Expressão do TLR-2 e do TLR-4 em monócitos de recém-nascidos a termo com sepse tardia.

www.jped.com.br

ARTIGO

ORIGINAL

TLR-2

and

TLR-4

expression

in

monocytes

of

newborns

with

late-onset

sepsis

夽

,

夽夽

Ana

C.C.

Redondo

_,

_Maria

_E.J.R.

_Ceccon

_,

_Ana

_L.

_{Silveira-Lessa}

_,

_Camila

_Quinello

_,

Patrícia

Palmeira

_,

_Werther

_B.

_Carvalho

_e

_Magda

_{Carneiro-Sampaio}

a_{UnidadedeCuidadosIntensivosNeonatais,InstitutodaCrianc¸a,HospitaldasClínicas,FaculdadedeMedicina,Universidadede}

SãoPaulo(USP),SãoPaulo,SP,Brasil

b_{DepartamentodeParasitologia,InstitutodeCiênciasBiomédicas,UniversidadedeSãoPaulo(USP),SãoPaulo,SP,Brasil} c_{LaboratóriodeInvestigac¸ãoMédica(LIM-36),InstitutodaCrianc¸a,HospitaldasClínicas,FaculdadedeMedicina,Universidade}

deSãoPaulo(USP),SãoPaulo,SP,Brasil

d_{DepartamentodeNeonatologia,FaculdadedeMedicina,UniversidadedeSãoPaulo(USP),SãoPaulo,SP,Brasil} e_{DepartamentodePediatria,FaculdadedeMedicina,UniversidadedeSãoPaulo(USP),SãoPaulo,SP,Brasil}

Recebidoem1deoutubrode2013;aceitoem26dedezembrode2013

KEYWORDS

Sepsis/immunology; Innateimmunity; Toll-likereceptor2; Toll-likereceptor4; Newborn;

Monocytes

Abstract

Objective: Toanalyzetoll-likereceptor(TLR)-2andTLR-4expressioninmonocytesofnewborns withlate-onsetsepsis.

Methods: Thisprospectivestudyincluded27full-termnewbornsaged8to29days,with cli-nicalandlaboratorydiagnosisoflate-onsetsepsis.Tennewborns(37%)hadpositivecultures. Cytokinesweremeasured bycytometricbeadarrayinperipheralblood,whileTLR-2,TLR-4 expression,andmedianfluorescenceintensity(MFI)weredeterminedbyimmunophenotyping peripheral wholebloodmonocytes, andwere analyzed with aBD FACSDiva flowcytometer (Becton,DickinsonandCompany,USA).Acomparisonwasperformedwithhealthyadults.

Results: Microorganismswereidentifiedin37%ofthesesepticnewborns,andallofthemhad highlevels ofpro-inflammatorycytokines (IL-8, IL-6,IL-1␤)and anti-inflammatorycytokine (IL-10)corroboratingtheinflammatory/septicprocess.Inmonocytes,thefrequencyofTLR-4 expressionwashigherininfectednewborns(p=0.01).

Conclusion: Thisstudy investigatedtheinnate immune responseinseptic newborns.Septic newborns thatreliedalmostexclusively ontheinnateimmune system showedlittle invivo

DOIserefereaoartigo:http://dx.doi.org/10.1016/j.jped.2013.12.012

夽 _{Comocitaresteartigo:RedondoAC,CecconME,Silveira-LessaAL,QuinelloC,PalmeiraP,CarvalhoWB,etal.TLR-2andTLR-4expression}

inmonocytesofnewbornswithlate-onsetsepsis.JPediatr(RioJ).2014;90:472---8.

夽夽_{EstudorealizadonoInstitutodaCrianc¸a,HospitaldasClínicas,FaculdadedeMedicina,UniversidadedeSãoPaulo,SãoPaulo,SP,Brasil.}

∗_{Autorparacorrespondência.}

E-mail:[email protected](M.E.J.R.Ceccon).

responseatmonocyteactivation,suggestingimpairedimmuneresponseandincreased suscep-tibilitytoinfection.

©2014SociedadeBrasileiradePediatria.PublishedbyElsevierEditoraLtda.Allrightsreserved.

PALAVRAS-CHAVE

Sepse/imunologia; Imunidadeinata; Receptor2toll-like; Receptor4toll-like; Recém-nascidos; Monócitos

ExpressãodoTLR-2edoTLR-4emmonócitosderecém-nascidosatermocomsepse tardia

Resumo

Objetivos: AnalisaraexpressãodosTLR-2eTLR-4emmonócitosderecém-nascidoscomsepse tardia.

Métodos: Trata-sedeumestudoprospectivocom27recém-nascidosatermoentre8e29dias devidacomdiagnósticoclínicoelaboratorialdesepsetardiadosquaisdez(37%) apresenta-ramculturapositiva.AscitocinasforamdeterminadasportestedeCBAemsangueperiférico enquantoqueaexpressãoeMFI(medianadeintensidadedefluorescência)dosTLR-2eTLR-4 foi determinadoporimunofenotipagemem monócitosde sangueperiféricototal atravésde análisepelocitômetrodefluxoBDFACSDiva. Ogrupousadopara comparac¸ãofoideadultos saudáveis.

Resultados: Microrganismosforamidentificadosem37%dospacienteseestesjuntamentecom ospacientescomsepseclínicativeramníveiselevadosdecitocinaspró-inflamatórias(IL-8,IL-6, IL-1␤)edecitocinaanti-inflamatória(IL-10)corroborandooprocessoinflamatório/infeccioso. Nomonócito,afrequênciadeexpressãodoTLR-4foimaiselevada(p=0,01).

Conclusões: Esteestudoanalisouarespostaimuneinatanorecém-nascidocomsepse. Recém--nascidossépticosquedependemquaseexclusivamentedosistemaimuneinatoapresentaram poucarespostainvivonaativac¸ãodemonócitosoquesugereumarespostaimunedeficientee maiorsusceptibilidadeàinfecc¸ão.

©2014SociedadeBrasileiradePediatria.PublicadoporElsevierEditoraLtda.Todososdireitos reservados.

Introduc

¸ão

A sepse corresponde a uma das principais causas de morbidade e mortalidade no recém-nascido (RN),1,2 _com

gravidadeproporcional à interac¸ão existente entreo

hos-pedeiro e seu agente agressor,desencadeando a ativac¸ão

deumacascatadeeventosresponsáveispelaexpressãoda

respostaimune.

A sepse neonatal tardia ocorre após 72h de vida com

sinaisesintomasclínicosquepodemsersutiseinespecíficos

nocomec¸odainfecc¸ão, emuitas vezesmal interpretados

ouconfundidoscomoutrascondic¸õesclínicasnão

infeccio-sas.Apesardisso,suaevoluc¸ãopodeserfulminanteelevar

a choque séptico, coagulac¸ãointravascular disseminadae

óbitoempoucashoras.3---5

Diferentementedoadulto,foramdescritosnoRNmuitos

grausdedeficiêncianarespostaimuneinataeadaptativa.6

Ao nascimento, a resposta imune adaptativa está

preju-dicadatanto pela mínima exposic¸ão antigênicaintraútero

quantopeladisfunc¸ãodascélulasBeTefetora.1_Porconta

disso,oRNcontacomaefetividadedarespostaimuneinata

ecomaprotec¸ãopassivadosanticorposmaternosadquiridos

viatransplacentária.7

Parte primordial do desencadear da resposta imune

inatacorrespondeàativac¸ãodosreceptoresToll-like(TLR)

expressosnasuperfície demonócitos,macrófagos,células

dendríticas,linfócitos,célulasepiteliaisounocitoplasmade

célulasdediferentestecidos.Dosdez tiposdereceptores

descritosemsereshumanos,oTLR-2eoTLR-4reconhecem

principalmentecomponentesdebactériasGram-positivase

Gram-negativas,respectivamente.A ativac¸ão desinaisde

transduc¸ãorecrutaváriasproteínas intracelulares(MyD88,

IRAK e TRAF-6), que vãodesencadear a ativac¸ãodas vias

JNKe ERKda cascata das MAPKs (proteínas quinases

ati-vadaspormitógeno). Issoinduz aativac¸ão dosfatoresde

transcric¸ãoAP-1(ativadorproteico-1)eNF-kB(fatornuclear

kappaB)queexpressamváriosgenesdiretamente

envolvi-dosna produc¸ão decitocinas inflamatórias em respostaà

infecc¸ão,exercendoinfluênciafundamentalnaamplificac¸ão

darespostaimunecelular.8---11

Osmonócitos sãocélulas possuidorasde antígenosque

agemsobreoprocessoinflamatórioecomofontesde

macró-fagosecélulasdendríticas.Apósaativac¸ãoviaTLRocorre

aumentonaexpressãodemoléculascoestimuladoras(CD80

eCD86), quesãoimportantesnoiníciodarespostaimune

adaptativaenaproduc¸ãodecitocinas.12

A regulac¸ão do sistema imunológico ao nascimento se

traduznumarespostaneonataldoTLRtendenciosapor

esti-mularumamenorproduc¸ão decitocinas pró-inflamatórias

e mostrar menor polifuncionalidade.13,14 _{Somente com o}

decorrerda vida os níveis de citocinas se equiparam aos

do indivíduo adulto.15 _{Ainda no período neonatal têm-se}

descritoalterac¸õesquantitativas equalitativas dos

recep-toresToll-likeedascélulasparticipantesdarespostaimune

inataquandocomparadasaoindivíduoadulto,proporcionais

àidadegestacionalaonascer.16 _{Estasdiferenc¸aspoderiam}

elucidaramaiorsusceptibilidade àinfecc¸ão observadana

Portanto,apesar da crescenteconscientizac¸ão sobrea

importânciadosistemadoTLR nadefesadoRN contraas

infecc¸ões,18 _{muito ainda precisa ser esclarecido sobre os}

mecanismosderegulac¸ãodasrespostasTLRnoperíodo

neo-natal.Assim,esteestudo tevecomo objetivocaracterizar

a expressão dos TLR-2 e TLR-4 em monócitos de

recém--nascidosatermocomsepsetardia.

Métodos

Trata-se de um estudo prospectivo cuja amostra de con-veniência incluiu 27 recém-nascidos a termo transferidos paraaUnidadedeCuidadosIntensivosNeonataldoHospital InstitutodaCrianc¸adoHospitaldas ClínicasdaFaculdade deMedicinada UniversidadedeSãoPaulo --- HCFMUSP, no períodoentrefevereiro de2011ajaneirode2013. Foram incluídospacientescujaidadegestacionalesteve entre37 e42semanas,queapresentarammanifestac¸õesclínicase/ ou laboratoriais (hemograma completo e PCR) de sepse neonatal entre 72h até 30 dias de vida no momento da internac¸ãoouduranteamesmaquelevouaoiníciode anti-bioticoterapia.Oscritériosdeexclusãoforamfatoresque por si só alterariam a resposta imune, como: diagnóstico de infecc¸ões congênitas, erros inatos do metabolismo, uso de anti-inflamatórios (indometacina, ibuprofeno e corticóides), diagnóstico de hemorragia intracraniana comprovadaporultrassonografiaoutomografia computado-rizadadecrânioeprocedimentocirúrgiconaúltimasemana alémdaquelesemqueadatadacoletadaamostranãoseria favorávelàanálisedomaterial.

Oscritériosutilizadosparadefinirodiagnóstico e clas-sificar quanto à gravidade clínica (sepse, sepse grave e choqueséptico)foramoscitadosnoSurvivingSepsis Cam-paign(2012), ajustados paraa faixa etária com base nos critérios de Goldstein (2005) conforme contemplado pelo consenso.19,20_{Aanálisedohemogramacompletofoibaseada}

noescorehematológicodeRodwell(SHR),enquantoqueum

PCR(proteínaCreativa)>10mg/Lfoiconsideradosugestivo

deinfecc¸ão.OestudofoiaprovadopelaComissãodeÉtica

paraAnálisedeProjetosdePesquisadoHCFMUSP(CAPPesq).

Amostras

Após consentimento livre e esclarecido dos responsáveis legais foram coletadas amostras de sangue dos RN por

punc¸ãovenosadeveiaperiféricaparaaavaliac¸ãodoquadro infeccioso (HMG, PCR e hemocultura) e análise das cito-cinas e monócitos. O momentoda coletafoi padronizado paraocorrernasprimeiras24hapartirdasuspeita diagnós-ticadeinfecc¸ãoeiníciodaantibioticoterapia.Distribuiu-se 0,5mLdosangueemtubocomgelseparadorparadosagem decitocinase1,5mLemtubocomEDTApararealizac¸ãode imunofenotipagem, que foram realizados no Laboratório deInvestigac¸ãoMédicadoInstitutodaCrianc¸adoHC-FMUSP (LIM36).

Análisedascitocinas

AscitocinasTNF-␣,IL-1␤,IL-2,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10foram dosadasnasamostrasdesoroatravésdotestedeCBA( Cyto-metricbeadarrayBDOptEIATM_{Set Human),deacordocom}

asinstruc¸õesdofabricante.

AnálisedereceptoresToll-like

Para a realizac¸ão daimunofenotipagem, as hemácias das amostrasdesanguecolhidasemtubocontendoEDTAforam preparadas para adic¸ão de anticorpos pré-estabelecidos (tabela 1) e processamento até serem transferidas para

leitura no citômetro de fluxo FACS LRS II Fortessa.

A populac¸ão demonócitos foi definida pelo gatede

célu-las CD14+HLA-DR+ utilizando como parâmetro o tamanho

(forwardscatter,FSC)eagranulosidadecelular(side

scat-ter,SSC),comodescritonaliteratura.20

Aanálise foifeita nosoftwareFlowJo (Tree Star,

Ash-land,OR,USA),ondecada populac¸ãocelularfoianalisada

separadamenteatravésdegatesutilizandocomoparâmetro

otamanhoeagranulosidadecelular.Pelomesmosoftware

foram obtidos os dados apresentados que representam a

MedianadaIntensidadedeFluorescência(MFI,median

flu-orescenceintensity)dosrespectivosmarcadores.

Os números absolutos das populac¸ões foram

calcula-dos pela multiplicac¸ão da porcentagem indicada de cada

populac¸ãonacitometriadefluxoeonúmeroabsolutode

leu-cócitosdeterminadospelocontadorautomáticodecélulas.

Amostrascontroledesanguedeadultossaudáveis

Foram obtidas amostras de sangue periférico de 27 adul-tossaudáveis,queforamutilizadasparaapadronizac¸ãoeo

Tabela1 Marcadoresdesuperfíciecelulardemonócitos

Anticorpomonoclonal Clone Fluorocromo Fabricante

HLA-DR L243 APCCy7 BDBiosciences

CD14 M5E2 Pacificblue BDBiosciences

CD80 BB1 FITC BDBiosciences

CD86 2331(FUN-1) PECy5 BDBiosciences

TLR-2(CD282) 11G7 Alexa647 BDBiosciences

TLR-4(CD284) HTA125 PE BioLegenda

HLA-DR,antígenoleucocitáriohumanoclasseII,locus-DR;CD,clusterofdifferentiation;TLR,receptorToll-like;APCCy7,aloficocianina combinadoaocorantedecianina;Pacificblue,fluoróforo6,8-difluoro-7-hidroxicumarina;FITC,isotiocianatodefluoresceína;PECy5, conjugadocom ficoeritrinaecorantedecianina;Alexa 647,fluorocromoparaleituraentre594e633nm;PE,R-ficoeritrina.Clone, refere-seaosmarcadoresdosanticorposmonoclonaisespecificados.

Tabela2 Distribuic¸ãodos27RNconformeosdadosclínicoselaboratoriais

DADOSCLÍNICOS[Mediana(p25-p75)]

Idadenainternac¸ão(dias) 11(2-22)

Idadenoiníciodossintomas(dias) 20(8-29)

Idadenacoleta(dias) 21(12-30)

Peso(g) 3130(2823-3511)

Sexo(M:F) 1,07:1

EXAMESLABORATORIAIS[Mediana(p25-p75)]

-SHR 1(0-3)

-PCR(mg/L) 35,2(9-83,1)

Culturas[N(%)]

-Culturaspositivas 10(37%)

BactériasGram-positivas 4(40%)

Staphilococcusepidermidis 3

Staphilococcusaureus 1

BactériasGram-negativas 6(60%)

Enterobactercloacae 1

Salmonellasp 1

Escherichiacoli 2a

Klebsiellapneumoniae 1

Bordetellapertussis 1

-Culturasnegativas 17(63%)

CITOCINASpg/mL[Mediana(p25-p75)] Culturapositiva Culturanegativa p

-IL-6 147,7(72,2-385,1) 132,3(6,3-332) 0,6066

-IL-8 137,9(61,1-411,8) 58,1(16,3-55,4) 0,5414

-IL-1␤ 3,0(1,07-15,8) 2,55(1,15-5,62) 0,5349

-IL-10 8,05(4,12-19,9) 3,5(1,8-76,15) 0,4516

-TNF-␣ 1,2(0,45-1,7) 1,75(1,0-2,47) 0,1188

-IL-2 1,7(1,4-1,9) 2,4(1,6-4,55) 0,1014

-IL-4 2,2(0,85-2,8) 0,4(0,3-1,1) 0,0714

N,númeroabsoluto;%,porcentagem;SHR,escorehematológicodeRodwell;PCR,proteínaCreativa;IL,interleucina;TNF-␣,fatorde necrosetumoralalfa.

a _{1pacientecomuroculturapositivaparaEscherichiacoli.}

controledostestesrealizados.Oscritériosdeselec¸ãoforam: adultosvoluntáriossaudáveisde18a35anos,dossexos mas-culinoe feminino,comreac¸õessorológicasnegativaspara HIV,HTLVI/II,hepatitesBeC,doenc¸adeChagasesífilis,e ausênciadesintomasdeinfecc¸ãonoperíododacoleta.

Análiseestatística

OsdadosdosRNforamregistradosemformuláriodecoleta earmazenadosemplanilhaeletrônicadopacoteestatístico GraphPad-Prismversão6.0cparaMacOSX(GraphPad Soft-ware,LaJolla,Califórnia,EstadosUnidos).Paraasvariáveis qualitativas foicalculada a frequênciaabsolutae relativa (númerode casos e porcentagem), enquanto que para as variáveisquantitativasfoicalculadaamediana,osvalores mínimoe máximo e intervalointerquartil (p25-p75), para cadaumdosreceptoresavaliadosemcadaanálise.Oteste de Mann-Whitney foi usado para comparar a mediana de marcadoresentreosgrupos,enquanto queaanálise com-parativadasmedianasdemaisdedoisgruposutilizou-seo Testede Kruskal-Wallis compós-teste de Dunn. Ostestes

foramrealizadoscomlimitesdeintervalodeconfianc¸ade 95%,eumvalordep<0,05foiconsideradosignificativo.

Resultados

Ascaracterísticasclínicaselaboratoriaisdos 27RN incluí-dos noestudo encontram-se na tabela 2. Observa-se que

a maioria dos pacientes (62,9%) apresentou quadro

com-patívelcomsepse grave(44,4%) echoque séptico (18,5%)

ocorridocommedianadeidadede20diasdevida,sendoque

foiconstatadoóbitoemapenasdoispacientes(7,4%).Dentre

os17 pacientesqueapresentaram culturanegativa,todos

apresentaramsinaisesintomasclínicosclarosdeinfecc¸ãoe

alterac¸õeslaboratoriaiscompatíveisem hemogramaePCR

nomomentododiagnósticoenaanáliseclínicasequencial,

sendoassimconsideradospacientescomsepseclínica.

Dessespacientescomsepseclínica,oito(47%)

apresenta-ramquadroclínicocompatívelcomsepse,cinco(29,5%)com

sepsegraveequatro(23,5%)comchoqueséptico.Alémdo

mais,a dosagem dascitocinas pró-inflamatóriasfoi

Monócito CD14 HLA-DR

Monócito CD80

Monócito TLR-2

Monócito CD86

Monócito TLR-4

Monócito TLR-4 Monócito TLR-2

Número absoluto (células/

μ

L)

MFI MFI

%

4000

3000

2000

1000

0

2000 4000 6000 8000

0 0

MFI MFI

0 5000 10.000 20.000

15.000 25.000

0 5000 10.000 15.000 0 50

%

0 50 100

150 100

10.000 20.000 30.000

RN Adulto

RN Adulto RN Adulto

RN Adulto

RN Adulto

RN Adulto

RN Adulto

p < 0,05

Monócito CD14 HLA-DR

%

0 2 4 6 8 10

RN Adulto

p < 0,05

p < 0,05

Figura1 Apresentac¸ãodográfico decaixadonúmeroabsoluto(células/␮L),frequência(%)emedianadaintensidadede flu-orescência(MFI)paramoléculasdeativac¸ãoCD80,CD86,TLR-2eTLR-4.Valoresexpressosemmediana±intervalointerquartil (p25-p75);preferenteàsignificânciaestatística.Númerodaamostradosgrupos‘‘RN’’e‘‘adulto’’=27.

RN,recém-nascido;HLA-DR,antígenoleucocitáriohumanoclasseII,locus-DR;CD,clusterofdifferentiation;TLR,receptorToll-like.

dapositividadedacultura,conformemostradonatabela2.

Apositividadede culturacoletada delíquido estéril

(san-gue, urina e líquor) ocorreu em dez pacientes(37%) com

distribuic¸ãoconformeoagenteisolado,comoapresentado

namesmatabela.

Com relac¸ão aos monócitos observa-se que, apesar

doseunúmeroabsolutototalsermaiornosRNcomparado

aosadultos(p<0,0001),houvefrequênciasemelhantedos

monócitosentreosgrupos(fig.1).

OMFIparamoléculasdeativac¸ãoCD80,CD86ea

frequên-ciaeMFIparaTLR-2eTLR-4encontra-seexpostanafigura1.

AlémdomenorMFI paraCD86 nosRNcominfecc¸ão,esses

pacientesapresentarammanutenc¸ãodaexpressãonoCD80

eTLR-2(p=0,822ep=0,825,respectivamente),enquanto

houvemaiorfrequênciaparaTLR-4noRNsépticoemrelac¸ão

aoadulto(p=0,0043).

A positividade da cultura esteve relacionada à maior

Tabela3 Medianadafrequência(%)eMFIdosreceptoresToll-like2e4emmonócitosdesangueperiféricoderecém-nascidos cominfecc¸ão(culturapositivaounegativa)edesangueperiféricodeadultos

Monócitos Adulto Culturanegativa Culturapositiva p

[N]Mediana(p25-p75)

%

TLR-2 [27]93,5

(82-98,5)

[17]96,5 (82,2-97,6)

[10]87,1 (59-92,2)

0,475

TLR-4 [27]10,6

(5,7-17,9)

[17]11,8 (6,7-24,9)

[10]30,5 (18,5-72,1)

0,0011

MFI

TLR-2 [27]3134

(1336-6386)

[17]8631 (2972-15300)

[10]5504 (3921-42850)

0,516

TLR-4 [27]2768

(2159-4377)

[17]4276 (1594-5088)

[10]3204 (2017-3831)

0,867

N,númerodaamostra;Medianadaintensidadedefluorescência(MFI)preferenteàsignificânciaestatísticapelotestedeKruskal-Wallis; TLR,receptorToll-like.

pacientescomculturanegativa(tabela3),enquantohouve

frequênciasemelhanteentreosgruposnaavaliac¸ãodo

TLR-2.

Apesar daidentificac¸ãodealgumasbactérias, aanálise

entreapositividadedaculturaconformeotipodebactéria

identificadaeostiposdereceptorToll-likenãofoirealizada

devidoaonúmerodaamostraestudada.

Discussão

Descrevemosarespostainvivodemonócitosneonataisde sangue periférico frente a umquadro infeccioso que evi-denciou expressão semelhanteoumenor de moléculas de ativac¸ão,alémde maiorexpressão dosTLR-4 em RN com infecc¸ãoporbactériasgram-positivasegram-negativasedo TLR-2empacientescomsepseclínica.

Osmonócitossãocélulasdosistemafagocitárioe exer-cem importante papel na imunidade inata e adquirida atravésdasuaac¸ãosobreoprocessoinflamatóriooucomo fonte dos macrófagos e células dendríticas. O comporta-mentodos TLRnoRN,sejaelesaudáveloucominfecc¸ão, é controverso. Segundo Levy et al., embora a expressão basaldosreceptoresToll-likeemmonócitosdeRNatermo seja similar ao de adultos, as consequências funcionais daativac¸ãosão bemdiferentes,já queseobserva menor produc¸ãodecitocinasnosRNemenorexpressãodas molé-culascoestimuladoras.18

Pôde-seobservarque,frenteaumestímuloinfeccioso,

apopulac¸ãoderecém-nascidosanalisadaapresentoumenor

quantidadedecélulasativadas(MFIparaCD86menorqueno

indivíduoadulto eMFI paraCD80semelhanteao indivíduo

adulto sem infecc¸ão)em sangue periférico,sugerindo um

menorpotencialdeatividadedestetipocelularnoRN,dado

essedeacordocomaliteratura.18---21

Com relac¸ão ao TLR-2, observou-se que o mesmo foi

amplamente expresso nos monócitos neonatais (93,9%) e

nosmonócitosdeindivíduosadultosseminfecc¸ão(94,6%).

A mesma semelhanc¸a foi observada com relac¸ão ao MFI

paraessereceptor(MFI =4748 e6386, respectivamente),

independentemente da positividade ou não da cultura,

contrariandoachadosdaliteraturaquedemonstramum

up--regulationna expressão de TLR-2 em monócitos isolados

de pacientes com sepse bem como mudanc¸as

significan-tesnaexpressão deTLR-2.22,23 _{Assim,nanossacasuística,}

onde todos os recém-nascidos apresentavam sinais

clíni-coselaboratoriaisdeinfecc¸ão,observamosque,apesarde

apresentaremasferramentasnecessáriasparareconhecer

oantígenoinvasor(receptorToll-likeemoléculas

coestimu-ladoras), estasnãosofreram o up-regulationesperado na

análiseglobal.

Enquanto isso,deformacontráriaao relatadopor

Vie-mannetal.,1_{apresenc¸adeculturapositivaesteveassociada}

aumamaiorfrequêncianaexpressãodoTLR-4comrelac¸ão

aoindivíduoadultoecomculturanegativaprovavelmente

secundáriaaofatodeamaiorpartedospacientescom

cul-turapositivaterisoladobactériasgram-negativas(60%)na

cultura.Jáaexpressãosemelhantedomesmoreceptornos

RNcomculturanegativaenospacientesadultospodesugerir

umatendênciaaimunoparalisiaqueteriadesviadoa

medi-anaparaníveismaisbaixosesemelhantesao doindivíduo

adulto saudável, jáque quatro RN deste grupoevoluíram

comquadrodechoqueséptico.

Nossoestudoapresentalimitac¸õesquemerecemser

res-saltadas,comootamanhodaamostraeseucaráterpontual

quantoà avaliac¸ão doquadro infeccioso. Ainda assim,os

resultadossugeremquenomomentodahipótesediagnóstica

deinfecc¸ãonoRNosreceptoresTLR-2eoTLR-4

apresenta-ram umaexpressão maiorem RN com infecc¸ão, mascom

manutenc¸ão da expressão das moléculas coestimuladoras

indicandoumapossíveldeficiêncianoprocessodeativac¸ão

celularinvivo.

Assim,emboramaioresextrapolac¸õesnãopossamser

fei-tas,acreditamosqueseriainteressanteverificarnaevoluc¸ão

deumquadroclínicodeinfecc¸ãoarespostadosTLR,bem

comodaativac¸ãocelularemRNcominfecc¸ão.

Financiamento

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

Agradecimentos

OsautoresagradecemàFundac¸ãodeAmparoàPesquisado EstadoSãoPaulopelofinanciamentodoprojeto.

Referências

1.ViemannD,DubbelG,SchleifenbaumS,HarmsE,SorgC,Roth J.Expressionoftoll-likereceptorsinneonatalsepsis.Pediatr Res.2005;58:654---9.

2.DellingerRP,LevyMM,CarletJM,BionJ,ParkerMM,Jaeschke R,etal.SurvivingSepsisCampaign:internationalguidelinesfor managementofseveresepsisandsepticshock:2008.CritCare Med.2008;36:296---327.

3.Camacho-GonzalezA,SpearmanPW,StollBJ.Neonatal infecti-ousdiseases:evaluationofneonatalsepsis.PediatrClinNorth Am.2013;60:367---89.

4.Bedford Russell AR. Neonatal sepsis. Paediatr Child Health. 2011;21:265---9.

5.CianciarulloMA,CostaIC,CecconME,KrebsVL.Newandold markersoninfectioninneonatalsepsisdiagnostic:criticvision. Pediatria(SãoPaulo).2008;30:107---17.

6.KollmannTR,CrabtreeJ,Rein-WestonA,BlimkieD,Thommai F,WangXY,etal.NeonatalinnateTLR-mediatedresponsesare distinctfromthoseofadults.JImmunol.2009;183:7150---60. 7.Yoon HS. Neonatal innate immunity and toll-like receptor.

KoreanJPediatr.2010;53:985---8.

8.MuzioM,BosisioD,PolentaruttiN,D’amicoG,StoppacciaroA, MancinelliR,etal.Differentialexpressionandregulationof toll--likereceptors(TLR)inhumanleukocytes:selectiveexpression ofTLR3indendriticcells.JImmunol.2000;164:5998---6004. 9.TippingPG.Toll-likereceptors:theinterfacebetweeninnate

andadaptiveimmunity.AmSocNephrol.2006;17:1769---71. 10.BochudPY,Calandra T.Pathogenesisofsepsis: newconcepts

andimplicationsforfuturetreatment.BMJ.2003;326:262---6. 11.HigginsSC,LavelleEC,McCannC,KeoghB,McNeelaE,Byrne

P,et al. Toll-likereceptor 4-mediatedinnate IL-10 activates antigen-specific regulatory T cells and confers resistance to

Bordetella pertussis by inhibiting inflammatory pathology. J Immunol.2003;171:3119---27.

12.KadowakiN,HoS,AntonenkoS,MalefytRW,KasteleinRA,Bazan F,etal.Subsetsofhumandendriticcellprecursorsexpress dif-ferent toll-like receptorsand respond to different microbial antigens.JExpMed.2001;194:863---9.

13.NguyenM,LeuridanE,ZhangT,DeWitD,WillemsF,VanDamme P,etal.Acquisitionofadult-likeTLR4andTLR9responsesduring thefirstyearoflife.PLoSOne.2010;5:e10407.

14.PrabhuDasM,AdkinsB,GansH,KingC,LevyO,RamiloO,etal. Challenges ininfant immunity:implications for responses to infectionandvaccines.NatImmunol.2011;12:189---94. 15.KollmannTR,LevyO,MontgomeryRR,GorielyS.Innateimmune

functionbyToll-likereceptors:distinctresponsesinnewborns andtheelderly.Immunity.2012;37:771---83.

16.Förster-WaldlE,SadeghiK,TamandlD,GerholdB,HallwirthU, RohrmeisterK,etal.Monocytetoll-likereceptor4expression andLPS-inducedcytokineproductionincreaseduring gestatio-nalaging.PediatrRes.2005;58:121---4.

17.Wynn JL, Levy O. Role of innate hostdefenses in suscepti-bilitytoearly-onsetneonatalsepsis. ClinPerinatol.2010;37: 307---37.

18.LevyO.Innateimmunityofthenewborn:basicmechanismsand clinicalcorrelates.NatRevImmunol.2007;7:379---90.

19.DellingerRP,LevyMM, RhodesA, AnnaneD,GerlachH,Opal SM,et al.Survivingsepsiscampaign:internationalguidelines formanagementofseveresepsisandsepticshock:2012.Crit CareMed.2013;41:580---637.

20.Goldstein B, Giroir B, Randolph A. International Consensus ConferenceonPediatricSepsis.Internationalpediatric sepsis consensusconference:definitionsforsepsisandorgan dysfunc-tioninpediatrics.PediatrCritCareMed.2005;6:2---8.

21.Sánchez-TorresC,García-RomoGS,Cornejo-CortésMA, Rivas-CarvalhoA,Sánchez-SchmitzG.CD16+andCD16-humanblood monocytesubsetsdifferentiateinvitrotodendriticcellswith different abilities to stimulate CD4+ T cells. Int Immunol. 2001;13:1571---81.

22.Hirschfeld M, Ma Y, Weis JH, Vogel SN, Weis JJ. Cutting edge:repurificationoflipopolysaccharideeliminatessignaling throughbothhumanandmurinetoll-likereceptor2.JImmunol. 2000;165:618---22.