC 1410) com conídios brancos e verdes. Os intervalos I, II e III destacam-se pela dispersão dos pontos amostrais permitindo a diferenciação dos grupos. O intervalo IV apresenta os pontos sobrepostos onde não é possível diferenciar os conídios brancos e verdes.114 4.18 Espectros de absorção no infravermelho das espécies A. flavus (ATCC
1410) com conídios verdes e brancos e A. nidulas (ATCC 10074). Os espectros apresentam-se subdivididos nos intervalos I em (a) 910-1178 cm−1
, II em (b) 1178-1490 cm−1
, III em (c) 1490-1790 cm−1
e IV em
(d) 2810-2990 cm−1
xvi
4.19 Análise das componentes principais aplicada a espécie A. flavus (ATCC 1410) com conídios brancos e verdes e a espécie A. nidulans (ATCC 10074). Os intervalos I, II e III destacam-se pela dispersão dos pontos amostrais permitindo a diferenciação dos grupos. O intervalo IV apresenta os pontos sobrepostos onde não é possível diferenciar os conídios brancos e verdes. . . 124 4.20 Dendrogramas dos quatro intervalos dos espectros de absorção das
espécies A. flavus (ATCC 1410) com conídios brancos e verdes e A. nidulans (ATCC 10074) crescidos sob as mesmas condições. . . 126 4.21 Espectros de absorção no infravermelho das espécies M. acridum,
M. anisopliae e M. brunmeum crescidos nas mesmas condições. Os
espectros apresentam-se subdivididos nos intervalos I) 910-1178 cm−1
,
II) 1178-1490 cm−1
, II) 1490-1790 cm−1
e IV) 2810-2990 cm−1
com suas respectivas derivadas de segunda ordem. . . 127 4.22 Análise das componentes principais do gênero Metarhizium nas
quatro regiões de interesse. Destaque para o inetervalo II onde as variações da espécie M. brunmeum (pontos pretos e azuis) apresentam-se deslocadas para o eixo negativo de PC 1, a espécie M. anisopliae (pontos amarelos) apresentam-se dispersa entre a origem do mesmo eixo e as variações da espécie M. acridum apresentam-se deslocadas para o eixo positivo de PC 1. . . 131 4.23 Dendrogramas da análise hierárquica de todas as amostras do gênero
Metarhizium crescidos sob as mesmas condições. . . 133 4.24 Espectros de absorção no infravermelho de todas as espécies
anteriormente usadas neste trabalho dos gêneros Aspergillus e
Metarhizium crescidos nas mesmas condições. Os espectros
apresentam-se subdivididos nos intervalos I) 910-1178 cm−1
, II)
1178-1490 cm−1
, II) 1490-1790 cm−1
e IV) 2810-2990 cm−1
com suas respectivas derivadas de segunda ordem. . . 135 4.25 Análise de componentes principais para os dois gêneros: Metarhizium
xvii
4.26 Dendrogramas da análise hierarquica das quatro regiões do espectro com nove amostras pertencentes a dois gêneros diferentes: Aspergillu e Metarhizium. . . 143
A.1 Análise da primeira e terceira componentes principais aplicada a
espécies A. nidulans (ATCC 10074) com crescimento na presença
(P) e na ausência (A) de luz para os quatro intervalos do espectro de absorção. . . 156 A.2 Análise da segunda e terceira componentes principais aplicada a
espécies A. nidulans (ATCC 10074) com crescimento na presença
(P) e na ausência (A) de luz para os quatro intervalos do espectro de absorção. . . 157 A.3 Análise da primeira e terceira componentes principais aplicada a
espécies M. acridum (ARSEF 324) com crescimento na presença (P)
e na ausência (A) de luz para os quatro intervalos do espectro de absorção . . . 159 A.4 Análise da segunda e terceira componentes principais aplicada a
espécies M. acridum (ARSEF 324) com crescimento na presença (P)
Lista de Tabelas
1.1 Graus de liberdade para moléculas poliatômicas . . . 13
3.1 Associação bioquímica das bandas encontradas no espectro de
absorção do meio de cultura, PDA [44, 45]. A letra ν representa
estiramento e δ flexão. . . 41
4.1 Apresentação dos valores médios da posição das bandas de absorção com seus respectivos desvios padrão e associação bioquímica subdivida nas quatro regiões em estudo. Destacam-se as bandas que estão presentes apenas em um ou outro grupo. Nas células em branco
a respectiva associação não foi encontrada na literatura. As letras ν,
γ e δ referem-se ao estiramento, deformação e flexão das ligações
respectivamente. . . 53 4.2 Apresentação do teste estatístico para a posição de cada banda
de absorção e também para os valores das razões das áreas das bandas divididas pela área da amida I, localizada em torno de 1650 cm−1
. Destacam-se em cinza as bandas que apresentam diferenças significativas. Nas células em branco não foi possível realizar o teste devido a falta da banda correspondente no outro grupo amostral. . . 58 4.3 Tabela com os resultados estatísticos da análise de componente
principal aplicada ao A. nidulas em duas condições de luminosidade.
Observam-se os autovalores, a variância explicada e a variância acumulada sempre superior a 86%. . . 66
xix
4.4 Valores médios da posição das bandas de absorção com seus respectivos desvios padrão e associação bioquímica subdivida nas
quatro regiões em estudo. Nas células em branco a respectiva
associação não foi encontrada na literatura. As letras ν, γ
e δ referem-se ao estiramento, deformação e flexão das ligações
respectivamente. . . 69 4.5 Teste estatístico para a posição de cada banda de absorção e também
para os valores das razões das áreas das bandas divididas pela área
da amida I, localizada em torno de 1650 cm−1
, para a linhagem M.
acridum. Destacam-se em cinzal as bandas que apresentam diferenças significativas. Nas células em branco não foi possível realizar o teste devido à falta da banda correspondente no outro grupo amostral.Nas
células com ∗ o ajuste não convergiu. . . 73
4.6 Tabela com os resultados estatísticos da análise de componente
principal aplicada M. acridum em duas condições de luminosidade.
Observa-se os autovalores, a variância explicada e a variância acumulada, sempre superior a 80%. . . 80 4.7 Valores médios da posição das bandas de absorção com seus
respectivos desvios padrão e associação bioquímica [20] subdivida nas quatro regiões em estudo. Destacam-se as bandas que estão presentes apenas em um ou outro grupo. Nas células em branco a
respectiva associação não foi encontrada na literatura. As letras ν,
γ e δ referem-se ao estiramento, deformação e flexão das ligações
respectivamente. . . 84 4.8 Teste estatístico para a posição de cada banda de absorção da
espécie A. nidulans. destacam-se em cinza as bandas que apresentam
xx
4.9 Teste estatístico t-Student para a razão entre as áreas de cada banda
de absorção da espécieA. nidulans. A comparação é feita entre os dois
valores de pH vizinhos a fim de avaliar a variação das bandas com o aumento do pH. Destacam-se em cinza as bandas que apresentam diferenças significativas. Nas células em branco não foi possível realizar o teste devido à falta da banda correspondente no outro grupo amostral. . . 92
4.10 Valores obtidos para a análise e componentes principais da espécieA.
nidulans submetidos a diferentes valores de pH do meio de cultura. Observam-se os autovalores, a variância explicada e a variância acumulada sempre superior a 86%. . . 97
4.11 Valores médios do pico de absorção de cada banda da espécie M.
acridum para diferentes valores de pH do meio de cultura nos intervalos I e II do espectro com seus respectivos desvios padrão.
. . . 97
4.12 Teste estatístico t-Student para os valores de pico da espécie M.
acridum submetidos a diferentes valores de pH do meio de cultura. Os valores de pH foram agrupados dois a dois em ordem crescente para verificar as alterações em função do aumento do pH. Poucas diferenças são apontadas pelas lacunas em cinza. . . 101 4.13 Teste estatístico t-Student para a razão da área de cada banda de
absorção da linhagem M. acridum submetidos a diferentes valores de
pH do meio de cultura. Os valores de pH foram agrupados dois a dois em ordem crescente para verificar as alterações em função do aumento do pH. As diferenças são apontadas pelas lacunas em cinza. 103
4.14 Valores obtidos para a análise e componentes principais da espécieM.
xxi
4.15 Valores médios dos picos de absorção de cada banda e a razão de suas áreas pela área da amida I com os respectivos desvios
padrão da linhagem A. flavus (ATCC 1410) com conídios verdes e
brancos.O resultado do teste t-student destaca em cinza os dados
significativamente diferentes. As céulas com ∗ referem-se as bandas
onde o ajuste de pico não convergiu. . . 110
4.16 Resultado da análise das componentes principais da linhagem A.
flavus com conídios brancos e verdes. Observam-se os autovalores, a variância explicada e a variância acumulada sempre superior a 69%. 115 4.17 Valores médios dos picos de absorção de cada banda e a razão de
suas áreas pela área da amida I com os respectivos desvios padrão da
linhagem A. flavus (ATCC 1410) com conídios verdes e brancos e A.
nidulans (ATCC 10074) . . . 118
4.18 Resultado da análise das componentes principais da linhagem A.
flavus com conídios brancos e verdes e A. nidulans. Observam-se os autovalores, a variância explicada e a variância acumulada sempre superior a 74%. . . 125 4.19 Resultado da análise por agrupamento dos espectros de absorção da
linhagem A. flavus com conídios brancos e verdes e A. nidulans. . . . 125
4.20 Valores médios dos picos de absorção das bandas com os respectivos
desvios padrão das linhagens M. acridum (ARSEF 324) e M.
brummeum (ARSEF 5616) com o resultado do teste estatístico para os valores de pico e razões entre áreas. Destacam-se em cinza as bandas que apresentam diferenças significativas. Nas células em branco não foi possível realizar o teste devido a falta da banda correspondente no outro grupo amostral. . . 128 4.21 Resultado da análise das componentes principais das amostras do
gêneroMetarhiziumcrescidas sob as mesmas condições. Observam-se
os autovalores, a variância explicada e a variância acumulada sempre superior a 72%. . . 132 4.22 Resultado da análise por agrupamento dos espectros de absorção da
xxii
4.23 Tabela comparativa entre os picos médios de absorção do A. nidulnas e do M. acridum e o resultado do teste estatístico entre os valores de pico e razões entre áreas. . . 135 4.24 Resultado numérico da análise de componentes principal para todas
as amostras de dois gêneros diferentes; Aspergillus e Metarhizium. . . 140 4.25 Resultado da análise hierárquica dos espectros de absorção dos
fungos pertencentes ao gênero Metarhizium crescidos sob as mesmas condições. . . 140
A.1 Resultado da análise de componentes principais aplicada a A.
nidulans em duas condições de luminosidade. A tabela apresenta os valores das variâncias das três primeiras componentes principais e a variância acumulada. . . 158
A.2 Resultado da análise de componentes principais aplicada a M.
Lista de Abreviaturas
ARSEF Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures.
ATCC American Type Culture Collection.
ATR Reflexão Total Atenuada (Attenuated Total Reflectance).
A. flavus Aspergillus flavus. A. fumigatus Aspergillus fumigatus. A. nidulans Aspergillus nidulans.
DNA Ácido Desoxrribonuneico (Deoxyribonucleic Acid).
EPR Ressonância Paramagnética Eletrônica (Electron paramagnetic
Resonance).
FTIR Transformada de Fourier no infravermelho (Fourier transform infrared).
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana (Human Immunodeficiency Virus).
IV Infravermelho (Infrared).
M. acridum Metarhizium acridum. M. anisopliae Metarhizium anisopliae. M. brummeum Metarhizium brummeum.
PCA Análise de Componentes Principais (Principal Component Analysis).
PDA Ágar Batata (Potato Dextrose Agar).
xxiv
RMN Ressonancia Magnética Nuclear.
Lista de Símbolos
λ Comprimento de onda.
υ Freqüência (Hz).
− →
B Campo Magnético.
υ Número de onda (cm−1
). −
→
E Campo Elétrico.
n Índice de refração.
c Velocidade da luz.
f Constante de força.
F Força restauradora.
re Posição de equilíbrio.
−
→p Momento de dipolo.
υe Frequencia de euilíbrio do oscilador.
Ex Energia Potencial Vibracional.
ε Energia dada pela equação de Bohr.
h Constante de Planck.
En Níveis de Energia quantizados.
V Nível quântico de energia vibracional.
xxvi
J Nível quântico de energia rotacional.
S Fonte emissora de radiação.
D Detector de radiação.
I Intensidade da radiação que chega ao detector.
B(υ) densidade espectral de potência.
X Matriz de dados.
X Vetor de médias amostrais.
X
pxp Matriz de covariância.
Spxp Matriz de covariância amostral.
V ar(X) Variância amostral.
Opxp Matriz ortogonal.
λp Autovalores.
ei Autovetor normalizado.
µ vetor de médias.
Y Componente principal da matriz de covariância.
∧
λ Variância estimada.
d(Xl, Xk) Distância Euclidiana entre dois elementos Xl eXk.
C Conglomerado.
ν Estiramento da ligação.
γ Deformação da ligação.
Sumário
Lista de Figuras x
Lista de Tabelas xi
Lista de Abreviaturas xii
Lista de Símbolos xiv
1 Introdução 1
1.1 Espectroscopia no Infravermelho[6] . . . 2
1.1.1 Histórico e desenvolvimento da técnica . . . 2
1.1.2 A Teoria Clássica e Quântica . . . 4
1.2 Instrumentação . . . 15
1.2.1 Interferômetro de Michelson . . . 15
1.3 Trasformada de Fourier no Infravermelho - FTIR . . . 16
1.4 Reflexão Total Atenuada - ATR . . . 18 1.5 Processamentos Matemáticos . . . 20
1.5.1 Deslocamento de pico . . . 20
1.5.2 Razões entre as áreas . . . 21
1.5.3 Análise de Componente Principal [11] . . . 22
1.5.4 Análise por agrupamento . . . 27
1.6 Fungos . . . 30
2 Motivação & Objetivos 33
2.1 Objetivos . . . 34
xxviii
3 Metodologia 36
3.1 Objetos de estudo . . . 36
3.1.1 Linhagens . . . 37
3.2 Cultivo dos fungos . . . 37 3.3 Espectroscopia por FTIR . . . 39
3.3.1 Testes Preliminares . . . 39
3.3.2 Aquisição dos espectros . . . 41
3.4 Análise de Dados . . . 42
3.4.1 Normalizaçao vetorial [46] . . . 44
3.4.2 Deslocamento dos picos de absorção . . . 44
3.4.3 Análise por Razões . . . 45
3.4.4 Análise de Componentes Principais . . . 45
3.4.5 Análise de Agrupamento . . . 46
4 Resultados e Discussão 47
4.1 Influência da Luz . . . 50
4.1.1 Aspergillus nidulans . . . 51
4.1.2 Metahrizium acridum . . . 68
4.2 Influência do pH . . . 81
4.2.1 Aspergillus nidulans . . . 82
4.2.2 Metarhizium acridum . . . 96
4.3 Classificação . . . 107
4.3.1 Aspergillus flavus . . . 108
4.3.2 Aspergillus . . . 115
4.3.3 Metarhizium . . . 126
4.3.4 Metarhizium e Aspergillus . . . 133
5 Conclusões e Perspectivas Futuras 145
Referências 148
Capítulo
1
Introdução
A
espectroscopia no infravermelho é uma técnica analítica capaz de identificarligações químicas em uma molécula destacando-se por obter espectros de uma gama de compostos [1]. Essa técnica tornou-se uma ferramenta de destaque ao ser aplicada em uma variedade de pesquisas biomédicas e biológicas, incluindo análise histopatológica de cânceres[2], detecção do parasita da malária nas células do sangue infectado [3], doenças ósseas [4] e classificação de microrganismos [5]. Dentro das suas possíveis aplicações, a identificação e classificação de microrganismos, no caso fungos, é o foco deste trabalho.Esta dissertação apresenta-se organizada em cinco capítulos, dentre os quais este primeiro apresentará uma descrição do início e da evolução da espectroscopia no infravermelho, a teoria, instrumentação, a descrição das espécies de fungos usados na pesquisa e a forma de análise dos dados coletados. O capítulo 2 detalha os objetivos deste trabalho, assim como sua motivação.
O capítulo 3 descreve cada espécie de fungo estudada, a metodologia empregada no cultivo dos mesmos, o processo para obtenção dos espectros, os parâmetros usados e a descrição das metodologias para análise dos dados. Os
resultados são apresentados no capítulo 4 juntamente com a discussão. Este
capítulo encontra-se subdividido em função dos diferentes experimentos realizados analisando primeiro alguns fatores ambientais que influenciam a cultura e seguido da diferenciação entre linhagens, espécies e gêneros dos fungos.
O capítulo 5 finaliza este trabalho apresentando as conclusões obtidas para cada tipo de análise e perspectivas para futuros trabalhos.
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 2
Após a defesa foram inseridas no apêndice deste trabalho algumas considerações feitas pela banca.
1.1
Espectroscopia no Infravermelho[6]
1.1.1 Histórico e desenvolvimento da técnica
A primeira ideia sobre a existência de uma região que se estendia além do
espectro visível da luz foi introduzida por Sir Willian Herschel em 1800. Ao
investigar a distribuição do calor no espectro visível solar obtido pela colocação de um prisma de vidro na frente de uma fenda da janela e por um termômetro
de mercúrio, Herschel descobriu que a temperatura máxima mostrada pelo
termômetro ocorreu além da extremidade vermelha do espectro. Porém, o prisma de vidro transmitia apenas o início da faixa de infravermelho (IV) que agora conhecemos como IV próximo. Para a detecção das regiões de infravermelho médio e distante foram necessários desenvolvimentos de instrumentos de medida mais sensíveis do que o termômetro de mercúrio, materiais com melhores propriedades de transmissão do IV e fontes de radiação mais adequadas do que a luz solar.
As primeiras medidas de bandas de absorção no infravermelho próximo
foram feitas por Sir John Herschel, filho de Sir William, em 1840. Já no
começo da década de 1850, John Tyndall foi o pioneiro em tratar as vibrações
moleculares como a origem da absorção da radiação IV. Os seus resultados (incluindo
a transparência dos elementos gasosos O2, N2 e H2 ao IV) encontraram mais tarde
explicação completa em termos de bandas de absorção individuais associadas com os graus de liberdade vibracionais moleculares.
Perto do final do século XIX a visão geral era de que as bandas de absorção ou emissão na região do visível estavam relacionadas com ressonâncias envolvendo cargas oscilatórias dentro da molécula. Contudo, isto não poderia explicar os espectros de emissão de átomos, mesmo estes apresentando espectros de linha mais simples do que o espectro de bandas moleculares. Logo após a descoberta do elétron, H.A. LorentzeJ. Larmorindependentemente sugeriram em 1897 que os espectros visíveis surgem a partir das oscilações de elétrons dentro de uma estrutura atômica
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 3
até mesmo as maiores absorções no comprimento de onda infravermelho deviam-se a essas vibrações dos átomos dentro de uma molécula, como intuitivamente antecipado por Tyndall 40 anos antes. Na primeira Conferência de Solvay, em 1911, N. Bjerrum introduziu a ideia de que as moléculas estão associadas com três tipos de energia de diferentes magnitudes - vibracional, rotacional e translacional.
Nas primeiras décadas do século XX, o advento da teoria quântica forneceu
uma compreensão geral da origem dos espectros moleculares. A teoria quântica
desenvolvida porSchroedingerpossibilitou aplicar a equação de onda a uma série de
modelos que representaram com grande sucesso os espectros no infravermelho médio como correspondente a transições vibracionais e níveis mais espaçados de energia rotacional; espectros no infravermelho próximo como originários de combinações vibracionais fundamentais e espectros no infravermelho distante como originários de baixa frequência vibracional. O sucesso esmagador da análise pela mecânica quântica dos espectros de vibração-rotação de pequenas moléculas poliatômicas
havia ficado claro no momento em que Gerhard Herzberg publicou seu famoso
relato e abrangente do tema "Molecular Spectra and Molecular Structure: Infrared
and Raman spectra of polyatomic molecules" em 1945.
Na mesma época, durante a Segunda Guerra Mundial, a evolução dos métodos de amplificação eletrônica, o desenvolvimento de espectrômetros de duplo feixe, entre outros avanços, possibilitaram o registo do espectro de maneira fácil, sendo obtido a partir de amostras muito pequenas, independentemente se estes eram na forma sólida, líquida ou gasosa. A partir de então o método de infravermelho tornou-se extremamente importante para a análise da estrutura molecular e como resultado do amplo uso potencial de espectrômetros de infravermelho levou à sua produção comercial, de modo que a partir de 1945 os espectrômetros foram construídos individualmente em universidade ou laboratórios industriais.
Um segundo avanço importante ocorreu na década de 1970 quando o desenvolvimento e a incorporação de computadores aos espectrômetros
possibilitaram a análise dos dados coletados através da transformada de Fourier,
método matemático através do qual o interferograma é transformado em um espectro
de frequência. Espectrômetros por transformada de Fourier no infravermelho
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 4
vantagens decorrentes das possibilidades de processamento digital de dados, abriram caminho para a esta espectroscopia ser aplicada em áreas anteriormente consideradas difíceis, como microscopia, espectroscopia de reflexão difusa, espectroscopia fotoacústica e suas primeiras aplicações na área médica [7].
1.1.2 A Teoria Clássica e Quântica
O espectro de luz que podemos obter do sol possui, entre outras regiões, uma faixa visível, contínua e policromática. Outros sistemas de detecção são capazes de revelar radiações que vão além do espectro visível, como: raios-x,
raios-γ, ultravioleta, infravermelho, micro-ondas e ondas de rádio. Essas regiões
estão ilustradas na Figura 1.1 com suas respectivas interações com a matéria. Ao
espectro que compreende dos raios-γ às ondas de rádio, dá-se o nome de espectro
eletromagnético.
A parte visível do espectro é uma porção relativamente pequena do total, porém foi através dela que se deu início todo o estudo da interação radiação com a
matéria. A radiação infravermelha estende-se aproximadamente de10−6
a10−3
m ou
como é usualmente tratada, de 40 a 4000 cm−1
. O espectro eletromagnético e suas interações com a matéria podem ser considerados em termos das teorias clássica e quântica, e assim trataremos também os modelos clássicos e quânticos vibracionais.
A natureza da radiação apresentada na Figura 1.2 foi descrita por Maxwell
como sendo dois campos, um elétrico (−→E) e outro magnético (−→B), perpendiculares
entre si, de ondas planas, em fase e senoidais. O modelo clássico para a radiação eletromagnética descreve sua propagação em um meio homogêneo com índice de
refração n, com velocidade c, dada pelo produto do comprimento de onda λ
(distância de dois picos adjacentes) e da frequênciaυ(número de ciclos por segundo),
como se segue:
c=nλυ (1.1)
O índice de refração n é próximo de 1 no ar e 1.6 no vidro para radiações
policromáticas. A velocidade de propagação da luz no vácuo c equivale a 2,99 x
108m.s−1
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 5
Figura 1.1: O espectro eletromagnético apresentado em função do comprimento de onda, da frequência e do número de onda. Cada intervalo está correlacionado com a região ou tipo de radiação e o processo que nela ocorre. UV refere-se ao Ultravioleta, EPR a Ressonância paramagnética eletrônica e RMN a Ressonância magnética nuclear.
Figura 1.2: O espectro eletromagnético é constituído por duas componentes que se
propagam através de uma onda senoidal. A radiação eletromagnética está representada pelos campos perpendiculares: E (elétrico) e B (magnético) e pelo comprimento de onda
λ.
A unidade mais usual quando tratamos de frequência na região do
infravermelho é o número de onda, dado em cm−1
. Essa unidade pode ser
interpretada como o número de ondas no comprimento de um centímetro.
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 6
pela distância que separa as componentes positiva e negativa da carga. No caso mais simples de uma molécula diatômica composta por dois átomos distintos (A-B) haverá no seu espectro uma banda com forte absorção em um determinado número de onda característico desta molécula.
Em contrapartida, uma molécula diatômica composta por dois átomos iguais (A-A) não possui dipolo e tão pouco absorve radiação no infravermelho. Por exemplo, o cloreto de hidrogênio (HCl) possui uma banda de absorção localizada em
1886cm−1
, já a molécula diatômica do hidrogênio H2 é completamente transparente
a radiação infravermelha. Para poder modelar matematicamente esse sistema,
considera-se uma molécula diatômica como duas massas m1 e m2 unidas por uma
mola que mantém as duas massas separadas e em equilíbrio. A rigidez dessa mola
pode ser caracterizada por uma constante de força, f. Se assumirmos que este
modelo obedece às leis de Hooke que afirma que se uma mola é deslocada por
uma pequena distância, x, haverá uma força oposta de restauração, F, que será
proporcional ao deslocamento, dado por:
F =−f x (1.2)
O deslocamento,x, das massas da sua posição de equilíbrio,re, para algum valor, r,
é dado por:
x=r−re (1.3)
Se considerarmos as massas m1 e m2 representado átomos diferentes, eles
deveram atrair os elétrons constituintes da ligação em diferentes intensidades, assim a molécula terá um momento de dipolo permanente. Se as massas representarem átomos iguais, a molécula diatômica não terá momento dipolar. A Figura 1.3 representa a descrição clássica para a interação da radiação eletromagnética com
a molécula dipolar, onde o momento de dipolo é representado pelo vetor −→p.
O mecanismo de deslocamento de uma das massas em relação à outra acontece através do acoplamento do vetor campo elétrico da radiação incidente ao
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 7
Figura 1.3: Modelo clássico da interação da radiação eletromagnética com uma molécula diatômica. Quando o vetor campo elétrico, E , da radiação incidente se acoplar com o momento de dipolo, p, a molécula A-B vibrará e a energia da radiação incidente será absorvida pela molécula. Quando a molécula não possui momento de dipolo permanente (A-A) não haverá acoplamento elétrico nem absorção de energia.
for igual a frequência natural de vibração da molécula então o vetor campo elétrico, −
→
E, da radiação incidente irá se acoplar com o momento de dipolo, −→p, e induzir a
molécula A-B a vibrar. A energia da radiação incidente é absorvida pela molécula gerando uma banda de absorção do espectro. Se a molécula não possui momento de dipolo permanente (A-A) não haverá acoplamento elétrico nem absorção de energia. Sabendo isso, como determinar então as frequências naturais de oscilação? Se
considerarmos a força de restauração,−→F, da mola conforme a lei de Hooke, esta
força também é dada pela segunda lei de Newton e sua solução é bem conhecida
fornecendo uma frequência de equilíbrio, υe, para o oscilador harmônico simples:
νe =
1 2π
s
f
µ (1.4)
Onde:
1
µ =
1
m1
+ 1
m2
(1.5)
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 8
Figura 1.4: O modelo clássico de um rotor linear rígido ilustra as interações rotacionais
da molécula (A-B) com a radiação eletromagnética.
a interação elétrica também é possível entre a radiação eletromagnética e a mudança dipolar nas moléculas decorrentes das rotações. Uma observação importante a ser considerada é que rotações livres são possíveis normalmente apenas no estado gasoso enquanto vibrações ocorrem em todos os estados da matéria. Tomando novamente o modelo hipotético diatômico anterior, as observações agora são que esta molécula (A-B) não absorve em uma frequência na região vibracional, mas em uma série de linhas na região rotacional. Se considerarmos a molécula (A-A) é interessante observar que não haverá absorção da região rotacional. A Figura 1.4 descreve essas interações em termos rotacionais.
O modelo nos explica porque o momento de dipolo permanente necessário para haver interação, já que o momento de dipolo acopla-se com o vetor campo elétrico. Se não houver momento de dipolo não haverá acoplamento. Este argumento aplica-se igualmente a qualquer molécula poliatômica. Embora o espectro rotacional seja bem entendido, suas linhas discretizadas não possuem explicação em termos clássicos. Esta estrutura discretizada implica que a molécula pode rodar apenas em certas frequências discretas o que não é explicado pela teoria clássica. Essas linhas características são apenas um dos exemplos de inadequações da teoria clássica. Até o momento consideramos apenas as frequências de absorção dos processos vibracionais
e rotacionais envolvidos. A energia potencial vibracional, Ex, para uma molécula
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 9
Figura 1.5: Representação do perfil de energia de uma molécula diatômica como um
oscilador harmônico, onde a energia pelo deslocamento apresenta o perfil de uma parábola simétrica ao eixo Ex.
podendo ser escrita pela integral indefinida:
Ex =−
Z
F dx (1.6)
Se a molécula diatômica pode ser descrita como um oscilador harmônico, a lei de Hooke pode ser aplicada para todos os valores de deslocamento para resolver essa integral e seu gráfico de energia por deslocamento nos revelará uma parábola simétrica, como ilustrado na Figura 1.5.
Esta função sugere que se x aumentar indefinidamente, Ex também
aumentará indefinidamente. Porém, com considerações simples observamos que quando x alcança valores suficientemente altos, a ligação entre os átomos se rompe.
E quando x tender a zero a função sugere que Ex varie da mesma forma tanto
para valores positivos como negativos de x. Devemos observar então que para
valores negativos de x e para x tendendo a zero haverá intensa repulsão entre os
átomos constituintes da molécula e consequentemente, o valor de Ex irá aumentar
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 10
Figura 1.6: Níveis quantizados de energia.
consistente, como foi demonstrado anteriormente, durante o séculoXIX muitas delas
afirmavam que a matéria não poderia interagir com a energia que forma contínua,
como era suposto até o momento. Trabalhos subsequentes de Einstein, Planck
e Bohr indicaram de formas diferentes que a radiação eletromagnética poderia ser
considerada uma corrente de partículas ou quanta onde cada energia,ε, é dada pela
equação de Bohr:
ε =hυ (1.7)
Ondehé a constante de Planckdada por 6,6262x10−34Js e υ equivale à frequência
clássica. O trabalho pioneiro de Balmer ao observar as linhas monocromáticas
obtidas no espectro do hidrogênio estabeleceu a existência de níveis de energia neste átomo. Esta é a forma mais simples dos níveis eletrônicos de energia em átomos e moléculas. Nessa nova condição, os processos vibracional e rotacional junto com outros processos apresentados na Figura 1.1 podem ser representados em termos de
níveis de energia quantizados, E0, E1,E2, ... En como representado na Figura 1.6.
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 11
Figura 1.7: Diagrama representativo os níveis quânticos de energia vibracional (V) e
rotacional (J) de uma molécula diatômica como o CO.
exatamente ao gapE1−E0 ou E2−E1, etc e essa mesma energia está relacionada
com a energia descrita na equação 1.7. Assim, podemos afirmar que a frequência de
emissão ou absorção da radiação para uma transição entre os níveis de energiaE0 e
E1 será dada por:
υ = E1−E0
h (1.8)
Logo, a frequência de uma banda de absorção no espectro será a mesma frequência da banda de emissão se não houver decomposição ou outros processos de transferência de energia. Mecanismo esse que pode ser ilustrado pela Figura 1.6. A espectroscopia no infravermelho é consequência das mudanças de energia vibracionais e rotacionais como no diagrama da Figura 1.7, que apresenta os estados quânticos vibracionais e rotacionais de uma molécula diatômica qualquer.
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 12
Figura 1.8: Função energia potencial anarmônica apresenta níveis de energias definidos ao invés de contínuos.
fica o novo modelo de energia potencial. A função de energia potencial clássica descrita anteriormente tratava o sistema como um oscilador harmônico, entretanto vimos que este modelo não é realista. Uma nova expressão matemática foi proposta porMorse em 1929 e é ilustrada na Figura 1.8.
O oscilador passa a ser tratado como anarmônico com níveis de energia bem definidos e que podem ser descritos como:
Ev =hυe(V + 1/2)−xhυe(V + 1/2)
2
, x=hυe/4D (1.9)
Onde a energia é função do numero inteiroV (numero quântico vibracional),
υe é a frequência molecular de vibração e logo também é a frequência da radiação
eletromagnética que interage com a molécula e D é a profundidade do mínimo da curva ou energia de dissociação. É importante notar que os níveis de energia não são igualmente espaçados.
As moléculas absorverão energia quando esta for igual ao espaçamento entre dois níveis consecutivos. Pela regra de seleção, temos a condição de que a molécula
só pode absorver energia correspondente a hυ. Este valor corresponde a um pico
simples no espectro. Entretanto, também pode ocorrer o chamado overtone, onde
a absorção de energia equivalente a2hυ. No espectro, esta absorção é representada
por um pico com menor intensidade e localizado em um número de onda um pouco
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 13
aqui aplicadas para o espectro infravermelho do modelo mais simples: uma molécula diatômica.
As considerações para moléculas poliatômicas são maiores, mas ainda assim suficientes para descrevê-las. As moléculas poliatômicas são podem também serem vistas como um sistema de massas ligadas por molas com propriedades elásticas.
As posições de cada átomo podem ser descritas em função dos eixos X, Y e Z de
um plano cartesiano. Cada átomo tem então três graus de liberdade. Isto significa que ele pode executar movimento relativo a esses três eixos. E isto é conhecido como movimento translacional. Como as moléculas possuem muito mais átomos, logo terão muitos graus de liberdade. Mas como entender e determinar o número de graus de liberdade?
Se cada átomo possui três graus de liberdade, é cabível imaginar que uma molécula diatômica possua o dobro, ou seis graus de liberdade. Sendo assim, quais são esses graus? Tomando como exemplo a molécula H-Cl, três deles são os descritos como graus de liberdade translacional. Os outros três são provenientes dos graus de liberdade rotacional e vibracional. No caso de uma molécula linear, como o H-Cl, dois desses graus são rotacionais e o restante é vibracional, em virtude do movimento oposto dos dois átomos gerando o efeito de estiramento e compressão da ligação.
Ampliando essa análise para uma molécula poliatômica contendo N átomos, vamos distinguir dois grupos: linear e não linear. Ambas têm três graus de liberdade translacional. As moléculas poliatômicas lineares possuem dois graus de liberdade rotacional e as moléculas não lineares possuem três. Podemos exemplificar para
duas moléculas simples como CO2 e H2O na Tabela 1.1:
Tabela 1.1: Graus de liberdade para moléculas poliatômicas
Graus de liberdade CO2 (Linear) H2O (Não Linear)
Translacional 3 3
Rotacional 2 3
Vibracional 3N - 5 3N - 6
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 14
Figura 1.9: Ilustração dos modos vibracionais para uma moléculas triatômica não-linear.
Os itens i e ii correspondem a estiramentos simétricos e assimétricos respectivamente, enquanto o iii corresponde a uma flexão.
Desta forma, temos duas relações para calcular os graus de liberdade vibracionais de moléculas lineares e não lineares. Essas vibrações ocorrem apenas nos chamados modos normais de vibração, onde cada modo corresponde a um grau de liberdade e tem uma frequência característica de uma forma de vibração.
Esses modos normais de vibração envolvem os movimentos dos átomos onde cada átomo se move em fase com a mesma frequência, mas com diferentes amplitudes
e diferentes direções. Essas amplitudes e direções de cada átomo podem ser
representadas por um vetor deslocamento. E o deslocamento de todos os átomos em um determinado modo vibracional pode ser representado pela combinação linear dos deslocamentos.
Uma molécula diatômica possui apenas a conformação linear com um modo vibracional chamado de estiramento. Esses modos vibracionais podem ser entendidos pela ilustração da Figura 1.9, onde a molécula não linear triatômica possui três modos vibracionais; dois modos de estiramento e um de flexão.
1.2 - Instrumentação 15
Em muitos casos apenas uma interpretação parcial é necessária, por dois motivos:
1. Certos grupos químicos possuem massas diferentes dos seus grupos adjacentes, com frequências características ou números de onda vibracionais específicos que podem ser comparados com tabelas ou espectros de referência, no intervalo de
1500-4000 cm−1
.
2. O intervalo restante, em torno de 50-1500 cm−1
, está correlacionado a
impressão digital da amostra. Este intervalo se deve ao acoplamento
vibracional da molécula como um todo, tornando-o único para cada molécula.
Assim, a complexidade do espectro de infravermelho pode ser teorizado através dos conceitos quânticos. Vamos compreender então como é constituída a instrumentação para obter tal espectro.
1.2
Instrumentação
Os primeiros espectrômetros eram chamados de dispersivos e possuíam prismas ou grades de difração da luz. A grade de difração possuía a vantagem de ter resolução alta e um grande intervalo de frequências, porém os prismas permitiam a passagem de mais energia. Entretanto, qualquer que fosse o método usado, haveria uma grande limitação do equipamento em termos energéticos, obtendo espectros com pouca resolução e com um limitado intervalo de números de onda.
1.2.1 Interferômetro de Michelson
No final do séculoXIX,Michelsonfez uma das mais importantes descobertas
óticas: o interferômetro que recebeu seu próprio nome. O sistema ótico está apresentado na Figura 1.10:
1.3 - Trasformada de Fourier no Infravermelho - FTIR 16
Figura 1.10: Ilustração do interferômetro de Michelson. A fonte S emite o feixe de
radiação que é dividido, metade é transmitido para o espelho móvel e a outra metade para o espelho fixo. Ambos os feixes são refletidos e então transmitidos para o detector.
Quando a posição do espelho móvel gerar dois feixes viajando com distâncias iguais até o detector, D, um forte sinal será obtido. Conforme o espelho móvel se movimenta em relação a sua posição central, a distância entre os feixes varia, e um
sinal de interferência é registrado pelo detector. Michelson notou que este padrão
de interferência possuía informações espectrais.
O desenvolvimento da técnica para registro do padrão de interferência através
do movimento do espelho por uma distância δ/2 produz uma diferença total de
caminho δ. O padrão de interferência é apresentado na Figura 1.11 para uma fonte
de radiação monocromática (i) e para uma fonte policromática (ii) de radiação. O primeiro é uma função cosseno simples enquanto o segundo possui uma forma mais complicada por conter toda a informação espectral da radiação que chegou ao detector.
1.3
Trasformada de
Fourier
no Infravermelho
-FTIR
A matemática para conversão do padrão de interferência em um espectro
possuiu equações que relacionam a intensidade que chega ao detector, I(δ) e a
1.3 - Trasformada de Fourier no Infravermelho - FTIR 17
Figura 1.11: Ilustração do interferograma uma fonte de radiação monocromática (i) e
policromática (ii).
dado por:
I(δ) = Z +∞
0
B(υ) cos(2πυδ).dυ (1.10)
Essa relação corresponde apenas à metade do par cosseno da transformada de Fourier, sendo a outra:
B(υ) = Z +∞
−∞
I(δ) cos(2πυδ).dδ (1.11)
As equações 1.10 e 1.11 são intermutáveis e conhecidas como par transformada de Fourier. A primeira demonstra a variação da densidade espectral de potência em função da diferença de caminho que é o padrão de interferência. A segunda demonstra a variação da intensidade em função da diferença de caminho que é o espectro. Uma podendo ser convertida na outra através da transformada de Fourier.
O experimento para obter um espectro de FTIR consiste em obter dois interferogramas; um com a amostra e outro sem a amostra no detector e transformar
ambos os interferogramas em espectros. A razão do primeiro pelo segundo
corresponde ao espectro de dispersão conhecido até então.
1.4 - Reflexão Total Atenuada - ATR 18
Figura 1.12: Ilustração esquemática do aparelho de FTIR. A fonte S emite o feixe de
radiação, este passa pelo interferômetro de Michelson, pela amostra e pelo detector. O
interferograma obtido é transformado no espectro de absorção através da transforamada deFourier.
de Fourier. Isto combinado com o avanço dos computadores ofereceram diversas
outras vantagens e consolidaram a transformada de Fourier como um método
largamente aplicado. A capacidade de medir todos os comprimentos de onda simultaneamente no interferômetro reduz o tempo de medida, tornando possível coletar vários espectros, diminuindo a relação sinal-ruído.
O método de FTIR ultrapassou as limitações até então encontradas, promovendo medidas rápidas. Sua composição está ilustrada na Figura 1.12:
O feixe de radiação após passar pelo interferômetro deMichelson atravessa
a amostra. O feixe transmitido incide sobre o detector e o espectro de absorção
é obtido a partir da transformada de Fourier do interferograma resultante. Nos
aparelhos modernos de FTIR, um laser He-Ne é usado para fornecer uma referência interna para a escala de frequência de cada interferograma, tendo assim um espectro estável.
1.4
Reflexão Total Atenuada - ATR
1.4 - Reflexão Total Atenuada - ATR 19
Figura 1.13: Ilustração da técnica ATR. O feixe de radiação atravessa o cristal até a
interface cristal-amostra, onde ocorre a reflexão interna total.
para análise no infravermelho foram desenvolvidos. Dentre eles, existem técnicas de reflexão como: Reflexão Especular e Reflexão Totalmente Atenuada (ATR). Aqui vamos tratar com mais detalhe do ATR.
Quando a radiação eletromagnética, ou no caso, a radiação infravermelha se propaga em um meio com alto índice de refração até o limite com outro material com baixo índice de refração, existe um ângulo de incidência onde ocorre a reflexão interna total, que deve ser maior do que o ângulo crítico dado por:
θc =sen
−1
(n1
n2
) (1.12)
onde n1 e n2 representam as índices de refração do ATR e da amostra
respectivamente.
A radiação reflete e absorve na interface várias vezes e em seguida é quantificada por um detector. Nesse ponto o feixe atua como se penetrasse uma pequena distância dentro da amostra. A radiação penetrante é chamada onda evanescente.
1.5 - Processamentos Matemáticos 20
Essa técnica também pode ser usada para análise de amostras líquidas ou emulsões, reduzindo o tempo de preparo das amostras [6].
Os espectros de reflectância total atenuada são semelhantes mas não iguais aos espectros comuns de absorção. Em geral, os mesmo picos são observados, porém suas intensidades relativas diferem. As absorbâncias dependem do ângulo de incidência, mas são independentes da espessura da amostra, uma vez que a radiação penetra apenas alguns micrômetros na mesma.
Entre as grandes vantagens do ATR está a rapidez com que os espectros são obtidos e a variedade de amostras possíveis.
1.5
Processamentos Matemáticos
Diversos processamentos matemáticos podem ser aplicados para análise
do espectro de absorção. O uso de cada processamento depende quase que
exclusivamente da quantidade de espectros e do objetivo da análise.
Trataremos aqui de quatro processamentos diferentes: o deslocamento de pico, as razões entre áreas, a análise de componentes principais e a análise por agrupamento. Essas duas últimas fazem parte do grupo de análise chamado de multivariada, onde muitas variáveis são medidas simultaneamente em cada elemento amostral.
1.5.1 Deslocamento de pico
O espectro de absorção pode ser descrito como um gráfico da absorbância pelo número de onda da radiação infravermelha. As bandas de absorção representam
sopreposições que não podem ser observadas individualmente [8]. Amostras
biológicas possuem bandas complexas e sua análise exige o emprego de métodos para aumento da resolução, em outras palavras, esses métodos para separação dos picos que compõem cada banda.
A derivação do sinal é uma das metodologias empregadas para a separação dos picos. O sinal de FTIR é digital e com resolução finita sendo a sua derivada de
segunda ordem a mais utilizada com o algoritmo Savitzky-Golay [9]. Na derivada
1.5 - Processamentos Matemáticos 21
Figura 1.14: Exemplo da derivada de segunda ordem do espectro de absorção no intervalo
de 910-1178 cm−1. Na parte inferior do gráfico está o espectro de absorção e na parte
superior sua segunda derivada. É possível observar que cada ponto de mínimo da derivada segunda ordem corresponde a um pico de absorbância do espectro.
absorbância do espectro, como pode ser observado na Figura 1.14.
O exemplo acima ilustra a derivada como método de separação dos picos de absorção. Da mesma maneira, este método pode ser empregado forma comparativa entre dois grupos de interesse para verificar o deslocamento do pico de absorção. Este deslocamento indica alterações na estrutura ou ligação em questão.
1.5.2 Razões entre as áreas
Cada banda do espectro de absorção pode ser analisada individualmente em função da sua posição, largura à meia altura e área. Dentre estes parâmetros, a área pode ser empregada para determinar a concentração ou composto a que a banda se refere. Assim, tomados dois grupos, a área de uma ou mais bandas pode ser o parâmetro de comparação entre elas.
