Diversidade genética em populações de Myracrodruon urundeuva Fr. All., sob diferentes tipos de perturbação antrópica

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Diversidade genética em populações de Myracrodruon

urundeuva Fr. All., sob diferentes tipos de perturbação

antrópica

MICHELE PEREZ VIEGAS

Orientador: Prof Dr. Mário Luiz Teixeira de Moraes

Co-Orientadora: Prof Dra. Cristina Lacerda Soares Petrarolha Silva

Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira da Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Agronomia – Área de Concentração: Sistemas de Produção.

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Aos meus pais, Francisco Carlos Viegas e Edazina Perez Viegas,

As minhas irmãs, Graciele e Daniele,

Ao meu namorado, Celso,

DEDICO

Por mais difícil que seja uma situação, não deixe

de acreditar e de lutar até o último momento.

“O homem de bem exige tudo de si próprio; o

homem medíocre espera tudo dos outros”

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AGRADECIMENTOS

Á Deus, em primeiro lugar, pois sem ele nada seria possível.

Ao meu pai, Francisco e minha mãe Edazina, minhas irmãs Graciele e Daniele, pelo apoio incondicional, compreensão, amor, carinho e amizade.

Ao meu namorado Celso, que desde a inscrição para seleção do mestrado, nos momentos mais difíceis e nos mais simples, esteve sempre ao meu lado, apoiando, dando muita força e carinho.

A toda minha família, Vó Jandira e Vó Luci, tias Lúcia, Rê, Bel, Edna, Bá, Marli e até o tio Ademir, e todos os primos e primas, que não são poucos, por todo apoio durante a realização deste trabalho.

* * *

À Universidade Estadual Paulista – Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira e ao Departamento de Fitotecnia Tecnologia de Alimentos e Sócio-Economia pela oportunidade de realização do mestrado.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela bolsa concedida durante a realização do mestrado.

À Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia pela oportunidade de desenvolvimento do trabalho de dissertação em suas instalações.

Ao Prof. D. Mário Luiz Teixeira de Moraes pela colaboração e orientação a este trabalho.

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esquecer o grande carinho por todos os seus orientados, aprendendo a trabalhar com os programas para depois me ensinar, às vezes deixando até sua família um pouco de lado para me ajudar, mostrando um grande profissionalismo.

À pesquisadora Dra. Ana Yamaguishi Ciampi, pela receptividade, amizade, apoio, companheirismo, e muita paciência até mesmo durante as madrugadas quando deixava sua casa para levar eu e Kitty até ao laboratório para colocar as amostras para seqüenciar, isso, durante toda a realização deste trabalho na Embrapa.

À pesquisadora Dra. Vânia Cristina Rennó Azevedo pelo apoio dado durante a realização deste trabalho na Embrapa, perdendo finais de semana e feriados para nos ajudar nos trabalhos de laboratório, auxiliando a resolver os problemas de amplificação e análise dos dados, não deixando de citar o apoio incondicional na escrita deste trabalho.

À banca examinadora da qualificação, ao Prof. Dr. João Antônio da Costa Andrade e ao Prof. Dr. Miguel Luiz Menezes Freitas, pelas valiosas correções e sugestões, contribuindo para melhorar o artigo.

Ao pesquisador e professor Dr. Alexandre Magno Sebbenn, pelas discussões, sugestões e apoio no desenvolvimento deste trabalho.

À Prof. Dra. Karina Martins por ter sido tão prestativa e pronta a ajudar, contribuindo muito para a realização deste trabalho.

Aos funcionários da seção de pós-graduação pela atenção, dedicação e compromisso.

* * *

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Aos amigos do Laboratório de Genética de Populações e Silvicultura, Verônica, Bianca, Juzinha, Laila, Juliana, Flavinho e por último, mas não menos importante, aos grandes amigos Deise e Hélio (Guará).

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DIVERSIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÕES DE Myracrodruon urundeuva FR.

ALL., SOB DIFERENTES TIPOS DE PERTURBAÇÃO ANTRÓPICA

Autora: MICHELE PEREZ VIEGAS Orientador: Prof Dr. MÁRIO LUIZ TEIXEIRA DE MORAES Co-Orientadora: Prof. Dra. CRISTINA LACERDA SOARES PETRAROLHA SILVA

RESUMO

Os marcadores de microssatélites tem sido utilizados com grande freqüência como ferramenta efetiva para estudos de estrutura genética de populações, fluxo gênico, parentesco e para quantificar os efeitos da fragmentação de habitats e guiar estratégias de conservação e melhoramento genético. Este trabalho teve como objetivo avaliar a diversidade genética e o sistema reprodutivo em progênies de duas populações de Myracrodruon urundeuva,

procedentes de Aramina-SP e Selvíria-MS, assim como verificar os efeitos da ação antrópica sobre estas populações. Foram avaliadas 25 progênies de cada população, cada uma com 17 a 20 indivíduos, sendo analisados oito locos polimórficos de regiões microssatélites.

Observou-se 118 alelos nas duas populações e o número efetivo por loco (Ae

= 4,05) foi inferior ao

número médio de alelos por loco (A = 14,75), indicando elevado número de alelos em baixa freqüência. O índice de fixação (F= 0,210 e 0,107, respectivamente para Aramina e Selvíria)

foi positivo, relativamente alto e significativamente diferente de zero. A taxa de cruzamento

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Entretanto, as duas populações apresentaram alta diversidade genética, o que as qualifica para utilização em programas de conservação e melhoramento genético da espécie.

Palavras-chave: microssatélites, conservação ex situ, aroeira, marcadores genéticos,

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GENETIC DIVERSITY IN POPULATIONS OF Myracrodruon urundeuva FR. ALL.,

UNDER DIFFERENT TYPES OF DISTURBANCE ANTROPIC

Author: MICHELE PEREZ VIEGAS Adviser: Prof Dr. MÁRIO LUIZ TEIXEIRA DE MORAES Co-Adviser: Prof. Dra. CRISTINA LACERDA SOARES PETRAROLHA SILVA

ABSTRACT

The microsatellite markers has been often employed as effective tool for studies of genetic structure of populations, gene flow, relationship and also for to quantify environmental fragmentation effects and to outline strategies for conservation and breeding. This study aimed to evaluate the genetic diversity and mating system in progenies of two Myracrodruon urundeuva populations from Aramina-SP and Selvíria-MS, as well as verify the effects of

antropic action on these populations. From each population were evaluated 25 progenies, with 15-20 individuals each, using genetic data from 8 microsatellite loci. There was 118 alleles in

both populations and the actual number per locus (Ae

= 4.05) was lower than the average

number of alleles per locus (A = 14.75), indicating high number of alleles in low frequency. The fixation index (F = 0,210 e 0,107, respectively for Aramina and Selvíria) was positive,

relatively high and significantly different from zero. The multilocus outcrossing rate (t = _m

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two populations had high genetic diversity, which qualifies them for use in programs for conservation and breeding of this species.

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Características dos primers SSR (CAETANO et al., 2005) empregados... 30

Tabela 2 - Estimativa de parâmetros genéticos em oito locos microssatélites para 978

indivíduos de duas populações de Myracrodruon urundeuva. A é o número de alelos por

loco; Ae é o número efetivo de alelos por loco; Ho é a heterozigosidade observada; He é a

heterozigosidade esperada. ... 45

Tabela 3 - Estimativa de índices de diversidade genética para duas populações de

Myracrodruon urundeuva. n é o número de indivíduos analisados; At é o número total de

alelos; Aé o número médio de alelos por loco; A_e é o número efetivo de alelos por loco; A_excl

é o número de alelos exclusivos; Ar é o número de alelos raros; Ho é a heterozigosidade

observada; He é a heterozigosidade esperada; F é o índice de fixação. ... 47

Tabela 4 - Estimativa de diversidade genéticas e estatística ,

ST

G de Hedrick (2005) para o

pólen e os óvulos de Myracrodruon urundeuva... 48

Tabela 5 - Estimativa de coeficientes de coancestria (4) e tamanho efetivo (N_e) para cada

progênie e média populacional para duas populações sob conservação em banco de germoplasma de Myracrodruon urundeuva. ... 50

Tabela 6 - Estimativa de parâmetros do sistema de reprodução em populações de

Myracrodruon urundeuva, onde Mat. é o número de matrizes; n é o número de progênies; t_m

e ts são a estimativas da taxa de cruzamento multilocos e unilocos, respectivamente; tmts

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - A) Árvore de M. urundeuva. B) Ramo com inflorescência. C) Sementes maduras.

... 20

Figura 2 - Eletroferograma do padrão de peso molecular, marcado com ROX e empregado

em cada amostra para os cálculos de tamanho alélico em pares de bases (pb). O eixo Y indica a intensidade do sinal de fluorescência e o eixo X número da varredura a laser em que se captou o sinal... 31

Figura 3 - Eletroferogramas de alelos observados em indivíduos de M. urundeuva no loco

A392. ... 32

E062... 32

Figura 5 - Eletroferogramas de alelos observados em indivíduos de M. urundeuva no loco

D094. ... 33

C072. ... 33

B209. ... 34

D282. ... 34

D167. ... 35

D200. ... 35

Figura 11 - Distribuição dos alelos no loco C072, em função da freqüência alélica, nas

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Figura 12 - Distribuição dos alelos no loco D094, em função da freqüência alélica, nas populações de M. urundeuva provenientes de Aramina-SP e Selvíria-MS... 41

Figura 13 - Distribuição dos alelos no loco D167, em função da freqüência alélica, nas

populações de M. urundeuva provenientes de Aramina-SP e Selvíria-MS... 42

Figura 14 - Distribuição dos alelos no loco E062, em função da freqüência alélica, nas

Figura 16 - Distribuição dos alelos no loco A392, em função da freqüência alélica, nas

Figura 17 - Distribuição dos alelos no loco B209, em função da freqüência alélica, nas

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SUMÁRIO

1 - INTRODUÇÃO ... 15

2 - REVISÃO DE LITERATURA ... 18

2.1- A espécie Myracrodruon urundeuva... 18

2.2 - Fragmentação e conservação de espécies arbóreas tropicais ... 20

2.3 - Marcadores moleculares... 23

3 - MATERIAL E MÉTODOS... 27

3.1 – Material... 27

3.2 – Métodos ... 28

3.2.1 - Amostragem, extração e quantificação do DNA... 28

3.2.2 - Análises dos locos SSR... 28

3.2.3 - Análise dos dados... 36

3.2.3.1 – Diversidade genética e índice de fixação ... 36

3.2.3.2 - Diferenciação genética entre populações ... 37

3.2.3.3 - Tamanho efetivo populacional... 37

3.2.3.4 – Sistema de Reprodução ... 39

4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 40

4.1 - Diversidade genética ... 40

4.2 - Diferenciação genética entre populações ... 47

4.3 - Tamanho efetivo populacional... 49

4.4 - Sistema de Reprodução ... 54

5 – CONCLUSÕES... 58

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1 - INTRODUÇÃO

A conservação de espécies florestais deve ser conduzida preferencialmente in situ,

permitindo assim a dinâmica natural das populações ali presentes, e conseqüentemente a sua evolução (FERNANDEZ; MARTINEZ, 2009). Entretanto, quando o ambiente natural teve suas relações ecológicas comprometidas por ações antrópicas, ou por outros fatores, é prudente que também se utilize a conservação ex situ, promovendo assim, uma maior garantia

da sobrevivência das populações (PINTO et al., 2004, SEGARRA-MORAGUE´S et al. 2005). Perturbações antrópicas têm levado a fragmentação de populações naturais de espécies florestais, gerando um risco real de erosão genética e até mesmo de extinção de espécies, especialmente nos biomas tropicais (PINTO et al., 2004). Quando a floresta se torna fragmentada há uma diminuição no tamanho das populações, e consequentemente na sua diversidade genética do potencial evolutivo das populações arbóreas ali presentes tornando-as isoladas e vulneráveis a eventos ambientais, demográficos e genéticos, causando reduções. A diversidade genética é fundamental para a sustentabilidade das espécies, pois fornece matéria-prima para a adaptação, evolução e sobrevivência populações arbóreas (RAJORA; MOSSELLER, 2001), entretanto a ocorrência de perturbação antrópica pode levar à alteração da distribuição da variabilidade genética gerando estruturação genética espacial nas (LACERDA ; KAGEYAMA, 2003, MORAES et al., 2005).

A exploração inadequada de populações naturais de Myracrodruon urundeuva Fr.

All., vem comprometendo sua capacidade de sobrevivência em habitat natural (FREITAS et al., 2006), dessa forma ações que promovam a sua conservação ex situ são importantes.

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desta área de ocorrência encontra-se fragmentada. Como conseqüência, M. urundeuva

atualmente é pouco encontrada na região centro-sul do Brasil, especialmente no estado de São Paulo, onde não mais se apresenta em grandes proporções em seu estado silvestre, exceto em reservas estaduais e reservas particulares. Nestas, com freqüência observa-se que a distribuição é do tipo agrupado, em forma de manchas, constituído por menos de cem indivíduos. As manchas são provavelmente resultantes da dispersão das sementes próximas às árvores matrizes, o que gera estruturação genética espacial intrapopulacional (MORAES et al., 2005).

Se estas populações forem mantidas pequenas por muitas gerações poderão perder variabilidade genética por deriva genética, o que leva a endogamia e desencadeia a depressão endogamica. Conseqüentemente, haverá reduções na capacidade adaptativa, no vigor, no porte e produtividade, entre outros fatores (RITLAND, 1996). Portanto, esta é uma espécie que necessita de conservação, e para que sejam traçadas estratégias adequadas, deve-se dar ênfase a estudos sobre a biologia reprodutiva, métodos de propagação, estrutura genética, tamanho efetivo populacional e variação genética entre e dentro das populações (RESENDE, 1999, KAGEYAMA et al., 2003, SEBBENN, 2003).

Estudos prévios avaliaram a diversidade e estrutura genética de outras populações de

M. urundeuva utilizando marcadores isoenzimáticos (MORAES et al., 2005), RAPD e

cpDNA (REIS et al., 2004), AFLP (FREITAS et al., 2005) e microssatélites (CAETANO et

al., 2008).

O objetivo geral deste estudo foi criar um banco de dados de parâmetros genéticos que propiciem informações para que estratégias de conservação e melhoramento genético de populações de Myracrodruon urundeuva sob diferentes tipos de perturbação antrópica,

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Assim, tem-se por objetivos específicos, com base na estimativa de parâmetros genéticos, obtidos em análises moleculares de locos microssatélites (SSR):

i) Avaliar a diversidade genética em progênies de duas populações de M. urundeuva procedentes de Aramina-SP e Selvíria-MS.

ii) Estudar o sistema de reprodução apresentado por M. urundeuva nestas

populações.

iii) Verificar os efeitos da ação antrópica como o cultivo da cana-de-açúcar em Aramina-SP e da pecuária extensiva em Selvíria-MS, nas populações de

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2 - REVISÃO DE LITERATURA

2.1- A espécie Myracrodruon urundeuva

O termo aroeira pode ser encontrado em quatro gêneros da família Anacardiaceae: Lithraea, Schinus, Astronium e Myracrodruon. A aroeira-preta é a Myracrodruon urundeuva

Allemão, que possui os sinônimos Astronium juglandifolium Griseb. e Astronium urundeuva

Engl., é uma planta dióica e alógama (SANTOS, 1987, MORAES; FREITAS, 1997). Nas florestas primárias, M. urundeuva pode estar associada a outras espécies, ao contrário do que

se observa nas florestas secundárias, onde sua ocorrência é praticamente homogênea, especialmente em áreas perturbadas (FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION-FAO, 1986). Atualmente, M. urundeuva é pouco encontrada na região centro-sul do Brasil,

especialmente no Estado de São Paulo, onde não é mais possível encontrá-la em grandes proporções em seu estado silvestre, a não ser em reservas estaduais e pequenas reservas particulares. Nestas, com freqüência observa-se que a distribuição é do tipo agrupado, em forma de manchas, constituído por menos de cem indivíduos. As manchas podem ser constituídas pela dispersão das sementes próximas às árvores matriz, o que favorece a estruturação genética das populações (MORAES et al., 2005).

Os principais vetores de polinização de M. urundeuva são abelhas e diversos

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em um reflorestamento homogêneo com M. urundeuva o primeiro evento de florescimento

ocorreu aos três anos e meio de idade, sendo observado em 34,7% das plantas.

As sementes de M. urundeuva são esféricas, castanho-amareladas, aladas, a dispersão

é do tipo anemocórica, de maturação rápida e muito pequena, o que dificulta a coleta. A semente apresenta pequena dormência atribuída ao embrião, perdendo poder germinativo em pouco tempo, em condições naturais, devido à impermeabilidade do tegumento. Testes feitos com as sementes armazenadas à temperatura ambiente por mais de um ano comprovaram que elas após esse período, não mais germinavam (GONZAGA et al., 2003). A crioconservação dessas sementes é um método de armazenamento promissor para M. urundeuva

(CARVALHO, 1994).

Estudos realizados pelo Instituto de Pesquisas Tecnológicas (IPT) indicam que um pedaço de madeira de M. urundeuva do tamanho de uma caixa de fósforos suporta 6 toneladas

de carga, sem se deformar. A característica de durabilidade é encontrada em apenas 1% a 5% das madeiras e apenas menos de 1% delas são muito duráveis. De acordo com testes realizados pelo IPT, M. urundeuva foi classificada como muito durável e está incluída no grupo das

madeiras chamadas imputrescíveis (MAINIERI; CHIMELO, 1989, BRAGA, 1990).

Além das propriedades mecânicas que formam uma barreira física de proteção, existe também uma barreira química caracterizada por uma elevada quantidade de compostos fenólicos em função de sua riqueza em metabólitos secundários, que podem ou não estar associado à lignina, sendo provavelmente, os principais responsáveis pela resistência natural da espécie à degradação química e biológica (QUEIROZ et.al., 2002). Tais características tornam esta madeira muito adequada à confecção de postes, esteios, moirões, dormentes, etc.

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a sua utilização vêm sendo realizadas, como a sua utilização medicinal (FREITAS et al., 2005).

Figura 1 - A) Árvore de M. urundeuva. B) Ramo com inflorescência. C) Sementes maduras.

(Fontes: Fotos Ai e C – WWW.biologo.com.br/plantas/cerrado, Fotos Aii e B – Lorenzi, 1992.)

2.2 - Fragmentação e conservação de espécies arbóreas tropicais

Os efeitos da degradação dos diversos ecossistemas vêm sendo objeto de discussões e estudos nos últimos anos, tanto por parte de instituições governamentais quanto pela comunidade científica (RAJORA et al., 2000). Neste sentido, atitudes vêm sendo tomadas

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As florestas brasileiras vêm sofrendo acelerado processo de fragmentação, principalmente em decorrência da expansão urbana e das atividades ligadas ao crescimento populacional. Dessa maneira, a fragmentação é um processo resultante da ação antrópica, que possui dois componentes principais: a redução da área de um habitat grande e contínuo, e a divisão do habitat remanescente em fragmentos menores (ISHIHATA, 1999).

A fragmentação florestal provoca a diminuição do número de indivíduos de uma população, favorecendo a perda de variação genética. A população remanescente passa a ter um tamanho menor que o mínimo adequado (Ne mínimo) para que o mesmo possa ter sua

normal continuidade e evolução. Nessa população pequena pode ocorrer, em curto prazo, deriva genética, o que significa ter as freqüências de seus genes afastadas daquelas da população original, inclusive chegando a perder alelos. Em longo prazo, ainda pode haver um aumento da endogamia, decorrente da maior probabilidade de autofecundação e cruzamentos entre indivíduos remanescentes (KAGEYAMA, et al., 1998).

Somado a isto há ainda uma perda de genes adaptados aos ambientes específicos de ocorrência das espécies arbóreas. A redução contínua no tamanho das populações as submete a diminuição da variabilidade genética, por deriva genética (SEBBENN; ETTORI, 2001), podendo causar a depressão por endogamia e conseqüentemente, reduzir a capacidade de sobrevivência além da capacidade adaptativa, a fertilidade, o vigor, o porte e a produtividade, entre outros (ALLARD, 1971, RITLAND, 1996).

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fisiológicas que atribuem características demográficas e comportamentais que sustentam toda sua complexidade (BAZZAZ, 1991).

Processos demográficos (como natalidade, mortalidade, dispersão de sementes e recrutamento) e taxas de crescimento são dois atributos funcionais que podem ser considerados importantes componentes da biodiversidade de espécies que sofrem com a exploração. No entanto o fator genético é o componente mais sensível ao desmatamento (PUTZ et al., 2000), e é componente chave da sustentabilidade dos recursos florestais (RAJORA et al., 2000). Conhecer a distribuição da variação genética dentro e entre populações pode promover descobertas relativas à história de uma população, uma vez que os atuais níveis e a distribuição da variação genética podem influenciar o sucesso futuro de populações (ERICKSON et al., 2004).

Assim, o conhecimento da estrutura genética de populações é entendido como a etapa fundamental para a realização de programas conservacionistas. Os dados gerados por pesquisas em genética de populações podem ser utilizados para definir unidades de conservação e prioridades para o manejo de recursos genéticos, indicando áreas e populações de maior ou menor importância para a preservação de táxons em questão e permitindo o desenvolvimento de estratégias efetivas de conservação (CAVALLARI, 2004).

O melhoramento de espécies nativas é de grande importância pois muitas espécies arbóreas tropicais não apresentam comportamento de sociabilidade, ou seja, dentro da mesma espécie existe um mecanismo que faz com que não seja possível o plantio homogêneo da espécie ex situ, não se adequando a plantios puros. Assim, a conservação genética dessas

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entre e dentro das populações (KAGEYAMA et al., 1990, RESENDE, 1999, SEBBENN, 2003).

A obtenção de populações melhoradas, que satisfaçam às exigências da produtividade florestal, depende da capacidade de identificação de genótipos desejados na população sob seleção. Uma estratégia de eficiência comprovada para a seleção desses genótipos é a combinação dos testes de procedências e progênies, que permitem a determinação do valor reprodutivo dos indivíduos selecionados, a estimativa de parâmetros genéticos, da estrutura genética e seleção, orientando decisões práticas no programa de melhoramento (KEIDING, 1976, SAMPAIO et al., 2000, AGUIAR, 2004). Dessa forma, os testes de progênies, além de serem extremamente úteis para a conservação genética, permitem o contínuo potencial evolutivo das espécies e o resgate de material genético para o uso em futuros programas de melhoramento (ETTORI et al., 1999).

2.3 - Marcadores moleculares

Quando se objetiva a efetiva conservação genética de uma espécie, utiliza-se o conhecimento prévio de seu sistema de reprodução, estrutura e diversidade genética, no delineamento de estratégias para a recombinação, amostragem e uso do material genético remanescente. Tais informações podem ser obtidas por meio do uso de marcadores genéticos, e no caso de espécies arbóreas, programas de conservação têm procurado dar ênfase à determinação dos níveis de variabilidade genética mantidos dentro e entre populações naturais, como forma de planejar o uso sustentável e a conservação in situ (KAGEYAMA,

1987).

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entre as espécies. Isto se deve principalmente aos avanços significativos na área de marcadores moleculares aliados a PCR (reação em cadeia da polimerase), que vem possibilitando a amplificação dos conhecimentos sobre espécies nativas. Marcadores microssatélites ou SSRs tem sido utilizado nos estudos de populações naturais (COLLEVATTI et al., 2001, DICK et al., 2003, MARTINS et al., 2006, AZEVEDO et al., 2008) uma vez que são altamente polimórficos quando comparados com outras classes de marcadores, podendo responder a diversas questões sobre a genética de populações como estrutura genética espacial, sistema de cruzamentos e fluxo gênico.

Os microssatélites são abundantes e estão dispersos nos genomas eucariotos, em regiões codificadoras e não codificadoras; possuem herança codominante, o que discrimina homozigotos de heterozigotos; são multialélicos, apresentando o maior conteúdo informativo por loco entre todas as classes de marcadores moleculares e são detectáveis por meio de PCR; altamente reproduzíveis; não requerem radioatividade; os locos são frequentemente conservados entre espécies relacionadas, podendo ser transferidos e uma vez desenvolvidos podem ser compartilhados entre diferentes laboratórios. Todas essas características tornam a utilização deste marcador vantajosa, fazendo com que este possa ser considerado um marcador ideal. Os SSRs são ainda automatizáveis em sistemas multiplex, o que permite

avaliar rapidamente um grande número de indivíduos para um grande número de locos a curto prazo (AZEVEDO, 2007).

A variabilidade genética é a base da biodiversidade e pode ser acessada por meio de marcadores genéticos. Em estudos populacionais de espécies arbóreas, a utilização de marcadores genéticos baseados em PCR tem demonstrado tratar-se de ferramenta altamente eficiente. Em Myracrodruon urundeuva os primeiros estudos com marcadores genéticos

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marcadores microssatélites (MORAES, 1992, LACERDA et al., 1999, REIS, 1999, LACERDA et al., 2003, REIS; GRATTAPAGLIA, 2004, CAETANO et al., 2005, FREITAS et al., 2005, CAETANO et al., 2008).

A associação de técnicas moleculares às técnicas tradicionais de melhoramento pode propiciar um grande avanço na obtenção de genótipos superiores. Assim os marcadores moleculares funcionam como ferramentas auxiliares no melhoramento genético florestal, permitindo entre outros, avaliações da adequação da base genética de populações florestais para utilização em programas de melhoramento (CAIXETA, 2003), avaliações da ocorrência de genes ligados a características específicas, e ainda propiciam uma redução do tempo de seleção dos materiais genéticos a partir da seleção assistida e estudo de características poligênicas pela detecção de QTLs (ENGELBORHS et al., 1998).

Métodos tradicionais, como os testes de procedências, associados aos marcadores moleculares vêm sendo empregados no estudo da diversidade genética em populações de espécies florestais. O conhecimento da distribuição da variabilidade genética entre e dentro de populações destas espécies, é essencial para adoção de estratégias eficientes que visam a conservação de germoplasma ex situ e in situ (OLIVEIRA et al., 2006)

Empregando-se marcadores genéticos do tipo fAFLP, Freitas et al. (2005) analisaram a divergência genética e distância entre progênies de Myracrodruon urundeuva oriundas de

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Marcadores de RAPD foram usados para estudar a distribuição e a variabilidade genética em uma coleção de germoplasma de M. urundeuva com polinização aberta, com

árvores dispostas 300m umas das outras, agrupando-se em nove áreas de coleção ao longo do Brasil, incluindo também duas populações naturais. Em análises com 83 marcadores de RAPD, baseado em semelhanças genéticas não houve nenhum agrupamento definido entre indivíduos das mesmas áreas de coleção. Com isso observou-se 92% de variação genética dentro de áreas de coleção. Nos indivíduos das duas populações naturais observou-se 97% de variabilidade dentro das populações. Estes resultados indicam que para o estabelecimento de reservas genéticas ex situ ou para a conservação ex situ, deve-se manter a conservação de

várias árvores individuais ou coleção de sementes obtidas de polinização aberta de locais distantes (REIS; GRATTAPAGLIA, 2004).

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3 - MATERIAL E MÉTODOS

3.1 – Material

Foram estudadas progênies de duas populações de Myracrodruon urundeuva,

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3.2 – Métodos

3.2.1 - Amostragem, extração e quantificação do DNA

A amostra populacional para os estudos genéticos constituiu-se de 25 progênies de cada população, cada uma com 17 a 20 indivíduos, num total de 978. Os tecidos vegetais utilizados para a extração do DNA foram folhas jovens, sendo coletadas, identificadas e acondicionadas em sacos de papel, contendo sílica gel azul (8mm) até o momento da extração do DNA, mantendo assim a integridade do DNA.

A extração do DNA genômico foi realizada no Laboratório de Genética de Populações e Silvicultura (LGPS da FEIS/UNESP), empregando-se o protocolo Doyle e Doyle (1990), com modificações realizadas por Silva et al. (2008b), com a adição de proteinase K (100 ug/mL), de PVP-40 (4%), PVP-360 (1%), mercaptoetanol (2%) na solução de extração. A quantificação e verificação da qualidade do DNA genômico foi feita em comparação com DNA padrão ( DNA) em gel de agarose 0,8%, com TEB 1X (Tris 28 mM, ácido bórico 88 mM, EDTA 7 mM, pH 8,3) corado com brometo de etídio (5 Pg/ mL).

O DNA foi diluído para 1,0ng/ μl.

3.2.2 - Análises dos locos SSR

As análises dos locos SSR foram realizadas no Laboratório de Genética Vegetal do Centro Nacional de Recursos Genéticos - CENARGEN/EMBRAPA. Para otimização de temperatura e pareamento dos primers SSRs foram utilizadas cinco amostras de DNA

(30)

condições de amplificação proposta por Caetano et al. (2005). Para amplificação dos alelos utilizou-se termocicladores 9600 e 9700 Applied Biosystem, com blocos para placas de 96 poços, com o seguinte programa: um ciclo de 94°C por 3 min., 35 ciclos de 94°C por 30 s, temperatura de pareamento por 30 s, 72°C por 30 s, e um ciclo final de 72°C por 5 min. Para cada primer, foram testadas de 12 a 17 temperaturas de pareamento, a saber: 36°C, 36,2°C,

37,3°C, 39,1°C, 41,3°C, 43,9°C, 46,7°C, 49,4°C, 52°C, 54°C, 55,8°C, 56,7°C, 58,5°C, 61°C, 63,1°C, 64,7°C e 65,6°C. Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese em gel de agarose 3%, em TEB 1X, com ddp constante de 60V por cerca de três horas. As temperaturas que produziram bandas robustas e sem ocorrência de artefatos foram escolhidas para as amplificações posteriores.

A amplificação dos locos SSR foi realizada a partir de uma reação geral descrita a seguir: 6uL de reação contendo 1ng DNA genômico, 2,5mM de MgCl2, 200 μM de cada

dNTP, Taq DNA polimerase (Go Taq Master Mix PROMEGA), 0,33 μM de cada primer

(forwarde reverse) e água ultrapura estéril. O componente Foward de cada par de primers foi

marcado na sua extremidade 5’ com um fluorocromo conforme descrito na Tabela 1. As condições de termociclagem foram as mesmas acima descrita, exceto para o primer D282,

cujo o programa de amplificação foi do tipo touchdown (um ciclo de 95°C por 5 min, cinco

(31)

Tabela 1 - Características dos primers SSR (CAETANO et al., 2005) empregados.

Primer - SSR Seqüência 5’ – 3’ Tpareamento_(ºC) Marcação com _fluorocromo

Auru D200 – F TTCACCACAGGTTTGCG 55,8 NED Auru D200 - R TAGTGAGCAACGACGAGAGC --- Auru E062 – F CAAAATTGCCGTCTGGGC 49,4 NED Auru E062 - R GGATCGGATTCAGCGGG --- Auru B209– F CACATTAACTCCTAATTACAAGG 49,4 HEX Auru B209- R AAGCATGTGTATGACAGCTC --- Auru A392– F GCAAGAAATAAAAGAATCAGATG 43,9 NED Auru A392- R GTGTAACAGCCCACAGTATCAG --- Auru C072– F ATGCATCTAGCTTGCTCTTTC 61 FAM Auru C072- R TTAACTGTCGGGGGTTCG --- Auru D167– F TGTTGTTACGAGAGAAGGCAG 58,5 NED Auru D167- R TACCCTACGTGTTATCCATCTG --- Auru D282– F TTCAAAGTGGTGTCATTAAGC TD* 65-55 FAM

Auru D282- R CATTTGACCATAGACAAGAGC --- Auru D094– F CACATTTGAAAAATGCTAGGG 61 HEX Auru D094- R ATGGTGATGGGGAAACTCTC ---

x TD: Amplificação tipo touchdown

(32)

A detecção e a estimativa do tamanho de alelos em pares de bases foram realizadas com o uso do software ABI Prism GeneScan versão 3.7 (Applied Biosystems). Logo, os valores foram

importados para o software ABI Prism Genotyper versão 2.0 NT (Applied Biosystems)

(Figuras 3 a 10) para filtragem dos picos e interpretação dos dados, definindo o genótipo de cada indivíduo. Os valores alélicos, foram ajustados em categorias discretas, com base em quadrados mínimos pelo software AlelloBin (IDURY; CARDON, 1997) eliminando o

problema de padronização com uso de critérios pessoais.

Figura 2 - Eletroferograma do padrão de peso molecular, marcado com ROX e empregado

em cada amostra para os cálculos de tamanho alélico em pares de bases (pb). O eixo Y indica a intensidade do sinal de fluorescência e o eixo X número da varredura a laser em que se captou o sinal.

59

310 248

203 150

106

121

144 162 75

(33)

A392.

(34)

D094.

(35)

B209.

(36)

D167.

(37)

3.2.3 - Análise dos dados

3.2.3.1 – Diversidade genética e índice de fixação

A diversidade genética em cada população foi estimada agrupando todas as progênies. O número total de alelos (A_t), número médio de alelos (A), heterozigosidade

observada (H ) e esperada (_o H ) em Equilíbrio de Hardy-Weinberg foram calculados para _e locos e média entre locos. Os níveis de endogamia dentro das amostras foram quantificados pelo índice de fixação médio entre progênies (F) de acordo com o método de Weir e

Cockerham (1984). A significância estatística dos valores de F foram testados por

permutação (10.000), utilizando uma correção para Bonferroni(95%, D=0,05). O erro padrão

dos valores de F foram estimados por reamostragem Jackknife sobre os locos. Os desvios do

equilíbrio de Hardy-Weinberg foram testados pelos valores índice de fixação em cada população e utilizando um teste exato de Fisher e 10000 permutações. Aplicou-se uma correção de Bonferroni(95%, D=0,05) para evitar falsos positivos. Todas estas análises foram

geradas utilizando os programas FSTAT, versão 2.9.3.2. (GOUDET et al., 2002) e GDA,

versão 1.1 (Lewis e Zaikin, 2002). Adicionalmente, estimou-se o número efetivo de alelos por loco (Ae) usando a expressão Ae = 1/(1 – He). Os alelos foram classificados em dois grupos

(38)

3.2.3.2 - Diferenciação genética entre populações

Como a amostra utilizada estava estruturada em famílias de polinização aberta, a diferenciação genética entre as populações foi investigada utilizando-se as freqüências gênicas estimadas separadamente para óvulos e polens. A estimativa da diferenciação genética entre populações usando estrutura de progênies não é adequada, visto que cada planta de uma progênie sempre recebe um dos alelos da árvore materna, o que superestima a freqüência destes alelos. As freqüências alélicas medidas no pólen, podem melhor representar as freqüências alélicas da população, devido ao fato de que cada progênie pode receber pólen de um diferente pai. Isso só não será verdadeiro, caso os cruzamentos sejam biparentais, ou seja, as progênies sejam formadas por irmãos-completos. As frequências alélicas foram estimadas separadamente para o pólen e os óvulos usando o programa MLTR (RITLAND, 2002). Para medir a diferenciação genética entre as populações, foi empregado o método desenvolvido para locos microssatélites por Hedrick (2005), e a estatística ´

ST

G . A

significância estatística dos valores ´

ST

G foram testados utilizando-se o método de Jackknife

entre os locos.

3.2.3.3 - Tamanho efetivo populacional

O tamanho efetivo foi calculado individualmente para cada progênie e para o conjunto das progênies de cada população (estimativa populacional), usando a expressão:

4 / 5 . 0 ˆ

e

N (COCKERHAM, 1969),

em que, 4é o grupo de coancestria (dentro de progênies e para a população total). O

(39)

SPAGEDI (HARDY; VEKEMANS 2002). Para esta estimativa, utilizou-se as freqüências

alélicas medidas no pólen como sendo representativas das freqüências alélicas da população parental. O coeficiente de coancestria esperado dentro de progênies de polinização aberta de espécies dióicas, na ausência de cruzamento entre parentes é de 0.125 para indivíduos meios-irmãos e de 0.25 para indivíduos meios-irmãos-completos. O coeficiente de coancestria de grupo dentro de progênies foi estimado por:

n n f f n x n y xy xy 4

¦ ¦

1₂ z1

ˆ

ˆ T _,

onde, n é o número de progênies dentro de cada família, T_xy é o coeficiente de coancestria

entre os irmãos x e y dentro de cada família. O coeficiente de coancestria é uma medida de

identidade por descendência dos alelos entre indivíduos. Neste caso, como a referência é uma simples progênie, esta identidade pode se obter de duas formas: a) devido apenas aos alelos maternos, no caso de dois meios-irmãos maternos (cruzamento da árvore matriz com dois indivíduos diferentes e não parentes e; b) devido a ambos alelos maternos e paternos, no caso de dois irmãos-completos (cruzamento da árvore matriz com o mesmo pai duas vezes). O coeficiente de coancestria de grupo estimador em nível populacional foi calculado por:

hs m i hs hs n x n y xy n n n n f f 2 ) ( 2 ˆ ˆ 1 2 1 1 4

¦

¦ ¦

zT T

onde, m é o número de famílias dentro de cada população, n é o número de progênies dentro

de cada família; nhsé o número de meio-irmãos paternos (a mesma árvore doadora de pólen

cruzando com mais de uma árvore produtora de semente) entre diferentes famílias. T_xy é o

(40)

esperado para o coeficiente de coancestria entre dois meio-irmãos paternos é 0,125, mas nós somente consideramos como meio-irmãos paternos, aqueles indivíduos cujo valor estimado para coeficiente de coancestria foi superior a 0,4. Nesses casos, os valores estimados foram substituídos por 0,125 para serem incluídos nas estimativas de grupo de coancestria.

3.2.3.4 – Sistema de Reprodução

O sistema de reprodução foi analisado com base nos modelos de reprodução mista (RITLAND; JAIN, 1981) e cruzamentos correlacionados (RITLAND, 1989) utilizando o programa “Multilocos MLTR” (RITLAND, 2002), usando o método de máxima verossimilhança (Algoritmo Newton-Rapson); Os parâmetros estimados foram a taxa populacional de cruzamento multiloco (tm), taxa populacional de cruzamento uniloco (ts),

taxa de cruzamento entre aparentados (t_m t_s) e correlação multiloco de paternidade (r_p₍_m₎).

O intervalo de confiança das estimativas foi obtido por 1000 reamostragens bootstraps. Como

(41)

4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 - Diversidade genética

Todos os oito locos analisados foram polimórficos nas duas populações. Para o total de plantas genotipadas foram observados 118 alelos. As duas populações estudadas de M. urundeuva apresentaram um número maior de alelos do que tem sido observado em prévios

estudos com a espécie. O total número de alelos (118) observado em M. urundeuva nas

populações de Aramina e Selvíria foi superior ao observado por Caetano et al. (2005) (72 alelos) em populações do Paraguaia e da Argentina. Entretanto, em trabalho mais recente, Caetano et al. (2008) estudando 1048 indivíduos de populações distribuídas por toda a

América do Sul, observaram um total de 97 alelos com seis marcadores idênticos aos utilizados no trabalho. Quando utilizamos estes mesmos marcadores, encontramos nas populações de Aramina e Selvíria um total de 84 alelos. O elevado número de alelos e de diversidade genética observada nas duas populações (Aramina e Selvíria) de M. urundeuva

denota a ocorrência de alta diversidade genética nas mesmas.

O número de alelos variou entre locos de 6 a 27 alelos, com média de 14,5 alelos/loco (Tabela 2). O número efetivo de alelos por locos foi muito menor do que o número de alelos totais por locos, variando entre locos de 2,15 a 6,99, com média de 4,05 alelos efetivos por loco, o que sugere que muitos alelos são raros (pd 0,05) ou tem baixa freqüência (Figuras 11 a

18) (0,05 > p< 0,25). A heterozigosidade observada variou entre locos de 0,117 a 0,790, com

(42)

0 0,1 0,2 0,3 Fr e q . A lél ic a

146 148 150 156 158 160 162 164 166 168 170 172 174 176 178 180 182 184 186 188 190 192 196 198

Alelos Loco C072 Pop. Aramina-SP

0 0,1 0,2 0,3 Fr e q. A lé lic a

146 148 150 156 158 160 162 164 166 168 170 172 174 176 178 180 182 184 186 188 190 192 196 198

Alelos Loco C072 Pop. Selvíria-MS

Figura 11 - Distribuição dos alelos no loco C072, em função da freqüência alélica, nas

populações de M. urundeuva provenientes de Aramina-SP e Selvíria-MS

0 0,2 0,4 0,6 F re q . A lé lic a 10 4 10 8 11 2 11 6 12 0 12 4 Alelos Loco D094 Pop. Aramina-SP

0 0,2 0,4 0,6 F re q . A lé lic a

104 106 108 110 112 114 116 118 120 122 124 126

Alelos Loco D094 Pop. Selvíria-MS

(43)

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 F re q .A lé li c a 1 3 0 1 3 2 1 3 4 1 3 6 1 3 8 Alelos Loco D167 Pop. Aramina-SP

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Fr e q. A lé lic a

130 132 134 136 138

populações de M. urundeuva provenientes de Aramina-SP e Selvíria-MS

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Fr eq. A lé lic a

78 80 82 84 86 88

Alelos Loco E062 Pop. Aramina

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 F re q . A lé lica

78 80 82 84 86 88

Alelos Loco E062 Pop. Selvíria-MS

Figura 14 - Distribuição dos alelos no loco E062, em função da freqüência alélica, nas

populações de M. urundeuva provenientes de Aramina-SP e Selvíria-MS.

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Fr e q. A lélic a

193 197 199 201 203 205 207 209 211 213

Alelos Loco D200 Pop. Aramina-SP

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Fr e q. A lélic a

193 197 199 201 203 205 207 209 211 213

(44)

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Fr e q. A lé lica

179 181 183 185 187 189 191 193 195 197 199 201 203

Alelos Loco A392 Pop. Aramina-SP

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Fr e q. A lé lic a 17 9 18 1 18 3 18 5 18 7 18 9 19 1 19 3 19 5 19 7 19 9 20 1 20 3 Alelos Loco A392 Pop. Selvíria-MS

Figura 16 - Distribuição dos alelos no loco A392, em função da freqüência alélica, nas

0 0,1 0,2 0,3 F re q . A lé lica

185 189 191 197 199 201 203 205 207 209 211 213 215 217 219 221 223 227 229

Alelos Loco B209 Pop. Aramina-SP

0 0,1 0,2 0,3 Fr e q. A lé lica

185 189 191 197 199 201 203 205 207 209 211 213 215 217 219 221 223 227 229

Alelos Loco B209 Pop. Selvíria-MS

Figura 17 - Distribuição dos alelos no loco B209, em função da freqüência alélica, nas

0 0,1 0,2 0,3 Fr e q. A lé lic a

187 189 207 211 213 215 217 219 221 223 225 227 229 231 233 235 237 239 241 243 245 247 249 257 259 261 267 299

Alelos Loco D282 Pop. Aramina-SP

0 0,1 0,2 0,3 Fr e q. A lé lic a

187 189 207 211 213 215 217 219 221 223 225 227 229 231 233 235 237 239 241 243 245 247 249 257 259 261 267 299

(45)

A população de Selvíria apresenta número superior de alelos (A_t= 105) em relação à

Aramina (At= 94), o que pressupõem uma maior diversidade genética naquela população.

Estes resultados indicam que a perturbação antrópica sofrida pela população de Aramina, mais recentemente devido à cultura de cana-de-açúcar e anteriormente devido às culturas de café e algodão, levou a uma redução de sua base genética e conseqüentemente de sua diversidade genética. Isso se deve a degradação sofrida no local para o plantio destas culturas que ocorreu de forma drástica, onde em pouquíssimo tempo a população de M. urundeuva foi

(46)

Tabela 2 - Estimativa de parâmetros genéticos em oito locos microssatélites para 978 indivíduos de duas populações de Myracrodruon urundeuva. A é o número de alelos por

loco; A_e é o número efetivo de alelos por loco; H_o é a heterozigosidade observada; H_e é a

heterozigosidade esperada.

Locos A Ae Ho He

C072 24 6,99 0,774 0,857

D094 12 2,67 0,623 0,626

D167 6 2,15 0,117 0,536

D282 27 3,07 0,411 0,674

B209 19 6,53 0,656 0,847

A392 13 4,42 0,790 0,774

D200 10 3,25 0,623 0,692

E062 7 3,34 0,821 0,701

Média 14,75 4,05 0,601 0,713

Embora as amostras em cada população tivessem tamanhos muito similares (Tabela 3), a população Selvíria apresentou 11 alelos a mais que a população Aramina. A população Selvíria também apresentou um maior número de alelos exclusivos (23 alelos) em relação à população Aramina (12 alelos). Contudo, em ambas as populações, os alelos exclusivos tinham baixa freqüência (variando de 0,025 a 0,001). O número médio de alelos por locos (A),

o número de alelos efetivo por locos (Ae), a heterozigosidade observada (Ho) e a

heterozigosidade esperada (He) foram sensivelmente maiores na população Selvíria do que

em Aramina (Tabela 3). A população Selvíria apresentou também um maior número de alelos raros (pd0,05) que a Aramina, 73 alelos (69,5%) contra 60 alelos na população Aramina

(47)

O índice de fixação foi positivo e relativamente alto em ambas as populações, sendo significativamente diferente de zero, a julgar pelo intervalo de confiança a 95% de probabilidade, indicando possível endogamia nas populações (Tabela 3).

(48)

Tabela 3 - Estimativa de índices de diversidade genética para duas populações de

Myracrodruon urundeuva. n é o número de indivíduos analisados; A_t é o número total de

alelos; Aé o número médio de alelos por loco; A_e é o número efetivo de alelos por loco; A_excl

é o número de alelos exclusivos; Ar é o número de alelos raros; Ho é a heterozigosidade

observada; H_e é a heterozigosidade esperada; F é o índice de fixação.

IC: Intervalo de confiança a 95% de probabilidade, com 10 mil reamostragens

bootstrap sobre os locos.

4.2 - Diferenciação genética entre populações

A diferenciação nas freqüências alélicas entre as duas populações para o pólen cruzado foi de 15,9%, indicando que aproximadamente 84% da diversidade genética está dentro das populações (Tabela 4) e a diferenciação nas freqüências alélicas para os óvulos (0,235) foi maior que a medida entre o pólen, indicando que aproximadamente 77% da diversidade genética está dentro de populações. A julgar pelo intervalo de confiança a 95% de

Populações

Parâmetros Aramina Selvíria

n 492 486

t

A _{94 105}

A 11,75 13,135

e

A 3,105 3,984

excl

A 12 23

r

A 60 73

o

H _{0,535 0,669}

e

H 0,678 0,749

(49)

probabilidade, ambas as estimativas de diferenciação foram significativamente diferentes de zero.

Tabela 4 - Estimativa de diversidade genéticas e estatística ,

ST

G de Hedrick (2005) para o

pólen e os óvulos de Myracrodruon urundeuva.

Pólen Óvulos

Loco HS HT

,

ST

G H_S H_T GST,

D167 0,437 0,496 0,305 0,481 0,611 0,608

E062 0,641 0,663 0,153 0,488 0,488 0,001

D094 0,624 0,636 0,081 0,460 0,484 0,135

D200 0,727 0,733 0,057 0,624 0,679 0,350

A392 0,810 0,817 0,082 0,652 0,668 0,112

B209 0,871 0,882 0,181 0,795 0,808 0,145

C072 0,891 0,897 0,111 0,814 0,833 0,231

D282 0,900 0,914 0,305 0,881 0,898 0,300

Média 0,738 0,755 0,159 0,649 0,684 0,235

IC-sup (95%) 0,783 0,797 0,187 0,696 0,727 0,288

IC-inf (95%) 0,692 0,713 0,132 0,603 0,640 0,183

Intervalo de confiança a 95% de probabilidade, calculado por reamostragem Jackknife sobre

locos.

(50)

geograficamente e reprodutivamente isoladas entre si, devido a diferentes eventos históricos de colonização e dinâmicas populacionais são esperadas apresentarem maior diferenciação genética entre si do que populações localizadas espacialmente próximas e que trocam genes constantemente. O fluxo gênico pode homogeneizar a diversidade genética entre populações. Por outro lado, a ausência de fluxo gênico pode aumentar a diferenciação entre populações, chegando a alguns casos a dar origem a espécies diferentes. Outro fato a ser considerado é que mesmo que estas duas populações forem resultantes da fragmentação de uma única população, ainda assim poderiam atualmente ser geneticamente similares, desde que as condições ambientais e reprodutivas tivessem sido idêntica para ambas. Ou seja, provavelmente após a fragmentação, diferentes conjuntos de fatores bióticos e abióticos (como por exemplo: polinizadores, dispersores de semente, clima, solo, água, etc) atuaram em cada uma das populações estudadas, levando-as a diferirem também no processo de adaptação. Assim, a grande distância separando estas populações e, conseqüentemente, isolando-as reprodutivamente, somado a diferentes situações adaptativas que cada uma experimenta, pode explicar esta alta diferenciação genética observada entre estas duas populações.

4.3 - Tamanho efetivo populacional

(51)

(média de 3,04). Já o coeficiente de coancestria de cada população (considera as coancestrias dentro de progênies mais as coancestrias de meio-irmãos paternos) foi de 0,007029 na população Aramina e 0,007412 na população Selvíria. O tamanho efetivo total da população Aramina foi estimado em 71,13 e o da população Selvíria em 67,46.

Tabela 5 - Estimativa de coeficientes de coancestria (4) e tamanho efetivo (Ne) para cada

progênie e média populacional para duas populações sob conservação em banco de germoplasma de Myracrodruon urundeuva.

População de Aramina População de Selvíria

Progênies n 4 Ne n 4 Ne

1 20 0,168 2,98 18 0,175 2,86

2 20 0,154 3,24 19 0,150 3,33

3 20 0,183 2,74 19 0,137 3,64

4 20 0,154 3,26 20 0,151 3,30

5 20 0,174 2,87 19 0,160 3,13

6 20 0,163 3,06 20 0,152 3,29

7 20 0,185 2,70 20 0,155 3,23

8 18 0,214 2,34 20 0,148 3,38

9 20 0,166 3,02 20 0,145 3,46

10 19 0,163 3,06 19 0,160 3,12

11 20 0,182 2,75 20 0,160 3,13

12 20 0,183 2,73 20 0,156 3,20

13 20 0,151 3,31 19 0,176 2,85

14 20 0,172 2,91 17 0,157 3,18

15 17 0,163 3,08 19 0,209 2,39

16 20 0,197 2,53 19 0,158 3,17

17 19 0,173 2,89 20 0,183 2,73

18 20 0,140 3,57 20 0,210 2,38

19 20 0,140 3,57 19 0,177 2,83

20 20 0,190 2,63 20 0,166 3,01

21 19 0,171 2,92 20 0,162 3,09

22 20 0,163 3,06 19 0,167 2,99

23 20 0,151 3,31 20 0,172 2,91

24 20 0,148 3,37 20 0,157 3,18

25 19 0,168 2,98 20 0,171 2,92

Média_prog -- 0,169 2,96 -- 0,165 3,04

Total_pop 491 0,007029 71,13 486 0,007412 67,46

(52)

Em espécies dióicas, o parentesco dentro de progênies de polinização aberta pode ser composto por misturas de meios-irmãos e irmãos-completos, dependendo de como ocorreu à reprodução, se foi aleatória ou correlacionada. Ainda, os valores de coancestria entre parentes podem ser maiores do que o esperado entre dois meios-irmãos (0,125) ou irmãos-completos (0,25), caso estes tenham sido gerados por cruzamentos entre parentes. O coeficiente de coancestria estimado dentro das progênies foi maior que o esperado em progênies de meio-irmãos em todas as progênies de ambas as populações. Isto indica que muitos dos cruzamentos foram correlacionados ou endogâmicos. A taxa de cruzamentos correlacionada pode ser estimada em espécies dióicas do coeficiente de coancestria médio dentro de progênies, usado a expressão sugerida por Sousa et al. (2005): 4 0.125(1F_p)(1r_p), em

que Fp é o coeficiente de endogamia na geração parental (aqui Fp=0 em ambas as

populações) e r_p é a correlação de paternidade, a qual mede a proporção de progênies de

cruzamentos que são irmãos-completos. Assumindo F_p=0, conforme estimativa do índice de

fixação em ambas as populações (Tabela 3) e isolando o rp na expressão de Sousa et al.

(2005) [rp (4/0,125)1], estima-se uma correlação de paternidade de 0,35 e 0,32 nas

populações Aramina e Selvíria, respectivamente. Portanto, aproximadamente 30% das progênies eram parentes no grau de irmãos-completos. Isto significa que as árvores matrizes de Aramina e Selvíria receberam pólen de poucas árvores doadoras (aproximadamente 2,9 e 3,1 árvores, N_ep 1/r_p). Em outros termos, significa que as árvores matrizes destas

populações possuem uma pequena vizinhança reprodutiva.

(53)

coancestria entre plantas nas populações (<0,007). Isso, em termos teóricos sugere que uma baixa endogamia poderia ser esperada pelo cruzamento aleatório no atual banco de germoplasma.

O entendimento da relação entre o tamanho efetivo e o tamanho real de uma população é de fundamental importância para o planejamento de estratégias de conservação. Sob cruzamentos perfeitamente aleatórios e se as progênies amostradas tivessem recebido pólen de diferentes conjuntos gênicos, o tamanho efetivo deste conjunto de progênies de cada população seria de 100 [Ne 4x(0,5/0,125)]. Em outras palavras, estas 25 progênies compostas

(54)

Uma grande utilidade prática da estimativa do tamanho efetivo é sua utilidade para estimar o número de árvores matrizes (m) para a coleta de sementes (SEBBENN, 2003).

Sebbenn (2003) propôs que este número de matrizes pode ser estimado diretamente do tamanho efetivo alvo que se pretende conservar ou amostrar (N_e₍_reference₎), dividido pelo

tamanho efetivo médio das progênies, m N_e₍_reference₎/N_e. Esta expressão é baseada em três

pressuposições básicas: i) as árvores matrizes onde é feita a coleta das sementes não são parentes entre si; ii) as árvores matrizes não fertilizam uma a outra e; iii) as árvores matrizes compartilham diferentes conjunto gênicos, ou seja, não existe sobreposição no conjunto gênico recebido pelas diferentes árvores (ausência de meios-irmãos paternos). Caso todas estas pressuposições sejam satisfeitas a expressão sugerida por Sebbenn (2003) é válida. Como M. urundeuva é dióico, a pressuposição ii é sempre verdadeira, visto que árvores

fêmeas não cruzam umas com as outras. Por outro lado, as outras duas pressuposições são mais difíceis de serem satisfeitas. É necessário que sementes sejam coletadas a grandes distâncias para evitar que as árvores matrizes sejam parentes entre si e para que o seu conjunto gênico polínico não seja sobreposto. Portanto, a mínima distância entre matrizes para a coleta de sementes não pode ser determinada somente com base em informações na estrutura genética espacial das populações, mas sim também em informações na distância de dispersão de pólen e na área de vizinhança reprodutiva. Este tipo de estudo falta em M. urundeuva, bem como na grande maioria das espécies arbóreas. Como exemplo, assumindo

que todas as três pressuposições citadas são validas e que o objetivo é reter uma amostra com um tamanho efetivo de 150, o número médio de árvores matrizes necessárias para a coleta de sementes seria de 51 (m 150/2,96) na população Aramina e de 49 (m 150/3,04) na Selvíria.

(55)

regra de três. Por exemplo, se estas sementes de polinização aberta de 25 matrizes representam tamanhos efetivos de 71,1 e 67,46, para ter-se um tamanho efetivo de 150 na amostra seria necessário coletar sementes de 53 (m Ne(reference)xnmatrizes/Ne 150x25/77,1, em que

matrizes

n é o número de árvores matrizes onde foi feita a coleta de sementes) árvores matrizes na

população Aramina e de 56 (m 150x25/67,46) árvores matrizes na população Selvíria.

Portanto, seriam necessárias amostras de mais 28 e 31 árvores matrizes das populações Aramina e Selvíria para reter o tamanho efetivo de referência de 150 de cada população.

Finalmente, os resultados obtidos nas populações estudadas de M. urundeuva,

mostram que existe a possibilidade de utilização destas em programas de conservação e melhoramento genético. Por apresentarem uma alta diversidade genética, mais acentuada na população de Selvíria, essas populações podem ser utilizadas em programas de conservação, desde que o tamanho efetivo populacional conservado ex situ seja aumentado

significativamente, visto que a presença de parentesco entre e dentro de progênies reduziu substancialmente o tamanho efetivo das amostras.

4.4 - Sistema de Reprodução

A estimativa da taxa de cruzamento multilocos (t ) foi alta para a população de _m Aramina (1,000 r0,000) assim como para Selvíria (1,000 r 0,001) (Tabela 6). As altas taxas

de cruzamentos multilocos detectadas confirmam que a espécie é predominantemente de cruzamento. A estimativa da taxa de cruzamento unilocos que diz respeito ao cruzamento

entre indivíduos não aparentados (t_s ) foi igualmente alta para Aramina (0,989 r 0,003),

assim como para Selvíria (0,999 r 0,001) e próxima aos resultados estimados para

m

(56)

Resultados semelhantes obtidos em populações de espécies arbóreas tropicais tem sido relatado em diversos estudos do sistema de reprodução como Shoreasp. (MURAWSHI et al.,

1994), Shorea leprosula (LEE et al., 2000), Cariniana legalis (SEBBENN et al., 2000), Esenbechia leiocarpa (SEOANE et al., 2001), Chorisia speciosa (SOUZA et al., 2003), Caesalpinia echinata (GIUDICE NETO et al., 2005), Eschweilera ovata (GUSSON et al.,

2005) e Solanum lycocarpum (MARTINS et al., 2006).

A estimativa de diferença entre a taxa de cruzamento multilocos e unilocos (t - _m t ) _s tem sido utilizada para quantificar a ocorrência de cruzamentos endogâmicos ou, em outros termos, entre indivíduos aparentados (GUSSON et al., 2005). A diferença entre a taxa de

cruzamento multilocos e unilocos (t - _m t_s ) para Aramina foi de 0,011 (r0,003) e para a

população de Selvíria foi de 0,001 (r0,001). A julgar pelo intervalo de confiança a 95% de

(57)

Tabela 6 - Estimativa de parâmetros do sistema de reprodução em populações de

Myracrodruon urundeuva, onde Mat. é o número de matrizes; n é o número de progênies; t_m

e ts são a estimativas da taxa de cruzamento multilocos e unilocos, respectivamente; tmts

é a taxa de cruzamento entre parentes; r_p₍_m₎ é a correlação de paternidade.

Populações

Parâmetro Aramina-SP (IC95%) Selvíria-MS (IC95%)

Mat. 25 25

N 492 486

m

t 1,000 (0,000) 1,000 (0,001)

s

t 0,989 (0,003) 0,999 (0,001)

m

t - t_s 0,011 (0,003) 0,001 (0,001) )

m ( p

r

0,163 (0,029) 0,213 (0,021)

O sistema misto de reprodução tem sido conceituado como a mistura de cruzamentos aleatórios e autofecundações e desconsidera a ocorrência de cruzamentos correlacionados, que também pode causar desvios de cruzamentos aleatórios (AZEVEDO, 2007). Os cruzamentos

correlacionados podem ser calculados pela correlação de paternidade (

m

p

r ), que mede a

proporção de indivíduos que foram gerados por cruzamentos correlacionados (irmãos

completos) (RITLAND, 1989). A estimativa de correlação multilocos de paternidade (

m

p r ) na

população de Aramina mostrou que 16,3% das progênies foram geradas por cruzamentos correlacionados e são parentes no grau de irmãos completos e 83,7% meios-irmãos. Na população de Selvíria a proporção de irmãos completos foi de 21,3% e 78,7% de meios-irmãos. A estimativa da correlação de paternidade em M. urundeuva foi relativamente alta

(58)

(59)

5 – CONCLUSÕES

x Existe alta diversidade genética nas populações conservadas ex situ, embora

também exista endogamia.

x No longo prazo, pode ocorrer aumento da endogamia, devido à maior

probabilidade de cruzamentos entre indivíduos aparentados.

x A diversidade genética na população Aramina sofreu um maior efeito da

intervenção antrópica.

x A maior diversidade genética encontra-se dentro das populações. x Ocorreu cruzamento entre indivíduos parentes nas populações.

x As progênies de polinização aberta são compostas por misturas de meios irmãos e irmãos completos.

x A estratégia de conservar parte desta diversidade natural ex situ foi eficiente, e