DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA ESPACIAL EM DUAS POPULAÇÕES
DE
Myracrodruon urundeuva
Fr. All. SOB DIFERENTES CONDIÇÕES
ANTRÓPICAS
1Mario Luiz Teixeira de Moraes2, Paulo Yoshio Kageyama3 e Alexandre Magno Sebbenn4
RESUMO – O objetivo deste trabalho foi estudar, por locos isoenzimáticos, a diversidade e a estrutura genética espacial de genótipos de Myracrodruon urundeuva em duas populações naturais, uma no Sudoeste (Selvíria– SEL) e outra no Sudeste (Paulo de Faria–PFA) do Brasil. Para isso, foram avaliados cinco sistemas isoenzimáticos, 25 e 30 indivíduos adultos das populações SEL e PFA, respectivamente. A estimativa da divergência genética entre populações foi baixa (0,043). As heterozigosidades observada e esperada foram altas nas populações (0,317 e 0,511, respectivamente), e o excesso significativo de heterozigotos foi detectado na população PFA (-0,252). A análise da distribuição genética espacial dos genótipos a partir do índice I de Moran revelou estruturação
significativa até 5.224 m na população mais explorada (SEL=0,09) e tendência à distribuição aleatória na população menos explorada (PFA=-0,02). A provável causa da estruturação na população SEL foi a dispersão de sementes próxima às árvores-matriz, associada ao processo de recolonização a partir de sementes oriundas de poucos genótipos remanescentes. As implicações dos resultados são discutidas do ponto de vista da conservação e do melhoramento genético.
Palavras-chave: Espécies arbóreas, índice I de Moran, diversidade genética e isoenzimas.
DIVERSITY AND SPATIAL GENETIC STRUCTURE IN TWO POPULATIONS OF
Myracrodruon urundeuva
Fr. All
. UNDER DIFFERENT ANTROPIC CONDITIONS
ABSTRACT – The diversity and spatial genetic distribution of Myracrodruon urundeuva genotypes were studied in two Brazilian populations in the Southwest (Selvíria-SEL) and Southeast Brazilian regions (Paulo de Faria-PFA). Twenty-five and thirty adult individuals were evaluated for five allozyme systems in SEL and PFA populations, respectively. Estimates of the genetic divergence between populations were low (0.043). Observed and expected heterozygosities were high in both populations (0.317 to 0.511, respectively). Significant and excessive number of heterozygotes was detected in PFA population (-0.252). The spatial distribution analysis through Moran’s index I revealed a significant structuring up to 5,224 m in the more exploited population (SEL =0.09) and a trend to randomness in the less exploited area (PFA=-0.02). Seed dispersion near mother trees and the recolonization process through seeds from few genotypes are probable causes of the structuring in the SEL population. The implications of the results are discussed from the conservation and breeding point of views.
Key words: Forest tree species, I Moran index, genetic diversity and allozymes.
1 Recebido em 16.06.2003 e aceito para publicação em 25.11.2004. 2 FEIS/UNESP, Av. Brasil Centro, 56, 15385-000 Ilha Solteira-SP.
Mato-Grossense e Pantanal Mato Grossense (CARVALHO, 1994). M. urundeuva é considerada espécie
dióica (SANTIN e LEITÃO FILHO, 1991), mas há relatos de monoicia (NOGUEIRA et al., 1982) e ocorrência de hermafroditismo juntamente com dioicia (CARVALHO, 1994). Os frutos são dispersos por anemocoria (CARVALHO, 1994), e a polinização é feita por abelhas.
A reprodução por cruzamentos, a ampla distribuição geográfica e a capacidade de adaptar-se a diversos ecossistemas evidenciam que M. urundeuva apresenta
altos níveis de variabilidade genética. Contudo, no passado, a espécie foi muito explorada devido às qualidades e utilidades de sua madeira para construção civil e indústria moveleira (CARVALHO, 1994). Atualmente, M. urundeuva é pouco encontrada na região
centro-sul do Brasil, especialmente no Estado de São Paulo, onde não é mais possível encontrá-la em grandes proporções em seu estado silvestre, a não ser em reservas estaduais e pequenas reservas particulares. Nestas, às vezes, observa-se que a distribuição é agrupada em forma de manchas, formadas por menos de uma centena de indivíduos. As manchas podem ser constituídas pela dispersão das sementes próximas às árvores-matriz, o que favorece a estruturação genética das populações.
A maior parte da variação genética encontra-se dentro de populações (97,26%) e apenas 2,74%, entre populações (MORAES, 1992). Desse modo, a estrutura genética dentro de populações de aroeira passa a ter fundamental importância, pois se refere à distribuição não-aleatória dos genótipos, formando manchas, onde as freqüências alélicas são mais homogêneas do que a esperada pela pressuposição de dispersão aleatória de genótipos. A estrutura genética espacial dentro de populações de plantas é primariamente determinada pelos efeitos da limitada dispersão de pólen e sementes, isolamento em pequenas manchas, mortalidade diferencial e seleção para micro-“habitats”. A estrutura genética
aumentar (COLES e FOWLER, 1976). O parentesco de uma geração, quando medido em termos de coancestria, corresponde à endogamia que pode ser gerada na descendência, se os indivíduos forem cruzados.
O principal tema deste artigo é a distribuição espacial de genótipos de M. urundeuva dentro de duas
populações com diferentes históricos de antropização: Selvíria, MS, no sudoeste, e Paulo de Faria, SP no Sudeste brasileiro. O objetivo foi avaliar a diversidade e a distribuição espacial de genótipos de M. urundeuva
em duas populações, sob diferentes condições antrópicas, para estudos de conservação e melhoramento de populações.
2. MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi realizado em duas populações de
M. urundeuva, Selvíria, MS (SEL), e Paulo de Faria,
exemplares da espécie. Embora não existam levantamentos fitossociológicos nessas áreas, relatando a densidade de indivíduos por hectare, é possível observar que
M. urundeuva encontra-se em baixa densidade em ambas
as populações (1 a 5 indivíduos por hectare).
As sementes foram utilizadas para determinar o genótipo materno, devido à dificuldade de revelação de número suficiente de locos isoenzimáticos que permitisse a avaliação adequada dos genótipos adultos. O genótipo das árvores maternas foi inferido a partir da segregação de suas progênies (20 progênies por planta materna, totalizando 500 plântulas em SEL e 600 em PFA), com base no genótipo parental mais provável, segundo o método de Brown e Allard (1970), utilizando o programa MLTR (RITLAND, 1997).
Tecidos foliares de aproximadamente 20 plântulas por progênie foram avaliados por eletroforese de isoenzimas no Laboratório de Genética de Populações e Silvicultura do Departamento de Fitotecnia, Tecnologia de Alimentos e Socioeconomia da FEIS/UNESP, Ilha Solteira, SP. As enzimas foram extraídas de tecidos foliares, empregando-se aproximadamente 20 mg de tecido de limbo foliar, 10 mg de areia lavada, 7 mg de Polivinil 40 (PVP 40), 7 mg de Polivinil Pirrolidona-60 (PVP-Pirrolidona-60) e 200 microlitros da solução de extração número 1, de Alfenas (1998). A eletroforese foi a horizontal, conduzida em gel de amido de milho (penetrose 30) a 12%, usando-se o tampão eletrodo-gel tris citrato, pH 8,5. As corridas foram realizadas em geladeira à temperatura de 5° C, em corrente constante. Foram avaliados cinco sistemas isoenzimáticos: aspartato aminotransferase (AAT), leucina aminopeptidase (LAP), fosfoglucose isomerase (PGI), 6-fosfogluconato desidrogenase (6PGDH) e fosfoglucomutase (PGM). O protocolo de revelação das isoenzimas foi o mesmo descrito por Alfenas (1998). Os locos foram designados seqüencialmente com o alelo de maior migração anodal denominado 1, o próximo 2, e assim por diante. As enzimas selecionadas expressaram fenótipos consistentes em estrutura de subunidades e interpretação genética de outros estudos em plantas, como documentado por Wendel e Weeden (1989) e Alfenas (1998), apesar de a base genética dos locos não ter sido testada por cruzamentos controlados.
A diversidade genética intrapopulacional foi analisada pelo número médio de alelos por locos ( , obtido pela divisão do número total de alelos pelo número
de locos), porcentagem de locos polimórficos ( , obtido pela divisão do número de locos polimórficos pelo número total de locos), sendo um loco considerado polimórfico quando a freqüência do alelo mais comum não ultrapassava 95%, heterozigosidade observada ( , em que: = freqüência dos genótipos homozigotos) e diversidade gênica esperada em equilíbrio de Hardy-Weinberg ( , em que: pi= freqüência alélica estimada do i-ésimo alelo), estimados
a partir do programa BIOSYS-1 (SWOFFORD; SELANDER, 1989). Também, foi estimado o índice de fixação não viesado ( ), com base em Weir (1996):
.
A distribuição da variabilidade genética entre e dentro das populações foi calculada pelo coeficiente de coancestralidade ( ), obtido por análise da variância de freqüências gênicas, segundo Weir (1996). A significância estatística dos valores médios de e foi calculada pelo intervalo de confiança a 95% de probabilidade, utilizando-se 10.000 reamostragens
bootstrap sobre locos e usando o programa GDA, de
Lewis e Zaykin (1999).
A distribuição espacial dos genótipos foi analisada por autocorrelação espacial, empregando o índice I,
de Moran. Para análise de autocorrelação espacial, os dados de cada genótipo foram codificados para suas freqüências alélicas, ou seja, quando o genótipo era homozigoto, no alelo sob análise recebeu valor 1,0, quando heterozigoto recebeu valor 0,5 e quando homozigoto para outro alelo recebeu valor 0,0 (SOKAL e ODEN, 1978). Se o loco era dialélico, a análise era feita em apenas um dos alelos, já que o segundo contribui com informação idêntica. Quando o loco tinha mais de dois alelos, a análise foi realizada em todos os alelos. Em cada população foram criadas cinco classes de distâncias, devido ao pequeno tamanho amostral (n)
das populações (25 genótipos em SEL e 30 em PFA). Maior número de classes implicaria menor número de pares possíveis de comparações de genótipos dentro de cada classe [n(n-1)/2x5]. Portanto, menor poder para
wij= 0; W é a soma de todos os pesos (contagem de
todos os pares usados em todos os casos); e é o desvio da freqüência alélica da i-ésima célula da média. O valor
esperado de I = -1/(n-1) aproxima-se de zero em grandes n. Os valores estimados do índice I de Moran foram
usados para testar a significância dos desvios dos valores esperados sobre a hipótese de nulidade de distribuição aleatória (CLIFF e ORD, 1981). A significância total de cada correlograma foi testada, usando-se critérios de Bonferroni (SAKAI e ODEN, 1983). As análises de autocorrelação espacial e os testes foram realizados empregando-se o programa SAAP (versão 4.3), de D. Wartenberg (WARTENBERG, 1989).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os cinco sistemas isoenzimáticos revelaram seis locos, sendo cinco polimórficos, em ambas as populações, segregando de dois a três alelos, e um monomórfico (Pgm1) na população PFA. O mesmo número médio de alelos por loco ( =2,33) foi encontrado nas duas populações, com a ressalva de que a população PFA apresentou maior porcentagem de locos polimórficos ( =0,830), heterozigosidade observada ( =0,511) e esperada em equilíbrio de Hardy-Weinberg ( =0,408) (Tabela 1). Em espécies como M. urundeuva, que se
M. urundeuva apresentam valores muito superiores
a esses. Outras espécies arbóreas tropicais dióicas também têm revelado altos níveis de heterozigosidade: 0,182 em Genipa americana L. (SEBBENN et al., 1998),
0,450 em Rhus trichocarpa M. (CHUNG et al., 1999)
e 0,277 em Eurya japonica T. (CHUNG e EPPERSON,
2000), embora inferiores aos detectados em M. urundeuva.
A divergência genética entre as populações ( ) foi baixa, 0,043 (0,002 a 0,100), mas estatisticamente diferente de zero. A distribuição da diversidade genética entre e dentro de populações, em locos neutros, como a maioria das isoenzimas estudadas em plantas, é determinada pelo sistema de reprodução, deriva genética e fluxo gênico. Espécies alógamas, polinizadas por animais e dispersas pelo vento, como M. urundeuva, geralmente
apresentam baixos níveis de divergência genética entre populações (HAMRICK e LOVELESS, 1986). A baixa divergência genética entre as populações indica que o fluxo gênico é alto entre as populações e que os polinizadores e a dispersão de sementes pelo vento seriam capazes de transpor a longa distância que as separa (aproximadamente 250 km). Entretanto, atualmente estas se encontram isoladas por culturas agrícolas, aglomerados urbanos, estradas etc., e a baixa divergência reflete, provavelmente, o fluxo gênico ocorrido no passado, quando as florestas eram contínuas ou ocupavam grande parte da extensão que as separaram e não o fluxo atual. O isolamento, possivelmente, no futuro reflitirá em aumento na diferenciação entre populações por deriva genética.
A análise da distribuição espacial dos genótipos, a partir do índice I, de Moran, revelou forte estruturação
na população SEL e fraca na população PFA (Tabelas 2 e 3 e Figura 1). Na população SEL, foram encontrados nove valores de I Moran (22,5% dos valores)
significativamente diferentes do esperado (-0,042), sendo quatro positivos na classe 1, dois negativos na classe 2, um negativo na classe 3 e dois negativos na classe
População n (95%)
Selvíria-SEL 25 2,33 40 0,333 0,317 -0,053 Paulo de 30 2,33 83 0,511 0,408 -0,258* Faria-PFA
*: P≤ 5%; A significância do índice foi estimada pelo intervalo
de confiança a 95% de probabilidade, a partir de 10.000 reamostragens
bootstrap. n = número de árvores amostradas; = número médio
de alelos por loco; = porcentagem de locos polimórficos; = heterozigosidade observada; = heterozigosidade esperada; e = índice de fixação.
Tabela 1 – Índices de diversidade genética em árvores adultas
de duas populações de M. urundeuva
5 (Tabela 2). Para o correlograma total, quatro dos 10 casos (alelos) foram significativos, reforçando a hipótese de estruturação. Indícios de estruturação são observados também na estimativa média do índice I, de Moran,
por classe de distância (Tabela 2 e Figura 1), em que
I assume valores positivos nas três primeiras classes
e negativos nas duas últimas, apesar de nenhum valor médio ser estatisticamente diferente do esperado. Na população PFA, foram observados apenas quatro valores de I, de Moran (8,8% dos valores), estatisticamente
diferente do esperado (-0,034), sendo um valor positivo na primeira classe de distância e três negativos nas classes 2, 3 e 4 (Tabela 3). O correlograma total dos alelos não foi significativo para nenhum dos valores,
e os valores médios do índice I, de Moran, foram todos
baixos, negativos e não-significativos, reforçando a hipótese de ausência de estruturação. A forte estruturação na população SEL e ausência na PFA devem estar associada ao fato de a primeira população ter sido formada a partir da regeneração após a exploração, enquanto a população PFA foi pouco explorada. A regeneração a partir de sementes de poucos indivíduos (gargalo genético), combinada com a disponibilização de espaço para recolonização (área explorada), pode ser a explicação para a mais forte estruturação detectada na população SEL. Resultado semelhante, no que se refere à perturbação antrópica na estruturação de populações de aroeira, foi encontrado por Lacerda e Kageyama (2003) no semi-árido brasileiro.
*: P≤ 5% e **: P≤ 1%.
P: Significância total do correlograma (aproximação de Bonferroni).
Classes de Distância (Número de Pares)
Loco Alelo 5.224 m (60) 8.810 m (60) 11.830 m (60) 14.795 m (60) 19.654 m (60) P
Aat1 1 0,30** -0,16 -0,11 -0,05 -0,19 0,006
2 0,29** -0,17 -0,15 -0,00 -0,19 0,006
3 0,01 -0,13** -0,10 0,01 0,01 0,033
Aat2 1 -0,01 -0,16 -0,02 -0,02 -0,01 0,759
Lap1 1 0,03 -0,14 0,20* -0,03 -0,26* 0,078
2 0,04 -0,17 0,08 -0,05 -0,12 0,615
3 0,27** 0,13 -0,17 -0,21 -0,23* 0,010
Pgi1 1 0,15* -0,22* 0,09 -0,17 -0,05 0,208
6Pgdh1 1 -0,03 -0,05 -0,06 -0,05 -0,03 1,000
Pgm1 1 -0,16 0,02 -0,05 0,03 -0,05 0,741
Média 0,09 -0,10 -0,03 -0,05 -0,11
Tabela 2 – Índices I de Moran para classes de distâncias na população SEL de M. urundeuva
Table 2 – Indexes of Moran I for classes of distances in SEL population of Myracrodruon urundeuva
Classes de Distância (Número de Pares)
Loco Alelo 4 m (87) 9 m (87) 18 m (87) 78 m (87) 223 m (87) P
Aat1 1 -0,13 -0,01 -0,04 0,05 -0,05 0,350 Aat2 1 -0,02 -0,13 0,05 -0,07 0,00 0,592 Lap1 1 0,03 -0,20* -0,00 -0,01 -0,00 0,136 2 -0,09 -0,07 0,02 -0,02 -0,00 1,000 3 -0,06 -0,10 0,03 -0,02 -0,02 1,000 Pgi1 1 -0,05 -0,07 -0,02 -0,03 -0,00 1,000 2 -0,07 -0,04 -0,01 -0,05 -0,01 1,000 3 0,12* -0,05 -0,21* 0,03 -0,07 0,087 6Pgdh1 1 0,09 -0,04 -0,09 -0,15* 0,01 0,170 Média -0,02 -0,08 -0,03 -0,03 -0,02
*: P≤ 5% e **: P≤ 1%.
P: Significância total do correlograma (aproximação de Bonferroni).
Tabela 3 – Índices I de Moran para classes de distâncias na população PFA de M. urundeuva
A população SEL apresentou fortes evidências de estruturação genética espacial nas duas primeiras classes de distâncias, indicando que árvores distanciadas até aproximadamente 5.224 m possam ser aparentadas em algum grau e que, provavelmente, existe um limite para a dispersão de sementes na espécie. A formação de estruturação dentro de populações pode ser causada pela combinação de várias forças evolutivas, como dispersão de pólen e sementes, deriva genética, seleção para micro-“habitats” e natureza do tempo de colonização (CHUNG et al., 1999). A dispersão de sementes pelo vento em M. urundeuva possivelmente ocorre em maior
intensidade até a distâncias de aproximadamente 5.200 m, favorecendo a formação de manchas. A principal implicação da estruturação é o aumento da probabilidade de cruzamentos entre indivíduos aparentados, o que
na população SEL foi maior que a relatada em outros estudos. Em Acer saccharum M. (PERRY e KNOWLES,
1991), Quercus margaretta A. (BERG e HAMRICK,
1994), Rhus trichocarpa M. (CHUNG et al., 1999), Eurya japonica T. (CHUNG e EPPERSON, 2000), Machaerium villosum V. (GIUDICE NETO e KAGEYAMA, 2000) e Pinus estrobus L. (EPPERSON; CHUNG, 2001), o raio
da mancha não foi superior a 50 m. A dispersão de sementes por anemocoria, associada à disponibilidade de espaço para o crescimento da população SEL, devido à exploração, pode ser a causa do maior tamanho da mancha em M. urundeuva. Porém, outros fatores podem
estar envolvidos, como a dispersão secundária de sementes por animais.
M. urundeuva é predominantemente dióica.
Portanto, autofecundações devem ser raras, e o cruzamento entre parentes deve ser a principal forma de geração de endogamia nas populações. A estruturação das populações pode favorecer a ocorrência de cruzamentos entre indivíduos aparentados e gerar endogamia. Contudo, o índice de fixação ( ) detectado nas progênies foi alto, mas não significativo na população SEL (0,122) e alto e significativo na população PFA (0,180). Provavelmente, isso esteja associado ao pequeno tamanho amostral na geração adulta e ao fato de que a amostragem só representou as árvores femininas das populações, o que poderia estar subestimando a verdadeira estruturação, devido à possibilidade de existir parentesco entre árvores masculinas e femininas. No entanto, o índice nas árvores adultas foi negativo e significativo na população PFA (-0,258) e negativo, mas não-significativo na população SEL (-0,053), indicando ausência de endogamia em ambas as populações e indícios de seleção a favor de heterozigotos na população PFA. A presença de endogamia nas progênies e a ausência e endogamia nos adultos de populações estruturadas constituem um indicativo de seleção contra homozigotos. Seleção contra homozigotos tem sido reportada em inúmeras espécies
Figura 1 – Correlograma dos valores significativo e médio
do índice I de Moran para cinco classes de distância em populações de Myracrodruon urundeuva, localizadas em Selvíria (SEL) e Paulo de Faria (PFA).
arbóreas, como: Pinus ponderosa L. (LINHART et al.,
1981), Picea mariana (Mill.) B.S.P. (BOYLE e
MORGENSTERN, 1986), Eucalyptus rhodantha B. &
S. (SAMPSON et al., 1989), Eucalyptus argutifolia
G. & B. (KENNINGTON e JAMES, 1997), Eucalyptus marginata (MILLAR et al., 2000) e Metrosideros excelsa
Sol. ex Gaertn (SCHIMIDT-ADAMS et al., 2000), entre outros.
Os resultados obtidos têm fortes implicações para a conservação e o melhoramento genético da espécie. Para fins de amostragem, tanto para o melhoramento quando para a conservação genética das populações estudadas, a estruturação detectada na população SEL mostra a necessidade de se coletarem sementes em árvores distanciadas entre si por mais de 5.200 m, para evitar coletar sementes de árvores aparentadas. A coleta de sementes em árvores distantes 100 m entre si tem sido preconizada para evitar árvores aparentadas, em programas de melhoramento e conservação genética (SHIMIZU et al., 1982; ELDRIDGE et al., 1993). Para a população SEL, os resultados indicam que essa estratégia pode ser ineficiente, por tratar-se de uma população com baixa densidade populacional e ter sido submetida a uma alta intensidade de exploração. Provavelmente, as matrizes amostradas sejam descendentes de poucos indivíduos remanescentes. Nesse caso, a coleta deveria ser feita em árvores espaçadas por mais de 5.000 m. Essa prática, em populações estruturadas, evita que matrizes aparentadas sejam amostradas para os testes de progênies, mas não evita que sementes advindas dos cruzamentos entre parentes dentro das manchas sejam incluídas no teste (SEBBENN, 2002). Portanto, níveis de endogamia podem ser esperados nos testes de progênies de M. urundeuva, sendo estes
tanto maiores quanto maior for a coancestria entre os indivíduos que darão origem às sementes. Se os níveis de endogamia forem altos, a herança de caracteres quantitativos, em programas de melhoramento, deve ser avaliada por modelos que considerem desvios das pressuposições de cruzamentos aleatórios. Em termos de conservação genética, a estruturação indica que maiores tamanhos populacionais deverão ser conservados in situ como retidos ex situ, visto que
o parentesco e a endogamia reduzem tanto o tamanho efetivo de endogamia quanto o de variância.
Em vista da endogamia detectada nas populações, outra alternativa seria procurar populações sem endogamia e parentesco para a conservação in situ
e coleta de sementes para programas de melhoramento, conservação ex situ e recuperação de áreas degradadas.
A avaliação da estrutura genética espacial de M. urundeuva, em um número maior de populações e
utilizando amostras maiores (pelo menos 50 indivíduos por população) do que as utilizadas no presente estudo (25 a 30), é desejável para o melhor entendimento da escala espacial da estruturação. A amostragem de 50 indivíduos adultos permitiria que número maior de classes de distâncias fosse utilizado no estudo da distribuição espacial de genótipos da espécie e, conseqüentemente, entender melhor a escada de estruturação.
4. CONCLUSÕES
1. Existe baixa divergência genética nas freqüências alélicas entre as populações estudadas de M. urundeuva.
2. Os níveis de variabilidade genética intrapopulacionais são altos, quando comparados com outras espécies arbóreas.
3. Existem fortes indícios de estruturação genética espacial na população mais explorada (Selvíria-MS), enquanto na população menos explorada (Paulo de Faria, SP) os indícios são de distribuição aleatória dos genótipos.
4. Os níveis de fixação de alelos são menores nas árvores adultas, comparativamente com a fase de plântulas, indicando a existência de seleção contra indivíduos endogâmicos.
5. AGRADECIMENTOS
Os autores são gratos à Selma Maria Bozzite de Moraes e à Elza Martins Ferraz, pelo apoio nas análises de isoenzimas; a Alexandre Marques da Silva, Gelson Dias Fernandes, Ailton dos Reis, Manoel Fernandes da Rocha Bonfim e José Cambuim, pela assistência no trabalho de campo; à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo financiamento do projeto; ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelas bolsas concedidas; e aos três revisores anônimos, pelas correções e sugestões no manuscrito.
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