REINFECÇÕES POR ROTAVÍRUS EM C R I A N Ç A S DE BELÉM, PARÁ, BRASIL (*)
A l e x a n d r e C . L I N H A R E S ( 1 ) , R o n a l d o B . F R E I T A S ( 1 ) , Y v o n e B . G A B B A Y ( 1 ) Se
Joana D ' A r c M . P E R E I R A ( 2 )
R E S U M O
Reinfecções por rotavírus foram detectadas em 7 (9,2%) de 76 crianças ha-bitantes da periferia de Belém, Pará, Brasil, no decurso de seus primeiros 20 meses de vida. A presença de rotavírus classificados no subgrupo II ("long pattern") foi assinalada, tanta na primeira como segunda infecções, em cinco desses indivíduos. Em duas situações, a primeira infecção foi causada por rota-vírus subgrupo II e, a reinfecção, por rotarota-vírus de subgrupo não claramente ca-racterizado. Seis diferentes padrões foram observados, não ocorrendo casos em que, numa única criança, se tenham assinalado perfis homólogos. O maior intervalo de tempo registrado entre duas infecções no mesmo indivíduo foi de
19 meses, enquanto que o menor, de 6. Formas sintomáticas em ambos os pro-cessos infecciosos se apresentaram em cinco crianças; em duas, os primeiros epi-sódios revelaram-se assintomáticos, sucedendo-se quadros diarréicos. Em seis dos sete indivíduos, observaram-se soroconversões para rotavírus durante a se-gunda infecção; durante a primeira, entretanto, a elevação significativa nos níveis de anticorpos grupo-específicos se registrou em apenas um caso (Paciente F). UNITERMOS: Rotavírus — Reinfecções por rotavírus em crianças
Epidemiologia — Pará, Brasil
I N T R O D U Ç Ã O
A importância dos rotavírus na etiologia tias gastroenterites infantis agudas, tem sido assinalada através de múltiplas investigações,
•quer em países de clima temperado 2 , 6 , i 5 , i 6 quer
em regiões tropicais 10,23,24, Estima-se8
, com efeito, que um milhão de óbitos por ano ocor-ram entre crianças acometidas de quadro diar-réico associado a esses agentes.
No Brasil, vários estudos 4,5,2a têm
registra-do a ocorrência de diarréias por rotavírus res-saltando-se invariavelmente a relevância que as-sumem esses patógenos. Na Amazônia,
parti-cularmente, LINHARES & col. têm relatado a expressiva freqüência com que esses vírus
inci-dem, tanto em comunidades urbanas2 0
como em
populações indígenas relativamente isoladasI 8.
Reconhecem-se atualmente32, cerca de
qua-tro sorotipos e dois subgrupos de rotavírus ca-pazes de infectar o homem, que podem ser de-tectados a partir de várias técnicas tais como: soroneutralização, fixação do complemento, imuno-microscopia eletrônica e ensaio imunoen-zímático. A análise eletroforética do genoma virai, originalmente descrita como recurso diag
(1) Instituto E v a n d r o C h a g a s , F u n d a ç ã o Serviços d e S a ú d e Pública, M i n i s t é r i o d a S a ú d e , C a i x a Postal 6 2 1 , B e l é m , P a r á , Brasil.
(2) Universidade Federal d o P a r á , C u r s o d e Licenciatura e m B i o l o g i a .
nóstico por ESPEJO & c o l . t e m sido utilizada por outros Autores com vistas à diferenciação dos rotavírus em dois subgrupos: I e II.
Investigações levadas a efeito por
PEREI-RA & col.2 6 em três cidades do Brasil,
assina-lam a maior prevalência do subgrupo II entre crianças portadoras de quadro diarréico agudo. Infecções subseqüentes em um mesmo indiví-duo não se têm registrado até então em nosso país. Tais ocorrências repetidas, entretanto, foram observadas em um estudo prospectivo
conduzido em uma creche na Bélgica1 3, onde
cinco crianças exibiram quadros de gastroente-rite aguda associados ao agente em questão, com aproximadamente um ano de diferença en-tre o primeiro e segundo episódios; não se determinaram, no entanto, os subgrupos ou so-rotipos envolvidos.
RODRIGUES & col.77 detectaram
reinfec-ção por rotavírus em paciente de 12 meses de idade, acometido nas duas ocasiões (11 meses de diferença) de diarréia; nesse caso demonstrou-se a participação de dois sorotipos distintos.
Observações de BISHOP & col.3
na Aus-trália também revelaram casos em que infec-ções neonatais foram sucedidas por outras, no curso dos três primeiros anos de vida. Dessas observações se concluiu que a infecção neonatal por rotavírus não confere imunidade contra uma subseqüente, porém, protege contra o de-senvolvimento, nessa última, de forma clinica-mente severa.
Os presentes achados são relativos à ocor-rência de reinfecções por rotavírus por primei-ros 20 meses de vida, em 76 crianças habitan-tes da periferia da cidade de Belém, Pará, Bra-sil, observadas no âmbito de um estudo longi-tudinal em curso nessa comunidade. Aspectos etiológicos, clínicos e imunitários são discuti-dos em particular.
MATERIAL E MÉTODOS
Crianças habitantes da periferia em Belém, Pará, em número de 76, foram acompanhadas ao longo de seus primeiros 26 meses de vida, face a um estudo prospectivo com duração pre-vista de três anos. Esses indivíduos pertencem a famílias que se caracterizam por baixas condi-ções sócio-econômicas, tendo sido freqüente
ob-servar-se, no início da investigação (dezembro de 1982), muitas casas em que não era disponí-vel a água potádisponí-vel; característico ainda é o ele-vado número de pessoas por residência (em ge-ral de madeira com 1 a 2 cômodos), incluindo vários menores de 5 anos, vivendo sob precá-rios padrões de higiene.
Ao nascimento colhiam-se: amostras de so-ro do cordão umbilical e da mãe, leite materno e mecônio do recém-nascido. Enquanto no hos-pital, as crianças eram visitadas diariamente, coletando-se fezes; por duas semanas após a al-ta hospial-talar, ocorriam visial-tas domiciliares em dias alternados, quando se obtinham os mes-mos espécimes; em casos de diarréia, além des-se material, colhiam-des-se: soros agudo e conva-lescente, bem como a secreção láctea da mãe. Decorridas essas duas semanas, cada partici-pante era visitado quinzenalmente, procedendo-se, sistematicamente, à coleta de fezes; em sín-dromes diarréicas, observava-se o anteriormen-te descrito.
Assinale-se que as mães foram orientadas quanto à caracterização dos episódios diarréi-cos: situações em que os espécimes exibem con-sistência anormal (pastosa ou aquosa), regis-trando-se várias (em geral mais de três) eva-cuações ao dia. Todos os pacientes portadores de quadro gastro-intestinal agudo eram aten-didos à domicílio por um médico que, parale-lamente à avaliação clínica, administrava, quan-do necessária, a terapêutica de reposição hídri-ca e eletrolítihídri-ca preconizada pela Organização
Mundial de Saúde ( O M S )3 1.
75 fíl por orifício, de PBS/T acrescido de EDTA (etileno-diamino-tetra-acetato), numa concentra-ção final de 0,01 M (PBS/T/EDTA); 25 /d de suspensões de fezes clarificadas, a 10% em PBS, foram acrescidos em duplicata (2 orifícios por espécime). As microplacas foram incubadas a 4°C "overnight" e, após, lavadas como
anterior-mente descrito. Sucedeu-se a adição de 100 i*l
em cada orifício, de soro hiperimune anti-rota-virus obtido em cobaia, diluído a 1:10 000 em PBS/T com albumina bovina a 1% v/v (PBS/ T/BSA); seguiu-se incubação a 37°C por 21/2 horas e imersão por 6 vezes consecutivas em PBS/T. Conjugado enzimático ("Kirkegaard and Perry") de imunoglobulina anti cobaia (prove-niente de cabra) com a fosfatase alcalina 1:200 em PBS/T/BSA, foi então utilizado na
quanti-dade de 100 fil por orifício. Nova incubação a
37°C, agora por 11/2 horas, foi observada, su-cedendo-se lavagem. Substrato enzimático de íosfato de paranitrofenil (Sigma 104-105; 1 *ig/ ml) em dietanolamina a 10% v/v, pH 9,8, foi
usado, sendo 100 /il por orifício. Depois de
per-manecer 20 min. a 37°C, a reação foi bloqueada através da adição de 50 /d de solução de hi-dróxido de sódio 3 M. A leitura das densidades títica (D.O.) foi realizada em microespectrofo-tômetro (Flow ELISA — reader Multiskan), uti-lizando-se filtro de 405 Nm. Todos os espécimes que exibiram valores de D.O. superiores a 0,1 foram, preliminarmente, considerados como po-sitivos; a seguir, submetidos a um "blocking test" utilizando soro hiperimune de cabra anti-rotavírus.
A classificação dos rotavírus em subgrupos foi estabelecida com base na eletroforese do genoma virai em substrato de gel de poliacri-lamida. O método utilizado consistiu,
basica-mente, no descrito por LAEMMLI1 7 contendo
modificações propostas por PEREIRA & cólP.
Tia coloração utilizou-se o nitrato de prata.
A pesquisa de anticorpos grupo específicos para rotavírus foi realizado consoante técnica
previamente descrita w.
Tanto o isolamento como a identificação de enterovírus se processaram com base nos
pro-cedimentos descritos por MELNICK2 2.
Quanto às técnicas bacteriológicas, fo-ram observadas aquelas recomendadas por
EDWARDS & E W I N G9
e, para o.estudo das
toxinas lábil ("LT") e estável ("ST") de
Esche-richia coli, os métodos de EVANS & EVANS 1 2
e DEAN & col.7. Não se procedeu à tentativa
de isolamento de Campylobacíer.
O exame parasitoscópico foi essencialmen-te o direto em que os espécimes (o mais pre-cocemente possível) foram misturados com so-lução salina fisiológica e examinados ao micros-cópio óptico comum.
RESULTADOS
A distribuição temporal das sete reinfecções-é representada na Pig. 1. Em apenas um casa (Paciente F) registrou-se primo-infecção no pri-meiro mês de vida, com desenvolvimento de quadro diarréico; as demais se observaram a partir dos três meses. O menor intervalo entre duas infecções na mesma criança foi de seis. meses, em uma situação (Paciente C), enquanto que o mais prolongado, de 19, em outra (Pa-ciente F). Todos os indivíduos foram infectados por rotavírus, pela primeira vez, no curso do primeiro ano de vida; as infecções subseqüen-tes por outro lado, ocorreram de 12 a 20 meses de idade. Em cinco crianças, o subgrupo II foi assinalado em ambas as infecções; em outras, duas não foi possível classificar-se as amostras associadas às reinfecções. Awenas duas situa-ções revelaram-se assintomáticas.
A Fig. 2 oferece a representação esquemáti-ca dos resultados obtidos à análise eletroforéti-ca dos genomas dos rotavírus. O "long pattern" foi registrado em 12 das amostras. Observaram-se Observaram-seis diferentes perfis, todos compatíveis com o subgrupo II, porém, não se registraram ho-mologias ao comparar-se os padrões da primei-ra e segunda infecções, em quaisquer dos casos em questão.
ente-rotoxigênicas (positiva para "LT") foram de-tectados era um espécime (Paciente A) obtido à primeira infecção: em outro caso (Paciente C) assinalaram-se, na primeira e segunda ocor-rências, respectivamente, esporos de cogumelos em brotamento e E. coli enteropatogênica. Fun-gos também ocorreram em um material (Pa-ciente E) e, E. histolytiea, em outro (Pa(Pa-ciente F). Esses dois últimos em segundas infecções associadas a rotavírus.
A Tabela II reúne os resultados relativos à pesquisa de imunidade para rotavírus. Em ape-nas uma das primo-infecções (Paciente P) se detectou viragem sorológica (soro agudo nega-tivo e, convalescente, posinega-tivo); em outro (Pa-ciente E) se denotou nítido declínico no nível de anticorpos (provavelmente de origem ma-terna) comparando-se a primeira e segunda amostras. Em contrapartida, nas reinfecções, denotaram-se invariavelmente soroconversões.
DISCUSSÃO
Sete casos de reinfecção por rotavírus fo-ram detectados no curso de um estudo longi-tudinal na área de Belém, Pará, Brasil.
Inves-tigações anteriores2
-13
.27
, também assinalaram a ocorrência de infecções repetidas por esse agen-te em um mesmo indivíduo. PONTEYNE & col.» relataram o acometimento de uma criança aos três meses, por subgrupo I, sucedendo-se, um ano após, gastroenterite mais severa pelo II. Note-se que em nosso estudo não se observou infecção pelo subgrupo I.
RODRIGUEZ & col.27
no México, descreve-ram caso de uma criança que desenvolveu dois episódios de diarréia, com 11 meses de dife-rença um do outro, em que foram envolvidos dois sorotipos. Ê possível que tal condição se tenha observado em Belém, uma vez que nos-sos dados se restringem à classificação em sub-grupos.
Em uma (Paciente F) das sete crianças ana-lisadas, ocorreu primo-infecção por subgrupo II nos primeiros 30 dias de vida. Dezenove meses depois notou-se gastroenterite por rotavírus com manifestações clínicas leves (sem sinais de desidratação), envolvendo também perfil ele-troforético longo. Tal condição foi assinalada
por BISHOP & col.3, ao evidenciarem que os
sintomas associados à infecção por esse vírus.
são significativamente menos freqüentes e seve-ros, em crianças antes infectadas na fase neo-natal.
Os intervalos de tempo observados entre duas intecçòes consecutivas em nosso estudo, variaram ae 6 a 19 meses. As iniciais situaram-se, invariavelmente, no primeiro ano de vida, enquanto as reinfecções, no segundo. A
ocor-rência desses episódios subseqüentes suscita a
hipótese de associação a sorotipos heterólogos.
Com efeito, alguns Autores1 referem existir até
quatro variedades antigênicas capazes de infec-tar o homem, diferenciáveis por técnicas de neu-tralização.
Não obstante em cinco casos de reinfecção, se tenham registrado subgrupos homólogos, admite-se o envolvimento de sorotipos diversos. Testes complementares, com vistas a elucidar esse aspecto, serão processados no "WHO Colla-borating Center for Reference and Research on Rotavírus", Birmingham Inglaterra. Acresça-se que a ocorrência do subgrupo II, corrobora achados anteriormente obtidos por PEREIRA
& col.20, em três cidades do Brasil. Os dois
ca-sos em que não se estabeleceu claramente o perfil eletroforético, talvez tenham decorrido da
baixa concentração de ácido nucléico obtida a
partir das amostras examinadas.
A análise genômica em questão, no presen-te estudo, revelou seis diferenpresen-tes padrões.
Esses achados configuram o amplo espectro
já antes relatado por LOURENÇO & col.21, que
detectaram 29 perfis desiguais em amostra bas-tante superior à nossa.
Em quatro episódios diarréicos denotou-se a presença de outros enteropatógenos associa-dos a rotavírus, destacando-se: Shigella sonnei, Escherichia coli enterotoxigênica e clássica, esporos de cogumelos em brotamento e E. his-tolytiea. Note-se que tais associações foram
pre-viamente assinaladas20 em investigações
envol-vendo crianças atendidas em hospitais de Belém, Brasil.
Em apenas dois casos a segunda infecção, do ponto de vista clínico, revestiuse
claramen-te de maior severidade de que a primeira; em
duas outras situações observou-se o inverso. Um fator que poderia determinar tais condições
relacio-nados aos quadros diarréicos em questão; nesse particular ressaltem-se os achados de YOLKEN & col.3 3
, caracterizando a maior expressão pa-togênica do subgrupo II, sorotipo I. Em nosso estudo, nótese que a concomitância de outros patógenos, não parece ter interferido no esta-belecimento de condições clínicas mais ou me-nos expressivas.
Outro provável condicionante do quadro clinico foi o tipo de aleitamento administrado à criança durante o processo infeccioso. Não
obstante alguns Autores3 0 destaquem o possível
papel protetor do leite materno contra infec-ções por rotavírus, isso não se observou no presente estudo. Com efeito, um dos indivíduos, cujo primeiro episódio revelou-se clinicamente mais severo que o segundo, recebia aleitamen-to natural quando houve primo-infecção; para-doxalmente, durante a reinfecção, menos seve-ra, a alimentação era artificial.
Na Tabela II avaliou-se o estado imunitário no curso das infecções estudadas. BISHOP &
col.3
assinalam que a ocorrência de rotavírus durante a fase neonatal não confere, em geral, imunidade para rotavírus. Em nosso estudo, a única viragem sorológica detectada em primo-infecção, envolveu criança infectada em seu pri-meiro mês de vida (Paciente F).
Por outro lado, às reinfecções, o fenômeno da soroconversão foi registrado em seis indiví-duos. Tais resultados, aparentemente contradi-tórios, merecem avaliação mais precisa, a
par-SUMMARY
Reinfections by rotavirus in children living in Belém-Pará — Brazil
Reinfections caused by rotavirus were detected in 7(9.2%) out of 76 children from Belém, Pará, Brazil, followed up since birth to twenty months of age. Rotavirus subgrupo II ("long pattern") in both infections was noted in five children. In two, the first infection was asso-ciated with subgroup II and the second ones with a strain whose electropherotype was not determined. Six different electropherotypes were observed in these cases and no homolo-gous profiles were associated with reinfections in the same child. The lenght of time between the two infections ranged from six to 19 months. Diarrhoea in both infections was. observed in five children; in two of them, however, first episodes were asymptomatic. Seroconversions to rotavirus were noted in six of the seven children, during reinfection. In the first infec-tions, however, seroconversion was observed in only one case (Paciente F).
tir de observações que abranjam uma amostra de maiores proporções.
AGRADECIMENTOS
Formulamos nosso agradecimentos ao apoio técnico proporcionado pelos Srs. Antônio Fran-cisco Pires Martins e Antônio de Moura, bem como pelo trabalho datilográfico das Srtas. Si-mone Rosa de Oliveira e Maria da Conceição Mendes Chagas.
R E F E R Ê N C I A S B I B L I O G R Á F I C A S
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