Contribuição dos receptores b1 e b2 de cininas em músculos liso vascular e não-vascular pelo rompimento seletivo dos genes que codificam os dois receptores: reavaliação dos efeitos farmacológicos da bradicinia e das interações cruzadas com angiotensina ii

(1)

CONTRIBUIÇÃO DOS RECEPTORES B1 E B2 DE CININAS EM MÚSCULOS LISO VASCULAR E NÃO-VASCULAR PELO ROMPIMENTO SELETIVO DOS

GENES QUE CODIFICAM OS DOIS RECEPTORES: REAVALIAÇÃO DOS EFEITOS FARMACOLÓGICOS DA BRADICININA E DAS INTERAÇÕES

CRUZADAS COM ANGIOTENSINA II E ENDOTELINA-1

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Mestre em Ciências.

SÃO PAULO 2006

(2)

CONTRIBUIÇÃO DOS RECEPTORES B1 E B2 DE CININAS EM MÚSCULOS LISO VASCULAR E NÃO-VASCULAR PELO ROMPIMENTO SELETIVODOS

(3)

Orientadora: Profa. Dra. Suma Imura Shimuta.

(4)

FELIPE, SANDRA ARANTES

CONTRIBUIÇÃO DOS RECEPTORES B1 E B2 DE CININAS EM

MÚSCULOS LISO VASCULAR E NÃO-VASCULAR PELO ROMPIMENTO SELETIVO DOS GENES QUE CODIFICAM OS DOIS RECEPTORES: REAVALIAÇÃO DOS EFEITOS FARMACOLÓGICOS DA BRADICINIA E DAS INTERAÇÕES CRUZADAS COM ANGIOTENSINA II E ENDOTELINA-1 /

Sandra Arantes Felipe. – São Paulo 2006. xiii,106f.

Tese (Mestrado) – Universidade federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular.

Título em Inglês: Contribuition of Kinin B1 and B2 receptors in vascular and

nonvascular smooth muscles by selective disruption of genes codifying the two types of recptors

1. Receptores B1 e B2 de cininas 2. Camundongos nocaute B1/ 3.

Camundongos nocaute B2/ 4. Camundongos nocaute B1eB2/ 5. Bradicinina e

(5)

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE BIOFÍSICA

Chefe do Departamento de Biofísica: Dra. Viviane Louise Andree Nouailhetas

(6)

iv

SANDRA ARANTES FELIPE

Presidente de Banca: Profa. Dra. Suma Imura Shimuta

BANCA EXAMINADORA

(7)

v

Podemos de forma geral, pôr todas as coisas em

dúvida, e, em particular, as coisas materiais, ao menos

enquanto não contarmos com outros fundamentos

científicos além dos que obtivemos até hoje. Embora a

utilidade de uma dúvida tão geral não se denote desde o

começo, ela é bastante grande, porque nos liberta de todo

tipo de preconceitos e nos abre um caminho muito fácil

para habituar nosso espírito e abstrair-se dos sentidos, e,

enfim, naquilo que nos impossibilita de ter qualquer

dúvida no que concerne ao que mais tarde descobriremos

ser verdadeiro.

(8)

vi

Dedicatória

(9)

vii

(10)

viii

(11)

ix

(12)

x

(13)

xi

Agradecimentos

Ao Dr. João Bosco Pesquero, pela gentileza em ceder camundongos para os experimentos

À Dra Lucimar por acreditar e confiar no meu trabalho.

Ao Dr. Antonio C.de Matos Paiva e Dra. Therezinha B. Paiva pelo exemplo de seriedade e dedicação à pesquisa.

A todos os professores colaboradores do Departamento de Biofísica.

Ao Técnico de Laboratório Nelson A. Mota, nosso anjo da guarda, pela fundamental colaboração na realização dos experimentos e pelo grande exemplo de dedicação e humildade.

Às colegas Jamile, Graziela, Renan, Nelson Pacheco, Silvana e Michelle pelo apoio e amizade.

Aos amigos Maurício e Elaine pelo apoio e incentivo.

Aos companheiros da E.M.E.F. Frei Francisco de Mont’ Alverne pela compreensão e incentivo.

(14)

xii Sumário

Dedicatória ...vi

Agradecimentos...xi

Lista de figuras ...xvi

Lista de abreviaturas e símbolos ... xviii

Resumo ...xix

1 INTRODUÇÃO ... 1

1.1 Objetivos... 2

2 REVISÃO DA LITERATURA ... 3

2.1 Bradicinina... 3

2.2 Endotelinas... 9

2.2.1 Endotelina I... 10

2.3 Angiotensina II... 12

2.4 Camundongos nocaute para o receptor B1 ou B2 de cininas... 16

2.5 Estômago ... 17

2.6 Aorta... 17

3 MATERIAL E MÉTODOS ... 19

3.1 Materiais ... 19

3.1.1 Reagentes ... 19

3.1.2 Animais... 19

3.1.3 Soluções... 19

(15)

xiii

3.2 Métodos... 21

3.2.1 Registro de Contração Isométrica ... 21

3.2.2 Registro de Contração Isométrica em Fundus de Estômago ... 21

3.2.3 Registro de Contração Isométrica na Aorta Abdominal ... 21

3.2.4 Protocolo taquifilático... 22

3.2.5 Determinação dos níveis de ET-1 em fundus de estômago e aorta abdominal de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 22

3.2.5.1 Preparo do tecido ... 22

3.2.5.2 Purificação de ET-1 ... 23

3.2.6 Estatística ... 23

4 RESULTADOS ... 24

4.1 Preparação não vascular: fundus de estômago ... 24

4.1.1 Determinação da potência e efeito máximo da BK na ação contrátil sobre o fundus do estômago isolado de camundongos ... 24

4.1.2 Curvas cumulativas concentração-resposta da BK em fundus de estômago de camundongo WT e KOB1... 26

4.1.3 Efeito máximo da BK em fundus de estômago de camundongos WT e KOB1... 27

4.1.4 Efeito taquifilático induzido pela BK em fundus de estômago de camundongos WT e KOB1... 28

4.1.5 Efeito do L-NAME sobre a resposta contrátil à BK em fundus de estômago de camundongos WT e KO B1... 29

4.1.6 Curva concentração resposta da DBK cumulativa e não cumulativa em fundus de estômago de camundongos ... 30

4.1.7 Determinação da potência da DBK em fundus de estômago de camundongos WT e KOB2... 31

4.1.8 Efeito máximo da DBK sobre fundus de estômago isolado de camundongos WT e KOB2... 32

(16)

xiv

4.1.10 Efeito da ET-1: dose cumulativa e não-cumulativa em fundus de estômago de

camundongos C57Bl/6 ... 33

4.1.11 Efeito da ET-1 em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 35

4.1.12 Efeito máximo da ET-1 em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 36

4.1.13 Efeito taquifilático induzido pela ET-1 em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 37

4.1.14 Dosagem de ET-1 em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2. 38 4.1.15 Efeito da indometacina sobre a resposta à BK em fundus de estômago de camundongos WT e KOB1... 39

4.1.16 Efeito contrátil da AII: dose cumulativa e não-cumulativa em fundus de estômago de camundongos ... 39

4.1.17 Efeito da AII em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 41

4.1.18 Efeito máximo da AII em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 42

4.1.19 Efeito taquifilático induzido pela AII em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 43

4.1.20 Resumo: eficácias dos agonistas em fundus de estômago ... 44

4.1.21 Curvas concentração resposta induzida por nitroprussiato de sódio em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 45

4.1.22 –Efeito máximo induzido por nitroprussiato de sódio em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 46

4.1.23 Efeito de zaprinast em fundus de estômago de animais WT, KOB1 e KOB2... 47

4.2 Preparação vascular: aorta abdominal ... 49

4.2.1 Efeito da BK em aorta abdominal e aorta torácica de camundongos ... 49

4.2.2 Efeito máximo da BK em aorta abdominal de camundongos WT e KOB1... 49

4.2.3 Efeito do inibidor da enzima conversora de angiotensina I (ECA) sobre a resposta da BK em camundongos WT e KOB1... 49

4.2.4 Efeito máximo da DBK em aorta abdominal de camundongos WT e KOB2... 49

(17)

xv

4.2.6 Efeito máximo da ET-1 em aorta abdominal de camundongos WT, KOB1 e KOB2.. 51

4.2.7 Dosagem de ET-1 em aorta abdominal de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 52

4.2.8 Curvas concentração resposta da AII em aorta abdominal de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 53

4.2.9 Efeito máximo da AII em aorta abdominal de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 54

4.2.10 Taquifilaxia à AII em aorta abdominal de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 55

4.2.11 Efeito do antagonista do receptor AT2 em aorta abdominal de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 55

4.2.12 Efeito da AII em aorta abdominal de camundongos duplo nocaute (KOB1B2)... 56

4.2.13 Efeito da ET-1 em aorta abdominal de camundongos duplo nocaute (KOB1 B2).... 57

4.2.14 Efeito do L-NAME sobre o efeito da AII em aorta abdominal de camundongos KOB1... 58

4.2.15 Efeito do L-NAME sobre o efeito da ET-1 em aorta abdominal de camundongos KOB1... 59

4.2.16 Taquifilaxia á ET-1 em aorta abdominal de camundongos WT,KOB1 e KOB2... 60

4.2.19 Resumo da eficácia dos agonistas em aorta abdominal... 60

5 DISCUSSÃO ... 61

6 CONCLUSÕES ... 66

7 PERSPECTIVAS DE TRABALHO... 68

(18)

xvi

Lista de figuras

Fig. 1. Representação esquemática da ativação do sistema calicreína-cininas... 04

Fig. 2. Esquema para metabolismo das cininas... 06

Fig. 3 Transdução de sinal da bradicinina... 08

Fig. 4.Endotelina no sistema vascular... 11

Fig. 5. Cascata enzimática para a formação da AII... 14

Fig. 6. Determinação da potência e efeito máximo da BK na ação contrátil sobre o fundus do estômago isolado de camundongos ... 25

Fig. 7. Curva concentração resposta da BK em fundus de estômago de camundongo WT e KOB1 ... 26

Fig. 8.Efeito máximo da BK em fundus de estômago de camundongos WT e KOB1 ... 27

Fig. 9. Efeito taquifilático induzido pela BK em fundus de estômago de camundongos WT e KOB1... 28

Fig. 10.Curva concentração resposta da DBK cumulativa e não cumulativa em fundus de estômago de camundongos ... 30

Fig. 11.Curvas cumulativas concentração-resposta para DBK em fundus de estômago isolado de camundongo WT e KOB2... 31

Fig. 12. Efeito máximo da DBK sobre fundus de estômago isolado de camundongos WT e KOB2... 32

Fig. 13. Curvas concentração resposta para a ET-1 administrada cumulativa e não cumulativamente em fundus de estômago de camundongo C57Bl/6... 34

Fig. 14. Efeito da ET-1 em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 35

Fig. 15. Efeito máximo da ET-1 em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 36

Fig. 16. Efeito taquifilático induzido pela ET-1 em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 37

Fig. 17. Determinação da concentração de ET-1 em fundus do estômago isolado de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 38

(19)

xvii

Fig. 19. Efeito da AII em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 41

Fig. 20. Efeito máximo da AII em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e

KOB2... 42

Fig. 21. Resposta taquifilática a AII em fundus de estômago de camundongos controle (WT), nocaute B1 (KOB1) e nocaute B2 (KOB2) ... 43

Fig. 22. Curvas concentração-resposta relaxante induzida pelo nitroprussiato de sódio em fundus de estômago isolado de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 45

Fig. 23. Relaxamento induzido por nitroprussiato de sódio em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 46

Fig. 24.Efeito de zaprinast em fundus de estômago de animais WT, KOB1 e KOB2... 48

Fig. 25. Curva concentração-resposta da ET-1 em aorta abdominal de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 50

Fig. 26. Efeito máximo da ET-1 em aorta abdominal de camundongos WT, KOB1 e

KOB2... 51

Fig. 27.Dosagem de ET-1 em aorta abdominal de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 52

Fig. 28.Curva concentração resposta da AII em aorta abdominal de camundongos WT, KOB1 e KOB2... 53

Fig. 29.Efeito máximo da AII em aorta abdominal de camundongos WT, KOB1 e KOB2.. 54

Fig. 30. Efeito da AII em aorta abdominal de camundongos duplo nocaute (KOB1B2) ... 56

Fig. 31. Efeito da ET-1 em aorta abdominal de camundongos duplo nocaute (KOB1 B2) .. 57

Fig. 32. Efeito do L-NAME sobre o efeito da angiotensina II em aorta abdominal de camundongos KOB1 ... 58

(20)

xviii

Lista de abreviaturas e símbolos

AII angiotensina II BK bradicinina

cGMP monofosfato de guanosina cíclico CCh carbacol

DBK Des-Arg9-bradicinina

ECA enzima conversora de angiotensina I KOB1 nocaute para receptor B1 das cininas

KOB2 nocaute para receptor B2 das cininas

KOB1B2 nocaute para os receptores B1 e B2 das cininas

NO óxido nítrico

NPS nitroprussiato de sódio

(21)

xix Resumo

Objetivo: caracterizar farmacológicamente as respostas à bradicinina e outros agonistas no músculo liso não vascular (fundo do estômago) e vascular (aorta abdominal) isolados de animais nocaute B1 e B2 de cininas. Métodos: Foram isolados fundus de estômago e

aorta abdominal de animais normais, nocaute B1 e animais nocaute B2; registros de

contrações isométricas foram obtidos para determinação da potência e eficácia dos agonistas. Foram aplicadas doses crescentes cumulativas e não-cumulativas dos agonistas peptídicos bradicinina (BK), Des-Arg9 bradicinina, angiotensina II (AII) e endotelina-1 (ET-1). Resultados: O estudo da potência em fundus de estômago isolado de animais nocautes revelou que a afinidade dos agonistas testados, não foi alterada. Quanto ao efeito máximo, verificou-se que a ausência do receptor B1 diminuiu a eficácia

da BK, porém não da ET-1 e AII. No tecido vascular, a BK mostrou-se menos eficaz em animais nocaute B1 assim como a ET-1, enquanto a AII teve sua eficácia diminuída, tanto

em animais nocaute B1 como B2. As respostas à ET-1 e AII apresentaram o Emax alterado

nos animais nocautes o qual foi revertido em nocaute duplo B1 e B2.

Conclusão: A verificação de que a afinidade relativa dos agonistas testados, no estômago isolado de camundongos nocautes B1 e B2 não foi alterada significativamente em relação

à determinada em animais WT, sugeriu que neste tecido não ocorrem interações entre os receptores que afetariam a ligação dos agonistas ao seu receptor. Entretanto a redução na contração máxima induzida pela BK no animal nocaute B1 poderia estar relacionada com o

elevado nível de óxido nítrico (NO) endógeno encontrado no fundus de estômago desse animal. Porém, L-NAME (inibidor da NO sintase) não afetou o Emax da BK, descartando

essa hipótese. Considerando-se que heterodimerização entre os receptores B1 e B2 ocorre

nas células do estômago, a falta de B1 teria favorecido a homodimerização do B2, que leva

à ativação e dessensibilização, induzindo a taquifilaxia mais acentuada para a BK, e a redução do Emax. Para o caso da AII, que mostrou ter a afinidade e a eficácia mantidas nos

nocautes, mas a taquifilaxia atenuada no KOB1 e no KOB2 poderia ser atribuída ou a

(22)

xx

receptores AT1 no KOB2. Quanto à aorta abdominal, esta se mostrou sensível à BK, mas

não a DBK que não induziu resposta no WT e nos nocautes, sugerindo que este receptor não seria expresso. Entretanto aorta isolada de KOB1 teve a sensibilidade drasticamente

reduzida à BK que é mediada pelo receptor B2 indicando expressão funcional importante

do receptor B1 nesta preparação. Quanto a ET-1, a eficácia diminuída somente no animal

KOB1 poderia ser devida à interação cruzada do receptor da ET-1 com o B2, que deixaria

de dimerizar com o B1. A AII teve sua eficácia diminuída nos animais KOB1 e KOB2,

sugerindo que heterodimerização entre estes receptores e também destes com o AT1 da

AII poderia ocorrer, favorecendo a ação da AII. Os resultados obtidos no fundus do estômago e na aorta abdominal sugerem importância na expressão funcional simultânea dos receptores B1 e B2 em ambas as preparações, e interferência nos mecanismos de

(23)

1 INTRODUÇÃO As cininas fazem parte de grupo de potentes peptídeos mediadores inflamatórios que promovem contração e relaxamento de numerosos músculos lisos vasculares e não vasculares (Regoli e Barabé, 1980; Bhoola et al., 1992).

A família das cininas inclue: a bradicinina (BK), a desArg9_{-bradicinina (DBK), calidina}

e a desArg10_{-Lys-bradicinina (Regoli et al.1981). A ação das cininas é mediada por dois}

tipos de receptores, B1 e B2 (Regoli e Barabé, 1980).

A utilização de camundongos nocaute para os receptores de cininas B1(Pesquero et

al., 2000) e B2 (Borkowski et al.,1995) mostraram-se de grande utilidade para o

esclarecimento do papel destes receptores em processos fisiopatológicos, na resposta inflamatória e transmissão da dor (Pesquero et al., 2000), para estudar mecanismos que conduzem à hipertensão (Madeddu, 1997; Brochu, 2002; Schanstra, 2003) e nocicepção causada por cininas ao nível espinhal (Ferreira et al., 2001) entre outros.

Já foi demonstrado que em tecidos de animais nocaute B2 o receptor B1 pode

substituir o B2 em alguns efeitos conhecidos, induzidos pela BK (Duka et al., 2001). Há

evidências que a BK mediada por B2 pode afetar a produção de endotelina-1 (ET-1)

(Momose et al., 1993). Existem dados experimentais onde o captropil, inibidor da ECA (enzima conversora de angiotensina I), não só diminui a formação de angiotensina II (AII) (Greene et al., 1972) e previne a degradação da bradicinina (BK) (McGiff et al., 1972), mas inibe a secreção de ET-1 (Yoshida et al., 1992). Por outro lado, a via da AII pode aumentar a produção de ET-1 (Barton et al., 1997) e o receptor B1 pode formar um complexo com o

receptor B2 (Kang et al. 2004). Tais fenômenos poderiam ocorrer em vários níveis,

incluindo, o receptor influenciar as atividades de outros receptores para o mesmo agente ou de outros agentes.

(24)

1.1 Objetivos

1. Investigar o perfil farmacológico de receptores B1 e B2 de cininas em tecidos,

vascular e não-vascular, isolados de camundongos que expressam os dois tipos de receptores constitutivamente.

2. Investigar o papel do receptor B2 em fundus do estômago e aorta torácica e

abdominal de animal nocaute para o receptor B1 (KOB1), sobre a reatividade à BK.

3. Estudar o papel do receptor B1 na ausência do receptor B2 (KOB2) sobre a

reatividade à DBK .

4. Investigar as hipóteses de que a falta de um dos receptores, B1 ou B2, poderia

afetar a expressão funcional do receptor de cininas, o nível de sua expressão (modulação positiva ou negativa), e a afinidade do receptor remanescente para o seu ligante.

(25)

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Bradicinina

Em 1920, Rocha e Silva e colaboradores descreveram pela primeira vez uma substância que induz motilidade em alças intestinais (Rocha e Silva et al., 1949). O nonapeptídio bradicinina (BK) e o decapeptídio calidina (Lys-bradicinina) são os principais peptídeos derivados da proteólise de seu precursor inativo, o cininogênio, pelas cininogenases. As duas cininogenases mais potentes são as calicreínas plasmáticas e as glandulares (Fig 1). No plasma e em outros fluidos biológicos, a BK pode ser ativada pela calicreína plasmática ou glandular ou outras cininogenases, como por exemplo: a tripisina, uropepsina ou plasmina. Nos tecidos, como rim, a calicreína glandular é a principal cininogenase (Carretero et al., 1988).

A BK é um potente vasodilatador e sua infusão na artéria femoral de indivíduos normais em doses crescentes, diminui significantemente a resistência vascular. A nível sistêmico, a infusão de BK é acompanhada por redução da resistência vascular periférica total associada a uma queda da pressão arterial e aumento reflexo da freqüência cardíaca (Rocha e Silva et al., 1949). Quando se avalia seu efeito em indivíduos hipertensos, observa-se que sua infusão promove queda da pressão arterial, de acordo com a dose utilizada e do tipo de hipertensão arterial. Nos pacientes com hipertensão arterial “borderline” ou mineralocorticóide a queda pressória promovida pela BK é semelhante á de indivíduos normotensos. No entanto, nos hipertensos essenciais ou nos renovasculares, este peptídeo induz uma queda pressória significantemente maior que nos normotensos (Bonner et al.,1989).

(26)

BK LBK GENE

K

CININIGÊNIO DE ALTO PESO MOLECULAR

CININOGÊNIO DE BAIXO PESO MOLECULAR

CALICREÍNA

PLASMÁTICA CALICREÍNA _TECIDUAL

RECEPTOR B2

RECEPTOR B1

DBK

LDBK

CARBOXIPEPTIDASES CARBOXIPEPTIDASES

Fig. 1. Representação esquemática da ativação do sistema calicreína-cininas. Cininigênio, sob ação da calicreína dá origem à bradicinina (BK) e a Lys-bradicinina (LBK), agonistas do receptor B2.

Sob a ação das carboxipeptidases a BK é hidrolizada em Des-Arg9 _{bradicinina (DBK), e a LBK em}

(27)

de cada uma das peptidases no controle dos níveis de cininas varia de acordo com a espécie, o tipo de fluído biológico e o sítio de formação do peptídeo (Bhoola et al., 1992; Campbell, 2000). Um esquema mostrando as diferentes enzimas envolvidas na hidrólise da bradicinina e seus sítios de atuação está apresentado na Fig. 2.

As cininases I são arginino e lisino carboxipeptidases, ou carboxipeptidases básicas. A carboxipeptidase N é produzida no fígado e secretada na circulação, onde é responsável por cerca de 90% da degradação da BK no plasma humano (Zacest et al., 1974), sendo que a importância primária desta é clivar cininas na circulação de diversas espécies. A carboxipeptidase M é uma enzima de membrana que é encontrada no rim humano, tecido do pulmão e em placenta (Johnson et al. 1984). Devido a sua localização na superfície celular e a especificidade para ligações de arginina ou lisina, esta enzima apresenta um importante papel no processamento de pró-hormônios.

As cininases têm grande importância no sistema calicreína-cininas, já que liberam a arginina carboxiterminal das moléculas de cininas, produzindo o metabólico ativo, Des-Arg9-bradicinina (DBK), que exerceseus efeitos pela ativação do receptor B1 das cininas.

Além disso, da liberação de resíduos de arginina provém o substrato primário para a formação de óxido nítrico (NO), pela ação da enzima NO sintase (Moncada et al., 1988; Erdös et al., 1990).

(28)

Fig. 2 Esquema para metabolismo das cininas. Algumas enzimas que metabolizam as cininas estão indicadas neste esquema, onde as flechas indicam os seus respectivos sítios de clivagem. ACE, enzima conversora da angiotensina. Retirado de Campbell, (2002)

Estudos farmacológicos demonstraram que a BK assim como as demais cininas desempenham seu grande espectro de ação pela ativação de dois subtipos de receptores denominados B1 e B2, (para revisão Leeb-Lundberg et al., 2005). A localização

cromossômica dos genes destes receptores já foi encontrada em humanos no cromossomo 14q32 (Ma et al., 1994; Chai et al., 1996) e em ratos, no cromossomo 6q3.2 (Gösele et al., 2000).

O receptor B1 tem sido descrito, especialmente em músculos lisos de várias

espécies, como coelho, rato, camundongo, cão, porco e humano (Hall, 1992). Foram originalmente descritos em tecidos isolados, incluindo a aorta de coelho, uma preparação que é pouco sensível à bradicinina e altamente responsiva à DBK (Regoli et al., 1977). Além disso, receptores B1 têm sido implicados em mediar efeitos de cininas em certas

(29)

A clonagem e o sequenciamento já foram efetuados em receptor B1 humano (Menke

et al. 1994) de coelho (Mac Neil et al. 1995), de camundongo (Pesquero et al. 1996) e de rato (Ni et al. 1999; Jones et al. 1999) e demonstrado que o gene apresenta três exons separados por dois introns (Bachvarov et al.,1996; Yang e Polgar, 1996). A partir desses dados observou-se que além da baixa homologia com o receptor B2, o mRNA do receptor

B1 é expresso a uma extensão muito pequena ou nula em tecidos normais, mas induzido a

uma extensão considerável por estímulos inflamatórios.

Acredita-se que a maior parte das ações da BK seja mediada pelo receptor B2

(Leeb-Lundberg et al.,2005).O gene para o receptor B2 de rato foi clonado e a proteína expressa

em células adequadas (McEachern et al. 1991). Subseqüentemente foi clonado o receptor B2 em diferentes espécies de mamíferos, inclusive humano (Hess et al. 1994). Em 1994,

Pesquero e colaboradores mostraram a presença de quatro exons e três íntrons no gene que codifica o receptor B2 em ratos (Pesquero et al. 1994). Receptores B2 têm sido

descritos em numerosas preparações in vitro, incluindo aquelas do trato intestinal, cardiovascular, genitourinário, respiratório, neural e em tecidos oculares (Hall, 1992). Obedecendo esta larga distribuição, a maioria dos efeitos in vivo, são atribuídos ao receptor B2, incluindo broncoconstrição, hipotensão, reações inflamatórias agudas, dor e

hiperalgesia (Steranka e Burch, 1991; Hall, 1992).

O receptor B1 bem como o receptor B2 de cininas pertencem à superfamília de

receptores acoplados à proteína G, e possuem sete hélices transmembranais, que apresentam 20-30 resíduos hidrofóbicos, ligados por três alças extracelulares e três citoplasmáticas, possuem uma região N - terminal extracelular e um domínio C - terminal citoplasmático (Fredriksson et al. 2003). A homologia entre os dois receptores das cininas é de 35%, sendo que a maior parte do segmento conservado se encontra na região transmembranar (Menke et al. 1994).

O receptor uma vez ativado acopla-se à proteína G que ativa a enzima fosfolipase C (PLC). Da ação desta resulta a liberação de diacil glicerol (DAG) e trifosfato de inositol (IP3) que respectivamente, conduzem à ativação da proteína quinase C e à mobilização de

Ca2+ _{a partir do retículo sarcoplasmático; a ativação do receptor promove também o influxo}

de Ca2+_{do meio extracelular que ocorre através de canais catiônicos não seletivos. A}

(30)

pela produção de óxido nítrico (NO), do cAMP e da prostaglandina I2 (PGI2) (Field et al.

1994). No citoplasma da célula endotelial, o Ca2+ _{desempenha um papel central na}

cascata de mensageiros secundários, desencadeado pelas cininas, ativando a síntese de NO pela enzima NO sintase constitutiva. Após a difusão do NO para a camada muscular, ocorrerá hiperpolarização da membrana das células musculares pela ativação do canal de K+. Além disso, o aumento do Ca2+ contribui para a liberação de ácido aracdonico (A) por ação da fosfolipase A2 (PLA2) que por sua vez, é processado pela cicloxigenase (CO)

em PGI2, a qual vai atuar sobre a célula muscular lisa adjacente. O ácido aracdonico, pode

ainda sob ação da epoxigenase (EOX) dependente do citocromo P-450 dar origem ao fator hiperpolarizante derivado do endotélio, EDHF (Coelho et al., 2002). A cascata de eventos está esquematizado na Fig. 3.

Fig. 3 Transdução de sinal estimulada pela bradicinina. As respostas vasculares a cininas envolvem mediadores liberados nas células endoteliais e suas ações subsequentes nas células do músculo liso vascular. PLA2, fosfolipase A2; PLC, fosfolipase C; CO,

(31)

2.2 Endotelinas

As endotelinas são peptídeos de 21 aminoácidos que pertencem a uma família de agentes vasoativos extremamente potentes. Estes peptídeos foram inicialmente descritos em celulas endoteliais por Hickey et al., (1985), que demonstraram a presença de uma substância vasoconstritora no sobrenadante de células endoteliais em cultura e posteriormente caracterizadas por Yanagisawa et al., (1988).

Atualmente já foram identificadas quatro diferentes isoformas de endotelina (ET), ET-1, ET-2, ET-3 (Inoue, et al., 1989) e ET-4 (Saida et al., 1989).

Estes peptídeos apresentam grande variedade de efeitos biológicos, que inclui mediação de broncoconstrição, estimulação de liberação de peptídeo atrial natriurético, inibição da liberação de renina por glomérulos isolados, contração de músculo liso uterino e renal, estimulação da liberação de aldosterona através de células adrenocorticais e modulação da liberação de neurotransmissores e secreção de hormônio neuroendócrino (Rubanyi e Polokoff,1994). Além dessas ações in vivo, as ETs podem estimular a proliferação de melanócitos humanos (Yada et al. 1991), do músculo liso vascular (Nakaki et al. 1989), da célula mesangial renal em cultura (Simonson et al. 1989).

As ET-1 e ET-3 são as isoformas melhor estudadas, produzidas principalmente no endotélio vascular (Cunnighaham, et al. 1997).

ET-2 e ET-4 são produzidas pelas células da mucosa intestinal, pulmão e rins in vitro (Huribal, et al. 1994). Apesar de apresentarem semelhança estrutural, ET-1, ET-2 e ET-4 podem afetar a musculatura lisa do intestino e outros tecidos diferentemente (Cunningham, et al. 1997).

A ET-4 possui duas pontes disulfeto presentes nas ET-1 e ET-2, mas diferente da ET-1 que apresenta a asparagina, triptofano e leucina em lugar de serina, leucina e metionina nas posições 9,11 e 12 respectivamente, e diferente da ET-2 somente pela asparagina na posição 9 (Cunningham, 1997).

(32)

revelou que são constituídos por sete domínios transmembranares e pertencem à superfamília de receptores acoplados à proteína G (GPCR) (Rubanyi e Polokoff. 1994).

O primeiro subtipo, o receptor de endotelina A (ET-A), apresenta maior afinidade para ET-1, sendo expresso principalmente em células dos músculos liso vascular e cardíaco. Quando ativado a ETA induz vasoconstrição via ativação da fosfolipase C que catalisa a hidrólise de fosfatidilinositol (PIP2) para produzir DAG e IP3 e elevando a

concentração de cálcio intracelular promovendo a contração (Rubanyi e Polokoff, 1994). O segundo receptor de endotelina clonado, denominado receptor ET-B apresenta-se em todos os tecidos, e é ativado por todas as endotelinas com a mesma afinidade (Terada et al. 1992). Quando expresso em células endoteliais, acredita-se que regule a vasodilatação por liberação de um fator relaxante derivado do endotélio, o óxido nítrico (NO) e a prostaciclina (Rubanyi e Polokoff, 1994).

O terceiro receptor de ET, ET-C, demonstra seletividade à ET-3 e pode ser encontrado em células bovinas, nas células pituitárias e nos melanóforos (Emori et al. 1991; Karne et al. 1993). A ativação de células endoteliais por ET-C induz a liberação do óxido nítrico (Emori et al. 1991) uma vez que estimulam receptores nos lactótrofos inibindo a liberação de prolactina (Samson et al. 1990,1991).

2.2.1 Endotelina I

ET-1 é o mais potente vasoconstritor descrito até o momento, tanto em vasos de maior calibre (Yanagisawa et al. 1988) quanto na microcirculação (Fortes et al. 1989). É a única endotelina produzida pelas células endoteliais, sendo também produzida pelas células musculares lisas vasculares, células mesangiais e hepatócitos. Está presente no estômago, duodeno, jejuno, íleo e cólon (Takahashi et al. 1990). Pode ligar-se ao receptor ETA ou ETB (Masaki et al. 1994). Em fundus de estômago de camundongo normal tanto o receptor ETA como o receptor ETB estão envolvidos na contração induzida pela ET-1

(Mizuguchi et al. 1997), em músculo liso vascular o receptor ETA predomina sob o ETB (Masaki et al.1994; Miyuchi et al. 1999) (Fig. 4).

(33)

formação da artéria subclávica e sépto ventricular, além de retardamento do desenvolvimento do endocárdio. A ausência de ET-1 promove elevação e não dominuição da pressão arterial como seria esperado (Kurihara et al., 1994).

A ET-1 estimula a transcrição da fase G0 para G1 no ciclo celular, aumentando a

síntese de DNA. Entre os mecanismos intracelulares ativados pela ET-1 podemos citar a estimulação de várias quinases, incluindo a quinase S6 que fosforila uma das subunidades ribossomais; a proteína tirosina quinase pp60c-src, e as proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs). As MAPKs são fosforiladas e ativadas pelas quinases que reconhecem MAPKs (MAPKKs), que por sua vez são ativadas por outra quinase (MAPKK K), após ativação da proteína G como a Ras. Após sua fosforilação e ativação, as MAPKs ativam vários substratos que estão envolvidos na proliferação e diferenciação celular, como proteínas envolvidas na ativação do processo de transcrição (Elk, TAL1, RNA

(34)

liberação de agentes vaso relaxantes, tais como óxido nítrico (NO) ou prostaciclina (PGI2)

para induzir relaxamento do músculo liso ou inibição do crescimento celular. Retirado de Schiffrin (2005).

polimerase) e translação (PHAS1), proteínas envolvidas no rearranjo estrutural de outras proteínas (proteínas associadas a microtúbulos), bem como proteínas que ativam enzimas secundárias tais como a quinase S6 ribossomal e tironina hodroxilase/fosfatase (Schiffer et al., 1997; Douglas et al., 1997).

Rossi e colaboradores (2001) demonstraram que a ET-1 pode estimular a produção de NO, via receptor ET-B localizado nas células endoteliais e bloquea-la via ET-A, que é predominantemente localizado nas células do músculo liso vascular. A produção de ET-1 é inibida pelo NO derivado do endotélio (Bourlanger e Luscher, 1990) e o efeito contrátil induzido pela ET-1 é inibido pelo NO (Zhang et al., 1998). Sabe-se que a ET-1 pode ter sua ação vasoconstritora suprimida pela BK, via receptor B2 no endotélio (Momose et al.,

1993) assim como em artérias coronárias na presença de endotélio (Ohde. et al., 1992). Foi demonstrado que o captopril, inibidor da enzima conversora de AI (ECA), que diminui a formação de angiotensina II (A II) (Greene et al., 1972) e previne a degradação da BK (McGiff et al., 1972) pode também inibir a secreção de endotelina (Yoshida et al., 1992). Foi verificado que a ET-1 pode estimular a produção de leptina sendo que a leptina pode também aumentar os níveis séricos de ET-1 (Xiong et al., 2001)

A biossíntese de ET-1 é estimulada por fatores de risco cardiovasculares tais como altos níveis de colesterol LDL (Boulanger et al., 1992), deficiência de estrógeno (Akishita et al., 1996), obesidade (Ferri et al., 1995; Barton et al., 2000), isquemia (Firth et al., 1992) e lesão vascular (Wang et al., 1996). Por outro lado, a formação de NO e prostaciclina, mediada pela BK, inibe a produção basal de ET-1 nas células endoteliais (Momose et al., 1993).

2.3 Angiotensina II

(35)

de converter o decapeptídeo AI no octapeptídeo AII pela remoção dos resíduos His-leu da região carboxiterminal (Helmer, 1997). Trabalhos recentes descreveram a existência de outras vias para a síntese da AII a partir da AI (Tipnis et al., 2000). Como mostra o esquema da Fig. 5, a AI pode sofrer ação da ECA II, carboxipeptidase insensível a captopril, uma enzima relacionada a ECA (dicarboxipeptidase), resultando na formação de angiotensina (1-9) pela remoção de um resíduo de aminoácido (Leu). Em seguida a angiotensina (1-9) por ação da ECA será convertida em angiotensina (1-7) (Santos et al., 2001; Carey e Siragy, 2003).

Atuando no coração, no rim, no músculo liso vascular, na supra-renal e no cérebro, a AII desempenha um papel fundamental no controle da pressão arterial, na manutenção da homeostasia do sódio e água e no equilíbrio funcional e estrutural cardiovascular (Krieger e Santos, 1998).

(36)

Fig. 5. Cascata enzimática para a formação da AII. Esquema mostrando a cascata renina-angiotensina com várias etapas hidrolíticas a partir do angiotensinogênio e peptídeos relacionados com a angiotensina. ACE, enzima conversora da angiotensina I; ACE2, carboxipeptidase; PEP, prolill-endopeptidase. Adaptado de Carey e Siragy (2003).

A quase totalidade dos efeitos sistêmicos e locais resultam da interação da AII com receptores específicos de membrana, acoplados a proteínas G, que modificam em sistemas diversos a transdução de sinal, alguns ainda não completamente definidos (cAMP, fosfolipase C e IP3/DAG com a ativação de canais de cálcio) (Eberhardt et al.,

(37)

Atualmente são conhecidos três tipos receptores para a AII: subtipos AT1 (AT1-R),

AT2 (AT2-R) e AT4 (AT-R) (Carey e Siragy, 2003). Aparentemente os subtipos AT1-R e

AT2-R têm uma estrutura polipeptídica similar, com cerca de 360 aminoácidos com sete

domínios transmembranares, mas com 32% de homologia nas seqüências (De Gasparo et al.,2000). O AT1-R está geneticamente relacionado com o cromossomo três (localizado

num gene com 60 Kb e cinco exons) e o AT2-R é codificado por um gene com três exons

do cromossomo X. Enquanto o AT1-R é o mediador central dos principais efeitos

homeostáticos da AII como secreção de aldosterona e de catecolaminas, vasoconstrição e inotropismo cardíaco, potenciação adrenérgica e efeitos renais, as funções do AT2-R estão

direta ou indiretamente relacionadas com a diferenciação e a regeneração celular, com a inibição da proliferação induzida pela AII, com a indução da apoptose e com a eventual estimulação de fatores vasoativos de origem endotelial (De Gasparo et al., 2000).

Em condições fisiológicas diversas como, por exemplo, a maior ou menor depleção de sódio e a ativação do sistema renina-angiotensina (Ferrario et al., 1993) os receptores celulares da AII estão sujeitos a estímulos e processos que podem modificar significativamente a sua expressão nos tecidos (Matsubara et al., 1998; Ardaillou et al., 1999 b). De um modo geral, nos modelos animais de hipertrofia cardíaca, enfarto do miocárdio ou cardiomiopatia há uma superexpressão tecidual dos receptores da AII (AT1-R

e AT2-R), enquanto na falência miocárdica há uma redução na densidade dos AT1-R e,

conseqüentemente, um aumento proporcional dos AT2-R. Fenômeno idêntico foi

referenciado no miocárdio humano (Rogg et al., 1996), pelo menos nas fases avançadas da insuficiência cardíaca (Regitz et al., 1995). Em alguns estados fisiopatológicos, tais como proliferação da neoíntima, remodelagem pós-enfarte do miocárdio ou hipertrofia ventricular, tem-se admitido que a maior expressão, absoluta ou relativa, dos AT2-R

poderia estar relacionada com uma tentativa de re-equilibrar a estimulação excessiva dos AT1-R, procurando, dessa forma, controlar, direta ou indiretamente, o exagero de resposta

hipertrófica/hiperplásica (Chung et al., 1999). Curiosamente, o bloqueio crônico farmacológico dos AT1-R, em animais, provocou uma dissociação aparente entre os níveis

(38)

2.4 Camundongos nocaute para o receptor B1 ou B2 de cininas

Animais trangênicos têm sido gerados na tentativa de compreender melhor o papel do sistema calicreína-cinina no controle da pressão arterial e na inflamação. Em 1995, Borkowski e colaboradores, retiraram geneticamente o receptor B2 de camundongos

(KOB2) e verificaram que estes animais não apresentaram diferenças na pressão arterial,

quando submetidos a uma dieta com teor de sal moderado, no entanto ao acentuar a ingestão de sal, foi observado um aumento na pressão arterial, acompanhado de dilatação das cavidades do coração e rim destes animais (Alfie et al., 1996). Estes dados sugerem participação do receptor B2 na sensibilidade ao sal induzindo problemas cardiovasculares.

Por outro lado. Emanueli e colaboradores em 1999, opondo-se ao observado pelos autores acima, demonstraram que os animais nocaute B2 tornam-se hipertensos aos 60

dias do nascimento, apresentando também taquicardia, além de hipertrofia e fibrose cardíaca.

Camundongos nocaute B1 (KOB1)foram gerados por Pesquero e colaboradores em

2000. A caracterização fisiológica dos animais nocaute para o receptor B1 das cininas

demonstrou que estes animais 129SvJ/C57Bl-6 nocautiados apresentavam uma massa corporal 46% maior que os animais selvagens, isto aos 28 dias após o nascimento, sendo que esta diferença se mantinha até os 90 dias de vida. O estudo organométrico demonstrou que o coração e o baço dos animais KOB1 apresentavam maior massa

relativa à massa corporal que os animais selvagens (WT). Além disso, foi verificada uma menor ingestão de alimentos relativa à massa corporal em animais KOB1. Foi verificado

ainda um aumento na atividade da NO sintase no ipotálamo de animal trangênico KOB1,

quando comparada a atividade no mesmo tecido de animais selvagens (Araújo et al., 2000).

(39)

verificado que no modelo de pleuresia induzida por carragena a invasão de leucócitos polimornucleares foi ausente em animais KOB1, embora a permeabilidade endotelial e a

infiltração de células mononucleares tenham sido preservadas. Estes animais também apresentaram reações tardias na percepção do estimula doloroso (Pesquero et al., 2000).

Recentemente foram produzidos em nosso laboratório pelo Dr. Jõao Bosco Pesquero e colaboradores, camundongos onde os genes para os dois receptores de cininas foram deletados (KOB1B2). Estes animais estão sendo fisiológica e

farmacológicamento caracterizados. Em estudos preliminares observou-se que são normotensos.

2.5 Estômago

O estômago é um órgão exócrino e endócrino que digere os alimentos e secreta hormônios. É uma parte dilatada do tubo digestivo e é formado por várias camadas compostas por diversos tipos de células. A camada mais interna, e em contato direto com o alimento, é a mucosa, definida como o conjunto epitélio mais conjuntivo que reveste cavidades úmidas, como a boca, bexiga, intestino, etc., o tecido conjuntivo das membranas recebe o nome de lâmina própria ou córion. O estômago possui a camada muscular da mucosa, localizada abaixo da lâmina própria, e em seguida a camada muscular. Estas camadas contêm feixes de musculatura lisa, de contração involuntária. A contração destes feixes de musculatura, provocam os movimentos peristálticos e de mistura do alimento no estômago (Guyton ,1991).

2.6 Aorta

A aorta é a principal artéria sistêmica do corpo e como descrito por Junqueira et al. (1974), divide-se em aorta ascendente, arco aórtico e aorta descendente. A porção da aorta descendente no tórax é chamada aorta torácica. O segmento abdominal é denominado aorta abdominal. A aorta é uma artéria elástica, de túnica espessa e constituída, em grande parte, por lâminas de tecido elástico. Microscopicamente caracteriza-se por:

(40)

• Camada média, formada por fibras elásticas e musculares dispostas de forma concêntrica, que chega a representar 80% da parede do vaso;

• Camada adventícia, constituída por tecido conjuntivo com fibras elásticas.

A BK tem receptores no endotélio e a ativação dos mesmos pode originar a formação de NO que se difunde para a camada média e induzir relaxamento. Além disso há receptores que podem induzir efeito direto sob o tônus vascular (Leeb-Lundberg et al.,2005).

(41)

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Materiais 3.1.1 Reagentes

Os peptídeos BK, DBK, AII, ET-1, PD 123319 e PD156252 foram adquiridos da Calbiochem (EMD Biosciences, Inc. 10394 Pacific Center Court – San Diego, CA 92121). O carbacol (CCh), (NPS), a norepinefrina (NE), ácido acético glacial, ácido etílico diamino tetracético (EDTA), pepstatina, ácido trifluroacético, acetonitrila e fluoreto phenilmetilsufonilfluoride (PMSF) da Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, EUA). Todos os sais e a glucose foram da Merck (Darmstald, Alemanha) e o L-NAME (cloridrato) da Sigma foi gentilmente cedido pela Profa. Dra Rita de Cássia Aleixo Tostes do Departamento de Farmacologia da USP.

Para dosagem de ET-1 no plasma foram utilizados kit Endothelin-1 Biotrak ELISA System, RPN 228 da Amersham Biosciences UK Limeted (Buckinghamshire, UK) e coluna SEP-PAK C18 (Península Laboratories, Inc.).

3.1.2 Animais

Foram utilizados camundongos 129SvJ/C57Bl-6 para o KOB1, 129/SvJ para KOB2 e

C57Bl-6 como KOB1B2. Os animais utilizados eram todos machos, com idade entre 12 e

16 semanas, provenientes do Departamento de Biofísica.

3.1.3 Soluções

As soluções concentradas (10-2 - 10-4 M) da AII, BK, DBK e NPS foram preparadas em água deionizada e guardadas em tubos de polipropileno à -20°C. As diluições necessárias foram feitas no momento do experimento.

A solução concentrada de ET-1 (10-4_{M) foi preparada em ácido acético glacial a}

0,1% , a solução estoque de NE (10-2 _{M) em HCl 0,1N e a NE (10}-3_{) em salina contendo}

10% de ácido ascórbico.

(42)

Tabela 1. Composição da solução de Krebs.

Reagente Concentração (mM)

NaCl 122,00 KCl 5,90

MgCl2 1,25

NaHCO3 15,00

C6H12O6 11,00

CaCl2 1,25

Tampão de Extração:

NaCl 1%, HCl 1N, ácido fórmico 1% , ácido trifluoroacético 1%.

Tampão A:

Ácido trifluoroacético 1%

3.1.4 Equipamentos utilizados nos testes farmacológicos

Para o registro da atividade mecânica de órgãos isolados, utilizou-se transdutor de força (NARCO Bio-Systems Division of intermnational Biomedical, INC. Myograph F-60), um amplificador (E805, Hewlett- Parckard, Palo Alto, CA) e um registrador potenciométrico (RB – 102, ECB, São Paulo).

Utilizou-se ainda: agitador de tubos Phoenix AP56 (SP,Brasil); Speed Vac Svant Plus SC110 (Savant Instruments, Inc. EUA); centrífuga refrigerada Hettich Zentrifugen modelo 16R, rotor 1616; purificador de água Milli-Q TM_{Water System da Millipore Corp., Bedford,}

(43)

3.2 Métodos

3.2.1 Registro de Contração Isométrica

Registros isométricos da variação de tensão nos tecidos, vascular (aorta) e não vascular (fundus de estômago), por meio de um transdutor de força.

3.2.2 Registro de Contração Isométrica em Fundus de Estômago

Após a decaptação do animal, o fundus do estômago foi removido preservando-se a mucosa e os nervos, dividido longitudinalmente em duas tiras, lavado em solução de Krebs e suspenso em cuba de vidro de 5ml, preenchida com solução de Krebs a 37ºC e aerada (95% O2 – 5% CO2) com tensão de 0,5g.

As tiras de estômago permaneceram sob estas condições por 90 min, após o qual foram estimuladas com KCl (80mM) até a estabilização da preparação.

Para a construção de curvas concentração-resposta, adicionou-se concentrações crescentes do agonista em estudo. Para curvas cumulativas, aplicou-se concentrações crescentes do agonista sem lavagem entre as doses. Para as curvas não cumulativas o agonista foi lavado após cada estimulação com 90 s de contato e 20 min de intervalo ou aplicando-se uma única concentração do agonista em cada preparação (para a ET-1).

Os gráficos obtidos foram analisados utilizando-se o programa “GraphPad Prism” (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). A partir da análise interativa de ajuste dos dados a uma equação sigmóide pelo programa computacional, foi determinado, em cada experimento o valor de EC50, equivalente a concentração que produz 50% do efeito máximo e o valor de pD2, logaritmo negativo da concentração molar do agonista que

produz 50% do efeito máximo e o efeito máximo induzido pelo agonista (Emax).

3.2.3 Registro de Contração Isométrica na Aorta Abdominal

(44)

permaneceram sob estas condições por 90 min durante o qual foram estimulados com KCl (60 mM) para estabilização da preparação.

A presença de endotélio foi determinada ao final de cada experimento pela adição de NE (1µM) e registro de relaxamento pela Ach (10-5M).

Os anéis da aorta foram estimulados pela adição de concentrações crescentes do agonista em estudo. As doses foram administradas isoladamente para evitar taquifilaxia.

3.2.4 Protocolo taquifilático

O agonista foi colocado em contato com o tecido em estudo (fundus de estômago ou aorta abdominal) por 90 segundos, após o qual foi lavado com solução de Krebs.

Este procedimento foi repetido por três vezes, usando-se a mesma concentração do agonista em intervalos de 5 minutos (Shimuta et al. 1989).

A amplitude de cada resposta obtida foi medida e os resultados expressos como índice taquifilático, que foi calculado pela razão entre a terceira e a primeira resposta.

3.2.5 Determinação dos níveis de ET-1 em fundus de estômago e aorta abdominal de camundongos WT, KOB1 e KOB2

3.2.5.1 Preparo do tecido

Os animais foram sacrificados, como previamente descrito, e o fundus de estômago e aorta abdominal rapidamente removidos e congelados em nitrogênio líquido.

Antes de cada ensaio o tecido foi pesado e agrupado para obter amostra suficiente para análise (quatro a cinco).

(45)

3.2.5.2 Purificação de ET-1

Preparou-se a coluna sepak - C18 lavando-a por quatro vezes com 5 ml de metanol, seguido por 4 vezes com 5 ml de acetonitrila, e 4 vezes com tampão A.

As amostras foram descongeladas, misturadas com duas vezes o seu volume de tampão A e então transferidas para a coluna.

Em seguida a coluna foi lavada 4 vezes com 5 ml de tampão A, seguida por 3,5 ml de acetonitrila 20% v/v contendo 0,1% v/v de ácido trifluoroacético. A ET-1 foi eluida com 3,5 ml de acetonitrila á 50% v/v contendo ácido trifluoroacético 0,1% v/v.

O solvente foi evaporado sob gás nitrogênio até 0,5 ml e em seguida congelada em nitrogênio líquido “over night”, o que permitiu a remoção do solvente.

No dia seguinte ressuspendeu-se a amostra em 250 µl de tampão de ensaio utilizado no Kit Endothelin-1 Biotrak Elisa System.

3.2.6 Estatística

Os resultados experimentais foram apresentados como média ± erro padrão da média (E.P.M.).

(46)

4 RESULTADOS

4.1 Preparação não vascular: fundus de estômago

4.1.1 Determinação da potência e efeito máximo da BK na ação contrátil sobre o fundus do estômago isolado de camundongos

Com objetivo de determinar a afinidade relativa dos receptores B1 e B2 de cininas

que são expressos constitutivamente no estômago de camundongos C57/BL6, curvas concentração-resposta foram obtidas (Fig. 6). Os valores de pD2, que expressa a potência

relativa e das respostas máximas (Emax) equivalentes à eficácia do agonista

foram determinados a partir dessas curvas concentração-resposta para a BK. A fim de investigar se ocorre dessensibilização da preparação a esse agonista obteve-se curvas cumulativas pelas adições sucessivas do peptídeo com doses crescentes sem lavagem.

Nestas condições, curvas cumulativas e não-cumulativa foram obtidas que são mostradas na Fig. 6, das quais os seguintes valores de pD2 foram obtidos para a BK: 7,7 ±

0,2 a partir de curvas cumulativas e 7,6 ± 0,1 de curvas não-cumulativas. Como se pode observar nesta Fig., além da semelhança na potência, não houve diferença significativa entre as respostas máximas obtidas pela curva cumulativa e não-cumulativa, indicando que não houve dessensibilização pelas adições sucessivas da BK ao fundus do estômago de camundongos.

(47)

-11

-10

-9

-8

-7

-6

-5

0

25

50

75

100 não cumulativa

cumulativa

log [BK] M

Co

ntr

aç

ão (% CCh)

Fig. 6. Determinação da potência e efeito máximo da BK na ação contrátil sobre o fundus do estômago isolado de camundongos. Curvas concentração-resposta para bradicinina (BK) em fundus de estômago de camundongo C57/BL6, obtidas a partir de registro de contração isométrica. A estimulação das preparações com concentrações crescentes da BK foi efetuada com administrações sucessivas, de modo cumulativo, ou com a remoção do agonista após cada estimulação com intervalos de 20 min (não cumulativa). Cada ponto representa o valor médio ± E.P.M. da resposta percentual à BK em relação à do carbacol (1µM, CCh), considerada 100%.

(48)

4.1.2 Curvas cumulativas concentração-resposta da BK em fundus de estômago de camundongo WT e KOB1

A determinação da potência e da eficácia da BK em contrair o fundus do estômago de camundongos WT e KOB1, foi efetuada através de registros de contração isométrica e

construção de curvas concentração-resposta, em doses cumulativas, uma vez que foi demonstrado que adição sucessiva de BK não causa dessensibilização da preparação. Os valores de pD2 obtidos das curvas da Fig. 7 foram 7,2 ± 0,2 e 6,9 ± 0,1, respectivamente

para WT e KOB1.

-11

-10

-9

-8

-7

-6

-5

0

25

50

75

100 WT

KOB

₁

log [BK] M

C

o

nt

ra

ç

ã

o

(%

C

h)

Fig. 7.Curvas concentração resposta da BK em fundus de estômago de camundongo WT e KOB1, obtidas a partir de registros de contração isométrica. Cada ponto representa a

(49)

4.1.3 Efeito máximo da BK em fundus de estômago de camundongos WT e KOB1 Os dados de Emax das respostas contráteis máximas induzidas pela BK foram

estatisticamente diferentes (Fig. 8), indicando que houve diferença na eficácia do peptídeo sobre o estômago isolado de animais nocaute B1 (KOB1) em relação ao controle (WT).

WT

KOB

₁

0

25

50

75

100 *

log [BK] M

C

ont

ra

ç

ã

o M

á

x

. (

%

C

h

)

Fig. 8. Efeito máximo da BK em fundus de estômago de camundongos WT e KOB1.

Comparação entre os valores percentuais do efeito máximo (Emáx) da BK (1µM) sobre o

fundus de estômago de camundongo contole (WT) e nocaute B1 (KOB1) em relação ao

(50)

4.1.4 Efeito taquifilático induzido pela BK em fundus de estômago de camundongos WT e KOB1

Para verificar se ocorre taquifilaxia à BK em fundus de estômago de camundongos controle (WT) e nocaute B1 (KOB1), foi aplicado protocolo taquifilático que consiste em

repetidas estimulações com 1 µM do agonista incubado por 90 s e intervalos de 5 min. Ocorreu uma inibição maior na amplitude das respostas do estômago isolado do KOB1. A

Fig. 9 mostra a diferença entre os índices taquifiláticos ou de inibição, considerando-se a inibição percentual na amplitude da terceira resposta em relação à primeira.

Fig. 9. Efeito taquifilático induzido pela BK em fundus de estômago de camundongos WT e KOB1. Contrações isométricas foram registradas em resposta a 1 µM de BK, com três

sucessivas adições do peptídeo, com incubações de 90 s de contato e 5 min de intervalo. A taquifilaxia foi determinada pelo grau de inibição (%) na amplitude da terceira resposta em relação à primeira. Os valores representam média ± E.P.M. de 4 experimentos com animais WT e 3 experimentos com KOB1. *Diferença significativa (P<0,05).

0 1 0

2 0

3 0

4 0

*

In

ib

içã

o

(

%

)

K O B

₁

(51)

4.1.5 Efeito do L-NAME sobre a resposta contrátil à BK em fundus de estômago de camundongos WT e KO B1

Com objetivo de verificar se NO está envolvido na diminuição do efeito máximo induzido pela BK em fundus de estômago de camundongos nocaute B1, testou-se o efeito

do peptídio 1µM na ausência e na presença de 1 mM L-NAME, inibidor da NO sintase, que foi pré-incubado durante 20 minutos. Os resultados mostraram que L-NAME não alterou a resposta contrátil induzida pela BK em camundongos WT e KOB1. As respostas foram

30% para 1 µM de BK no KOB1 e 75% no WT na presença de L-NAME enquantoa na sua

(52)

4.1.6 Curva concentração resposta da DBK cumulativa e não cumulativa em fundus de estômago de camundongos

Com objetivo de investigar se ocorre dessensibilização no fundus de estômago de camundongos quando estimulados com doses cumulativas de DBK, acrescentou-se doses crescentes a cada 90 segundos sem a remoção do agonista.

Curvas concentração resposta foram obtidas (Fig. 10) e os valores de pD2, e de

efeito máximo não foram significativamente diferentes. Esses resultados estão mostrados na Fig. 11.

-10

-9

-8

-7

-6

-5

0

25

50

75

100 não cumulativa

cumulativa

log [DBK] M

C

o

n

tr

a

ção

(

%

C

h

)

(53)

4.1.7 Determinação da potência da DBK em fundus de estômago de camundongos WT e KOB2

Após a verificação de que não houve dessensibilização à DBK (Fig. 10) investigou-se o efeito deste agonista na ausência do receptor B2 de cininas com doses cumulativas.

Curvas cumulativas concentração-contração para DBK foram obtidas para determinação da potência e eficácia do agosnista.

De acordo com a Fig. 11 a potência da DBK não foi significativamente diferente, sendo os valores de pD2 8,0 ± 0,3 para WT e 8,5 ± 0,2 para KOB2.

-11

-10

-9

-8

-7

-6

0

25

50

75

100 WT

KOB

₂

log [DBK] M

Co

nt

ra

çã

o (

%

C

h)

Fig. 11. Curvas cumulativas concentração-resposta para DBK em fundus de estômago isolado de camundongo WT e KOB2. Os resultados percentuais foram calculados em

(54)

4.1.8 Efeito máximo da DBK sobre fundus de estômago isolado de camundongos WT e KOB2

Os efeitos máximos da DBK sobre o estômago isolado de animais WT e KOB2,

foram comparados. Como pode ser observado na Fig. 12, os valores de Emax. para os

animais controle (WT) e na ausência do receptor B2 (KOB2) foram semelhantes, indicando

não haver diferença significativa na eficácia da DBK entre os dois grupos de animais.

0

25

50

75 Co

n

tr

a

ç

ã

o

(

%

C

h

)

WT

KOB

₂

Fig. 12. Efeito máximo da DBK sobre fundus de estômago isolado de camundongos WT e KOB2. Comparação entre os efeitos máximos da DBK (1 µM) sobre o fundus do estômago

isolado de camundongos controle (WT) e nocaute B2 (KO B2) expresso como percentual

(55)

4.1.9 Efeito taquifilático induzido pela DBK em fundus de estômago de camundongos WT, KOB2

Com objetivo de verificar se ocorre taquifilaxia à resposta contrátil em fundus de estômago de camundongos WT e KOB2, foi aplicado protocolo taquifilático (repetidas

estimulações com 1µM do agonista com 90 s de contato e 5 min de intervalo). Observou-se que a terceira resposta foi completamente inibida, porém não houve diferença na intensidade de inibição entre camundongos WT e KOB2.

4.1.10 Efeito da ET-1: dose cumulativa e não-cumulativa em fundus de estômago de camundongos C57Bl/6

Inicialmente investigou-se a potência e a eficácia da ET-1 no fundus de estômago de camundongos quando estimulado com doses cumulativas ou não cumulativas do gonista. Para isso foram utilizadas concentrações crescentes do agonista com intervalos de 20 min entre doses e lavando-se após 4 min. de contato enquanto um outro grupo era estimulado a cada 4 min sucessivamente.

Curvas concentração-resposta foram obtidas para ET-1 (Fig. 13) e os valores de pD2, foram: 8,0 ± 1,4 e 7,7 ± 4,1 pera curva cumulativa e não-cumulativa,

(56)

-11

-10

-9

-8

-7

-6

0

50

100 não cumulativa

cumulativa

*

log [ET-1] M

C

o

n

tr

ação

(

%

C

h

)

Fig. 13. Curvas concentração resposta para a ET-1 administrada cumulativa e não cumulativamente em fundus de estômago de camundongo C57Bl/6. As curvas foram obtidas a partir de registros de contração isométrica e cada ponto representa a média ±

(57)

4.1.11 Efeito da ET-1 em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2 Com o objetivo de investigar o efeito da ET-1 em fundus de estômago de animais na presença e ausência dos receptores B1 ou B2 de cininas, foram realizados ensaios com

registros da contração isométrica em tiras de fundus de estômago. Como foi verificado que em curvas cumulativas a ET-1 induz drástica redução no efeito máximo, pela dessensibilização induzida pelo agonista, as preparações foram estimuladas uma única vez, para as diferentes concentrações do agonista. As curvas não-cumulativasforam utilizadas para determinar a potência e a eficácia da resposta induzida pela ET-1 e mostradas na Fig. 14. Os valores de pD2: 7,7 ± 0,3 (WT), 8,1 ± 0,2 (KOB1) e 8,2 ± 0,10

(KOB2), indicando que a ausência de um dos receptores de cininas não afetou a

afinidade relativa do agonista.

-1 0 -9 -8 -7 -6

0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5

W T K O B₁ K O B₂

lo g [ET-1 ] M

Co n tr a ç ã o ( % C Ch )

Fig. 14. Efeito da ET-1 em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2.

Curva concentração-resposta da ET-1 em fundus de estômago de camundongo WT, KOB1

e KOB2 obtidas a partir de registro de contração isométrica com dose única por tira de

(58)

4.1.12 Efeito máximo da ET-1 em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e

KOB2

O efeito máximo da ET-1, à concentração de 1µM, mostrou-se estatisticamente semelhante nos três tipos de preparação. Conforme mostrado na Fig. 15, a eficácia da ET-1 em induzir a contração máxima não diferiu nos animais KOB1 e KOB2.

0

25

50

75

100 WT

KOB

₁

KOB

₂

C

o

n

tr

ação

M

áx.

(%

C

h

)

Fig. 15. Efeito máximo da ET-1 em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e

KOB2. Efeito máximo da ET-1 (1µM) em fundus de estômago de camundongos controle

(WT), nocaute B1 (KOB1) e nocaute (KOB2) é expresso como percentagem do efeito

(59)

4.1.13 Efeito taquifilático induzido pela ET-1 em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2

Para efeito de comparação a Fig. 16 apresenta os resultados obtidos após aplicação do protocolo taquifilático em fundus de estômago dos animais WT, KOB1 e KOB2 que

consistiu em três tratamentos sucessivos com a ET-1 (1µM), com 90 s de contato e 5 min de intervalo, com objetivo de determinar a taquifilaxia da resposta contrátil induzida pelo agonista. Já foi verificado que a ET-1 induz marcante dessensibilização (Fig. 13).

O índice taquifilático foi expresso como inibição percentual da amplitude da terceira resposta em relação à primeira. A Fig. 16 mostra que a ET-1 induziu uma drástica inibição, que foi comparável nos tecidos isolados de WT, KOB1 e KOB2.

WT

KOB

₁

KOB

₂

0

50

100 In

ib

iç

ão

(

%

)

Fig. 16. Efeito taquifilático induzido pela ET-1 em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e KOB2.Comparação do efeito taquifilático da ET-1 em fundus de estômago de

camundongos controle (WT), nocaute B1 (KOB1) e nocaute B2 (KOB2). Contrações

(60)

4.1.14 Dosagem de ET-1 em fundus de estômago de camundongos WT, KOB1 e

KOB2

Para verificar se a concentração de ET-1 endogenamente expressa em fundus de estômago estaria afetada pela deleção de um dos receptores de cininas, níveis deste peptídeo foram determinados em tiras do estômago de animais WT, KOB1 e KOB2. Como

mostra a Fig. 17, a concentração de ET-1 expressa no fundus de estômago foi maior nos animais KOB1 quando comparado com WT e KOB2.

0

1

2

3 [E

T-1

]

(p

m

o

l/g

)

_*

WT

KOB

₁

KOB

₂

Fig. 17. Determinação da concentração de ET-1 em fundus do estômago isolado de camundongos WT, KOB1 e KOB2. Níveis de ET-1 foram expressos em pmoles/g de tecido

do estômago de camundongos controle (WT), nocaute B1 (KOB1) e nocaute B2 (KOB2). Os

(61)

4.1.15 Efeito da indometacina sobre a resposta à BK em fundus de estômago de camundongos WT e KOB1

A observação que os níveis de ET-1 encontram-se aumentados apenas no estõmago de animais KOB1, onde o Emax para a resposta à BK está reduzida, juntamente com o

dado da literatura que a ET-1 além de regular a síntese do receptor B2 pode estimular a

produção de fatores relaxantes derivados do endotélio como a prostaciclina, nos levou a estudar o efeito da indometacina, um inibidor da produção de prostanoides. A indometacina (3 µM) foi pré-incubada por 40 min no meio nutritivo contendo o fundus de estômago de camundongos WT e KOB1 e o efeito da BK foi testado. Os valores da

resposta contrátil induzida pela BK (1 µM) foram: 29% na ausência e 21% na presença da indometacina para KOB1 (respostas percentuais em relação a 1 µM de carbacol). Portanto

a indometacina não potenciou a resposta contrátil induzida pela BK, em animais KOB1,

indicando que os prostanóides não estão envolvidos nas respostas mediadas pela BK no estômago de camundongo.

4.1.16 Efeito contrátil da AII: dose cumulativa e não-cumulativa em fundus de estômago de camundongos

Com objetivo de investigar se a potência e a eficácia da AII são afetadas em fundus de estômago de camundongos quando estimulado com doses cumulativas ou não cumulativas (doses crescentes do agonista com intervalos de 20 min e 90 s de contato), curvas concentração-resposta foram obtidas (Fig. 18). Os valores de pD2 foram: 7,9 ± 0,3