Caracterização genética, andrológica e congelabilidade do sêmen em cães da raça Fila Brasileiro

ANÍBAL SOUZA FELIPE DA SILVA

CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA, ANDROLÓGICA E

CONGELABILIDADE DO SÊMEN EM CÃES DA RAÇA

FILA BRASILEIRO

Belo Horizonte

Escola de Veterinária – UFMG 2012

Tese apresentada à Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciência Animal.

Curso: Ciência Animal Área: Reprodução

“A maior virtude do homem é saber esperar trabalhando sempre.”

Luiz de Mattos

“Estuuuda, menino!”

Pai

Ao meu pai José Luís Felipe da Silva, dedico esta conquista e o que ela representa e ainda representará: um passo importante e maduro para que homens de bem possam

AGRADECIMENTOS

À minha família, em especial ao meu pai e à minha amada esposa Fernanda de Melo Felipe da Silva, que tanto incentivou e participou ativamente com empenho, críticas, companheirismo, mas principalmente com muito amor e alegria de todos os difíceis momentos necessários para levar a termo essa valiosa conquista.

Ao Estado Brasileiro que, através da UFMG, da CAPES e do CNPq proporcionou, da melhor forma possível, toda a estrutura para que os avanços constantes desta tese pudessem ser atingidos.

Ao Prof. Vicente Ribeiro do Vale Filho, orientador que sempre acreditou e estimulou a minha capacidade de realização. Um gentleman. Uma pessoa de rara inteligência e capacidade de amar a vida. Seu otimismo não conhece barreiras e força todo o Universo a conspirar a seu favor. É extremamente difícil descrever as razões pelas quais lhe sou eternamente grato. Mas, certamente, sua orientação transcendeu o acadêmico e a solidez técnica quase se constituiu um detalhe perto da amizade e do crescimento humano proporcionados pelo convívio com o Magnífico Mestre e Patrono! TURBILHÃO 5!!

Ao Prof. Venício José de Andrade por ter gentilmente cedido seu laboratório e toda a infra-estrutura para a realização dos nossos trabalhos, durante todos esses anos de produtivo convívio, e por sua fraternal paciência, amizade e orientação.

À Profa. Denise Aparecida Andrade de Oliveira e ao Marcelo Yukio Kuabara, esse casal dinâmico e extremamente competente, pelo apoio e orientação que, desde 2006, fez com que eu acreditasse que seria capaz de caracterizar geneticamente o Fila Brasileiro. A abertura do Laboratório de Genética Animal da EV-UFMG, a paciência e o trabalho de credibilidade e qualidade, foi fundamental para o sucesso dessa tese.

Ao Prof. Marc Roger Jean Marie Henry pela confiança e presteza na cessão de uso de materiais, de sua sala e do Sperm Class Analyser, fundamental para a realização das leituras objetivas do sêmen dos doadores estudados, mas também pelo senso de contribuição científica e capacidade de trabalho em equipe.

Ao Prof. Martinho de Almeida e Silva que enxergou e estimulou meu espírito científico, ainda no 5º.período do curso de Medicina Veterinária, iniciando o marco de trabalho e de evolução na minha trajetória acadêmico-científica.

Ao Prof. Edison Martins, lutador e profundo conhecedor das dificuldades de se conservar uma raça localmente adaptada (a Crioula Lageana), pelo incentivo ao nosso trabalho com o Fila Brasileiro e pelas contribuições como membro da banca examinadora de defesa de tese. Serra acima se encontra História, Tradição e Amizade...

À Dra. Mayara Brito Ferreira, ex-estagiária que se tornou parceira imprescindível nos momentos de coleta, processamento e análise do sêmen dos doadores, agradeço pela seriedade, esforço, dedicação e fidelidade ao trabalho e à ciência.

À Profa. Adriane da Costa Val (Tia) pela colaboração com o projeto piloto, cessão e autorização de uso do cão Spok (valeu, Spok!), fundamental para a padronização da técnica de congelamento.

Ao funcionário da Unidade de Processamento de Dados da EV-UFMG, Danilo Gonçalves Bastos, pela inestimável ajuda com as análises estatísticas, sempre com a máxima presteza, gentileza e competência. A EV-UFMG também tem o seu Steve Jobs!

Aos professores Vicente Ribeiro do Vale Filho, Antônio de Pinho Marques Júnior, Denise Aparecida de Oliveira e Fernando Antônio Bretas, membros da banca de qualificação; aos professores Daniel Cardoso Carvalho, Denise Aparecida de Oliveira, Guilherme Ribeiro do Valle e Vicente Ribeiro do Vale Filho, membros da banca de pré-defesa; obrigado pelas considerações importantes ao refinamento deste trabalho.

Aos criadores preservacionistas da raça, aguerridos que são na busca da conservação e divulgação deste patrimônio genético histórico cultural nacional, desejo que esta tese sirva de oportunidade para o início do aprofundamento em pesquisas científicas e para o trabalho conjunto em prol da preservação deste cão magnífico, o FILA BRASILEIRO.

Um agradecimento especial à amiga pesquisadora holandesa Ines van Damme, cujas contribuições para o registro da história do Fila, e a determinação em perpetuá-lo nos seus livros, foram fundamentais para a minha motivação pessoal na condução desse trabalho. Também aos criadores Paulo Angotti, Olegário Bretas, Adriano Pacheco e Jaroslav Pörs (Jerry, da República Tcheca), com os quais aprendi e vivi muito do Fila.

Aos padrinhos Latife e Carlos Renato, da Fazenda Água Fria, Xinguara-PA, por ajudarem a eternizar os Filas de Fazenda e pelo carinho e dedicação a eles (e a mim).

A todos os Filas Brasileiros que já passaram pela minha casa e pela minha vida. O compromisso continua...

Aos colegas da Sociedade Brasileira de Recursos Genéticos, entidade da qual tenho a honra de ser um dos sócios fundadores, em especial aos doutores Andréa Alves Egito, Samuel Rezende Paiva, Marcelo Correa e Fernanda Paulini,pelo apoio, contribuições, trabalhos conjuntos ou simplesmente por vibrarem juntos, de alguma forma, com a execução deste trabalho.

Ao Laboratório de Genética Animal da EV-UFMG e a todos os proprietários que forneceram DNA de seus animais e/ou que pacientemente levaram seus animais à EV-UFMG para a coleta de sêmen viabilizando esta pesquisa inédita e tão importante.

A todos os funcionários, professores e colegas da EV-UFMG que, de uma forma ou outra, contribuíram para minha formação ao longo desses bons e rentosos 12 anos e que estarão comigo em cada ação profissional deste médico veterinário, desenvolvida em conjunto e para o benefício da nossa sociedade, tão carente de quase tudo, na construção de um mundo mais justo, mais fraterno e, se Deus ajudar, um pouco melhor...

SUMÁRIO

RESUMO ... 11

ABSTRACT ... 12

INTRODUÇAO GERAL ... 13

Capítulo 1

1. REVISÃO DE LITERATURA... 1.1. A raça Fila Brasileiro... 1.1.2. Origens... 1.1.3. Pioneiros em Minas Gerais... 1.2. Diluição genética em raças brasileiras adaptadas... 1.3. Marcadores de DNA... 1.4. Caracterização genética por marcadores de DNA... 1.5. Conservação e Preservação de recursos genéticos animais... 1.6. Bancos de sêmen... 1.7. Produção espermática em cães... 1.8. Criopreservação de sêmen canino... 1.8.1 Diluidores para congelação de sêmen canino...

1.8.2 Curvas e métodos de congelação-descongelação... 1.9. Avaliação do sêmen canino... 1.9.1 Análises físicas... 1.9.1.1 Concentração espermática... 1.9.1.2 Motilidade... 1.9.2 Morfologia... 1.9.3 Testes funcionais de membranas... 1.9.3.1 Teste hipo-osmótico... 1.9.3.2 Sondas fluorescentes... 1.10 A inseminação artificial com sêmen congelado...

14 14 14 15 16 17 18 20 21 22 23 24 27 28 29 29 30 31 32 32 34 35

Capítulo 2 – Experimento I

Caracterização genética de cães Fila Brasileiro por meio de marcadores microssatélites... Resumo... Abstract... 2.1 Introdução ... 2.2 Material e Métodos ... 2.2.1 Animais e extração de DNA ... 2.2.2 Marcadores de DNA e amplificação ... 2.2.3 Caracterização dos marcadores e da diversidade genética ... 2.2.4 Estrutura genética da população... 2.3 Resultados e Discussão... 2.5 Conclusão ...

Capítulo 3 – Experimento II

Avaliação clínico-andrológica e da congelabilidade do sêmen de cães da raça Fila Brasileiro ... Resumo ... Abstract ... 3.1 Introdução ... 3.2 Material e Métodos ... 3.2.1 Animais ... 3.2.2 Exames clínico-andrológicos ... 3.2.3 Coleta de sêmen ... 3.2.4 Avaliação do sêmen a fresco ... 3.2.4.1 Aspecto, volume e concentração ... 3.2.4.2 Motilidade e Vigor ... 3.2.4.3 Avaliação objetiva de motilidade (SCA - CASA) ... 3.2.4.4 Patologias espermáticas ... 3.2.4.5 Teste Hiposmótico (HOST) ... 3.2.4.6 Sondas fluorescentes ... 3.2.5 Meios diluidores e congelação do sêmen ... 3.2.6 Análise do sêmen pós-congelação ... 3.2.6.1 Motilidade e vigor pós-congelação ... 3.2.6.2 Avaliação objetiva de motilidade (SCA - CASA), pós-congelação . 3.2.6.3 Patologias espermáticas pós-congelação ... 3.2.6.4 Teste hiposmótico (HOST), pós-congelação ... 3.2.6.5 Sondas fluorescentes (CFDA-PI): análise pós-congelação ... 3.2.7 Análises estatísticas... 3.3 Resultados e Discussão ... 3.4 Conclusão ...

47 47 48 49 49 49 50 50 50 50 50 51 51 51 51 52 53 53 53 53 53 54 54 54 64

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 65 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 66

LISTA DE TABELAS Capítulo 2: Experimento I

Tab. 1 – Quantificação e descrição dos alelos amplificados em cada um dos 21 locos (ISAG-2008) utilizados para a caracterização genética de cães Fila Brasileiro-PSC

Tab.2 – Descrição dos alelos mais e menos freqüentes em cada um dos 21 locos (ISAG-2008) utilizados para a caracterização genética de cães Fila Brasileiro-PSC

Tab.3 – Descrição do número de alelos efetivos, índice de informação e endogamia para cada um dos 21 locos (ISAG-2008) utilizados para a caracterização genética de cães Fila Brasileiro-PSC

Tab.4 – Heterozigosidades esperadas e observadas e probabilidades de exclusão de parentesco simples e acumuladas, para os 21 locos (ISAG-2008) utilizados para a caracterização genética de cães Fila Brasileiro-PSC

Capítulo 3: Experimento II

Tab.5 – Composição dos diluidores experimentais

Tab.6 – Parâmetros clínico-andrológicos médios de machos da raça Fila Brasileiro

Tab.7 – Parâmetros da fração rica do ejaculado, pré-congelação, de cães Fila Brasileiro

Tab.8 – Indicadores da qualidade funcional dos espermatozóides de reprodutores Fila Brasileiro – PSC, pré-congelação

Tab.9 – Análise descritiva de parâmetros do sêmen fresco de cães Fila Brasileiro-PSC, avaliados pelo SCA-CASA

Tab.10 – Efeito geral da criopreservação sobre os parâmetros do sêmen de cães Fila Brasileiro-PSC, avaliados por microscopia convencional, de contraste de fase e de fluorescência com auxílio das sondas CFDA-PI

Tab.11 – Efeito geral da criopreservação sobre os parâmetros relativos à motilidade do sêmen de cães Fila Brasileiro-PSC, avaliados pelo Sperm Class Analyzer-CASA

Tab.12 – Parâmetros de motilidade do sêmen de cães Fila Brasileiro-PSC, avaliados subjetivamente, ao longo do teste de termo-resistência lento, em quatro diferentes diluidores

Tab. 13 e 14 – Parâmetros de motilidade do sêmen de cães Fila Brasileiro-PSC avaliados no SCA-CASA pós-congelação, ao longo do teste de termo-resistência lento, em quatro diferentes diluidores

Tab.15 – Número percentual de espermatozóides reagidos no HOST, em quatro diferentes diluidores, ao longo do teste de termo-resistência lento

LISTA DE QUADROS E FIGURAS

Capítulo 2: Experimento I

Fig. 1 – Relação genética entre cães de raças puras com auxílio de marcadores de DNA Fig. 2 – Agrupamento de cães de raças puras com auxílio de marcadores de DNA Fig. 3 – Fotos de alguns exemplares Fila Brasileiro-PSC genotipados neste estudo e mapa das áreas de coleta de DNA.

Fig.4 – Representação da distribuição genotípica de 40 cães Fila Brasileiro-PSC baseada na análise bayesiana das freqüências alélicas de cada animal da população, com auxílio de marcadores microsatélites de DNA (ISAG-2008)

Capítulo 3: Experimento II

Fig.5 – Exemplar Fila Brasileiro-PSC utilizado como doador de sêmen

LISTA DE ABREVIATURAS

ANOVA – Análise de variância

CAFIB – Clube de Aprimoramento do Fila Brasileiro CASA – Análise Espermática Assistida por Computador CFDA – Diacetato de carboxifluoresceína

DNA – Ácido desoxiribonucléico

FCI – Federação Cinológica Internacional

FILA BRASILEIRO PSC – animais da raça Fila Brasileiro que se enquadram no padrão morfológico descrito pelo Dr. Paulo Santos Cruz, atualmente adotado pelo CAFIB. HOST – Teste hiposmótico

TTR – Teste de termoresistência TRIS – tris(hidroximetil)aminometano

N2 líquido – nitrogênio líquido

Orvus – detergente lauril sulfato de sódio PI – Iodeto de Propídio

SCA® – Sperm Class Analyzer PSC – Paulo Santos Cruz

PCR – Reação em cadeia da polimerase

ISAG – International Society for Animal Genetics Inbreeding – Cruzamento endogâmico

RESUMO

A conservação dos cães Fila Brasileiro depende de projetos e ações que perpassem a caracterização genética das principais populações preservadas in vivo e sua análise comparativa, a criação e manutenção de bancos de sêmen para a preservação in vitro, além de um trabalho de conscientização para a associação de criadores conservacionistas. Objetivou-se com este trabalho caracterizar geneticamente uma população representativa da raça e testar diferentes diluidores para congelar o sêmen de seus reprodutores. Foram realizados dois experimentos. Primeiro, 40 cães Fila Brasileiro, enquadrados no padrão Paulo Santos Cruz, foram genotipados por meio de 21 marcadores microsatélites de DNA. No segundo experimento, realizaram-se análises clínicas, andrológicas e zootécnicas, com posterior coleta de sêmen de seis reprodutores Fila Brasileiro. Foram avaliadas variáveis do sêmen fresco imediatamente após a coleta e sua congelabilidade em quatro diluidores sob um protocolo de congelação. Foram também avaliadas a motilididade dos espermatozóides bem como variáveis pós-congelação por meio do sistema CASA e por testes de morfologia e funcionais de integridade das membranas espermáticas. Houve sucesso na criopreservação possibilitando o uso da inseminação articial (IA) com sêmen congelado na preservação e na criação. Conclui-se que genotipar cães Fila Brasileiro-PSC pode contribuir com a preservação e criação desse grupamento, especialmente se associadas ao uso da IA com sêmen congelado.

Palavras-chave: Fila Brasileiro, recurso genético animal, caracterização genética,

ABSTRACT

The conservation of Fila Brasileiro dogs depends on projects and actions related to genetic characterization of the main in vivo preserved bloodlines and its comparative analysis, the creation and maintenance of semen banks for the in vitro preservation and an educational work directed to the association of conservationist breeders. The aim of the present study was to genetically characterize a pure Fila population and to test different extenders for the semen freezing process for the breed. Two experiments were conducted. In the first experiment 40 Fila Brasileiro, phenotipically classified according to Paulo Santos Cruz standard, were genotyped using 21 DNA microsatellites markers (ISAG, 2008). In the second, clinical andrological examinations and semen collections of six Fila were performed. Characteristics of semen were evaluated immediately after sampling and also its freezability in four different extenders. Motility, as well as pos-thawing characteristics, were obtained by CASA and by functional tests for the integrity of spermatic membranes (HOST, FCDA and PI) during a thermo-resistance test. Successful semen cryopreservation were obtained and allows the artificial insemination (AI) with frozen stored semen usefull for preservation programs and breeding. It can be concluded that genotyping Fila Brasileiro-PSC dogs using genetic analyzes from DNA microsatellite markers can help Fila preservation programs and breeding, specially associated with the use of frozen semen AI.

Key-words: Fila Brasileiro, animal genetic resource, genetic characterization, semen

INTRODUÇÃO GERAL

A criação da raça Fila Brasileiro no Brasil e no Mundo tem sido marcada pela falta de profissionalismo e ausência de utilização de ferramentas técnicas cientificamente validadas para a orientação e a condução aprimorada dos acasalamentos entre os indivíduos escolhidos para a reprodução prejudicando a seleção e multiplicação das populações que devem ser preservadas. O histórico recente da raça, mais especificamente a diluição genética ocorrida no final da década de 70, traz à tona a necessidade de investigação da estrutura genética da raça, avaliada por meios práticos e de elevada precisão, como os testes realizados utilizando-se os marcadores de DNA. Também, outros aspectos relacionados tanto à brevidade do ciclo de vida dos cães, como a surtos de doenças e outros percalços naturais e/ou eventuais que culminem com a interrupção e inviabilidade de propagação do material genético desses animais ainda em vida, ou interesses econômicos, reforçam a necessidade da manutenção de estoques de germoplasma de reprodutores in vitro, como os proporcionados pelos bancos de sêmen congelado.

A sequência de capítulos que compõem esta tese de Doutorado em Ciência Animal, traz no Capítulo 1 uma revisão de literatura sobre a raça Fila Brasileiro. Os aspectos fundamentais relacionados à genética molecular de conservação e aos conceitos e métodos necessários para a realização da criopreservação de gametas de machos caninos e dos testes tradicionais e de vanguarda utilizados para monitorar a qualidade do sêmen pré e pós-congelação também são resgatados. Já o Capítulo 2, descreve a caracterização genética de um grupamento nacional representativo da raça Fila Brasileiro (Fila Brasileiro-PSC) e demonstra, de forma inédita, uma avaliação da estrutura genética dentro da raça. São identificadas duas subpopulações cujas origens, em última instância, remontam a diferentes pioneiros da criação Fileira no Brasil ratificando a importância dos marcadores de DNA como ferramenta auxiliar na conservação desse recurso genético-cultural-histórico brasileiro. Por fim, no Capítulo 3 são realizadas uma série de avaliações andrológicas e de testes de congelabilidade do sêmen de cães da raça Fila Brasileiro. As avaliações de motilidade, de patologia e funcionais dos espermatozóides, a fresco e pós-congelados, tanto por métodos subjetivos como objetivos, além do estudo das correlações entre as variáveis avaliadas, permitiram identificar processos e meios diluidores capazes de conduzirem a uma congelação eficaz do sêmen de machos da raça.

Capítulo 1 – REVISÃO DE LITERATURA

1.1 - A raça Fila Brasileiro

O Fila Brasileiro é a única raça canina Nacional de grande porte. Suas qualidades são relatadas desde o século XVII (Valle e Monte, 1981; Van Damme, 1999) quando provavelmente ainda não havia se fixado como raça. Era então denominado cabeçudo, boiadeiro, onceiro ou ainda cão de fila devido à robusta cabeça, habilidades na guarda, na lida com o gado, na caça às onças e também aos índios e escravos, os quais filava com tenacidade e equilíbrio suficientes para conter, no entanto, sem dilacerar.

O interesse dos brasileiros no Fila, portanto, surgiu há muito devido principalmente a essas qualidades, mas não unicamente. Por isso e por seu porte e coragem destacada, os Filas geralmente tornam-se inexcedíveis e poderosos em guarda ao patrimônio. Preservam ainda sua aptidão inata ao trabalho de pastoreio em fazendas, sendo rústicos e mentalmente equilibrados, sendo possível encontrá-los auxiliando, principalmente, no manejo de gado em fazendas de pecuária extensiva.

O surgimento do Fila Brasileiro confunde-se com o desenvolvimento da sociedade brasileira, especialmente a do Estado de Minas Gerais, considerado o seu berço. Diferentes aspectos envolvidos na história desta raça estão intimamente associados ao ambiente em que foi selecionado e o estudo dessa raça pode propiciar ainda uma melhor compreensão em relação a aspectos históricos, culturais e sociais do povo brasileiro.

1.1.2 – Origens

De modo geral, é consenso entre os criadores e estudiosos do Fila que as raças caninas que mais possuíam ou possuem características comuns às da

raça em questão e que teriam contribuído de maneira mais contundente para a sua formação seriam os antigos Mastiff, Buldogue Inglês e cão de Saint Hubert, ou Bloodhound. No entanto, o conhecimento mais aprofundado das proporções desses genes e dos fatores ambientais imprimidos pelo isolamento geográfico, fatores que segundo Darwin (2004) são essenciais para a seleção dos indivíduos mais adaptados, e ainda, a efetiva preservação desse recurso genético nacional, somente tornar-se-ão possíveis por meio do refinamento nas pesquisas genéticas e históricas sobre essa odisséia genética em Território Brasileiro.

O primeiro cão “cabeçudo” das Minas Gerais foi levado a uma exposição em 1939, em evento organizado pelo Kennel Clube Paulista, fundado em 1936. No início dos anos 40 a raça foi oficializada ainda com o nome de Fila Nacional e somente em 1951 o cão passou a se chamar Fila Brasileiro. Embora tenham sido reconhecidos há mais de 70 anos, esses cachorros já eram comuns no interior do Brasil, onde recebiam nomes ligados às funções que praticavam (Godinho, 2010).

labial até o peito e ainda boa parte do ventre, o olhar triste, os lábios pendentes, o faro aguçado, a pronunciada crista occiptal e o latido arrastado. Do antigo Buldogue inglês, o temperamento um tanto violento e teimoso, a coloração araçá-rajado-escuro e a garupa mais alta que a cernelha.

Apesar de bem fundamentada nos aspectos morfológicos típicos dessas raças, a teoria proposta por Cruz (1950), citada por CAFIB (1978), encontra na teoria proposta por Valle (1978-79), citada por Valle e Monte (1981), remissões históricas bastante contundentes dos séculos XV, XVI e XVII que, de certa forma, refinam a primeira com a adição de uma nova peça ao quebra-cabeças: os “Engelsen doggen”, que em flamengo significa cães ingleses ou buldogues, os quais consistiam em tipos diferentes dos antigos cães Mastiff ou dos seus cruzamentos. Seus estudos sugerem que esses cães foram trazidos ao Brasil, mais especificamente para Olinda-PE pelos holandeses, durante o auge da invasão desse povo à então Colônia portuguesa em 1631, após terem sido importados da Inglaterra como cães de guerra para perseguição de soldados fugitivos. Em curto prazo, com a farta caça disponível ao sul do estado (limite dos domínios holandeses) e a visível utilidade desses cães também para a caça e proteção de rebanhos, o cão de fila rapidamente teria se disseminado e se tornado muito valorizado.

A criadora de Filas, escritora e historiadora holandesa Van Damme (2006) contextualiza nesse período um mapa da primeira região brasileira a receber rebanhos bovinos, na Bahia do final do século XV, onde é descrito um rancho perto da foz do Rio Paraguaçu. Nos anos subseqüentes, esses ranchos espalharam-se a Oeste em direção aos rios Itapicuru passando Jacobina até o curso mais setentrional do Rio São Francisco, de onde supõe que o Fila tenha ganhado o Estado de Minas

Gerais, sempre auxiliando no trabalho com o gado.* A localização central de Minas e a vocação como pólo pecuário e de mineração teria favorecido a chegada de cães de guarda e boiadeiros (que acompanhavam longas comitivas, inclusive até o estado de Goiás), seguido pela sua fixação nas fazendas mineiras formando assim as linhagens-base para a formação do Fila Brasileiro como o conhecemos hoje.

O fato de a imprensa no Brasil-colônia ter sido reprimida, assim como outras fontes de informações públicas, fez com que relatos importantes sobre o Fila, principalmente entre a retirada dos últimos holandeses (1634) até a Abertura dos Portos às Nações Amigas (1808), tenham sido irremediavelmente prejudicados, apesar de algumas terem resistido em literaturas de púlpito e de academias:

O cão de Fila

1808)

“Almanak literário de Pernambuco”, PE (1882), citado por Valle e Monte (1981):

“Vinha para morder-me um cão de fila Enorme, furioso, e certamente

Me teria tragado ou engolido Se não sou tão ligeiro, felismente.

Pela immensa garganta escancarada Metti-lhe a mão direita sem demora E com tal força o fiz, com tal destreza Que virei-o de dentro para fora”.

1.1.3 - Pioneiros em Minas Gerais

A presença desses cães tornou-se particularmente notada nas fazendas de Minas Gerais, especialmente as da importante bacia leiteira do sul, de onde foram selecionados os primeiros

* _{VAN DAMME, I. Comunicação pessoal,}

exemplares já racialmente caracterizados para serem apresentados

em exposições caninas. Estes animais forneceram subsídios para a elaboração do primeiro Padrão Racial do Fila Brasileiro (padrão desenvolvido por Paulo Santos Cruz) e à homologação da raça junto à cinofilia oficial sendo, desde o início da década de 50, internacionalmente reconhecida pela Federation Cinologique Internationale - FCI (Valle e Monte, 1981; Van Damme, 1999; Godinho, 2010).

Os Filas estabeleceram-se nessas regiões devido, principalmente, à riqueza punjante durante os séculos XVII e XVIII. Ali encontraram uma dieta à base de angu, carne e muito leite. Encontraram também a presença de fazendeiros dotados de condições financeiras para alimentar vários cães e, principalmente, a necessidade de serem empregados nos trabalhos cotidianos, como a segurança domiciliar, pastoreio do gado e a busca de escravos fugidos durante o período da escravidão, outra marca importante na história das Minas Gerais.

Levantamentos históricos realizados ao longo de 10 anos junto a tradicionais fazendeiros do estado de Minas Gerais e suas famílias foram documentados por Van Damme (2005), efetivamente caracterizando a presença do Fila já com um fenótipo definido no Estado desde meados do século XIX (1870). Portanto, os primeiros núcleos das linhagens-base (puras) puderam ser vinculados a cidades como Varginha e Carmo de Minas (antiga Silvestre Ferraz), na Serra da Mantiqueira. Já com referência ao início do século XX, ainda segundo van Damme (2005), novos núcleos de preservação surgiram nas cidades de Itajubá, Itanhandu, Carrancas, Eloi Mendes, Três Pontas, Carmo da Cachoeirinha, Nepomuceno, Conselheiro Lafaiete, Pedro Leopoldo, dentre outras na região.

1.2- Diluição genética em raças brasileiras adaptadas

Consideram-se raças adaptadas, nativas ou naturalizadas brasileiras as raças, ou seus cruzamentos, trazidas por quaisquer colonizadores no período do descobrimento e da colonização do Brasil que, ao longo dos séculos, adaptando-se às condições sanitárias, de clima e manejo encontradas nos mais diferentes hábitats, evoluíram e se estabilizaram geneticamente, sendo capazes de transmitirem à sua descendência suas características morfológicas e comportamentais, sendo também denominadas raças locais ou crioulas (Mariante e Trovo, 1989; Ferreira, 1993; Egito et al., 2002; Mariante & Egito, 2002).

Exemplos de diluição genética em diferentes espécies nativas brasileiras como bovinos, ovinos, suínos, equinos e asininos podem ser constatados em literatura cada vez mais abundante devido ao trabalho de pesquisadores preocupados com a conservação dos recursos genéticos nacionais (Egito et al., 2002; Mariante & Egito, 2002; Egito et al., 2005; Mariante et al., 2005).

Após a criação, em 1983, do Programa de Conservação de Recursos Genéticos Animais da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa), coordenado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen), atualmente denominado Embrapa Recursos Genéticos, e do seu Laboratório de Genética Animal, em 1998, muito se tem realizado para que a redução no efetivo populacional das raças naturalizadas, algumas em risco de extinção, seja minimizada, a fim de preservar a máxima variabilidade genética dentro das raças nativas brasileiras (Egito et al., 2002).

que assegure sua preservação para as gerações futuras, uma vez que Acervo... (2012), também comprova que houve cruzamentos irresponsáveis de cães Fila com outras raças no final da década de 70, contribuindo para a diluição genética na raça, cuja criação responsável é uma atividade que preserva partes da tradição, da cultura e da história do nosso País.

Outras raças caninas brasileiras, além do Fila Brasileiro, também surgiram no interior do país, mas depois desapareceram. Foi o caso do Veadeiro Paulista, do Veadeiro Catarinense, do Braco de Japma e do Rastreador Brasileiro, sendo esta última extinta mesmo após ter sido reconhecida pela FCI na década de 1960 (Godinho, 2010).

1.3 - Marcadores de DNA

A informação genética de um organismo vivo está armazenada na seqüência do DNA que compõe seu genoma. Há, no entanto, pequenas variações (polimorfismos) quando se comparam as seqüências de nucleotídeos do DNA de indivíduos, mesmo dentro da mesma espécie. As análises dessas variações (marcadores de eleição) por métodos laboratoriais que determinam a seqüência do DNA desses indivíduos possibilitam, dentre outros, sua classificação dentro das respectivas espécies ou raças, a identificação genética para testes de parentesco e aplicações legais ou forenses, além da identificação de áreas do genoma responsáveis por doenças genéticas ou caracteres de interesse econômico.

Os efeitos dessas variantes genéticas ou alelos podem ser neutros, quando não provocam nenhuma alteração nas características fenotípicas dos indivíduos, ou podem ser funcionais, caso alterem o metabolismo ou características morfológicas dos animais. As variações nas sequências do DNA são mutações resultantes das

substituições de um simples nucleotídeo, inserções ou deleções de fragmentos de DNA de vários tamanhos (de um a milhares de nucleotídeos), ou duplicações e/ou inversões dos fragmentos de DNA (Furlan et al., 2008).

Nos mamíferos, a maior parte do DNA é composta por seqüências repetitivas que não estão relacionadas com o fluxo da informação dentro das células (íntrons). A pequena parte restante é composta pelas regiões do DNA que codificam e regulam a síntese (éxons) de RNA e proteínas (Lodish et al., 1999). As frações de DNA podem ser altamente repetitivas ou moderadamente repetitivas e suas classificações dependem também do número de nucleotídeos e da complexidade das seqüências que compõem tais repetições (Furlan et al., 2008).

Outros marcadores de DNA também utilizados são os Single

Nucleotides Polimorphism (SNP), que

são mutações pontuais que ocorrem no genoma. O conteúdo de informação por cada marcador SNP é menor que o proporcionado pelos marcadores microssatélites multialélicos. Assim, demanda-se cerca de cinco marcadores SNP para obter informação similar à de um marcador microssatélite e, portanto, grande número de SNP testados para investigar todo o DNA (Beuzen et. al, 2000). Consequentemente, o custo do processo é maior.

1.4 - Caracterização genética por marcadores de DNA

No Brasil, durante séculos, a caracterização das diferentes raças de animais domésticos baseou-se em características fenotípicas, resultantes da interação genótipo x ambiente, de tal sorte que os genótipos submetidos a condições ambientais específicas poderiam mudar. Surgiu no final do século XX, portanto, a necessidade da associação de informações fenotípicas e da caracterização genética, a fim de evitar esse problema (Egito et al., 1999; Mariante e Cavalcante, 2000), citados por Mc Mannus et al., (2005). Ainda, a utilização dos marcadores genéticos potencializa o correto emprego de verbas nos programas de conservação otimizando sua aplicação em situações mais críticas, por exemplo, quando se procede a caracterização genética em populações sob risco iminente de extinção (Haig, 1998).

Pesquisas para a conservação de canídeos não são recentes e já auxiliam, segundo Wayne (1995), na tentativa de resgate de espécies extintas como o Lobo vermelho (Canis rufus) ou, como descrito por Gottelli et al. (1994), para identificar cruzamentos entre diferentes espécies, como é o caso do Chacal simiano da Etiópia (Canis simien), o canídeo mais ameaçado do mundo, cuja

hibridização ocorre com o cão doméstico.

Para os cães domésticos (Canis

lupus familiaris), pesquisas iniciais para

Figura 2 – Agrupamento genético de raças caninas baseado em frequências alélicas

P

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2005

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Figura 2 – Agrupamento de cães de raças puras com auxílio de marcadores de DNA

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(2

004)

Em estudos publicados por Gonçalves et al. (2008), foi demonstrada a existência de alguns genes/ haplótipos exclusivos em raças naturalizadas de suínos e mesmo entre raças da mesma espécie. Estudos genéticos ainda não foram realizados para as diferentes populações da raça Fila Brasileiro e poderiam levantar informações de grande valor para o delineamento da estrutura dessas populações, inclusive com o objetivo de otimização da conservação das linhagens-base e diminuição da diluição genética. Haig (1998) descreve que os marcadores específicos de raças identificam o fluxo gênico ou de indivíduos e auxilia no entendimento de padrões de migração, de dispersão, de estrutura de população e de ações regulatórias frente a situações ilegais como o de dano ao patrimônio genético potencialmente causado pelas hibridizações.

Assim, os resultados de pesquisas que empregam marcadores moleculares para a caracterização genética das raças de cães domésticos fornecem subsídios para estudos genéticos das diferenças fenotípicas entre elas e mesmo dentro de determinadas raças, para comprovação de hibridizações com raças estranhas ou não à de sua composição original, como as que ocorreram na raça Fila Brasileiro.

Para caracterizar geneticamente a raça Fila Brasileiro, uma população de 26 cães enquadrados no padrão Paulo

Santos Cruz, provenientes de 4 Estados

brasileiros, foram avaliados por Felipe-Silva et al. (2008) em um estudo preliminar. Por meio de 21 marcadores microssatélites recomendados pela ISAG, foram apontadas as frequências alélicas mais e menos prevalentes em Filas puros, o número médio de alelos para cada marcador, probabilidades de 99,99% de certeza na exclusão de parentesco e de 100% na discriminação de irmãos completos, além de um índice de endogamia surpreendentemente

baixo (2,9%), quando informações oriundas de pedigrees sugeriam índices mais elevados.

1.5 - Conservação e Preservação de recursos genéticos animais

Os programas de conservação animal em países latino-americanos são instáveis devido à falta de políticas públicas e financiamento. Em termos de números, somente 55% das raças latino-americanas têm dados de população, e destas, 37% correm risco de extinção (Mariante e Fernandez-Baca, 1998), citados por McManus (2005). Ainda, segundo esta autora, a introdução de recursos genéticos no passado não necessariamente promoveu desenvolvimento econômico e potencialmente reduziu a diversidade genética. No uso de um recurso específico em um sistema, é necessário entender a capacidade e função do mesmo para determinar sua adequação.

Hetzel e Drinkwater (1992), citados por Egito et al. (2002), afirmaram que a quantificação da variabilidade genética medida por marcadores de DNA é instrumento importante para a realização de um programa de conservação. Ainda segundo esses autores, as tecnologias que empregam DNA podem otimizar o processo, já que as diferentes formas dessa molécula podem ser estocadas e utilizadas no futuro; os polimorfismos das seqüências de DNA identificam quais populações devem ser incluídas em um programa de conservação; o mapeamento genético é capaz de identificar regiões do DNA responsáveis por características adaptativas.

endogamia aplicada nos cruzamentos e responsáveis por gastos veterinários que ultrapassam bilhões de dólares anuais (Meyers-Wallen, 2003; Gough e Thomas, 2004; Sargan, 2004; Sutter e Ostrander, 2004), dentre outros. Essas pesquisas servem como modelo para identificação desses genes em outras espécies, por exemplo a humana, já que essas espécies possuem muitos genes em comum (Sutter e Ostrander, 2004).

A Embrapa Recursos Genéticos conta hoje com programas de conservação para o gado Caracu, o Crioulo Lageano, o Mocho Nacional, o Curraleiro, o Pantaneiro, assim como para os bubalinos Tipo Baio e Carabao, além dos suínos Piau, Moura, Caruncho, Pirapetinga, Nilo e Canastra. Também os caprinos, ovinos, eqüinos e asininos possuem rebanhos-núcleo essenciais para este objetivo (Mariante e Trovo, 1989; Egito et al., 2002). Até o presente momento, no entanto, os canídeos silvestres e os domésticos, em especial os cães nativos da raça Fila Brasileiro, não tiveram sua inclusão determinada nesses programas ou em programas com objetivos afins.

No Brasil, a relevância do mercado pet torna-se evidente ao se traçar um paralelo entre o consumo anual de 1,6 milhões de toneladas de ração canina e o equivalente em proteína animal de 680.000 bois gordos sendo que, somente no ano de 2009, proprietários de cães e gatos gastaram o montante de nove bilhões de reais com seus animais, incluídos os gastos com médicos veterinários, lazer e aquisição de produtos pet(Marthe, 2009). Quando consideradas compras e vendas de cães de raça pura, o valor preciso envolvido é desconhecido, mas sabidamente expressivo. Tais fatos apontam para uma inevitável mudança de um paradigma nacional onde esse mercado é considerado como desprovido de interesse econômico e zootécnico (BRASIL, 1980; BRASIL, 2009) e para a necessidade de estudos que concorram

para a maior valorização e valoração dos recursos genéticos brasileiros.

Uma importante quota desse segmento crescente deverá estar associada, em um futuro próximo, a tecnologias como os marcadores de DNA, capazes de gerar credibilidade e estabilidade à atividade cinófila, principalmente quando associadas ao uso das biotecnologias da reprodução, especialmente frente ao aumento da demanda, utilização e comércio internacional de sêmen congelado (Morton e Bruce, 1989; Ström, 1999, citado por Cardoso et al., 2005; Rijsselaere et al., 2003; Eilts, 2005).

A associação do setor às tecnologias genético-moleculares também agregará credibilidade às informações de pedigrees, cujas informações erradas são problema recorrente, assim como em outras espécies (Koskinen & Bredbacka, 2000; Ron et al., 1996; Israel & Weller, 2000).

1.6. - Bancos de sêmen

Em cães, a utilização de bancos de sêmen congelado se justifica, ainda que existam importantes limitações para a inseminação do material assim estocado em relação a outras espécies, como por exemplo a bovina e a suína. As taxas de concepção e o número de filhotes nascidos por meio da IA com sêmen congelado podem atingir resultados muito satisfatórios (Cardoso et al., 2007), especialmente pelo fato das fêmeas caninas serem pluríparas, promovendo a multiplicação de material genético raro e/ou de alto valor agregado mesmo em inseminações realizadas não cirurgicamente(Nöthling e Volkmann, 1993; Fontbonne e Badinand,1993; Rota et al. 1999). Assim, a utilização desses bancos para a preservação genética in vitro e para a exploração comercial é possível e desejada nessa espécie.

aponta que utilizar sêmen congelado de doadores de maneira rotativa nas filhas de cada doador de um mesmo programa, até que o círculo de doadores se complete (“n” gerações, onde n é o número de reprodutores do banco genético), não geraria endogamia alguma ou atingiria um máximo de

      +3 n 2 1 3 4

, o que representa um valor bastante reduzido. Embora tal afirmativa deva ser analisada com cuidado em função do número de indivíduos da população e ainda do seu grau de parentesco, tal estratégia pode possibilitar que a endogamia só recomece a aumentar quando os estoques de sêmen terminarem e um novo grupo de doadores tenha o sêmen congelado, quando os resultados se repetirão, também em função do número de doadores.

Os bancos de sêmen para cães de raça pura, segundo Morton e Bruce (1989), podem prover um pool gênico que pode ser usado para que populações caninas pequenas e isoladas geograficamente possam evitar

inbreeding excessivo e também auxiliar

na eliminação de doenças herdadas. Ainda mais importante que o isolamento geográfico como causador da endogamia em cães, as barreiras raciais impostas pelos sistemas de criação que regem as ações dos criadores de cães de raça pura são determinantes para a pouca variação genética observada na espécie e dentro das raças, de acordo com as pesquisas conduzidas por Sutter e Ostrander (2004). Os resultados demonstraram que a variação genética entre raças representa mais de 27% do total da variação genética da espécie, em contraste com níveis de variação genética muito mais baixos, entre 5 e 10%, relatados em populações humanas demonstrando a realidade da barreira racial na espécie canina e sua influência no desenvolvimento e manutenção das doenças genéticas em cães.

1.7 – Produção espermática em cães

O número total de espermatozóides em ejaculados normais, que podem variar de 300 x 106 a 2 x 109 (Johnston, 1991) é significativamente variável entre raças, uma vez que a produção espermática depende do tamanho testicular (Olar et al., 1983) e da sua composição morfológica e duração do ciclo do epitélio seminífero (Hess & França, 2007), citados por Soares et al. (2009).

Em estudo realizado por Soares (2009a) avaliando dados biométricos e morfométricos dos testículos de nove diferentes raças caninas presentes no Estado de Minas Gerais, incluída a Fila Brasileiro, a autora determinou que a raça Fila apresentou o maior peso testicular (28,2 ± 3,4g) mesmo não sendo a raça de maior peso corporal do

experimento, com índice gonadossomático (IG) de 0,11%, equivalente aos dos Labradores e dos Pastores Alemães, porém 3 vezes menor que o dos Pinscheres (0,33%), apresentando o IG correlação negativa de -0,68 (P<0,05) com o peso corporal. Isto demonstra que as raças menores alocam proporcionalmente maior massa testicular para a reprodução promovendo, no geral, maior eficiência na produção espermática. As correlações (P<0,05) entre peso corporal (PC) com peso testicular (PT) e produção espermática diária por testículo (PEDT) foram 0,92 e 0,87, respectivamente, enquanto a correlação entre PT e PEDT foi 0,95.

Ainda segundo os resultados de Soares (2009a), 77,9% dos testículos de cães Filas Brasileiros são ocupados pelos túbulos seminíferos, os quais apresentaram o maior comprimento total de túbulos seminíferos por testículo entre as raças estudadas (507 ± 91µ), obviamente em função do maior tamanho testicular médio apresentado por esses indivíduos.

apresentou-se equivalente ao dos Beagles, Labradores e Dogues Alemães (32 ± 2,2 x 106), sendo a produção espermática diária de cerca de 15 milhões de espermátides por grama de testículo, este número somente sendo significativamente diferente (menor) que os encontrados na raça Poodle, que produziu cerca de 50% mais células (22 milhões), apresentando-se como a raça canina estudada de maior eficiência na espermatogênese. A produção espermática diária por grama de testículo determinada por Soares (2009a) para a maioria das raças por ela avaliadas é similar (14,5 milhões) à relatada por Olar et al. (1983) ao avaliarem a produção espermática em 18 cães de laboratório adultos.

O número total de

espermatozóides em um ejaculado pode ser baixo devido a uma estimulação sexual insuficiente na falta de uma fêmea em cio ou devido ao estresse por dor ou por outros fatores ambientais. Assim, amostras oligo ou azospérmicas podem ser coletadas de cães com produção espermática normal (Olar et al, 1983; Peña Martinez, 2004). Segundo Olar et al. (1983) a equação de regressão que prediz a liberação espermática canina diária (Ŷ, 106) a partir das mensurações da largura total do escroto ou circunferência escrotal (X, mm) pode ser dada por Ŷ= -999 ± 23,9X (r = 0,75; n = 18; P<0,01).

Em caso de dúvidas sobre a capacidade espermatogênica do macho, o sêmen deve ser testado para concentração de fosfatase alcalina (FA), a fim de garantir que uma ejaculação completa foi coletada. Amostras oligo ou azospérmicas com concentrações de FA abaixo de 5000 UI/L podem ser reflexo de uma ejaculação incompleta, obstrução ou aplasia de epidídimo, enquanto concentrações maiores que 5000 UI/l podem ser indicativas de disfunção gonadal (Frenette et al., 1986), citado por Peña Martinez (2004); Stornelli et al. (2003).

1.8. – Criopreservação de sêmen canino

A criopreservação de sêmen é uma ferramenta importante para os estudos de fertilização e preservação de material genético, além de contribuir também para o desenvolvimento da pesquisa básica e para um aumento da performance reprodutiva dos animais domésticos com reflexos imediatos nos diferentes sistemas de produção. Segundo Luvoni (2000), os cães são considerados, além de animais de companhia, modelos experimentais comparativos para estudos em espécies de canídeos e felídeos não domésticos.

A partir da descoberta de Spallanzani em 1776 quando pela primeira vez foi observado que a redução na temperatura reduzia, de forma reversível, a atividade metabólica do espermatozóide, portanto permitindo seu armazenamento, uma série de descobertas, especialmente a da ação crioprotetora do glicerol (Polge et al., 1949, citados por England, 1993) culminaram com o sucesso da criopreservação do sêmen canino. O primeiro sucesso na congelação do espermatozóide canino e a primeira prenhêz de cadela obtida com sêmen

congelado-descongelado foram reportadas, respectivamente, por Rowson (1954) e Seager (1969), citados por England (1993).

possam contornar tal empecilho. Além disso, são marcantes os problemas organizacionais e de sistematização de projetos entre os criadores, o que provavelmente é um fator ainda mais crítico para que essas pesquisas até o momento não tenham sido realizadas.

Estudos com diferentes diluidores e crioprotetores têm sido realizados em diversas raças com resultados satisfatórios para a motilidade espermática pós-descongelação (Ström et al., 1997; Silva, 2007), bem como boas taxas de concepção após a inseminação artificial ou fertilização in vitro (Andersen, 1975 e Fergunson et al., 1989, citados por Silva et al., 2002a; Cardoso et al., 2007), demonstrando ser viável a preservação in vitro de sêmen canino, a fim de manter e multiplicar recursos genéticos nesta espécie. No entanto, resultados sugerindo baixa resistência do sêmen canino ao processo de criopreservação já foram também relatados (England e Ponzio, 1996, Ivanova-Kicheva et al. 1997), portanto, reforçando a necessidade de mais estudos.

Dentre os fatores não intrínsecos aos doadores de sêmen caninos, como a qualidade do sêmen pré-congelação, estão associados à qualidade do sêmen, após o processo de criopreservação, tais como: escolha dos componentes crioprotetores externos (Schäfer-Somi et al., 2007; Silva, 2007), tipo e concentração dos açucares adicionados (Yrldtz et al., 2000; Rigau et al., 2002), concentração de glicerol (Rota et al., 1998; Silva, 2007), curvas de congelação-descongelação (Rota et al., 1998; Silva, 2007).

De modo geral, falta padronização nas pesquisas sobre a congelabilidade e no uso do sêmen congelado em cães dificultando a comparação de resultados entre laboratórios e centros de andrologia, o que pode ser de extrema importância quando se considera o crescente mercado internacional de sêmen canino

congelado (Rijsselaere et al., 2003; Eilts, 2005). Além disso, não há consenso sobre o número mínimo de espermatozóides necessários para a fertilidade ótima, os melhores diluidores e técnicas para criopreservação, crioprotetores, formas de congelamento-descongelamento, métodos de envase, momento ou método da inseminação (Eilts, 2005).

1.8.1. – Diluidores para congelação de sêmen canino

A partir dos anos de 1990, diversos trabalhos foram realizados a fim de determinar os melhores diluidores para se preservar o sêmen canino, especialmente sob a forma congelada. Os diversos componentes de um bom diluidor, sua quantidade ou forma de adição ao sêmen fresco têm sido avaliados em diversos experimentos.

velhos no ejaculado podem piorar a resposta ao processo de congelação.

De acordo com Günzel-Apel et al. (1993), apesar de a velocosdade do espermatozóide ter sido ligeiramente reduzida após a adição de diferentes concentrações de glicerol ao diluidor de congelação de base TRIS-gema, ela restou não afetada pelo resfriamento e congelação que, de modo análogo, também não influenciaram a linearidade dos espermatozóides avaliados por dois diferentes métodos CASA.

Ainda com o objetivo de avaliar o efeito das diferentes concentrações de glicerol, neste caso sobre a longevidade e integridade acrossomal de espermatozóides caninos pós-descongelação, Peña et al. (1998) utilizaram um pool proveniente do ejaculado de 13 cães, diluído em meio TRIS-frutose-ácido cítrico, dividido em quatro tratamentos (2, 4, 6 e 8% glicerol v/v).

Ao medir a viabilidade pós-descongelação, aferida por meio da motilidade progressiva subjetiva, proporção de espermatozóides vivos:mortos corados pela eosina-nigrosina e pela integridade acrossomal pós-incubação a 39ºC pelo tempo de 0 até 4 horas, Peña et al. (1998), demonstraram que tanto a motilidade como a integridade acrossomal foram superiores quando da utilização do diluidor com 8% de glicerol. Em experimento subseqüente utilizando a melhor concentração avaliada para esse crioprotetor interno, sendo as mesmas variáveis utilizadas para a avaliação da viabilidade, os autores testaram o efeito da temperatura de adição do glicerol (37ºC e 4ºC após 1h de resfriamento ou a 4ºC após 2h de resfriamento) sem, no entanto, verificarem diferença entre os tratamentos.

Rota et al. (1997), citado por Rota et al. (1999) e Peña & Linde-Forsberg (2000) apontaram que a adição de Equex STM a um diluidor de

congelação aumentou significativamente a longevidade in

vitro dos espermatozóides caninos

pós-descongelação. A pasta Equex STM é um aditivo comercialmente disponível que contém sódio-dodecil-sulfato (SDS), um detergente que potencialmente aumenta o fator de proteção da gema de ovo contra o choque-térmico e contra as injúrias causadas pela congelação, para uso em diluidores de sêmen.

Rota et al. (1997), ao avaliarem a viabilidade in vitro do sêmen canino pós-congelado diluído em meios TRIS-citrato-glicose, adicionado ou não de 0,5% da pasta Equex STM, encontraram que a adição da pasta aumentou as porcentagens de espermatozóides com membranas intactas, tanto imediatamente (P<0,05) quanto após 1, 2 e 3h após a descongelação (P<0,03). Os autores utilizaram como variáveis a motilidade e a integridade de membrana espermática avaliada pela associação das sondas fluorescentes CFDA e IP. Para motilidade, não houve efeito significativo para a avaliação no tempo 0 (P = 0,093), mas a diferença foi significativa após 1, 2 (P<0,03) e 3 (P<0,05) horas pós-incubação, sendo a motilidade sempre maior no grupo com adição da pasta.

Embora o efeito da pasta Equex STM não tenha sido estudado em cães com relação ao aumento das taxas de prenhêz após a IA com sêmen pós-descongelação, Rota et al. (1999) apontaram, após experimento que utilizou o sêmen de 15 cães, diluído e congelado em meios que continham a pasta Equex STM e o de 10 cães, em meios que não continham a pasta para a realização da IA por via vaginal ou por via uterina, que houve uma tendência de que tanto a motilidade pós-descongelação (P < 0,053) quanto a motilidade progressiva (P < 0,062) fossem maiores no primeiro caso.

fluxo) de espermatozóides caninos pós-descongelação na presença ou ausência da pasta Equex STM e encontraram claros efeitos benéficos (P<0,001) em todos os indicadores de viabilidade (1, 3 e 6h de incubação) e que as melhores taxas de sobrevivência e termo-resistência pós-descongelação foram obtidas quando as palhetas foram descongeladas a 70ºC por 8 segundos (P<0,0001).

Em relação à determinação dos efeitos da glicose e da frutose no metabolismo das hexoses de espermatozóides provenientes de cães maduros, objetivando identificar os mecanismos usados por esses monossacarídeos para induzir seus efeitos funcionais diferenciados, Rigau et al. (2002) utilizaram o sêmen fresco de 11 Beagles entre 2 e 6 anos de idade para avaliarem o conteúdo total de proteína, concentrações de glicose 6-fosfato, frutose 6-6-fosfato, L-lactato, ribose 5-fosfato, glicogênio, ATP, além da porcentagem de espermatozóides viáveis, acrossomas alterados e motilidade total utilizando o SCA, CASA. Observaram que a ausência de frutose ou glicose nos meios de incubação por pelo menos 30 minutos causou um pequeno efeito deletério sobre a motilidade, viabilidade e porcentagem de acrossomas alterados nos espermatozóides e que, pelo menos parcialmente, esse efeito foi revertido com a adição desses açúcares ao meio diluidor.

Ainda de acordo com Rigau et al. (2002), o conteúdo intracelular de glicose 6-fosfato nas células espermáticas incubadas tanto com 10 mmol/L de glicose ( passando de 80 para 500 nmol/mg de proteína em 30s, com valor final de 400 nmol/mg de proteína após 30 min.) como com 10 mmol/L de frutose (passando de 80 para 950 nmol/mg de proteína em 30s, com valor final de 800 nmol/mg de proteína após 30 min.) sofreu aumento grande, rápido e significativo (P<0,05) sendo que a diferença nos valores obtidos

entre frutose e glicose foram também significativos (P<0,05).

O aumento no ATP intracelular também foi maior para os tratamentos utilizando frutose, muito embora tenha sido necessário para tal, concentrações até 10 vezes maiores comparadas às de glicose. A frutose aumentou a produção de ATP, mas também o seu consumo e, portanto, não houve diferença entre o uso de glicose e frutose em relação ao aumento do ATP intracelular. Rigau et al. (2002) também identificaram a presença dos transportadores Glut 3 e Glut 5 no espermatozóide canino e hipotetizaram sua função principal como transportadores de hexoses nessa espécie e, uma vez que detectaram a presença do Glut 5 (alta afinidade pela frutose) na região peri-acrossomal, os autores acreditam que esse açúcar pode ter uma função específica ligada à produção de energia nesse local, talvez relacionada com a reação acrossômica.

Os resultados obtidos por Martins-Bessa et al. (2006) ao submeterem o sêmen de 13 cães de diferentes raças, entre 2 e 5 anos de idade, à congelação em diluidores TRIS-ácido cítrico-gema contendo variadas concentrações de etileno glicol associados ou não à pasta Equex, etileno glicol associado ao glicerol ou apenas glicerol associado ou não ao Equex, demonstraram que os melhores padrões de motilidade foram obtidos com um diluidor contendo 5% glicerol + Equex e outro contendo 5% etileno glicol + Equex, não havendo, no geral, diferença entre eles. No entanto, os diluidores que utilizaram etileno glicol (4 e 8%) sem a pasta Equex STM não produziram resultados melhores que os obtidos com o diluidor com glicerol e sem a presença do Equex. Por fim, os autores não detectaram vantagens em substituir o glicerol por etileno glicol para congelação do sêmen canino, assim como nenhum benefício foi obtido por meio da combinação dos dois crioprotetores.

1.8.2. – Curvas e métodos de congelação-descongelação

Uma combinação ampla de curvas de congelação pode ser executada com a utilização das máquinas que regulam as taxas de queda de temperatura, nas quais o sêmen canino diluído é efetivamente congelado. No entanto, métodos menos modernos, mais baratos e alternativos de congelação, como a utilização da caixas de isopor ou as rampas de congelação, ainda hoje podem ser empregados nesse processo.

Hay et al. (1997) avaliaram cinco diferentes curvas de congelação para o sêmen canino preservado em diluidor TRISgemaglicerol_4% (A= 0,5ºC/min até 20ºC e 2ºC/min de -20ºC até -70ºC, seguido de imersão em N2 líquido; B= -12ºC/min até -70ºC, seguido de imersão em N2 líquido; C= -28ºC/min até -70ºC, seguido de imersão

em N2 líquido; D= 99ºC/min e E= -214ºC/min, os últimos diretamente em “botijão seco” de armazenamento de N2 líquido. Os resultados encontrados apontaram diferença (P<0,0001) entre as cinco curvas, onde a maior proporção de células espermáticas móveis à 0h pós-descongelamento (68±10% e 66±18%) foi observada nas amostras congeladas a -28 e -12ºC/min e a menor na curva de congelamento mais rápido. Embora, segundo os mesmos autores, não tenha havido diferença para a porcentagem de morfologia normal e acrossoma danificados entre os tratamentos na avaliação pós-descongelação, houve diferença (P<0,001) em relação aos valores de morfologia do sêmen a fresco e também (P<0,0001) em relação à porcentagem de acrossomas danificados pré e pós-congelação.

versus lenta, 38ºC por 1min) resultou

maior para motilidade e integridade de membranas no tempo 0 (P<0,01) e durante o período de incubação (P<0,001).

Peña & Linde-Forsberg (2000) avaliaram os efeitos de duas curvas de congelação (caixa de isopor versus rampa) e dois métodos de descongelação (rápida, 70ºC por 8s

versus lenta, 37ºC por 15s), além da

interação dessas variáveis e da adição do glicerol em uma ou duas etapas, sobre a motilidade (CASA) e a integridade das membranas plasmáticas e acrossomais (sondas fluorescentes + citometria de fluxo) de espermatozóides caninos diluídos em TRIS-gema-glicerol_3%, com e sem a presença da pasta Equex STM.

Segundo as autoras, para os tratamentos com Equex, foi encontrado que a motilidade total e progressiva, a integridade da membrana plasmática e acrossomal foram melhoradas (P<0,05) quando o sêmen foi diluído em duas etapas, congelado na caixa de isopor e descongelado a 70ºC. Para o grupo sem Equex, foi revelado que a motilidade total e progressiva e a integridade da membrana plasmática, além de variáveis relacionadas à velocosdade de movimento dos espermatozóides (VSL e VCL) e ao movimento lateralizado da cabeça (ALH), foram aumentados (P<0,05) pela descongelação a 70ºC, porém não influenciados pelo número de etapas para adição do glicerol ou pelo método de congelação.

Testando duas curvas de congelação para sêmen canino, submetidos ou não à centrifugação, sob duas concentrações diferentes de glicerol e na presença ou ausência da pasta Equex STM, Schafer-Somi et al. (2006) determinaram que houve diferença (P<0,01) entre elas. O maior incremento de temperatura na faixa de -8,7±1,8ºC (5,8±0,0 versus 2,1±0,5ºC) ocorreu quando, respectivamente, independentemente do diluidor utilizado, utilizou-se a caixa de isopor

ou a máquina programada de congelação. A curva de congelação sob vapor de nitrogênio líquido na caixa de isopor foi descrita atingindo uma taxa de queda na temperatura de -11ºC/min

até -5ºC; -3,5ºC/min até -15ºC e -12ºC/min até a marca de -100ºC,

quando as palhetas foram imersas no nitrogênio líquido, valores também controlados por Peña et al. (2003). Na máquina, as taxas foram de -17 ºC/min até -80ºC e -7ºC/min até -130ºC, quando foram também mergulhadas e armazenadas a -196ºC. Schafer-Somi et al. (2006) concluíram que a queda maior de temperatura no início do procedimento de congelação promovida pelo uso da máquina causou maior longevidade e motilidade progressiva pós-descongelação.

1.9 – Avaliação do sêmen canino

Avaliar os ejaculados caninos pré-congelação é fundamental ao processo de criopreservação e inclui determinar o volume, cor e aspecto, concentração espermática, número total de espermatozóides no ejaculado, porcentagem de espermatozóides móveis, de membranas intactas e de espermatozóides morfologicamente normais, além da presença de células não espermáticas no ejaculado (Johnston, 1991).

A avaliação do sêmen canino criopreservado tem, no entanto, o objetivo de determinar se um ejaculado congelado específico terá fertilidade aceitável. Entretanto, Eilts (2005) afirma que essa é uma tarefa difícil, pois não há padrão de fertilidade normal aceitável para o cão devido às muitas variáveis a serem consideradas ao se tentar prever a fertilidade do sêmen canino pós-descongelação e, ainda, que a fertilidade da fêmea também tem um papel crucial na estimativa da fertilidade do macho.

inseminadas, Amann (2005) publicou um artigo examinando estudos que utilizavam os resultados da fertilidade de garanhões e concluiu que 76% desses estudos eram falhos por um ou mais motivos, sendo vários deles amplamente aplicáveis aos estudos com cães. Segundo o pesquisador, ainda que a fertilidade observada de um macho fosse conhecida após a inseminação de um grande grupo de fêmeas férteis, a fertilidade desse macho não poderia ser predita sobre um grupo diferente de fêmeas com fertilidades diferentes. Nesse contexto, os testes de parentesco por marcadores de DNA poderiam auxiliar na determinação da fertilidade de reprodutores, uma vez que serviriam para identificar os produtos nascidos de inseminações artificiais heterospérmicas ou de sêmen sexado de machos diferentes, em fêmeas individualmente, a fim de obter-se melhor controle das variáveis relacionadas à fertilidade.

Amann (1993), citado por Eilts (2005), publicou a opinião de que mais de 60% da fertilidade de um macho pode ser predita com auxílio de avaliações da qualidade espermática in

vitro. Essas avaliações têm sido,

segundo Eilts (2005), uma das poucas formas com as quais a indústria pet tem gerado números suficientes para demonstrar estatísticas, ou mesmo tendências, quando da utilização de sêmen criopreservado. Há muitas variáveis a serem consideradas quando da estimativa da fertilidade do sêmen canino congelado-descongelado que devem ser controladas pelo pesquisador, para que algum dado significativo seja gerado, a fim de responder a questão que remete à fertilidade da amostra e não do macho, nos testes que envolvam a inseminação de cadelas. Predizer a capacidade fertilizante da amostra é, atualmente, a grande meta da avaliação do sêmen canino (Peña Martinez, 2004).

1.9.1 – Análises físicas

Além do volume, cor, aspecto que são indicativos da qualidade do sêmen canino, é necessário analisar a concentração espermática, número total de espermatozóides nos ejaculado e porcentagem de espermatozóides móveis. (MANUAL..., 1998; Johnston et al., 2001).

1.9.1.1 – Concentração espermática

A concentração espermática no ejaculado de cães pode ser determinada pela contagem em câmaras de Neubauer após diluição de 1:40 (Rijsselaere et al., 2003; Rota et al.; 2006), por espectrofotometria (Peña et al., 1998), hemocitômetros (Hay et al., 1997; Mahmoud et al., 1997), dentre outros métodos. Mais recentemente, a concentração do ejaculado de cães tem sido avaliada com auxílio das câmaras

Leja (Orange Medical, Brussels,

Belgium).

As câmaras Leja são acopladas a sistemas CASA onde 5µ L da amostra de sêmen, diluída em solução salina para valores próximos a 50 x 106 espermatozóides/mL, são depositados e, em seguida, cinco campos microscópicos aleatoriamente são escaneados, cinco vezes cada e a uma freqüência de 60 Hz, obtendo 25 leituras para cada amostra. As câmaras

Leja têm sido consideradas, após uma

série de seis experimentos que buscam a padronização e acurácia nas avaliações de sêmen canino, a ferramenta mais sensível para obtenção da concentração espermática (Rijsselaere et al., 2003).

final pré-estabelecida, que é a forma mais utilizada por diversos pesquisadores, embora em revisão realizada por Silva (2007) é sugerido não existir diferenças entre esse tipo de diluição frente a métodos que empreguem a diluição baseada em volumes fixos para o sêmen canino pré-congelação.

1.9.1.2 - Motilidade

A motilidade continua a ser o indicador de função espermática mais largamente empregado. É necessária boa motilidade espermática para a colonização eficiente das tubas uterinas durante a fase de transporte espermático ativo e para fertilização normal (Scott, 2000). Motilidade é a manifestação da competência estrutural e funcional do espermatozóide e a porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva é normalmente correlacionada de forma positiva com a integridade de membrana plasmática (Kumi-Diaka, 1993; Rodríguez-Gil et al., 1994) e com morfologia normal (Ellington et al., 1993).

A motilidade é expressa como a porcentagem total de espermatozóides móveis ou com motilidade progressiva. A porcentagem do total de espermatozóides móveis em ejaculados caninos normais está entre 70 e 90% (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001), embora possa ser menor após períodos prolongados de repouso sexual. Tem sido proposto que cães férteis devem ter no mínimo 70% de motilidade espermática total (Larsen, 1980); entretanto, o número total de espermatozóides com motilidade progressiva e morfologia normais no ejaculado pode estar mais correlacionado com fertilidade do que porcentagens individuais (Linde-Forsberg & (Linde-Forsberg, 1989; Mickelsen et al., 1993), condição que compensa a presença de espermatozóides defeituosos.

O número mínimo de espermatozóides móveis normais necessários para uma fertilização ótima não foi determinado para cães. Para inseminação vaginal com sêmen fresco, pelo menos 200×106 espermatozóides móveis foram necessários para que a fertilidade fosse similar à obtida após monta natural, em Beagles (Tsutsui et al., 1988), citado por Peña Martinez (2004). Para sêmen descongelado depositado in utero, uma dose

inseminante de aproximadamente 150 × 106 – 200 × 106 de espermatozóides móveis é recomendada (Morton & Bruce, 1989), embora prenhezes tenham sido obtidas com doses menores (Linde-Forsberg et al., 1999). Em um estudo utilizando dez cadelas da raça Pastor Alemão inseminadas intravaginalmente com sêmen congelado-descongelado, Nothling et al. (1997) determinaram que o único parâmetro altamente correlacionado (0,79) com a taxa de implantação foi o número de espermatozóides com motilidade progressiva, inseminados dois dias antes do início do metaestro, identificado por citologia vaginal.

Os CASA systems, Sistemas de análise espermática assistida por computador (Amann and Hammerstedt, 1980; O´Connor et al., 1981) permitem investigações para obter informações objetivas e precisas sobre a proporção de células móveis em uma amostra de sêmen e a qualidade do movimento das mesmas. Uma gama de dados derivados de mensurações individualizadas de espermatozóides relativas a várias características de motilidade são fornecidas pelos sistemas CASA produzindo informações interessantes sobre a motilidade média (Anzar et al., 1991; Ellington et al., 1993) e sobre as diferentes sub-populações espermáticas que coexistem em uma amostra de sêmen (Holt, 1996; Rigau et al., 2001).