Viabilidade de cepas de Malassezia pachydermatis mantidas em diferentes métodos de conservação.

Viabilidade de cepas de

Malassezia pachyderm atis m an tidas

em diferen tes m étodos de con servação

Viability of Ma la sse zia pa chyde rm a tis strains maintained

in various storage mediums

Marília Dutra Girão

_,

_{Marilena Ribeiro do Prado}

_{, Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante}

_,

Rossana Aguiar Cordeiro

_{, André Jalles Monteiro}

_{, José Júlio Costa Sidrim}

e Marcos Fábio Gadelha Rocha

RESUMO

A m a nute nç ã o de c ultura s de Malassezia pachydermatis e m m ic o te c a s é im po rta nte pa ra e studo s re tro spe c tivo s e pro spe c tivo s.

O o b je tivo de ste tra b a lho fo i a va lia r o c o m po rta m e nto de Malassezia pachydermatis fre nte a dife re nte s m é to do s de c o nse rva ç ã o

de c u ltu ra s. Pa ra ta n to , a pó s o pro c e sso de ide n tific a ç ã o , e ssa le ve du ra fo i e sto c a da , po r se is e n o ve m e se s, e m sa lin a e sa lin a c o m ó le o m in e ra l a 28° C, b e m c o m o , e m á ga r Dixo n , á ga r Dixo n a c re sc ido de glic e ro l e á ga r Dixo n a c re sc ido de dim e til- su lfó xido ( DMSO) a - 20° C. Os m e io s de Dixo n e Dixo n a c re sc ido de glic e ro l fo ra m o s m é to do s m a is a de q u a do s ( p< 0,05) pa ra m a n te r a via b ilida de da s c e pa s, e m se is e n o ve m e se s de e sto q u e . Qu a lq u e r do s m é to do s u tiliza do s fo i c o n ve n ie n te pa ra m a n u te n ç ã o da po sitivida de n a pro va da u re a se e m se is m e se s de e sto c a ge m , se n do o á ga r Dixo n e o á ga r Dixo n a c re sc ido de glic e ro l, o s m e lho re s ( p< 0,05) pa ra no ve m e se s. Po rta nto , pa ra a re c upe ra ç ã o e m a nute nç ã o da s c a ra c te rístic a s de Malassezia pac hydermatis, re c o m e n da - se o e m pre go do m e io de Dixo n o u do m e io de Dixo n a c re sc ido de glic e ro l.

Pal avr as-chave s: Le ve d u ra s. Malassezia pac hydermatis. Ma n u te n ç ã o d e f u n go s. Mi c o te c a . Vi a b i li d a d e b i o ló gi c a .

ABSTRACT

Th e m a i n te n a n c e o f Malassezia pac hydermatis i n f u n ga l c o lle c ti o n s i s ve ry i m p o rta n t f o r re tro sp e c ti ve a n d p ro sp e c ti ve

stu d i e s. Th e a i m o f th i s stu d y wa s to e va lu a te th e b e h a vi o r o f Malassezia pac hydermatis i n d i f f e re n t sto ra ge m e th o d s.

Af te r th e i d e n ti f i c a ti o n p ro c e ss, M. pac hydermatis stra i n s we re sto re d f o r si x a n d n i n e m o n th s, i n sa li n e a n d sa li n e p lu s

m i n e ra l o i l a t 2 8 ° C, a s we ll a s i n Di x o n ’s a ga r, Di x o n ’s a ga r p lu s glyc e ro l a n d Di x o n ’s a ga r p lu s d i m e th yl- su lf o x i d e ( DMSO) , a t - 2 0 ° C. Di x o n ’s a ga r a n d Di x o n ’s a ga r p lu s glyc e ro l w e re th e m o st a d e q u a te m e th o d s ( p < 0 .0 5 ) f o r th e

m a i n te n a n c e o f Malassezia pac hydermatis vi a b i li ty, a f te r si x a n d n i n e m o n th s o f sto ra ge . All th e m e th o d s u se d we re

c a p a b le o f m a i n ta i n i n g th e u re a se a c ti vi ty a t si x m o n th s o f sto ra ge , b u t o n ly Di x o n ’s a ga r a n d Di x o n ’s a ga r p lu s glyc e ro l

we re sta ti sti c a lly a d e q u a te a t n i n e m o n th s ( p < 0 .0 5 ) . Th u s, to a ssu re Malassezia pac hydermatis re c o ve ry a n d to m a i n ta i n

i ts c h a ra c te ri sti c s, Di x o n ’s a ga r o r Di x o n ’s a ga r p lu s glyc e ro l sh o u ld b e u se d .

Ke y-words: Ye a st. Malassezia pac hydermatis. Fu n gi m a i n te n a n c e . Bi o lo gi c a l vi a b i li ty.

1 . Fac uldade de Veterinária do Pro grama de Pó s-graduaç ão em Ciênc ias Veterinárias da Universidade Estadual do Ceará, Fo rtaleza, CE, B rasil. 2 . Departamento de Pato lo gia e Medic ina Legal da Fac uldade de Medic ina do Centro Espec ializado em Mic o lo gia Médic a da Universidade Federal do Ceará, Fo rtaleza, CE, B rasil. 3 . Departamento de Estatístic a e Matemátic a Aplic ada da Universidade Federal do Ceará, Fo rtaleza, CE, B rasil.

En de r e ço par a cor r e spon dê n ci a: Dra. Marília Dutra Girão . R. Ro drigues Júnio r 7 1 2 , Centro , 6 0 0 6 0 -0 0 0 Fo rtaleza, CE, B rasil. Tel: 8 5 9 9 4 6 -1 5 4 0 , Fax: 8 5 2 9 5 -1 7 3 6

e-mail: mariliagirao @ ho tmail.c o m Rec ebido para public aç ão em 1 1 /1 1 /2 0 0 3 Ac eito em 1 9 /4 /2 0 0 4

O gênero Ma la sse zia c ompreende leveduras lipofílic as que fazem parte da mic robiota c utânea do homem e animais. O seu isolamento a partir do meio ambiente é exc epc ional, pois sua sobrevivênc ia está c ondic ionada à presenç a de uma fonte lipídic a, exc etuando-se a espéc ie Ma la sse zia p a c h yd e rm a ti s,

que é menos exigente no requerimento de lipídeos para seu desenvolvimento1 5 1 6 2 5_.

A par tir da dé c ada de 1 9 8 0 , as le ve dur as do gê ne r o

Ma la sse zi a ganharam espec ial atenç ão, princ ipalmente na

M. pa c hyde rm a tis é a espécie mais adaptada a animais, sendo freqüentemente isolada c omo mic robiota de c onduto auditivo e pelame de cães, gatos e outras espécies de animais domésticos e selvagens. Em cães tem sido comumente associada a quadros clínicos de otites externas e dermatites, estando sua proliferação intensa associada a processos de desequilíbrio local ou sistêmico1 6 2 0 2 2_.

A manutenç ão de mic ro rganismo s em mic o tec as é de fundam e ntal im po r tânc ia par a e studo s r e tr o spe c tivo s e prospec tivos, que enfoquem sua biologia, etiologia e aspec tos epidemiológic os. Entretanto, para uma satisfatória análise fenotípic a e genotípic a, a longo prazo, é nec essária a esc olha adequada do método de preservaç ão5_.

A seleç ão de métodos apropriados para estoc agem de fungos baseia-se nas c arac terístic as fenotípic as inerentes a c ada mic rorganismo, bem c omo, no c omportamento de c ada espéc ie frente aos métodos de preservaç ão. Diversas téc nic as de estoc agem têm sido relatadas na literatura espec ializada, po r é m , n e n h um a te m s e m o s tr a do ple n a m e n te e fic a z, requerendo-se a c onjunç ão de dois ou mais métodos, para garantir melhor rec uperaç ão das c epas2 3 5 1 0 2 1_.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o c omportamento de c ultivo s de M. p a c h yd e rm a ti s, pr o c e de nte s de c o nduto s auditivos de c ães, frente a diferentes métodos de estoc agem.

MATERIAL E MÉTODOS

Co lheita do espécime clínico . Os espéc imes c línic os foram obtidos através de dois swa b s estéreis introduzidos, c om movimentos rotatórios, no terç o proximal do c onduto auditivo dos c ães, c onforme c itado por Mac hado et al2 2_{. Este}

pro c edimento fo i realizado apó s o preenc himento de um questionário c om dados referentes ao animal, c omo: estado de higidez, idade, sexo, raç a, pelagem, habitat, c onformaç ão da orelha e possíveis utilizaç ões de medic amentos.

Pr o c e s s a me nto la bo r a to r ia l. Par a a e xe c uç ão do exame direto eram c onfec c ionados esfregaç os do material biológic o, c orados pela téc nic a de Gram, sendo realizada a leitura em 4 0 c ampos, c om aumento de 4 0 vezes.

O material c línic o presente no segundo swa b foi semeado n o s m e io s de c ultur a á ga r Sa b o ur a ud de x tr o s e , á ga r Sabouraud dextrose ac resc ido de c loranfenic ol ( 0 ,0 5 g/l) , ágar Sab o ur aud de xtr o se c o m c lo r anfe nic o l ( 0 , 0 5 g/l) e

glabrosa e c oloraç ão variando no tom de amarelo-c reme. As l e ve d u r a s s u ge s ti va s d e Ma l a s s e z i a s p p e r a m c onsideradas c omo M. pa c hyde rm a ti s, quando apresentavam c resc imento c onc omitante no ágar Sabouraud dextrose e no meio de Dixon, assoc iado à positividade na prova da urease, c onforme desc rito por Sidrim e Moreira2 5_.

Estoque das cepas. Os métodos utilizados c onsistiram de: 1 ) salina; 2 ) salina com óleo mineral ( 1 :1 0 ) ; 3 ) ágar Dixon; 4 ) ágar Dixon ac resc ido de glic erol a 1 0 % ( c rioprotetor) ; 5 ) ágar Dixon ac resc ido de dimetil-sulfóxido 1 0 % ( DMSO; c rioprotetor) . Nos dois primeiros métodos, os c ultivos eram mantidos à temperatura ambiente ( 2 8 ° C) , enquanto que os demais foram submetidos a c ongelamento a -2 0 ° C.

Verificação da viabilidade das cepas. Após seis meses de estocagem, as 48 cepas de M. pa chyde rm a tis mantidas a -20° C, em ágar Dixon, ágar Dixon acrescido de glicerol 10% e ágar Dixon com DMSO 10%, foram descongeladas. Em seguida, um pequeno inóculo foi repicado para ágar Dixon, sendo observado diariamente por um período de dez dias. Nas cepas estocadas em salina e salina com óleo mineral, a 28° C, após leve agitação, uma pequena alíquota foi transferida para o meio Dixon, onde o crescimento fo i ta m b é m a c o m p a n h a d o p o r 1 0 d i a s . As c e p a s d e

M. pa chyde rm a tis que cresceram no ágar Dixon foram repicadas

em ágar Sabouraud dextrose, com o objetivo de se avaliar a preservação da não lipo-dependência. A prova da urease foi realizada com o objetivo de se verificar a manutenção da atividade de sta e nzima. Apó s no ve me se s de e sto que , as c o ndutas supracitadas foram repetidas, no entanto, com somente 24 cepas

de M. pa chyde rm a tis, em virtude de razões técnico-operacionais.

Análise estatística. Na análise dos dados foram utilizados testes de homogeneidade de proporções ( Teste exato de Fisher)1 4_.

Os valores de p

<

RESULTADOS

Os resultados de seis meses de manutenç ão demostraram que houve rec uperaç ão estatistic amente signific ante das c epas

de M. p a c h yd e rm a ti s e sto c adas e m ágar Dixo n a -2 0 ° C

( 7 0 , 8 % ; n = 3 4 ) , e m ágar Dixo n ac r e sc ido de glic e r o l ( 6 8 ,8 % ; n = 3 3 ) , em ágar Dixon ac resc ido de DMSO ( 6 8 ,8 % ; n = 3 3 ) e em salina c om óleo mineral ( 6 0 ,4 % ; n = 2 9 ) , em relaç ão ao emprego da salina ( 3 9 ,6 % ; n = 1 9 ) ( Figura 1 ) .

par tir da manute nç ão de se is me se s, e vide nc io u- se q ue 1 0 0 , 0 ; 8 2 , 8 ; 8 2 , 4 ; 8 1 , 8 e 7 8 , 8 % da s c e pa s m a n tida s , respec tivamente, em salina, salina c om óleo mineral, ágar Dixon, ágar Dixon ac resc ido de DMSO e ágar Dixon ac resc ido de glic ero l, c resc eram independentemente do méto do de c onservaç ão adotado ( Tabela 1 ) .

No em momento que utilizou-se o ágar Sabouraud dextrose c om a finalidade se avaliar a não-lipodependênc ia das c epas

de M. pa c hyde rm a tis, rec uperadas em ágar Dixon, a partir da

manutenç ão de nove meses, evidenc iou-se que as duas c epas ( 1 0 0 % ) oriundas da salina, 8 ( 1 0 0 % ) rec uperadas da salina c om óleo mineral, 1 4 ( 8 2 ,4 % ) proc edentes do meio de Dixon, 6 ( 6 6 ,7 % ) mantidas no meio Dixon ac resc ido de DMSO e 1 5 c epas ( 1 0 0 % ) oriundas do meio Dixon ac resc ido de glic erol apresentaram c resc imento ( Tabela 1 ) .

A atividade de urease, após nove meses de estoque, foi avaliada nas c epas de M. pa c hyde rm a tis que c resc eram em ágar Sabouraud dextrose, sendo evidenc iado que os resultados mais satisfatórios ( p < 0 ,0 5 ) foram obtidos nas cepas estocadas em ágar Dixon ac resc ido de glic erol e em ágar Dixon, c om 6 0 ,0 e 3 5 ,3 % de positividade, respec tivamente. Vale ressaltar que nenhuma c epa de M. pa c hyde rm a tis preservada em ágar Dixo n c o m DMSO e e m sa lina , te ve e sta c a r a c te r ístic a bioquímic a mantida ( Tabela 1 ) .

DISCUSSÃO

Diversos métodos vêm sendo empregados para preservação de fungo s, po r é m , e m vir tude da b io dive r sidade de ste s mic rorganismos, não existe uma téc nic a padrão que seja c apaz de preservá-los de forma adequada e generalizada2 6 2 1 2 3 2 4_.

Portanto, na esc olha de um método para preservaç ão de um de te r minado gr upame nto de fungo s, de ve se r le vada e m c onsideraç ão a c apac idade de manutenç ão das c arac terístic as fenotípic as, genotípic as e patogênic as das c epas estoc adas5_.

Em relaç ão às leveduras, espec ialmente no gênero Ma la sse zia, sua baixa viabilidade, in vitro , c onstitui a princ ipal dific uldade para estudos retrospec tivos e prospec tivos4 1 0 1 3_.

Neste estudo, os proc edimentos realizados para investigar a manutenç ão da propriedade de não-lipodependênc ia das c epas de M. p a c h yd e rm a ti s evidenc iaram que mais de 7 8 ,8 e 6 6 , 7 % das c e pas apó s se is e no ve me se s de e sto q ue , respec tivamente, c onseguiram manter sua c arac terístic a de c resc er em meio sem adiç ão de lipídeos ( ágar Sabouraud) , independente do método de c onservaç ão adotado.

Fi gu ra 1 - Vi a b i li d a d e d e c e p a s d e M. pac hydermatis m a n ti d a s e m d i f e re n te s m é to d o s d e e sto c a ge m , p o r p e rí o d o d e se i s m e se s.

* p < 0 ,0 5 = valo res estatistic amente signific antes.

* Salina + Óleo Mineral, Dixo n + DMSO, Dixo n + Glic ero l e Dixo n > Salina.

Ta bela 1 Uso de á ga r Sa bo ura ud dextro se pa ra a va lia çã o da m a nutençã o de nã o -lipo dependência e da a tivida de de urea se em cepa s de M. pachydermatis esto ca da s po r perío do s de seis e no ve m eses.

Tempo de conservação

Métodos de estoque seis meses nove meses

ágar Sabouraud urease ágar Sabouraud urease

no _{% n}o _{% n}o _{% n}o _%

Salina 19 100,0 14 73,7 2 100,0 0 0,0

Salina + óleo mineral 24 82,8 15 62,5 8 100,0 2 20,0

Dixon 28 82,4 14 50,0 14 82,4 8 35,3*

Dixon + DMSO 27 81,8 13 48,2 6 66,7 0 0,0

Dixon + glicerol 26 78,8 13 50,0 15 100,0 9 60,0

* p < 0,05 = valores estatisticamente significantes

* Dixon e Dixon + glicerol > salina, salina + óleo mineral e Dixon + DMSO

Quanto à atividade de urease das cepas de M. pa chyde rm a tis

q ue c r e sc e r am e m ágar Sab o ur aud, apó s se is me se s de manutenç ão, evidenc iou-se que o melhor resultado, embora sem diferenç a estatístic a em relaç ão aos demais métodos de c onservaç ão, foi obtido c om as c epas estoc adas em salina ( 7 3 ,7 % de cepas positivas) , sendo seguido por salina com óleo mineral ( 6 2 ,5 % ) , ágar Dixon ( 5 0 % ) , ágar Dixon ac resc ido de glic erol ( 5 0 ,0 % ) e ágar Dixon ac resc ido de DMSO ( 4 8 ,2 % ) ( Tabela 1 ) .

As 2 4 c epas de M. p a c h yd e rm a ti s, apó s no ve meses de esto c agem, apr esentar am melho r r ec uper aç ão ( p < 0 ,0 5 ) quando pr eser vadas em ágar Dixo n ( 7 0 ,8 % ; n= 1 7 ) e em ágar Dixo n ac r e sc ido de glic e r o l ( 6 5 , 5 % ; n = 1 5 ) . Os m e no r e s índic e s de r e c upe r aç ão fo r am o b se r vado s nas c e p a s m a n ti d a s e m s a l i n a c o m ó l e o m i n e r a l ( 4 1 , 7 % ; n = 1 0 ) , em ágar Dixo n ac r esc ido de DMSO ( 3 7 ,5 ; n = 9 ) e em salina ( 8 ,4 % ; n = 2 ) ( Figur a 2 ) .

Fi gu ra 2 - Vi a b i li d a d e d e c e p a s d e M. pac hydermatis m a n ti d a s e m d i f e re n te s m é to d o s d e e sto c a ge m , p o r p e rí o d o d e n o ve m e se s.

de M. pa chyde rm a tis que, provavelmente, tratava-se de uma variante lipo-dependente, uma vez que só evidenciava adequado desenvolvimento em meio de Dixon ou em mycosel suplementado c om azeite de oliva. Portanto, na presente investigaç ão, o pro c edimento de subc ultivo no ágar Sabo uraud, antes da estocagem, foi importante para evidenciar que todas as cepas de

M. pa chyderm a tis isoladas eram não-lipodependentes, sendo esta

característica verificada na maioria das cepas de M. pa chyderm a tis

estudadas em diversas partes do mundo4 9 11 2 0_{. Ademais, o cultivo}

no ágar Sabouraud dextrose foi importante para enfatizar a ausênc ia das outras espéc ies de Ma la sse zia , que são todas lipodependentes1 5_.

Em relação às cepas estocadas à temperatura ambiente, a escolha da preservação em salina e salina com óleo mineral ao invés da téc nic a de Castellani ( água destilada) , deveu-se principalmente ao fato que, embora este método seja efetivo e utilizado para grande variedade de fungos6 7 8 2 4_{, é referido como}

ineficaz para o gênero Ma la sse zia1 0_{. Além disso, a solução salina}

em relação à água destilada, oferece melhor equilíbrio osmótico do meio. O presente estudo evidenciou que embora a técnica de estocagem em salina seja pouco onerosa e de fácil execução para preservação de microrganismos, não se mostrou eficaz na manutenção de cepas de M. pa chyde rm a tis, conforme se observa c om os índic es de rec uperaç ão de 3 9 ,6 e 8 ,4 % das c epas estocadas há seis e nove meses, respectivamente ( Figuras 1 e 2 ) . Vale salientar que o uso de óleo mineral com salina melhorou a viabilidade das c epas, em ambos os períodos de estoque ( Figuras 1 e 2 ) , provavelmente devido à sua capacidade em prevenir a desidratação do meio e diminuir a atividade metabólica do fungo esto c ado5_{; assim c o mo em vir tude da lipo filia da}

M. pa chyde rm a tis1 7_.

Nas cepas de M. pa chyde rm a tis estocadas, há seis meses, em ágar Dixon, em ágar Dixon acrescido de glicerol e em ágar Dixon acrescido de DMSO, a -20° C, observou-se que não houve diferença significativa na viabilidade das cepas estocadas com ou sem crioprotetores. Esta evidência diverge de outros achados que mostram que algumas espécies de Ma la sse zia são sensíveis ao congelamento sem essas substâncias1 0_.

Após nove meses de estoque, não houve diferença estatística entre os métodos ágar Dixon e ágar Dixon acrescido de glicerol, que apr e se ntar am-se c o mo o s me lho r e s ( p< 0 ,0 5 ) par a manutenç ão da viabilidade dos mic rorganismos estoc ados. Contudo, houve drástic a reduç ão na rec uperaç ão das c epas estocadas em ágar Dixon acrescido de DMSO. Portanto, o uso deste c rioprotetor deve ser c ontra-indic ado na estoc agem de

M. pa chyde rm a tis por mais de seis meses.

e recuperação de cepas de M. pa chyde rm a tis, um desses dois métodos pode ser utilizado.

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