"JULIO DE MESQUITA FILHO"
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
DINÂMICA DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS EM VARIEDADES DE
Casearia sylvestris E ESTUDOS INICIAIS DE BIOLOGIA MOLECULAR
RELACIONADOS AOS GENES DAS ENZIMAS GGPP SINTASE E
CHIQUIMATO DESIDROGENASE (DHS)
LIVIA DE LIMA THOMAZ
ORIENTADOR: Prof. Dr. Alberto José Cavalheiro
CO-ORIENTADORA: Prof. Dr. Márcia Aparecida Silva Graminha
ARARAQUARA - SP
"JULIO DE MESQUITA FILHO"
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
DINÂMICA DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS EM VARIEDADES DE
Casearia sylvestris E ESTUDOS INICIAIS DE BIOLOGIA MOLECULAR
RELACIONADOS AOS GENES DAS ENZIMAS GGPP SINTASE E
CHIQUIMATO DESIDROGENASE (DHS)
LIVIA DE LIMA THOMAZ
ORIENTADOR: Prof. Dr. Alberto José Cavalheiro
CO-ORIENTADORA: Prof. Dr. Márcia Aparecida Silva Graminha
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista para obtenção do grau de Farmacêutica-Bioquímica.
ARARAQUARA - SP
À Deus, pois, sɟm Ele, ɟu nãɨ teria forças pɚrɚ essa longa jornada.
À minha família, pɨr acreditar ɟ investir ɟm mim,
me dando suporte para finalizar mais essa etapa da minha vida com sucesso.
Primeiramente, agradeço a Deus por ter me dado força e proteção durante todos os anos de
minha vida.
À minha família pelo apoio e incentivo em todos os momentos que precisei.
Ao meu amor, Ramon Fachini, por estar sempre ao meu lado, me apoiando e ajudando em
todas as ocasiões, tanto boas quanto difíceis e por todo carinho que me foi dado.
Ao meu orientador, Alberto José Cavalheiro, por acreditar na minha capacidade e me
incentivar durante todo o trabalho.
À minha co-orientadora, Márcia Aparecida Silva, também pelo incentivo e por todos os
ensinamentos.
Aos companheiros de laboratório e trabalho, Paula Pires, Isabel Duarte Coutinho,
Alexander Alves, Gabriel Mazzi Leme e Laís Simões pelo auxílio na realização dos experimentos
e conhecimento compartilhado.
Aos colegas da faculdade pela contribuição para a realização deste trabalho.
À Graduação da Unesp, em especial, agradeço ao Alexandre, por toda ajuda e paciência.
À FAPESP pelo apoio financeiro e por acreditar no projeto proposto.
Este trabalho de conclusão de curso refere-se ao projeto de pesquisa “Dinâmica de
metabólitos em variedades de Casearia sylvestris e estudos iniciais de biologia molecular
relacionados aos genes das enzimas GGPP sintase e chiquimato desidrogenase (SDH)”, e apresenta
as atividades desenvolvidas no período de agosto de 2012 a maio de 2014. Foram realizadas coletas
mensais de folhas de Casearia sylvestris variedade Sylvestris e Lingua para análise circadiana e
sazonal, utilizando método de cromatografia líquida. Além disso, foram feitos ensaios para
verificar compostos voláteis nos meses de floração através da cromatografia gasosa. Os resultados
obtidos demonstraram predomínio de compostos diterpênicos na variedade Sylvestris e de
compostos fenólicos na variedade Lingua. A partir desses dados, foram selecionadas as amostras
obtidas nos meses de fevereiro e abril para os experimentos de analise diferencial de SDH e GGPP
sintases, uma vez que entre esses meses foram observadas as diferenças mais marcantes nos teores
de fenólicos e diterpenos. Para fevereiro verificaram-se os maiores teores para fenólicos e
diterpenos, nas duas variedades, enquanto os menores teores, também para fenólicos e diterpenos,
foram observados no mês de abril. As análises dos compostos voláteis emitidos por folhas de C.
sylvestris indicam presença de sesquiterpenos em ambas as variedades e, também, de
2-trans-hexenal, 3-hexen-1-ol, (E) 2-hexen-1-ol, heptan-2-ol, α-Copaeno e ȕ-bourboneno na variedade
Sylvestris. Na amplificação dos genes referentes às enzimas GGPP sintase e SDH não foram
obtidos resultados conclusivos, apenas a PCR realizada com a enzima Phusion para o gene da
enzima SDH da variedade Lingua de C. sylvestris mostrou o aparecimento de bandas no gel de
TABELA 1. Composição de óleos essenciais de folhas de Casearia sylvestris, em porcentagem
normalizada. ... 16
TABELA 2. Composição do mix para PCR ... 37
TABELA 3. Ciclo de amplificação – PCR com enzima Platinum®Taq Polimerase ... 38
TABELA 4. Preparo do mix para PCR com enzima Phusion Teste 1 ... 38
TABELA 5. Ciclo de amplificação – PCR com enzima Phusion Teste 1 ... 39
TABELA 6. Preparo do mix para PCR com enzima Phusion Teste 2 ... 39
TABELA 7. Ciclo de amplificação - PCR com enzima Phusion Teste 2 ... 40
TABELA 8. Preparo do mix para PCR com enzima Pfu ... 40
TABELA 9. Ciclo de amplificação - PCR com enzima Pfu ... 41
TABELA 10. Composição do mix para PCR com enzima AmpliTaq ... 41
TABELA 11. Ciclo de amplificação - PCR com enzima AmpliTaq ... 42
TABELA 12. Índices de retenção encontrados na literatura e índices de retenção calculados para as substâncias identificadas no espectro de massas. ... 57
TABELA 13. Quantificação do DNA extraído. ... 63
TABELA 14. Proposta de identificação para mês de janeiro. ... 72
TABELA 15. Proposta de identificação para mês de fevereiro. ... 73
TABELA 16. Proposta de identificação para mês de março. ... 74
TABELA 17. Proposta de identificação para mês de abril. ... 75
TABELA 18. Proposta de identificação para mês de maio para a variedade Sylvestris. ... 76
TABELA 19. Proposta de identificação para mês de maio para a variedade Lingua. ... 77
TABELA 20. Proposta de identificação para mês de junho para a variedade Sylvestris. ... 78
TABELA 21. Proposta de identificação para mês de junho para a variedade Lingua. ... 79
TABELA 22. Proposta de identificação para mês de julho para a variedade Sylvestris. ... 80
TABELA 23. Proposta de identificação para mês de julho para a variedade Lingua. ... 81
TABELA 24. Proposta de identificação para mês de agosto. ... 82
TABELA 25. Proposta de identificação para mês de setembro. ... 83
TABELA 26. Proposta de identificação para mês de outubro. ... 84
TABELA 27. Proposta de identificação para mês de novembro. ... 85
FIGURA 1. Esquema do relógio circadiano. ... 12
FIGURA 2. Esquema simplificado das principais vias biossintéticas relacionadas à formação de sesquiterpenos, diterpenos e derivados de ácido gálico, com indicação das etapas em que as enzimas GGPP sintase (*) e SDH (**) atuam. ... 18
FIGURA 3. Grupo de filogenia das Angiospermas (APG III). ... 19
FIGURA 4. Distribuição filogenética de plantas terrestres de taxas e sucesso da PCR dos locos apresentados. ... 21
FIGURA 5. Análise circadiana da C. sylvestris (dia 1 e dia 2)... 46
FIGURA 6. Variação circadiana de fenólicos totais e diterpenos totais a cada mês. Cada ponto indica a média de 2 dias em um horário específico ... 49
FIGURA 7. Perfil cromatográfico de ambas as variedades ao longo de um ano. ... 51
FIGURA 8. Cromatogramas dos métodos de preparo da amostra ... 52
FIGURA 9. Cromatogramas dos testes feitos com as fibras para HS-SPME ... 53
FIGURA 10. Expansão dos cromatogramas de 0 - 40 minutos das fibras car/pdms 0,75 µm e 0,85 µm. 55 FIGURA 11. Cromatogramas dos voláteis de folhas de C. sylvestris variedade Lingua, obtidos para dias 1 e 2, em julho, às 9 horas. ... 55
FIGURA 12. Cromatogramas dos voláteis de folhas de C. sylvestris variedade Sylvestris, obtidos para dias 1 e 2, em julho, às 9 horas. ... 56
FIGURA 13. Cromatogramas representativos da variedade Lingua. ... 58
FIGURA 14. Cromatogramas representativos da variedade Sylvestris. ... 58
FIGURA 15. Sesquiterpenos e outros compostos identificados. ... 59
FIGURA 16. Alinhamento e região dos primers GGPP. ... 61
FIGURA 17. Alinhamento e região dos primers SDH. ... 62
FIGURA 18. Fotocópia do resultado da amplificação utilizando enzima Phusion e 48 ºC como temperatura de anelamento. ... 64
GRÁFICO 1. Teor de água nas folhas de C. sylvestris ... 43
GRAFICO 2. Umidade do ar (acima) e temperatura (abaixo) no período de 24 horas. ... 44
GRÁFICO 3. Variação sazonal de fenólicos totais nas variedades de C. sylvestris. Cada caixa
contém os valores observados nos dois dias de amostragem de cada mês. ... 50
GRÁFICO 4. Análise Variação sazonal de diterpenos totais nas variedades de C. sylvestris. Cada
1 INTRODUÇÃO ... 11
2COLETA DAS FOLHAS ... 23
3ANÁLISES FITOQUÍMICAS ... 24
3.1 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ... 24
3.2 MÉTODOS ... 26
3.2.1Metodologia de análise das amostras de Casearia sylvestris var. Sylvestris e Língua por UPLC-DAD ... 26
3.2.1.1 Desidratação das folhas ... 26
3.2.1.2 Preparo do solvente extrator ... 27
3.2.1.3 Extração da amostra ... 27
3.2.1.4 Análise cromatográfica ... 27
3.2.1.5 Forma de análise dos resultados ... 28
3.2.2Metodologia para análise das amostras de Casearia sylvestris variedades Sylvestris e Língua por CG-FID ... 29
3.2.2.1 Testes para definição do modo de preparo das amostras e fibra a ser utilizada para micro extração em fase sólida para as análises por CG-FID ... 30
3.2.2.2 Método definitivo de análise por CG ... 31
4ESTUDOS DE BIOLOGIA MOLECULAR... 32
4.1 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ... 32
4.2.2 Desenhos dos primers GGPP sintase e SDH ... 34
4.2.2.1 Primer GGPP sintase ... 34
4.2.2.2 Primer SDH ... 34
4.2.2.3 Primers GGPP sintase e SDH ... 34
4.2.3 Preparo da solução tampão brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) ... 34
4.2.4 Preparo da solução de clorofórmio / álcool isoamílico 24:1 e solução de Etanol 70% 35 4.2.5 Análises em gel de agarose 1% ... 35
4.2.6 Extrações de DNA ... 35
4.2.7 Preparo dos primers GGPP e SDH ... 36
4.2.8 Reações em cadeia da polimerase (PCR) ... 37
5RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 43
5.1 ANÁLISES DO TEOR DE ÁGUA E DOS DADOS DE TEMPERATURA E UMIDADE RELATIVA... 43
5.2 VARIAÇÃO CIRCADIANA E SAZONAL DE FENÓLICOS E DITERPENOS ... 45
5.3 ANÁLISES CROMATOGRÁFICA DE COMPOSTOS VOLÁTEIS DAS VARIEDADES ESTUDADAS ... 52
5.4 ESTUDOS DE BIOLOGIA MOLECULAR ... 60
5.4.1 Desenhos do primer GGPP ... 60
5.4.2 Desenhos do primer SDH ... 61
6CONCLUSÃO ... 65
7REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA ... 66
APÊNDICE A ... 71
1 INTRODUÇÃO
O ritmo circadiano das plantas corresponde ao subconjunto dos ritmos biológicos durante
o período de 24 horas, ou seja, um ciclo (THE PLANT CELL, 2006 apud DUNLAP et al., 2004).
O relógio circadiano define a temporização de vários eventos transcricionais e pós-transcricionais
específicos para momentos do dia (KINMONTH-SCHULTZ et al., 2013), sendo vital para o
controle de várias atividades fisiológicas (KONDO e ISHIURA, 1999). Os seus componentes não
são conservados entre os reinos, sugerindo que os relógios devem ter evoluído independentemente
em várias ocasiões (GARDNER et al., 2006). A temporização do relógio com saídas adequadas
para o ambiente externo permite a antecipação das transições ambientais e a fase apropriada de
fisiologia e metabolismo, aumentando assim o bom estado e a sobrevivência da planta (MÁS e
YANOVISKY, 2009).
O relógio circadiano é constituído por vias de entrada de um oscilador de arrastamento do
núcleo que gera saídas rítmicas (GARDNER et al., 2006). As vias de entrada fazem o arrastamento
de sinais ambientais, tais como a luz e a temperatura, necessitando de mecanismos de transdução
destes sinais para o oscilador principal. Um oscilador de núcleo que gera ritmos circadianos e as
vias de saída rítmica são acopladas ao oscilador circadiano por meio de vias de transdução. As vias
de saída são por vezes definidas como processos que não são essenciais para o oscilador manter o
núcleo de oscilações circadianas, mas que podem influenciar as propriedades dos ritmos. Além
disso, as vias de entrada também podem influenciar as propriedades de ritmos circadianos,
incluindo período, fase e amplitude (MICALLEF, 2011). A Figura 1 ilustra um esquema
FIGURA 1. Esquema do relógio circadiano.
Fonte: Adaptado de Gardner et al., 2006
Para determinar se um dado processo é regulado pelo relógio endógeno, três características
devem ser observadas: a primeira é a persistência de condições ambientais constantes; a segunda
é o oscilador estar em ressonância com um ciclo ambiental, estabelecendo com ele uma relação de
fase estável e, assim, seu período torna-se igual ao do ciclo ambiental; e, por fim, o período do
ritmo endógeno deve apresentar compensação à temperatura (SALLES e BUCKERIDGE, 2012).
A importância do ritmo circadiano para plantas pode ser medida pelo fato de que diversos
aspectos do desenvolvimento estão sob seu controle (BARAK et al., 2000). O ciclo controla a
expressão genética, a abertura dos estômatos e o componente de tempo de fotoperíodo, que regula
a reprodução sazonal, mas a base de sua contribuição para a aptidão durante o crescimento
vegetativo permanece indeterminada (DOBB, 2005). A regulação circadiana de muitos aspectos
do metabolismo da planta é observada, incluindo a fotossíntese, o metabolismo do amido, a
assimilação de nutrientes e o metabolismo secundário (HAYDON et al., 2013).
A base molecular da oscilação circadiana é fundamentada em alças de retroalimentação,
sendo que em plantas há uma alça central que gera o ritmo e duas alças de regulação fina, contendo
elementos negativos e positivos, abrangendo transcrição e tradução gênicas (KONDO E
ISHIURA, 1999; SALLES E BUCKERIDGE, 2012; MICALLEF, 2011; HARMER, 2009).
A expressão genética pode ser controlada ao nível do DNA, RNA ou proteína. No núcleo,
os fatores de transcrição se ligam a sequências de DNA, a RNA polimerase II é recrutada para
capeamento da extremidade 5’, splicing, poliadenilação da extremidade 3'. Os transcritos são
enviados ao citoplasma para a tradução em proteínas. Esse mecanismo controla, pelo menos em
parte, a organização temporal dos resultados metabólicos e atividades de desenvolvimento. No
sistema circadiano, o momento da transcrição é um importante regulador das oscilações, pois se
sabe que genes marca-passo codificam fatores de transcrição ou proteínas que funcionam de
alguma forma na regulação dos genes. Assim, genes marca-passo são essenciais para criação e
manutenção de ritmos sob condições constantes, sendo que sua inativação geralmente leva a perda
do ritmo ou a um maior ou menor período, reforçando a ideia de que os ritmos baseiam-se
principalmente em loops de feedback de transcrição e na ativação ou repressão da expressão
gênica. O estudo da expressão de todo o genoma ampliou a quantidade de atividades controladas
pelo relógio, mostrando que ritmos moleculares são subjacentes a oscilações fisiológicas
(CERMAKIAN, N. e SASSONE-CORSI, 2000; YANOVSKY e KAY, 2001; STAIGER e
GREEN, 2011).
Em plantas, metabólitos secundários são um grupo de compostos biossintetizados por
diferentes vias bioquímicas cujo conteúdo e regulação são fortemente suscetíveis às influências
ambientais e potenciais predadores de ervas naturais (PAVARINI, 2012).
A produção desses compostos pode sofrer modificações de acordo com a interação de
processos bioquímicos, fisiológicos, ecológicos e evolutivos que dependem das condições
ambientais (GOBBO-NETO e LOPES, 2007). Dentre os diversos fatores que controlam a síntese
dos metabólitos secundários, dois efeitos distintos podem ser determinados, o abiótico e o biótico.
Efeitos abióticos incluem todos os efeitos físicos do habitat. Já os efeitos bióticos estão
relacionados tanto às interações de plantas com micro-organismos ou aspectos fisiológicos da
dos principais fatores relacionados com os efeitos abióticos e que coordenam ou alteram o
conteúdo desses metabólitos são:
• Sazonalidade - diferentes classes de metabólitos secundários são produzidas em diferentes
épocas. O conteúdo de óleos essenciais, ácidos fenólicos, alcalóides, taninos, entre outros
são exemplos de compostos que sofrem influência das variações sazonais;
• Temperatura – é um fator importante no desenvolvimento, estando diretamente envolvido
com a produção dos metabólitos secundários. Baixas temperaturas, por exemplo,
promovem aumento no conteúdo de alguns metabólitos secundários. Altas temperaturas
parecem aumentar a formação de óleos essenciais;
• Umidade – o índice pluviométrico pode influenciar tanto positivamente quanto
negativamente na produção de metabólitos secundários. O estresse hídrico e a continuidade
da chuva também se correlacionam com a síntese desses compostos;
• Radiação Ultravioleta – as plantas estão adaptadas a variações na quantidade e intensidade
da radiação solar. Compostos fenólicos, por exemplo, são positivamente correlacionados
com a intensidade luminosa. A concentração de terpenóides, glicosídeos cianogênicos e
alcalóides também são influenciados pela radiação ultravioleta.
Compostos orgânicos voláteis biogênicos são um conjunto de compostos voláteis, por
exemplo isoprenos, monoterpenos e sesquiterpenos, que representam aproximadamente 20% do
carbono lançado na atmosfera (ZAGARI, 2002). Os isoprenóides sofrem influência de fatores
ambientais como a seca e a temperatura. A consequência da emissão desses compostos em relação
à seca varia de acordo com a duração em que este fenômeno ocorre, havendo uma diminuição
acentuada em períodos de seca prolongada. Temperaturas elevadas, por apenas alguns minutos,
temperaturas resulta em diminuição de tais metabólitos (NIINEMETES et al., 2010). Um estudo
feito com óleo essencial de partes aéreas de Santolina rosmarinifolia mostrou, no entanto, que
alguns compostos são influenciados pela temperatura e pela precipitação, porém outros não sofrem
variações de acordo com as condições climáticas, necessitando de estudos mais aprofundados para
entender todas as variáveis envolvidas na produção dos metabólitos do óleo essencial
(PALÁ-PAÚL et al., 2001).
As espécies de Casearia possuem diterpernos clerodânicos altamente oxigenados
distribuídos nos vários órgãos da planta. Esses compostos, que apresentam insaturações e, na
maioria das vezes, hidroxilas esterificadas, constituem marcadores taxonômicos de Casearia
(CARVALHO et al., 1998; SANTOS et al., 2007; CARVALHO et al., 2009; WANG et al., 2009).
Além desses compostos, relata-se também a ocorrência de diterpenos clerodânicos mais simples
(SANTOS et al, 2007).
Foram também descritos sesquiterpenos obtidos de folhas de C. sylvestris. Segundo Tininis
et al. (2006), a constituição do óleo essencial das folhas pode sofrer alterações ao longo do dia.
Cavallari (2008) descreve que há indicativos do predomínio de diterpenos clerodânicos na
Casearia sylvestris variedade sylvestris, enquanto na variedade língua haveria maior teor de
compostos fenólicos.
Os estudos já publicados sobre óleo essencial da Casearia sylvestris indicam constituição
variada de compostos voláteis (Tabela 1). Nos relatos de Schenider e Sousa (2007) foi verificada
a predominância de biciclogermacreno e cariofilenos. Esteves (2005) indica que os principais
constituintes do óleo são biciclogermacreno, ȕ-acoradieno, cariofileno e espatulenol, enquanto
Tininis encontrou predomínio de germacrenos no óleo de folhas de C. sylvestris. Foi verificada a
manhã e da tarde foram comparadas, sendo a diferença supostamente atribuída a rearranjos no
esqueleto carbônico induzidos pela luz.
TABELA 1. Composição de óleos essenciais de folhas de Casearia sylvestris, em porcentagem normalizada.
(continua)
2SCHNEIDER et al., 2006; 3SOUSA et al., 2007ª; 4ESTEVES et al., 2005; 5TITINISet al., 2006. 6valores em itálico
TABELA 1. Composição de óleos essenciais de folhas de Casearia sylvestris, em porcentagem normalizada.
(Conclusão)
2SCHNEIDER et al., 2006; 3SOUSA et al., 2007ª; 4ESTEVES et al., 2005; 5TITINISet al., 2006. 6valores em
itálico referem-se a folhas coletadas no período da manhã e valores entre parênteses são referentes a análises feitas em folhas coletadas à tarde, no mesmo indivíduo.
O geranilgeranil pirofosfato (GGPP) é um precursor essencial para a biossíntese de
diterpenos. A enzima GGPP sintase catalisa a reação de condensação do pirofosfato de farnesila
(FPP) com o pirofosfato de isopentenila para produzir GGPP, sendo considerada uma importante
enzima do ponto de ramificação na biossíntese de terpenóides (MAYNOR et al., 2008).
A enzima chiquimato desidrogenase (SDH) é responsável pela catálise,
NADP-dependente, do quarto passo na biossíntese do chiquimato, que é essencial para o metabolismo do
ácido aromático em plantas. A SDH representa uma classe distinta de enzimas que não têm
semelhança de sequência primária com outras classes de desidrogenases. Em plantas superiores, a
SDH é parte de uma enzima bifuncional, que catalisa o terceiro e quarto passos da via do
chiquimato (PADYANA e BURLEY, 2003).
A figura 2 ilustra a etapa catalisada pelas enzimas geranilgeranil pirofosfato sintase e
*
*
FIGURA 2. Esquema simplificado das principais vias biossintéticas relacionadas à formação de sesquiterpenos,
diterpenos e derivados de ácido gálico, com indicação das etapas em que as enzimas GGPP sintase (*) e SDH (**) atuam.
Fonte: Autoria própria
Na esfera da genética, estudos indicam a existência de diferenças significativas entre as
duas variedades de Casearia sylvestris (CAVALLARI M. M., et al., 2010). Entretanto, não há
relatos na literatura que caracterizem os genes que codificam para as enzimas geranilgeranil
pirofosfato desidrogenase sintase e chiquimato desidrogenase para essa planta.
Para estudos de biologia molecular em plantas superiores, a classificação taxonômica
proposta denominada por Grupo de Filogenia das Angiospermas (APG) é usualmente utilizada. O
APG foi criado em 1998 e atualmente encontra-se disponível a terceira classificação, feita em 2009
(APG III), que considera apenas famílias e ordens vegetais. Casearia sylvestris, por exemplo,
pertence à família Salicaceae e à ordem Malpighiales, sendo facilmente localizada na classificação
com tais informações. Esse sistema de classificação se baseia, principalmente, na sequência dos CO2H OH
HO Ácido mevalônico SCoA O Acetil-CoA Policetídeos Giberelinas CDP GGPP GPP Carotenóides Diterpenos Clorofitas Tocoferóis Monoterpenos OPP DMAPP IPP OP OH OH OH OP OH O OH Desoxi-xilulose
HC2O O
Ácido pirúvico FPP Esqualeno Sesquiterpenos Esteróides Triterpenos OPP
Metileritritol – 4P CO2 + H2O O OH OH OH OP OH Glicólise Glicose 6-P OHC PO OH Gliceraldeído 3-P Glicólise
HC2O OP
Fosfoenolpiruvato PO O OH OH Eritrose 4-P hv
Ciclo Pentose Fosfato
COOH O OH OH Ácido 3-desidroshiquimico (3-OHS)
CO2H NH2
CO2H
genes rbcl e atpB, sendo que o primeiro gene codifica a maior subunidade da enzima rubisco e o
segundo codifica a subunidade beta da enzima ATP sintase ribossomal (CHASE M.W. e
REVEAL, J.L., 2009; ANGIOSPERMAS WEBSITE FILOGENIA). A figura 3 ilustra a
classificação proposta no APG III.
FIGURA 3. Grupo de filogenia das Angiospermas (APG III).
Fonte: ANGIOSPERMAS WEBSITE FILOGENIA. Disponível em:
Atualmente, os códigos de barras de DNA (DNA barcodes) propostos para plantas incluem
matK e rbcl. Códigos de barras consistem em sequências curtas de DNA, contendo entre 400 e 800
pares de bases, que podem ser amplificados por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e
sequenciados. Para serem considerados ideais, os códigos de barras devem permitir
sequenciamento bidirecional, ser facilmente recuperáveis com um único par de primers e fornecer
discriminação máxima entre as espécies. Individualmente, rbcL e matK possuem atributos que são
altamente desejáveis em um sistema de DNA barcoding vegetal, entretanto nenhum dos 2 loci
atende aos critérios citados. Contudo, o rbcl apresenta alta universalidade e bom poder de
discriminação, sendo amplamente utilizada no estudo de plantas. Para estudos de biologia
molecular da Casearia sylvestris, pode-se fazer uso do rbcl como fragmento para exploração do
DNA da planta, pois estudos demonstram sucesso em reações de PCR (ALI et al, 2014;
BHARGAVA e SHARMA, 2013; CBOL Plant Working Group, 2009; KRESS, W.J e
FIGURA 4. Distribuição filogenética de plantas terrestres de taxas e sucesso da PCR dos locos apresentados.
Fonte: KRESS e ERICKSON, 2007; doi:10.1371/journal.pone.0000508.g001
A caracterização dos genes que codificam as enzimas GGPP sintase e SDH pode ser
realizada utilizando PCR em tempo real (PCR-RT) e sequenciamento do DNA. Avanços na
extração de DNA e em técnicas de quantificação permitiram que baixas quantidades de DNA
atualmente a ferramenta de elite para a detecção específica e quantificação precisa de DNA
endógeno ou transgênico. Nessa técnica, o DNA amplificado é quantificado por meio da
incorporação de fluoróforos durante o anelamento e a extensão. A fluorescência tem a forma de
uma curva formada conforme se esgota a Taq polimerase ou os componentes consumiveis da
reação. A automação foi um grande avanço no campo do sequenciamento do DNA,
proporcionando aumento na facilidade, na confiabilidade e na relação custo-eficácia. (GULDEN.
et al., 2007; SAVAZZINI e MARTINELLI, 2006; SINGH, et al., 2012).
Neste contexto, no presente trabalho, os objetivos pretendidos foram realizar estudos de
dinâmica metabólica (circadiana e sazonal) em terpenos e derivados de ácido gálico, utilizando
para isso uma árvore de C. sylvestris var. Língua e outra da var. Sylvestris, visando à caracterização
detalhada da produção desses metabólitos pelo vegetal. Adicionalmente, foram realizados estudos
preliminares de biologia molecular com o objetivo de iniciar a caracterização de genes
2 COLETA DAS FOLHAS
As árvores de C. sylvestris das variedades Língua e Sylvestris utilizadas para amostragem
localizam-se no Clube ASCAR, Estrada Abilio Augusto Correia n. 200, Bairro dos Machados,
Araraquara/SP, sendo a distância entre os indivíduos amostrados de cerca de 50 metros. As coletas
foram iniciadas no mês de agosto de 2012 e, a partir de então, mensalmente, cerca de 10 gramas
de folhas das variedades Língua e Sylvestris foram amostradas num período de 48 horas com
coletas a cada 3 horas.
Após a coleta, as folhas foram limpas e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido,
sendo mantidas em freezer -86°C até o preparo das amostras.
Os dados de temperatura e umidade foram monitorados com o uso de um termo higrômetro
e dados mais detalhados foram obtidos em parceria com Michele Souza, aluna de doutorado do
3 ANÁLISES FITOQUÍMICAS
3.1 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
Os materiais e equipamentos necessários para os experimentos no HPLC-DAD foram:
• Freezer - 86ºC, Forma Scientific, modelo 92;
• Estufa para esterilização e secagem Gehaka G4023D;
• Banho de ultrassom modelo USC 2800, UNIQUE;
• Balanças AG245 (Mettler Toledo) e BG 2000, Gehaka;
• Nitrogênio líquido;
• Mini-centrífuga Denver Instrument;
• Galato de butila Sigma- Aldrich®;
• Solventes: Acetonitrila, Etanol, Isopropanol J.T.Baker, grau HPLC;
• Sistema de purificação de água Millipore Mili-Q®;
• Coluna para análises no UPLC Core-Shell Kinetex de 150 mm x 2,1 mm i.d. x 2,6 µ m,
com pré-coluna;
• UPLC, modelo Ultimate 3000, marca Dionex® equipado com duas bombas modelo
DGP-3600RS, detector de arranjo de diodos (DAD) modelo DAD3000(RS), amostrador
automático modelo WPS3000RS e softwareChromeleon versão 6.80. A frequência de
aquisição de dados foi de 5,0 Hz;
• Filtros de nylon 0,22 µ m, 13 mm de diâmetro Lac;
Os materiais e equipamentos necessários para os experimentos no CG-FID foram:
• Nitrogênio líquido;
• Freezer - 86ºC, Forma Scientific, modelo 92;
• Vidrarias de laboratório;
• Cromatógrafo a gás Varian CP - 3800, com injetor manual e detector de ionização em
chama, software Galaxie;
• Coluna para análises no CG Supelco SPB-5 (5% fenil polimetilsiloxano) de 30 m x 0,25
mm x 0,1ȝm;
• Seringa 8200, Varian MD- 35-11-1;
• Cromatógrafo a gás Shimadzu QP-2010 equipado com injetor automático AOC-5000
Shimadzue e interface com um espectrômetro de massa, software GCMS solutions Ver.
2.5.;
• Coluna para análise no CG-MS Phenomenex ZB-5MS (30 mx 0,25 x 0,25 mm).
Para os testes de micro extração em fase sólida do tipo headspace (HS-SPME) dos voláteis
foram usadas as seguintes fibras (Supelco):
• Carboxen/Polydimethylsiloxane (car/pdms) 75 µm;
• Carboxen/Polydimethylsiloxane (car/pdms) 85 µm;
• Polydimethylsiloxane (pdms) 100 µm;
• Polydimethylsiloxane/ Divinylbenzene (pdms/dvb) 65 µm;
• Divinylbenzene/Carboxen/Polydimethylsiloxane (dvb/car/pdms) 50/30 µm;
3.2 MÉTODOS
Os compostos das folhas de C. sylvestris foram estudados por meio de métodos de análise por
HPLC e CG.
3.2.1 Metodologia de análise das amostras de Casearia sylvestris var. Sylvestris e Língua
por UPLC-DAD
Os itens de 3.2.1.1 a 3.2.1.4 foram desenvolvidos pela aluna de doutorado Paula C. P.
Bueno, bolsista FAPESP (processo n° 2011/21440-3), cujo projeto esteve interligado com este
trabalho, o qual resulta de uma iniciação científica.
3.2.1.1 Desidratação das folhas
Colocou-se de 3 a 5 folhas frescas e congeladas em placas de Petri, devidamente
identificadas e previamente pesadas. O material foi desidratado em estufa a 55°C, durante 24 horas.
Todas as placas de Petri foram pesadas após esse período e, com os dados obtidos, calculou-se o
teor de água das amostras conforme a fórmula 1:
Em que:
M1 = massa das placas de Petri
M2 = massa das placas de Petri + folhas frescas e congeladas
As folhas desidratadas foram trituradas em gral de porcelana utilizando nitrogênio líquido.
3.2.1.2 Preparo do solvente extrator
O solvente extrator, composto por etanol, isopropanol e água MiliQ na proporção de 3:2:5,
respectivamente, foi definido através do planejamento fatorial simplex centróide. Primeiramente,
preparou-se esta mistura em frasco separado devido à retração de volume. Para cada 10 mL do
solvente extrator, adicionou-se 5 mg do padrão interno galato de butila. Após homogeneização, a
mistura foi acondicionada em frasco hermético.
3.2.1.3 Extração da amostra
Para extração, foram transferidos 50 mg de folhas secas e trituradas para um tubo eppendorf
e adicionou-se 1 mL do solvente extrator. Essa mistura foi levada ao ultrassom por uma hora,
agitando-a a cada vinte minutos.
Após esse período, a amostra foi centrifugada a 5000 x g por 5 minutos. Finalmente, 0,7
mL do sobrenadante foram recolhidos e filtrados em filtro de nylon diretamente para o frasco do
amostrador automático. Cada amostra foi preparada em única replicata.
3.2.1.4 Análise cromatográfica
As condições da análise cromatográfica utilizadas foram: volume de injeção de 2 µ L, vazão
de 400 µ L/min, temperatura da coluna de 35°C e detecção na faixa de 200-800 nm. A coluna
utilizado foi: 10 a 25% de acetonitrila por 15 minutos e 25 a 90% de acetonitrila em 20 minutos,
permanecendo nesta condição por 5 minutos. O tempo de recondicionamento da coluna foi de 2
minutos, sendo mantida na condição inicial por 3 minutos. Ao final, o tempo de análise foi de 45
minutos.
3.2.1.5 Forma de análise dos resultados
O tratamento dos dados referentes ao teor de água nas folhas foi feito da seguinte maneira:
calculou-se o teor de água utilizando a fórmula descrita no item 3.2.2.1 para cada horário de coleta.
Com os resultados obtidos, fez-se uma média para os meses entre os teores de todos os horários
para cada dia de coleta separadamente. Ao final, calculou-se a média das médias obtidas para o
dia 1 e 2.
As condições ambientais foram monitoradas pela medição da temperatura e umidade
relativa do ar. A análise dos dados consistiu em calcular a média dos parâmetros estudados dos
dois dias de coleta, separando-os por horário.
Para a análise do dados do ciclo circadiano, foi feito um cálculo da razão entre a área dos
picos de interesse (agrupados em compostos fenólicos e diterpenos) e a área do pico do padrão
interno, para todos horários de coleta dos dois dias e para todos os meses separadamente (Fórmulas
2 e 3), com o objetivo de comparar os dois dias de coleta (dados organizados em gráfico de linha).
Posteriormente, para a comparação entre as duas variedades em função da expressão das duas
classes de metabólitos, calculou-se a média da razão encontrada entre os dois dias de coleta
(Fórmula 4) e os dados foram organizados em gráficos tipo “radar”.
R(dia 1) =
R'(dia 2) =
(3)
(4)
Em que:
An = área dos picos de interesse
API = área do pico do padrão interno
R = razão entre a área dos picos n e a área do pico padrão interno para o dia 1 de coleta
R’ = razão entre a área dos picos n e a área do pico do padrão interno para o dia 2 de coleta __
X = média entre as razões
Já para a análise do ciclo sazonal, para cada variedade e para cada classe de metabólitos,
fez-se uma média de todos dos resultados obtidos nos dois dias de coleta de cada mês
(totalizando-se 16 pontos), (totalizando-sendo os dados organizados em gráfico de linhas.
3.2.2 Metodologia para análise das amostras de Casearia sylvestris variedades Sylvestris e
Língua por CG-FID
Primeiramente definiu-se qual a melhor metodologia para extração dos voláteis bem como
a fibra para a micro extração em fase sólida. Com essas respostas em mãos, definiu-se as melhores
3.2.2.1 Testes para definição do modo de preparo das amostras e fibra a ser utilizada para micro
extração em fase sólida para as análises por CG-FID
Para saber qual modo de preparo das amostras seria o mais eficiente no que diz respeito à
quantidade de picos obtidos na análise, realizou-se a extração dos voláteis de duas maneiras,
preparando apenas uma replicata em cada teste. A massa das amostras foi de, aproximadamente,
200 mg, a fibra utilizada foi car/pdms 75 µ m e o método de análise aplicado foi o definido no item
3.2.2.2. As folhas usadas foram obtidas das amostras de dezembro de 2012 que se encontravam
acondicionadas no freezer -86°C. A temperatura do ambiente durante o processo de extração e
análise era de 21.9°C.
Primeiramente, a extração foi feita com uma folha inteira colocada em um frasco de 4 mL,
depois, uma folha foi triturada em nitrogênio líquido e transferida para outro frasco de 4 mL. Nos
dois casos, o procedimento seguinte foi introduzir a fibra nos frascos com a amostra, deixando-a
exposta por 40 minutos para a adsorção dos voláteis. Posteriormente, a fibra foi submetida à análise
em GC-FID, ficando exposta no injetor por 5 minutos para a dessorção dos voláteis. Tanto o
preparo das amostras quanto as análises foram feitas em ordem aleatória.
Com os cromatogramas resultantes, que se encontram no item 5.3, fez-se uma avaliação e
escolha da metodologia a ser utilizadas nas extrações realizadas futuramente.
Para definir qual seria a melhor fibra para a realização da micro extração em fase sólida,
foram utilizadas amostras também de dezembro de 2012, os seis tipos de fibras contidos nos
materiais e métodos (item 5.3) e o método de extração foi o descrito anteriormente neste item,
Tanto para a escolha da metodologia de extração dos voláteis quanto para definição de
fibra, o método utilizado no equipamento seguiu os parâmetros: temperatura do injetor: 200ºC,
modo de injeção split 1:10, temperatura do detector: 250 ºC. Programa de temperatura do forno:
50°C por 3 minutos, a seguir aquecimento a uma taxa de 3°C/min até 220°C, mantendo essa
condição por 10 minutos. O tempo de análise foi de 66,67 minutos. Vazão do gás de arraste (N2):
1,0 mL/min, gás de make up (N2): 29 mL/min, ar sintético: 10 mL/min e hidrogênio: 1 mL/min.
Com os resultados de ambas as análises chegou-se a um método de preparo das amostras e
extração dos voláteis.
3.2.2.2 Método definitivo de análise por CG
Para o procedimento utilizou-se o cromatógrafo a gás e a coluna descritos no item 3.1.
Para a análise dos voláteis de todas as amostras selecionadas, foram feitas algumas
modificações na metodologia citada no item anterior, pois verificou-se que aumentando a
temperatura do injetor em 20°C, era possível diminuir o tempo de análise, melhorando a condição
do experimento. Assim, os parâmetros do método definitivo foram: temperatura do injetor de
220°C por 5 minutos para a dessorção dos voláteis, modo de injeção split 1:10, temperatura do
detector de 250ºC. Programa de temperatura do forno de 50°C por 3 minutos, a seguir aquecimento
a uma taxa de 3°C/min até 200°C. O tempo de análise foi de 50 minutos. Vazão do gás de arraste
(N2): 1,0 mL/min, gás de make up (N2): 29 mL/min, ar sintético: 10 mL/min e hidrogênio: 1
mL/min.
A utilização de uma programação linear de temperatura foi utilizada para obtenção de
4 ESTUDOS DE BIOLOGIA MOLECULAR
4.1 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
Os materiais e equipamentos utilizados nos experimentos de biologia molecular foram:
• Isopropanol Sigma- Aldrich®;
• Clorofórmio Sigma- Aldrich®;
• Beta-mercaptanol Sigma- Aldrich®;
• Brometo de etídeo Hexapur;
• Agarose Sigma- Aldrich®;
• Tampão TAE (Tris – Acetato – EDTA);
• Álcool etílico Qhemis;
• Precellys Bertin Technologies;
• Espectrofotômetro Epach Biotek;
• Termociclador Veriti – Applied Biosystems;
• Termociclador PE Apllied Biosystems – Gene Amp® PCR System 9700;
• Centrífuga Beckman – Allegra™ 21R Centrifuge;
• Eletroforese Life Technologies, Inc. Modelo Horizon® 58;
• Fotodocumentador Multimage® I – Alpha Innotech;
• Banho-maria Boekel Scientific;
• DNA Speed Vac® DNA 110 Savant;
• Água Ultrapura – Equipamento Milipore Synthesis;
• Primer GGPP Exxtend;
• Primer SDH Exxtend;
• Primer rbcLa_f e rbcLajf634_r;
• Enzima Phusion DNA Polimerase 2U/µ L Thermo Scientific;
• Enzima Platinum® Taq Polimerase 5 U/µ L Invitrogen;
• Enzima AmpliTaq® (250U) Applied Biosystem;
• Enzima Pfu 2.5 U/µ L Fermentas.
4.2 ANÁLISE DAS AMOSTRAS DE Casearia sylvestris VARIEDADES SYLVESTRIS E
LÍNGUA POR BIOLOGIA MOLECULAR
A metodologia e os componentes para a realização dos estudos de biologia molecular
encontram-se relacionados nos próximos itens.
4.2.1 Primers controle
Os primers controle utilizados foram cedidos pela aluna de mestrado Laís Simões Sampaio
(FAZEKAS et al., 2008):
Primer rbcLa_f 10 µ M: 5’ ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC 3’
4.2.2 Desenhos dos primers GGPP sintase e SDH
Os primers GGPP e SDH foram desenhados e as sequências finais seguem nos próximos
itens.
4.2.2.1 Primer GGPP sintase
Primer Forward: 5' CAATGTAATTAGCYAAAGCM 3'
Primer Reverse: 5' GTGAMTYTAGGTTCATGGRTTS 3'
4.2.2.2 Primer SDH
Primer Forward: 5' CTTCAGGACYTTYTAATATTTC 3'
Primer Reverse: 5' CAATCGCAAYTTYGAGAGG 3'
4.2.2.3 Primers GGPP sintase e SDH
Os primers foram adquiridos da empresa Exxtend solução em oligos. A quantidade em
nmol e a temperatura de anelamento foram de:
GGPP_f: 18,9 nmol, 56 ºC; GGPP_r: 22,4 nmol, 66 ºC;
SDH_f: 21,1 nmol, 58 ºC; SDH_r: 21,1 nmol, 56 ºC.
4.2.3 Preparo da solução tampão brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB)
Para 1 litro de solução tampão misturou-se 20 g de CTAB, 82 g de NaCl, 20 g de PVP
de EDTA 0,5 M pH 8,0. Em seguida, a mistura é levada para agitação a 50ºC até dissolução
completa. Após esfriar, completou-se o volume para 1 litro, conservando em temperatura
ambiente.
No momento da extração, para cada 10 mL de tampão acrescentou-se 20 µ L de
ß-mercaptoetanol.
4.2.4 Preparo da solução de clorofórmio / álcool isoamílico 24:1 e solução de Etanol 70%
Para o preparo da solução de clorofórmio e álcool isoamílico misturou-se 24 partes de
clorofórmio para 1 parte do álcool.
A solução de etanol 70% foi preparada adicionando-se 30 mL de água destilada a 70 ml de
etanol absoluto, mantendo a mistura a - 20 oC.
4.2.5 Análises em gel de agarose 1%
Para visualização do DNA, as amostras foram aplicadas em gel de agarose 1%, em tampão
TAE (Tris-Acetato-EDTA). Após corrida eletroforética a 5V/cm, os géis foram corados com
brometo de etídeo e a visualização do gel foi feita sobre iluminação ultravioleta.
4.2.6 Extrações de DNA
A extração do DNA foi feita de folhas provenientes das coletas das 6h do mês de
fevereiro/2013 e das 9h do mês de abril/2013, selecionadas a partir dos resultados obtidos nas
O protocolo de extração de DNA utilizado foi desenvolvido por Murray e Thompson
(1980). O procedimento consiste em macerar 0,2 g de folhas em 1,2 ml de tampão de extração
contendo ß-mercaptanol. O macerado é colocado em banho-maria por trinta minutos a 65°C e, em
seguida, centrifugado a 1300 rpm por 5 minutos. Cerca de 400 µ L do sobrenadante é recuperado
e misturado com 400 µ L clorofórmio álcool isoamílico (24:1), essa mistura é centrifugada a 1300
rpm por 5 minutos. Em seguida, recolhe-se 300 µ L do sobrenadante e a este se adiciona 0,6 do
volume de isopropanol, deixando por trinta minutos a -4°C. Na sequência, a mistura é centrifugada
a 1300 rpm por 20 minutos. O sobrenadante obtido é descartado e ao pellet formado adiciona-se
900 µ L de álcool 70% gelado, centrifugando a 1300 rpm por 10 minutos, repetindo essa etapa mais
uma vez. O pellet é seco a vácuo em concentrador centrífugo.
A quantificação do DNA extraído é feita por espectrofotometria e a concentração do DNA
em ng/µ L obtida através do cálculo:
!"
#$%&'(%()()*+,$-.
*'/$'01.2#$%&'(%()()*+,$-. (5)
Onde, a quantidade de DNA puro é fornecida pela leitura no equipamento e a diluição
utilizada é de 10 vezes. A razão 260/280 refere-se à pureza do DNA, o valor encontrado deve estar
compreendido entre 1,8 e 2,1.
4.2.7 Preparo dos primers GGPP e SDH
Para estoque, os primers foram dissolvidos em H2O ultrapura a 100 pmol/µL. Para isso
acrescentou-se o volume de água necessário, de acordo com a concentração inicial de cada primer.
• GGPP forward: 18,9 nmol primer + 189 µ L de H2O ultrapura estéril;
• SDH forward: 21,1 nmol primer + 211 µL de H2O ultrapura estéril;
• SDH reverse: 21,1 nmol primer + 211 µL de H2O ultrapura estéril.
Para o preparo das soluções de trabalho, misturou-se uma alíquota de 5 µ L da solução mãe
de cada primer com 45 µ L de água ultrapura estéril. O volume final da solução de trabalho dos
primers foi de 50 µ L e a concentração final foi de 10 µM.
4.2.8 Reações em cadeia da polimerase (PCR)
Os produtos, de todas as PCRs, foram separados em gel de agarose 1% (vide item 4.2.5).
A primeira PCR foi feita para confirmar a correta execução da extração do DNA das folhas,
para isso utilizou-se a enzima Taq Polimerase de alta fidelidade e os primers descritos no item
2.4.1. Foram misturados os 19 µ L do mix com 1 µL do DNA 10 ng/µ L (tabela 2).
TABELA 2. Composição do mix para PCR
Componentes Volume
Tampão 2 µ L
MgCl2 1 µ L
dNTP 0,8 µ L
Primer forward 1 µ L
Primer reverse 1 µ L
Platinum® Taq Polimerase 0,2 µ L
H2O 13 µ L
TABELA 3. Ciclo de amplificação - PCR com enzima Platinum® Taq Polimerase
Temperatura (ºC) Tempo
95 4 min
94 30 seg
55 1 min
72 1 min
72 10 min
10
Na sequência, foram feitas PCRs utilizando os primers GGPP e SDH. Primeiramente,
realizou-se uma PCR cujos componentes da reação estão descritos na tabela 4. A enzima utilizada
foi a Phusion de alta fidelidade e os primers GGPP e SDH preparados anteriormente. Para a PCR
foram misturados os 19 µ L do mix com 1 µL do DNA 10 ng/µ L.
TABELA 4. Preparo do mix para PCR com enzima Phusion Teste 1
Componentes Volume
Tampão 4 µ L
dNTP 10 mM 0,4 µ L
Primer forward 10 µM 1 µ L
Primer reverse 10 µM 1 µ L
Phusion 0,2 µ L
H2O 12,4 µ L
A PCR consistiu em 30 ciclos com temperatura de desnaturação de 98 ºC, anelamento dos
primers a 52 ºC e extensão a 72 ºC, conforme descrito na tabela 5.
TABELA 5. Ciclo de amplificação - PCR com enzima Phusion Teste 1
Temperatura (ºC) Tempo
98 30 seg
98 10 seg
52 30 seg
72 45 seg
72 10 min
10
Outra PCR utilizando a mesma enzima foi feita, alterando-se a quantidade dos primers
(tabela 6) e a temperatura de anelamento.
TABELA 6. Preparo do mix para PCR com enzima Phusion Teste 2
Componentes Volume
Tampão 4 µ L
dNTP 10 mM 0,4 µ L
Primer forward 10 µM 2 µ L
Primer reverse 10 µM 2 µ L
Phusion 0,2 µ L
H2O 12,4 µ L
Esta reação consistiu em 30 ciclos com temperatura de desnaturação de 98 ºC, anelamento
dos primers a 48 ºC e extensão a 72 ºC (tabela 7).
TABELA 7. Ciclo de amplificação - PCR Enzima Phusion Teste 2
Temperatura (ºC) Tempo
98 30 seg
98 15 seg
48 30 seg
72 40 seg
72 5 min
10
Ainda utilizando a enzima Phusion, fez-se outra reação, porém dessa vez alterando a
concentração do DNA. Os componentes da PCR e o ciclo utilizado para amplificação do DNA
foram os mesmos descritos anteriormente porém, com a diferença na concentração do DNA
utilizada. Para obtenção das novas concentrações de DNA, volumes foram tomados da solução de
DNA 10 ng/µ L preparada anteriormente. Assim, para obtenção da concentração de 5 ng/µ L, a
alíquota foi de 0,5 µ L do DNA com concentração de 10 ng/µ L, para 20 ng/µL, foi utilizada uma
alíquota de 2 µ L e para 40 ng/µ L, tomou-se 4 µ L. Para a PCR utilizou-se 1 µ L de cada solução de
DNA, misturado com 19 µ L do mix.
Nova PCR foi feita usando a enzima Pfu. A tabela 8 contém os componentes e suas
respectivas quantidades e a tabela 9 contém a ciclagem utilizada.
TABELA 8. Preparo do mix para PCR com enzima Pfu
Componentes Volume
Tampão 5 µ L
dNTP 10 mM 5 µ L
Primer forward 10 µM 1,25 µ L
Primer reverse 10 µM 1,25 µ L
Pfu 0,2 µ L
H2O 11,3 µ L
TABELA 9. Ciclo de amplificação - PCR Enzima Pfu
Temperatura (ºC) Tempo
95 3 min
95 30 seg
50 30 seg
72 2 min
72 10 min
10
Fez-se um teste também utilizando a enzima AmpliTaq. Os componentes para a reação de
PCR bem como seus volumes estão listados na tabela 10.
TABELA 10. Composição do mix para PCR com enzima AmpliTaq
Componentes Volume
Tampão 2,5 µ L
MgCl2 2,5 µ L
dNTP 10 mM 2 µ L
Primer forward 10 µM 1,25 µ L
Primer reverse 10 µM 1,25 µ L
AmpliTaq 0,125 µ L
H2O 14,375 µ L
Para a PCR foram misturados os 24 µ L do mix com 1 µL do DNA 10 ng/µ L, sendo
realizadas em 30 ciclos com temperatura de desnaturação de 95 ºC, anelamento dos primers a 52
ºC e extensão a 72 ºC (tabela 11).
TABELA 11. Ciclo de amplificação - PCR Enzima AmpliTaq
Temperatura (ºC) Tempo
94 3 min
95 30 seg
52 30 seg
72 60 seg
72 7 min
10
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ANÁLISES DO TEOR DE ÁGUA E DOS DADOS DE TEMPERATURA E UMIDADE
RELATIVA
Os resultados obtidos após tratamento dos dados de teor de umidade das folhas das duas
variedades, no período de um ano, encontram-se no gráfico 1. Para a variedade Sylvestris nota-se
uma constância no teor de água entre os meses de janeiro e junho; de julho a setembro ocorre uma
queda de aproximadamente 10% e, de setembro a dezembro, um aumento de cerca de 15%. Já para
a variedade Língua, de fevereiro a junho, tem-se uma queda no teor de umidade, seguido de um
aumento discreto (aproximadamente 3%) de junho a julho. Novamente nota-se diminuição no teor
de água de julho a agosto e, de agosto a novembro, o conteúdo de água tem um aumento mais
acentuado (aproximadamente 15%) e, outra vez, uma queda entre os meses de novembro a janeiro.
A variedade Sylvestris apresenta um teor de água mais regular ao longo do ano em
comparação com a variedade Lingua, porém o máximo e mínimo observados não variam em alto
grau entre as mesmas.
Os dados de temperatura e umidade relativa do ar obtidos durante as 48h de coleta de cada
mês foram reunidos em gráficos (GRAF. 2).
Analisando os dados compilados nos gráficos observa-se que a umidade do ar apresenta
relação inversa à temperatura, conforme esperado. Comparando os resultados dessas análises com
o teor de água nas folhas temos em dezembro um pico de umidade entre às 15h e 18h acompanhada
de queda na temperatura e um teor de umidade elevado em ambas as variedades se comparado aos
outros meses. Em setembro, o teor de água na variedade Sylvestris está por volta de 48% e
encontra-se em queda em relação aos dois meses anteriores; já para a variedade Lingua, no mesmo
mês, temos um ligeiro aumento no teor de água para 51% aproximadamente. No entanto, a
diferença entre as plantas é pequena.
5.2 VARIAÇÃO CIRCADIANA E SAZONAL DE FENÓLICOS E DITERPENOS
Os cromatogramas resultantes das análises em HPLC-DAD foram registrados em dois
comprimentos de onda, 254 nm e 235 nm, a fim de monitorar os compostos fenólicos e os
diterpenos, respectivamente. No preparo das amostras foi adicionado um padrão interno (galato de
butila) para que possíveis problemas oriundos de variações na preparação das amostras e nas
condições da análise fossem corrigidos. Com o resultado do tratamento realizado, conforme
descrição no item 3.2.1.5, plotaram-se os gráficos discutidos a seguir.
Os resultados obtidos indicam que os compostos diterpênicos, representados pelas
casearinas, na variedade Sylvestris estão com teor maior que os compostos fenólicos. Efeito
inverso ocorre com a variedade Língua, onde os compostos fenólicos prevalecem sobre os
diterpenos. Tais observações repetem-se ao longo dos meses do ano (FIG. 5). Adicionalmente,
durante os dois dias amostrados em cada mês, não há, em geral, variações muito importantes no
teor de fenólicos ou diterpenos, com os níveis observados no primeiro dia mostrando boa
concordância com os níveis observados no segundo dia.
Ao longo de todo ano observam-se teores relativos de compostos diterpênicos bem
próximos a zero para a variedade Lingua. Avaliando a mesma variedade, porém agora se atentando
aos compostos fenólicos, o resultado obtido foi que no mês de fevereiro, o teor dessas substâncias
foi mais elevado tanto em relação aos outros meses quanto em relação aos horários do dia.
Para a variedade Sylvestris temos que os compostos diterpênicos apresentaram maior teor
nos meses de fevereiro, março, agosto, setembro, outubro e dezembro, sendo que fevereiro foi o
mês onde houve mais picos no teor ao longo do dia. Os compostos fenólicos para esta variedade
FIGURA 5. Análise circadiana da C. sylvestris (dia 1 e dia 2)
(continua)
Cinza……….diterpenos - dia 1
Azul………compostos fenólicos - dia 1 Vermelho……….compostos fenólicos - dia 2
Verde………diterpenos - dia 2
Mês C. sylvestris var. Lingua C. sylvestris var. Sylvestris
FIGURA 5. Análise circadiana da C. sylvestris (dia 1 e dia 2).
(continuação)
Cinza……….diterpenos - dia 1
Azul………compostos fenólicos - dia 1 Vermelho……….compostos fenólicos - dia 2
Verde………diterpenos - dia 2
FIGURA 5. Análise circadiana da C. sylvestris (dia 1 e dia 2).
(conclusão)
Para facilitar a visualização de variações circadianas e sazonais nos teores de fenólicos e
diterpenos, utilizou-se a média dos valores obtidos para cada classe de substância em cada horário
amostrado, para a elaboração dos gráficos do tipo “radar” (FIG. 6). Observa-se que na variedade
Lingua os teores de fenólicos são relativamente constantes durante o período circadiano, mas que
esses teores aumentam significativamente nos meses de fevereiro, março, maio, agosto e
dezembro, já os teores de diterpenos se mantiveram mínimos durante todo o ano. Em relação à
variedade Sylvestris, teores baixos de fenólicos foram observados durante todo o ano, com
pequeno aumento nos meses de agosto a outubro. No entanto, os diterpenos apresentaram variação
sazonal marcante, com teores destacadamente maiores nos meses fevereiro e de agosto a
dezembro, mas sem tendência claramente definida de oscilação durante o período circadiano.
Houve aumento intermediário nos meses de janeiro, março e maio.
Cinza……….diterpenos - dia 1
Azul………compostos fenólicos - dia 1 Vermelho……….compostos fenólicos - dia 2
Verde………diterpenos - dia 2
FIGURA 6. Variação circadiana de fenólicos totais e diterpenos totais a cada mês. Cada ponto indica a média de 2
Os gráficos de box splot facilitam a visualização da variação sazonal dos compostos estudados para as duas variedades de C. sylvestris.
GRÁFICO 3. Variação sazonal de fenólicos totais nas variedades de C. sylvestris. Cada caixa contém os valores
observados nos dois dias de amostragem de cada mês.
GRÁFICO 4. Análise Variação sazonal de diterpenos totais nas variedades de C. sylvestris. Cada caixa contém os
valores observados nos dois dias de amostragem de cada mês.
A figura 7 contém todos cromatogramas de cada mês sobrepostos, registrados em 235 nm
para a variedade Sylvestris e 254 nm para a variedade Lingua, com o objetivo de ilustrar o perfil
cromatográfico ao longo de um ano. Nota-se que a distribuição dos metabólitos secundários difere
significativamente entre as variedades e confirma a predominância de compostos fenólicos na
5.3 ANÁLISES CROMATOGRÁFICA DE COMPOSTOS VOLÁTEIS DAS VARIEDADES
ESTUDADAS
Notou-se, a partir dos cromatogramas da figura 8 que não houve diferença quantitativa
significativa entre as maneiras de preparo das amostras, apenas na intensidade dos mesmos. Assim,
definiu-se que para todas as análises, a extração seria feita com as folhas inteiras devido a
facilidade de preparo e também para evitar possíveis perdas de massa que poderiam ocorrer na
transferência da amostra triturada para o frasco de extração.
FIGURA 8. Cromatogramas dos métodos de preparo da amostra
Para definir a fibra a ser utilizada para a microextração em fase sólida nas amostras,
testou-se testou-seis tipos de fibras, com diferentes polaridades, as quais foram descritas no item 3.1. Para esta
etapa, o procedimento seguido foi realizar a extração e análise definidos (item 3.2.2.1). O fator
extratora, tanto para compostos polares quanto apolares, a qual é evidenciada, respectivamente,
pela quantidade de picos observados e pela distribuição destes nos cromatogramas. De acordo com
as figuras 9 e 10, nota-se que as fibras que apresentaram maior número de picos foram as car/pdms
75 µm e car/pdms 85 µ m, sendo a diferença entre elas apenas o fato da fibra com espessura de
revestimento maior ser flexível e, portanto, mais resistente à quebras ou torções, já a fibra com 75
µm não apresenta flexibilidade. Entretanto, a maior espessura de revestimento proporciona maior
quantidade de adsorvente e consequentemente, maior capacidade de adsorção mas, em
contrapartida, requer maior tempo de extração em relação à outra fibra, uma vez que o tempo para
saturar a fibra, isto é, atingir o equilíbrio, é maior. Ambas as fibras apresentaram capacidade
extratora semelhante, variando apenas a capacidade de extração de cada composto. Assim a
selecionada foi a fibra car/pdms 85 µm para utilização nos experimentos de dinâmica metabólica,
dado que compostos presentes em menor quantidade na planta podem não ser detectados na fibra
car/pdms 75 µ m.
FIGURA 9. Cromatogramas dos testes feitos com as fibras para HS-SPME
(continua) 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 50,000 45,000 40,000 35,000 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000
0 RT [min]
dvb_car_pdms_1.DATA µV 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 50,000 45,000 40,000 35,000 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000
0 RT [min]
pdms_1.DATA
FIGURA 9. Cromatogramas dos testes feitos com as fibras para HS-SPME (conclusão) 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 50,000 45,000 40,000 35,000 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000
0 RT [min]
pdms_dvb_1.DATA µV 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 50,000 45,000 40,000 35,000 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000
0 RT [min]
car_pdms_0,75µm_1.DATA µV 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 50,000 45,000 40,000 35,000 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000
0 RT [min]
car_pdms_0,85µm_1 .DATA µV 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 50,000 45,000 40,000 35,000 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000
0 RT [min]
FIGURA 10. Expansão dos cromatogramas de 0 - 40 minutos das fibras car/pdms 75 µ m e 85 µm.
Para a análise dos compostos voláteis de folhas das variedades Língua e Sylvestris, por
cromatografia gasosa, fez-se um teste inicial com duas amostras de cada variedade, obtidas no
mesmo horário, em dias consecutivos. O mês em que a amostra foi obtida foi escolhido ao acaso.
Esse teste foi feito para verificar a ocorrência de diferenças no perfil de voláteis em dias
consecutivos de coleta. O mês analisado foi julho de 2013 e o horário de coleta 09 horas. Os
cromatogramas apresentaram perfis muito semelhantes para ambas as variedades (FIGs. 11 e 12).
FIGURA 11. Cromatogramas dos voláteis de folhas de C. sylvestris variedade Lingua, obtidos para dias 1 e 2, em
julho, às 9 horas.
(continua) 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 50,000 45,000 40,000 35,000 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000 0 RT [min] car_pdms_0,75µm_1.DATA µV 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 50,000 45,000 40,000 35,000 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000 0 RT [min] car_pdms_0,85µm_1 .DATA µV 50 48 46 44 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 140,000 120,000 100,000 80,000 60,000 40,000 20,000
0 RT [min]
c. lingua 9h dia 1 julho_1_1 _10_24_2013 1_44_07 AM.DATA
µV
FIGURA 11. Cromatogramas dos voláteis de folhas de C. sylvestris variedade Lingua, obtidos para dias 1 e 2, em
julho, às 9 horas.
(conclusão)
FIGURA 12. Cromatogramas dos voláteis de folhas de C. sylvestris variedade Sylvestris, obtidos para dias 1 e 2,
em julho, às 9 horas.
Dessa forma, optou-se por iniciar as análises com amostras obtidas apenas no primeiro dia
de coleta, nos horários de 09 horas, 15 horas, 21 horas e 03 horas, sendo os meses de floração
(maio, junho e julho) escolhidos como ponto de partida para tais análises. Esta estratégia foi
adotada para minimizar o tempo de equipamento necessário para se obter um panorama anual de
eventuais variações na composição de constituintes voláteis de folhas.
A proposta de identificação dos constituintes voláteis foi obtida após análise de amostras
representativas por GC-MS, seguida comparação dos espectros de massas obtidos com espectros 50 48 46 44 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 140,000 120,000 100,000 80,000 60,000 40,000 20,000
0 RT [min]
c. lingua 9h dia 2 julho_1_1 _10_24_2013 12_44_52 AM.DATA
µV 50 48 46 44 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 140,000 120,000 100,000 80,000 60,000 40,000 20,000
0 RT [min]
c. sylvestris dia 1 9h julho_1_1_10_23_2013 11_46_40 PM.DATA µV 50 48 46 44 42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 140,000 120,000 100,000 80,000 60,000 40,000 20,000
0 RT [min]
c. sylvestris 9h dia 2 julho_1_1 _10_23_2013 10_35_50 PM.DATA
µV
Dia 2
Dia 1
das bibliotecas Nist e Wiley, através do software GCMS solutions. A identificação dos compostos
voláteis foi reforçada com a comparação dos índices de retenção lineares (RI), calculados (fórmula
6) para os constituintes voláteis das amostras de C. sylvestris, com os encontrados na literatura
(Tabela 12). Para a comparação dos índices de retenção, utilizou-se uma faixa de ± 5 unidades em
relação aos valores encontrados na literatura, assim para um mesmo IR calculado um ou mais
compostos foram sugeridos.
34565678 9 : ;
&<=2&<>&<>?@2&<>
(6)
Onde,
n = número de carbonos do n-alcano com o tempo de retenção anterior ao metabólito de interesse;
trx = tempo de retenção do metabolito de interesse;
(tRz) = imediatamente anterior ao padrão;
tRz+1 = tempo de retenção do n-alcano localizado imediatamente após o padrão avaliado.
TABELA 12. Índices de retenção encontrados na literatura e índices de retenção calculados para as substâncias
Através das análises observa-se algumas diferenças importantes entre a composição de
compostos voláteis emitidos pelas folhas de cada variedade. É nítida a ocorrência de teores maiores
de trans 2-hexenal, 3-hexen-1-ol, (E) 2-hexen-1-ol, heptan-2-ol, α-copaeno e ȕ-bourboneno na
variedade Sylvestris quando comparada à variedade Lingua. Em relação aos sesquiterpenos,
principalmente aqueles majoritários, eluídos entre 24 e 34 minutos, observa-se grande semelhança
na composição, mas a variedade Lingua apresenta teores maiores de sesquiterpenos em relação à
variedade Sylvestris (FIGS 13 e 14).
FIGURA 13. Cromatogramas representativos da variedade Lingua.
FIGURA 14. Cromatogramas representativos da variedade Sylvestris.
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 200,000 150,000 100,000 50,000
0 RT [min]
c. lingua 9h dia 1 janeiro_1_1_12_5_2013 3_00_23 AM.DATA µV 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 200,000 150,000 100,000 50,000
0 RT [min]
c. lingua 21h dia 1 novembro_1_2 _12_12_2013 11_37_33 PM.DATA µV 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 200,000 150,000 100,000 50,000
0 RT [min]
c. sylvestris 9h dia 1 dezembro_1_1 _12_5_2013 8_13_04 PM.DATA µV 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 200,000 150,000 100,000 50,000
0 RT [min]
