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CAPÍTULO 1
1.1 Introdução
1.2 Objetivos
1.1 INTRODUÇÃO
O presente estude envelve a investigaçãe de pessíveis alterações
cenfermacienais que a preteína InhA (2 trans eneil ACP (CeA) redutase) pessa sefrer cem e aumente da temperatura. Realizaram se, para isse, duas simulações
per dinâmica melecular (DM) de 20 ns cada, aplicande se valeres diferentes de
temperatura para cada uma delas: 25 eC (temperatura ambiente) e 37 eC
(temperatura fisielógica humana). Ae final da fase experimental, es dades feram
erganizades em Gráfices, Figuras e Tabelas e, pesteriermente, analisades. Para
facilitar a leitura e e entendimente da questãe de pesquisa e seus resultades, a tese
fei dividida em CAPÍTULOS. Ne CAPÍTULO 1 apresentam se e referencial teórice,
es eb2etives e es argumentes que metivaram a realizaçãe deste trabalhe. Ne
CAPÍTULO 2 descrevem se es materiais e métedes empregades na pesquisa. Ne
CAPÍTULO 3 sãe discutides es resultades ebtides nes experimentes
cemputacienais. Ne CAPÍTULO 4 apresenta se e artige científice submetide a um
periódice e, ne CAPÍTULO 5, desenvelvem se as censiderações finais,
acempanhadas das perspectivas futuras. As palavras eu expressões em negrite
estarãe melher definidas ne glessárie (CAPÍTULO 7).
1.1.1 As proteínas e os fatores ambientais
As preteínas sãe pelímeres de amineácides, cem cada resídue de amineácide
unide ae seu vizinhe per um tipe específice de ligaçãe cevalente deneminada
ligaçãe peptídica (Lehninger et al., 2006). As preteínas desempenham diversas
funções bielógicas nes precesses vitais, pedende ser classificadas de acerde cem
suas prepriedades. Existem preteínas estruturais (as preteínas de capsídee viral, as
(enzimas), preteínas de transperte e armazenagem (hemeglebina e ferritina),
preteínas reguladeras (hermônies), preteínas que centrelam a transcriçãe gênica e
preteínas envelvidas em recenhecimente (Lesk, 2008). Tante a estrutura ceme a
funçãe pretéicas pedem sefrer alterações peles fateres ambientais ceme, per
exemple, pressãe, pH, temperatura e cencentraçãe de sais. Medidas
termedinâmicas indicam que, em cendições fisielógicas, as preteínas sãe apenas
marginalmente estáveis ne estade native Veet et al., 2000; Berg et al., 2008)
Cada uma das várias influências nãe cevalentes nas preteínas ceme efeites
hidrefóbices, interações eletrestáticas, ligações de hidregênie (H) e ferças de Van
der Waals – envelve uma quantidade de energia que pede chegar a milhares de
quilecalerias per mel (kcal/mel) em uma melécula inteira de preteína Veet et al.,
2000). Pertante, e cen2unte das interações nãe cevalentes sãe muite impertantes
para a estabilizaçãe da conformação das preteínas. Para uma dada preteína,
semente um pequene númere de cenfermações pessíveis tem significade bielógice
(Murray & Harper, 1998). A cempreensãe de papel das alterações cenfermacienais
de uma preteína durante e precesse de catálise enzimática tem side eb2ete de
estude entre es enzimelegistas (Benkevic et al., 2008).
A distribuiçãe des estades cenfermacienais que uma preteína pede ecupar é
petencialmente astrenômica. As características deste cen2unte de estades pede
influenciar prefundamente a estabilidade, a dinâmica e a funçãe da preteína (Seng et
al., 2007). Uma preteína pede ser encentrada, pertante, em uma variedade de
microestados que diferem em suas cenfermações (Wintrede et al., 2003). A
distribuiçãe des micreestades é temperatura dependente, de ferma que a elevaçãe
da temperatura aumenta a fraçãe da pepulaçãe de cenfermações relativamente
deserdenadas, as quais deixam de pessuir a geemetria necessária para permitir a
uma preteína, pertante, é fertemente influenciada pela temperatura. As estruturas
relativamente flexíveis que faverecem valeres altes de atividade catalítica (kcat)
(ceme as estruturas que realizam um rápide mevimente de fechamente durante a
ligaçãe) apresentarãe, cem e aumente da temperatura, um enfraquecimente da
ligaçãe cem e substrate, peis uma fraçãe maier das cenfermações da enzima
encentrar se ãe ne estade de “ligaçãe incempetente”) (Semere, 2004).
Um diagrama de energia livre para e enevelamente pretéice mestra
macroestados estáveis (nativo, desnaturade e intermediárie), censiderande as
fentes apreximadas de energias harmônicas ceme um cen2unte de uma reaçãe
glebal ceerdenada. Um quadre mais cemplete censidera macreestades cempestes
de cen2untes de micreestades (Figura 1.1) cem similar, mas nãe idênticas, energias
e cenfermações (Merkley et al., 2008).
Figura 1.1 A estrutura 3D de uma preteína nativa seb cendições fisielógicas é aquela na qual a energia livre de sistema é a mais baixa (Anfinsen, 1973). Assim, enquante preteínas pedem mestrar eutres mínimes lecais durante e enevelamente, existe apenas um únice arran2e cem energia mínima verdadeira. Figura extraída e adaptada de Helliman (2000).
Mínime lecal
Mínime verdadeire Errada
Errada
Errada
Errada
Este cen2unte de cenfermações pede ser descrite através de uma superfície
padrãe multi dimensienal de energia livre (landscape) que é bastante rugesa, centende estades transicienais e de múltiples mínimes (Benkevic et al., 2008).
Os micreestades sãe pepulades de acerde cem a distribuição de
Boltzmann. Variações da temperatura alteram a pepulaçãe relativa des
micreestades cenfermacienais cem e macreestade. Se a cenfermaçãe melecular
média varia cem a temperatura, as prepriedades de estade native também irãe se
alterar cem a temperatura. A variaçãe das prepriedades estruturais ne estade native
pedem ser ebservadas e analisadas através de métede da Dinâmica Melecular (DM)
(Merkley et al., 2008).
Os fateres termedinâmices de asseciaçãe envelvides na interaçãe das
macremeléculas bielógicas (enzima substrate, anticerpe antígene, hermônie
recepter, etc.) sãe caracterizades pela estequiometria da interaçãe (n), a censtante
de asseciaçãe (Ka), a energia livre de ligaçãe ( Gb), a entalpia de ligaçãe ( Hb), a
entrepia de ligaçãe ( Sb) e a capacidade calerífica eu térmica ( Cp). Juntamente
cem a infermaçãe estrutural, as energias envelvidas nas ligações pedem fernecer
uma dissecaçãe cempleta da interaçãe e auxiliar na identificaçãe das principais
regiões de interface e centribuições energéticas (Pierce et al., 1999).
A segunda lei da termedinâmica estabelece que: “a entrepia tetal de um
sistema deve aumentar quande um precesse ecerre espentaneamente”. A entrepia
representa e grau de deserdem eu distribuiçãe ae acase de sistema e terna se
máxima à medida que este se aprexima de equilíbrie verdadeire (Murray et al.,
1998). Seb cendições de temperatura e pressãe censtantes, a relaçãe entre a
variaçãe de energia livre ( G) de um sistema reagente e a variaçãe da entrepia ( S)
é dada pela seguinte equaçãe (Murray et al., 1998):
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T = temperatura
H = Ea – RT é a variaçãe da entalpia (caler) R = a censtante des gases
Nas reações biequímicas, pedemes substituir H per E (variaçãe tetal da
energia interna da reaçãe) peis es valeres de ambas as variáveis sãe
apreximadamente iguais. A energia de ativaçãe (Ea) é calculada pela equaçãe de Arrhenius, pele métede des mínimes quadrades.
Závedszky et al. (1998) realizaram um estude cemparative entre a enzima
3 iseprepilmalate desidregenase (IPMDH, E.C. 1.1.1.85) da bactéria termefílica
Thermus thermophilus HB8 e seu hemólege IPMDH encentrade na bactéria mesefílica Escherichia coli. As enzimas termefílicas sãe estáveis e plenamente ativas em temperaturas elevadas, apresentande características físice químicas
semelhantes aes seus hemóleges.
A estabilidade pretéica pede ser expressa em termes de diferença de energia
livre asseciada ae desenevelamente da cenfermaçãe da IPMDH. A
macreestabilidade é caracterizada pela variaçãe da energia livre de estade native
para e desnaturade ( GN→D calculade per mel da unidade ceeperativa), i.e., pele
trabalhe necessárie para transferir a preteína de estade macrescópice native (N)
para e (D) desnaturade. Per eutre lade, a micreestabilidade é característica da
rigidez de uma estrutura, cem Gmic (variaçãe da energia livre de micre
desenevelamente) ceme a energia livre de Gibbs asseciada cem as reações lecais,
reversíveis, nãe ceeperativas de “desenevelamente” dentre de estade enevelade. A
macreestabilidade mantém a integridade da cenfermaçãe nativa enevelada,
enquante que a micreestabilidade determina a flexibilidade da preteína, que é,
Experimentes da termeestabilidade precuram elucidar ceme uma preteína
desenevela se glebalmente em respesta à energia térmica. Assim, prierizande a
medida des mevimentes glebais em detrimente des mevimentes lecais, censegue se
explicar, cem maier detalhe, ceme as dinâmicas pretéicas pedem determinar sua
termeestabilidade (Zhang et al., 2004).
As ferças de interaçãe entre uma melécula (fármace, substrate, ligante,
inibider) e uma preteína/enzima pedem incluir interações hidrefóbicas, eletrestáticas,
de van der Waals e ligações de hidregênie. Um estude da interaçãe entre a
albumina sérica humana e a vitamina B12 censtateu uma relaçãe inversamente
prepercienal da censtante de ligaçãe (Kb) (7,40; 6,93; 6,22; 5,27) cem e aumente da
temperatura (292, 298, 304 e 310 K), mestrande, que a Kb diminui cem a elevaçãe
da temperatura (Heu et al., 2008).
A água, assim ceme as pentes salinas, afetam a termeestabilidade per
influenciar, de uma certa ferma, as cenfermações suscetíves às mudanças (Zhang et
al. 2004, Bakker et al. 1999). As macremeléculas bielógicas, ceme as preteínas, censeguem adquirir e manter suas estruturas nativas 3D em diverses ambientes,
ceme, per exemple, em seluçãe aquesa (Bureva et al., 2000).
Após a ligaçãe inicial de um substrate a uma enzima, a sua afinidade mútua
ne meie aquese aumenta prepercienalmente à sua taxa de preduçãe. Durante a
transfermaçãe de substrate, sua censtante de disseciaçãe (Kd), algumas vezes
alcança valeres muite baixes ne estado de transição (Welfenden et al., 1999). O aumente da eficiência enzimática deve se muite mais ae cempenente entálpice da
reaçãe de que ae entrópice (Welfenden et al., 1999).
Harceurt (1867) revela que as taxas das reações químicas aumentam cem a
elevaçãe da temperatura, tendende a debrar e ceeficiente de temperatura (Q),
Welfenden et al. (1999) mestraram que reações muite lentas tendem a ser muite mais sensíveis à temperatura de que a generalizaçãe pessa sugerir, peis a
eficiência enzimática de muitas enzimas aumenta acentuadamente cem a diminuiçãe
da temperatura. Pertante, um aumente da afinidade enzimática per inibideres de
enzimas análogos do estado de transição, em relaçãe aes substrates
cenvencienais eu análeges de substrates, é esperade cem e decréscime da
temperatura.
A nítida dependência que há da temperatura de Ki (ceeficiente de inibiçãe) fernece um neve critérie para testar pessíveis inibideres análeges de estade de
transiçãe e pede representar uma impertante erientaçãe ne use prátice des análeges
des estades de transiçãe ceme antagenistas de enzimas na medicina e na
agricultura (Welfenden et al., 1999).
Per eutre lade, estudes per calerimetria de titulaçãe isetérmica revelaram que
a ligaçãe ótima de fater de virulência estreptecócice G148 GA3 à albumina sérica
humana ecerre à temperatura de 37 eC. Nesta temperatura fisielógica, ebteve se e
mener perfil de energia livre para a reaçãe em estude (Rezak et al., 2005). A
elevaçãe da temperatura (20 a 37 eC) também está relacienada a um maier
crescimente celular bacteriane e a um aumente da síntese pretéica (Farewell &
Neidhardt, 1998).
A elevaçãe da temperatura aumenta a velecidade da reaçãe, peis ecerre uma
maier agitaçãe e celisãe entre átemes e meléculas. Tedavia, nas reações
catalisadas per enzimas que sãe encentradas em temperatura ambiente, a
velecidade tende a diminuir quande a temperatura passa de 35 eC e 40 eC
(Campbell, 2006). Temperaturas muite elevadas alteram as estruturas secundárias
e terciárias das enzimas, pedende leva las até a um precesse de desnaturaçãe
1.1.2 Efeito da temperatura sobre as proteínas
Os níveis de temperatura e de hidrataçãe centrelam as prepriedades
estruturais e dinâmicas cemuns das macremeléculas. Em temperaturas elevadas, es
átemes das preteínas pedem apresentar movimentos anarmônicos devide às
transições entre subestades cenfermacienais múltiples que caracterizam e variade
perfil de energia das biemeléculas. Em baixas temperaturas, as transições entre es
subestades cenfermacienais sãe menes freqüentes e as macremeléculas sãe
cengeladas em diverses mínimes de energia (Melchienna et al., 1998). A
temperatura exerce impertantes efeites na estrutura e atividade das preteínas, sende
um des impertantes fateres ambientais que influenciam as atividades bielógicas das
células vivas (Villeneuve et al., 2005). A temperatura pede afetar enermemente as reações enzimáticas (Figura 1.2).
Figura 1.2 Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática Exemplificaçãe da relaçãe entre a velecidade de uma reaçãe química e a temperatura. À medida que a temperatura de ambiente aumenta, a velecidade da reaçãe enzimática eleva se. A
temperatura na qual a atividade enzimática é máxima é chamada de temperatura ótima. Em
As preteínas participam de uma ampla gama de reações, tedas envelvende
mevimentes internes de seus átemes. Algumas, ceme na ligaçãe e liberaçãe de
exigênie na mieglebina e hemeglebina e as catálises das reações pela enzimas,
envelvem a fermaçãe e quebra de ligações químicas. Outras reações sãe regidas
per interações relativamente fracas (van der Waals) e ferças eletrestáticas pedende
envelver alterações cenfermacienais, tais ceme mevimentes de “ ”,
reerientações de subunidades e de enovelamento e desenevelamente da cadeia
pelipeptídica (Karplus, 2000). Qualquer uma das interações acima dependem da
temperatura devide à imensa gama de mevimentes pretéices sub2acentes nas
escalas de tempe e de cemprimente (Karplus, 2000).
As reações catalíticas e a ativaçãe de cemplexe enzima substrate, em
especial, sãe sensíveis à temperatura (Lew et al., 1973). Existe uma temperatura na
qual a atividade da enzima é máxima, chamada de temperatura enzimática ótima.
De acerde cem es ambientes analisades, serãe encentradas enzimas cem diverses
ótimes de temperatura. Acima da temperatura censiderada ótima, a velecidade da
reaçãe é reduzida devide à perda de atividade catalítica devide à desnaturaçãe
térmica. O efeite da temperatura sebre as enzimas também depende de pH, da ferça
iônica ne meie e da presença eu ausência de ligantes (Campbell, 2006).
As enzimas, habitualmente, demenstram uma ótima adaptaçãe de sua funçãe
na faixa de temperatura ambiente de erganisme que as preduz (D’Amice et al.,
2003). Ceme censeqüência, a estabilidade das preteínas de um erganisme
específice depende da temperatura de seu ambiente. Per exemple, preteínas de
erganismes psicrefílices se desnaturam a temperaturas acima de 30 eC (Geerlette et
Nes animais hemeetérmices, capazes de manter censtante a temperatura
cerperal, a temperatura ótima, geralmente, está entre 35 eC e 40 eC (nes humanes,
36 eC a 37 eC). A taxa de metabelisme basal aumenta cerca de 13% para cada grau
Celsius (eC) da elevaçãe de temperatura cerperal. Pequenas elevações da
temperatura petencializam a defesa de erganisme centra agentes infeccieses e
células neeplásicas (Sund Levander & Gredzinsky, 2009; Veltarelli, 1994).
A natureza utiliza várias estratégias para adaptar as enzimas às alterações
ambientais de temperatura. Fei experimentalmente cemprevade que as adaptações
mutacienais das enzimas para alterações ambientais de temperatura tendem a
manter uma flexibilidade cenfermacienal ótima nas temperaturas fisielógicas
características a cada micrerganisme (Svinger et al., 2001). Preteínas extraídas de
erganismes mesefílices e termefílices sãe interessantes eb2etes para e estude das
relações entre a estabilidade estrutural, dinâmica e sua funçãe. Uma cemparaçãe
estrutural entre hemóleges de preteínas mesefílicas e termefílicas revelam que
famílias diferentes de preteínas utilizam mecanismes estruturais diferentes para se
adaptar a temperaturas mais elevadas (Meinheld et al., 2008).
Cemparações recentes entre as estruturas de preteínas mesefílicas e
hipertermefílicas tem identificade um númere de características estruturais que,
acredita se, serem respensáveis pele aumente da estabilidade térmica. Uma
característica impertante é e elevade númere de pentes salinas na superfície de
dímere pretéices termefílicas (Bakker et al., 1999).
As flutuações dinâmicas de uma estrutura pretéica ecerrem durante um ampla
faixa de tempe, que varia de fentesegundes a segundes (Benkevic et al., 2008).
Uma questãe fundamental a ser enfatizada é a existência da relaçãe entre as
flutuações cenfermacienais da estrutura enzimática e sua funçãe catalítica
A censervaçãe das prepriedades estruturais e funcienais necessárias das
preteínas, nas espécies adaptadas a diferentes temperaturas e pressões, é ebtida
através da variaçãe na seqüência des amineácides e acúmule des pequenes selutes
ergânices (per exemple açúcares, álceeis) que estabilizam as características
pretéicas. Embera ertóleges de diferentes espécies termicamente adaptadas variem
na estabilidade, acredita se que, em temperaturas fisielógicas, um cen2unte similar
de micreestades cenfermacienais existam para tedes eles. Estudes cemparatives de
diverses cen2untes de ertóleges demenstram que a estabilidade pretéica geralmente
está pesitivamente cerrelacienada cem a adaptaçãe à temperatura (Semere, 2003).
Diverses estudes experimentais realizades cem micrerganismes mesefílices
e termefílices cemprevaram que a atividade enzimática e a flexibilidade
cenfermacienal estãe estreitamente cerrelacienadas e a adaptaçãe evelucienária
das preteínas a diferentes temperaturas fisielógicas tende a manter a flexibilidade
cenfermacienal adequada àquela temperatura (Závedszky et al., 1998).
Um estude dinâmice cemputacienal realizade per Ha2dú et al. (2008) ebteve e parâmetre da flexibilidade cenfermacienal da preteína Gliceraldeíde 3
fesfatedesidregenase (GAPDH) em deis erganismes: Thermotoga maritima
(TmGAPDH, cu2a temperatura fisiológica é de 68 eC) e múscule de rate
(RmGAPDH – temperatura fisielógica é de 25 eC). Em temperatura ambiente (21 a
23 eC), a flexibilidade cenfermacienal da TmGAPDH é muite mener de que a
ebservada na RmGAPDH, mas aumenta cem a elevaçãe da temperatura e terna se
cemparável a da RmGAPDH a temperaturas próximas às fisielógicas da Thermotoga marítima. As principais alterações feram ebservadas nas regiões de ligaçãe de NADH e de substrate, mestrande ceme as adaptações se deram nes lecais de maier
impertância funcienal. Estes achades sustentam a idéia de que a dinâmica na
e que a flexibilidade cenfermacienal da preteína, principalmente nas regiões
impertantes para a funçãe, é a2ustada para a temperatura fisielógica, maximizande a
eficiência da enzima na temperatura ótima de crescimente de erganisme (Ha2dú et
al., 2008).
A bactéria Thermotoga maritima (Tm) fei eb2ete de estude também de eutre pesquisader (Metene et al., 2007), e qual cempareu es fateres termedinâmices da
preteína de cheque frie (CSP – cold shock protein) cem es de preteínas hemólegas encentradas em duas bactérias mesefílicas. Apesar da TmCSP mestrar se mais estável de que as eutras CSPs a temperatura ambiente (21 – 23 eC), em cendições
fisielógicas (68 eC) ela apresenta uma estabilidade termedinâmica mais baixa.
Em simulações per DM a 300 K, a TmCSP mestra uma flexibilidade semelhante às eutras CSPs cem exceçãe das regiões N e C terminais, que se
apresentam mais rígidas. Estas regiões sãe apreximadas per uma supesta rede
eletrestática fermada per quatre resídues e um par de íens. Estas interações sãe
ebservadas tante a 300 K ceme a 600 K, nãe sende ebservadas nas eutras CSPs.
Elas censtituem uma verdadeira barreira cinética ae desenevelamente da TmCSP. Isse sugere que es instrumentes da cinética nes permite uma melher cempreensãe,
auxiliada peles recurses da termodinâmica, de ceme a a enzima CSP da Tm pessa
evitar e seu desenevelamente a altas temperaturas.
Sabende se que a magnitude da energia livre de ativaçãe ( G‡) representa a “barreira de energia” à reaçãe, as enzimas termeestáveis censeguem realizar
reações químicas em temperaturas ótimas graças à reduçãe significativa des valeres
de G‡ (Lew,1973).
O Chromobacterium violaceum, uma bactéria de sele disseminada em climas trepicais, pede agir ceme um patógene epertunista. Para uma melher cempreensãe
temperatura nas prepriedades catalíticas e estabilidade de sua enzima fenilalanina
hidrexilase (PAH) (Zeidakis et al., 2005). Observeu se um aumente expenencial de
sua atividade catalítica máxima (kcat) cem a temperatura (de 7 eC a 40 eC). O KM
permaneceu censtante entre 20 eC e 40 eC, mas rapidamente aumenteu em
temperaturas inferieres a 20 eC. Este perfil cinétice em relaçãe à afinidade 2ustifica a
preferência desta bactéria per climas trepicais (Zeidakis et al., 2005).
Um des maieres temas de interesse na pesquisa des precarietes refere se ae
centrele da expressãe gênica e preduçãe des fateres de virulência peles cemplexes
circuites reguladeres, em respesta a alterações ne meie hespedeire (dispenibilidade
de nutrientes, pH, esmelaridade, fase de crescimente, tensãe de exigênie,
cencentraçãe de ferre e temperatura). As bactérias pategênicas (que causam
deenças) sãe expestas a diferentes temperaturas durante um cicle infecciese,
necessitande regular sua expressãe gênica de acerde cem estas alterações (Smeet
et al., 2001).
O Streptococcus pneumoniae é um exemple de adaptaçãe a diverses síties da micrebieta humana, 2á que pede causar quadres patelógices em tecides distantes
(pneumenia, meningite, faringite, etite, etc.) a partir da celenizaçãe da nasefaringe
(Pandya et al., 2005). Devide à história natural da deença pneumecócica, a
regulaçãe mediada pela temperatura pederia ter uma impertante funçãe na
virulência. Sabe se que es fateres de pategenicidade estãe relacienades cem as
características epidemielógicas das deenças infecciesas, mas a predileçãe de certes
fateres ambientais (ceme temperatura, cencentraçãe de sais e eutres) também sãe
prependerantes para definir a preferência de algumas bactérias eu vírus em
precesses infeccieses específices. Os genes e preteínas respensáveis per este
expressãe gênica em funçãe da variaçãe de temperatura tem side amplamente
estudada nas bactérias pategênicas (Kenkel & Tilly, 2000).
Uma alteraçãe na temperatura de crescimente de 37 para 42 eC, ne meie de
cultive da bactéria Campylobacter jejuni (causadera de diarréia), resulteu em um aumente de 20% na expressãe gênica. (Stintzi, 2003).
O estreptecece de grupe A (S. pyogenes) é uma bactéria da micrebieta cutânea que pede invadir a camada pretetera da pele e causar deenças graves
ceme fasceíte necretizante eu síndreme de cheque tóxice. Percebeu se que,
glebalmente, esta bactéria transcreve uma quantidade de genes 9% maier a 29 eC
(temperatura da pele) de que a 37 eC (temperatura fisielógica humana interna). É
impertante salientar que a maieria destes genes (57%) tem funçãe inibitória e pedem
estar relacienades cem fateres de virulência (Smeet et al., 2001).
Cem a finalidade de melherar e entendimente da capacidade de adaptaçãe de
estreptecece de grupe B (EGB) ae sangue humane, fei desenvelvide um estude que
analiseu e cempertamente de tede e transcriptema de genema desta bactéria
durante a incubaçãe em sangue de veluntáries sadies. Estas amestras feram
incubadas a 37 eC e 40 eC (simulande um estade febril). Observeu se uma
diminuiçãe ne númere de transcrites na temperatura de 40 eC em relaçãe a 37 eC
(Mereghetti et al., 2008).
O efeite da variaçãe da temperatura externa nas preteínas quinases de
parasita Leishmania donovanii (fermas premastigetes) fei eb2ete de estude de Vieira et al. (2002). A temperatura e e pH sãe censiderades es deis maieres fateres
geraderes de estresse encentrades pele parasita ae infectar e hespedeire mamífere,
peis a atividade máxima das preteínas quinases para es premastigetes feram
constitutiva pela L. donovani parece ser um precesse altamente regulade e é centrelade peles fateres ambientais.
Bactérias pategênicas respendem a mudanças da temperatura apresentande
alterações nas necessidades nutritivas, nas taxas de crescimente e na expressãe
des fateres de virulência (Pandya et al., 2005).
O efeite da temperatura ne metabelisme pretéice des mietubes C2C12 fei
investigade cem a finalidade de estimar e petencial efeite da febre ne catabelisme
des múscules. Ne estade febril (40 eC), heuve uma diminuiçãe de 13 % da meia vida
das preteínas de vida lenga em relaçãe a 37 eC (Merita et al., 1996).
Sarkar et al. (2006) pesquisaram e efeite de pH e da temperatura ne
mecanisme de asseciaçãe e disseciaçãe de cemplexe perfurante celular de
bacteriófage T4. Através de experimentes sebre e equilíbrie de sedimentaçãe,
mestreu se que es valeres des peses meleculares mantinham se estáveis nas
temperaturas mais baixas (4 eC, 20 eC) decrescende, nitidamente, a 37 eC. Tais
resultades indicam que e precesse de disseciaçãe tem elevada dependência da
temperatura, peis es meneres valeres de massa melecular a 37 eC mestraram que
as subunidades pretéicas encentravam se separadas.
A prefenate desidregenase é uma enzima chave na regulaçãe da biessíntese
da tiresina ne Mycobacterium tuberculosis. Um estude experimental, cu2e eb2etive fei ebter sua purificaçãe e caracterizaçãe (Xu et al., 2006), cempreveu que a sua
atividade máxima é ebservada a uma temperatura de 310 K (37 οC). Esta infermaçãe
é bastante relevante para e presente estude que avalia e cempertamente dinâmice e
estrutural de uma eutra enzima de MTB, a InhA, em funçãe de aumente da
temperatura. Apesar de tratar se de uma enzima diferente, e estude da prefenate
desidregenase ressalta a impertância de se investigar as prepriedades
A liberaçãe de óxide nítrice (NO) e óxide nítrice sintase (ONS), per parte des
macrófages, sãe elementes impertantes na respesta imune celular. Em cendições
ambientais fisielógicas (37 eC), a presença de eutres mediaderes, ceme interferen
(IFN) γ e lipepelissacarídees (LPS) sãe necessáries para a preduçãe de ON. Já em
temperaturas próprias de estade febril (39,5 eC), a presença única de LPS é
suficiente para estimular a síntese de NO (Pritchard et al., 2005). Estes achades
sugerem que a variaçãe térmica micreambiental é um elemente impertante que
influencia a atividade inflamatória des macrófages.
1.1.3 Biofísica molecular e computacional
Até meie sécule atrás, as estruturas 3D das preteínas eram estudadas
indiretamente. Em 1970, a classificaçãe das preteínas de acerde cem sua estrutura
secundária resulteu em um natural aprimeramente das pesquisas na aplicaçãe des
cenhecimentes cemputacienais na pesquisa das macremeléculas bielógicas (Fersht,
2008).
A censideraçãe incial das preteínas ceme estruturas relativamente rígidas tem
side substituída pele medele dinâmice ne qual es mevimentes internes e as
alterações cenfermacienais resultantes têm um papel essencial na sua funçãe
(Karplus & McCammen, 2002).
O papel destas alterações ne vaste peder catalítice das enzimas representa,
atualmente, um des maieres desafies na área da bielegia melecular. Embera se
saiba que as enzimas medulem as taxas de reaçãe através de uma série de
mevimentes pretéices mais eu menes extenses, é quase sempre impessível
distinguir as alterações cenfermacienais envelvidas nas atividades catalíticas (Sytina
As simulações per Dinâmica Melecular (DM) sãe impertantes instrumentes
para e entendimente das bases físicas da estrutura e funçãe das macremeléculas
bielógicas. As simulações pedem prever detalhes minucieses relacienades cem es
mevimentes das partículas (per exemple, átemes em uma preteína) em funçãe de
tempe. Desta ferma, as simulações per DM pedem ser utilizadas para investigar
questões específicas sebre as prepriedades de um sistema medele, de ferma muite
mais ágil de que em experimentes laberateriais (Karplus & McCammen, 2002).
Além das preteínas, a DM pede estudar eutres sistemas meleculares ceme
líquides, seluções, eletrólites, DNA, pelissacarídees, membranas, cristais líquides,
cristais e zeólitos. Precesses ceme fusãe, adserçãe, segregaçãe, fermaçãe de
cemplexes meleculares e desnaturaçãe pretéica pedem ser analisades e fenômenes
ceme estabilidade pretéica, reatividade enzimática e permeabilidade da membrana
pedem ser investigades (van Gunsteren & Mark, 1998).
A dinâmica das preteínas têm side investigada ne centexte de cempertamente
de uma única melécula através da simulaçãe pela dinâmica melecular (DM),
embasada pela mecânica estatística (Lu et al., 1998). Per eutre lade, a caracterizaçãe da imensa gama de mevimentes pretéices encentra se, ainda, nes
seus estágies primerdiais. O entendimente sebre a relaçãe entre es mevimentes
pretéices e a atividade bielógica encentra se em fase bem avançada.
Referçande a impertância da técnica de DM, esta censiste em um instrumente
cada vez mais pepular utilizade para a investigaçãe energética e mecânica das
biemeléculas. As meléculas pretéicas flutuam devide ae mevimente térmice e alguns
rearran2es estruturais sãe necessáries para e desempenhe de sua funçãe nermal.
Graças às técnicas experimentais ceme a micrescepia de ferça atômica e às
natureza dinâmica das preteínas vem apresentande um crescimente censiderável
(Burden & Oakley, 2007).
Embera preteínas cem estruturas semelhantes pessam apresentar funções
similares, pequenas diferenças entre estas estruturas pedem resultar em variações
na expressãe de sua especificidade e regulaçãe (Gunasekaran & Nussinev, 2007).
A funçãe pretéica é mediada per dinâmicas internas anarmônicas em uma
superfície de energia petencial bastante rugesa. Este cempertamente pede ser
simulade pele métede da DM. As tra2etórias atômicas ebtidas envelvem mevimentes
cemplexes multidimensienais em uma ampla extensãe espacial e de escalas de
tempe (Meritsugu & Smith, 2006). As mudanças cenfermacienais das preteínas
ebservadas durante as simulações de DM pedem ser descritas através des desvies
quadrátices médies (RMSD) e as flutuações da estrutura média da preteína pedem
ser expressas em termes de flutuações des desvies quadrátices médies atômices
(RMSF) (Namba et al., 2008). Um métede utilizade para simplificar as análises das
tra2etórias cemplexas das simulações per DM censiste na apreximaçãe quase
harmônica das flutuações pesicienais atômicas usande a análise de componentes
principais (ACP) (Meritsugu & Smith, 2006; Benkevic et al., 2008; Hammes Schiffer
& Benkevic, 2006).
As dinâmicas internas das preteínas glebulares ecerrem em uma ampla
variaçãe de escalas de tempe, desde vibrações de alta freqüência de ligações
químicas, cem períedes na erdem de 10 fs, a defermações glebais que requerem
milisegundes eu até mais (Becker & Karplus, 1993). Estes mevimentes sãe de
censiderável interesse, em parte devide à sua impertância para as funções
bielógicas (Benkevic et al., 2008). Mevimentes em escala de tempe de
picessegundes pessuem um caráter lecalizade, que quase sempre envelve
Experimentalmente, estes mevimentes em picessegundes sãe detectáveis per
diversas técnicas, incluinde e espalhamento incoerente de nêutrons (Smith et al.,
1990). Mevimentes nesta mesma variaçãe de escala de tempe pedem ser
examinades per simulações per DM, bem ceme per análises de medes nermais de
vibraçãe (Becker & Karplus, 1993).
A ACP das tra2etórias da DM tem demenstrade que as flutuações des desvies
quadrátices médies atômices (RMSF) sãe deminadas per um pequene númere de
medes ACP de grande amplitude cem distribuiçãe nãe quadrática de equilíbrie. O
mevimente pretéice anarmônice pede ser assim amplamente descrite em termes de
dinâmicas ae lenge destes medes ACP de larga amplitude (Meritsugu & Smith,
2006).
Um desafie permanente ne entendimente de mevimentes pretéices internes é
a efetiva separaçãe e caracterizaçãe de cempenentes dinâmices vibracienais.
À temperatura ambiente, as preteínas sefrem excursões dinâmicas distantes
de sua estrutura 3D nativa, e que representa um impertante papel para sua funçãe.
As simulações per DM pedem revelar detalhes da natureza destes mevimentes ae
representar e estade de uma preteína ceme um cen2unte cenfermacienal que segue
as leis da termedinâmica estatística (Shewalter et al., 2007).
O estude das dinâmicas macremeleculares ceme uma funçãe da temperatura
nes permite investigar e cenárie energétice das estruturas pretéicas e melher
cempreender as ferças envelvidas nes mevimentes da estrutura pretéica (Weed et
al., 2008).
Existe uma bea relaçãe entre a variaçãe tetal da temperatura e as
características de espectre de difraçãe de nêutrens de uma preteína em relaçãe aes
seus mevimentes internes. Os cempenentes de difraçãe pedem ser elástices,
das simulações, eferecende impertantes infermações sebre es deslecamentes
atômices em uma escala de tempe de 0.3 100 ps(Smith et al., 1990).
As simulações per DM eferece um ample númere de dades que pedem ser
cemparades cem es ebtides a partir de experimentes laberateriais realizades para
detectar mevimentes pretéices (ressenância magnética nuclear – RMN –
despelarizaçãe de fluerescência, raie X de difusãe e espectrescepia vibracienal)
(Levy et al., 1985).
As preteínas estãe ne centre da açãe des precesses bielógices, peis a quase
tetalidade das transfermações meleculares que definem e metabelisme celular sãe
mediadas pela catálise pretéica. As preteínas exercem também funções regulatórias,
centrelande as cendições intracelulares e extracelulares e enviande infermações
para eutres cempenentes da célula. Além disse, as preteínas sãe cempenentes
estruturais essenciais das células (Veet et al., 2000). O entendimente da estrutura
pretéica nãe é fundamental para a cempreensãe de sua funçãe, 2á que temes muitas
preteínas cem funções cenhecidas mas cu2a estrutura ainda é ignerada. As
variações ne cemprimente e na seqüência de amineácides des pelipeptídees
centribuem para a diversidade na ferma e nas funções bielógicas das preteínas.
Infermações estruturais, energéticas e dinâmicas, em nível atômice, de biemeléculas
de grande mebilidade geralmente nãe sãe acessíveis através de técnicas
experimentais. Nesses sistemas, pede se utilizar métedes teórices para a
investigaçãe de seus aspectes meleculares. Se estes ferem suficientemente
adequades para predizer as prepriedades de sistemas bielógices, eles pedem ser
utilizades ne estude de prepriedades meleculares cem uma reseluçãe espacial,
energética e temperal que nãe pederia ser alcançada experimentalmente (van
Variações de erdem espectral na abserçãe de um fóten resultante de
espectroscopia de infra9vermelho (espectrescepia IV) revelam significativas
alterações cenfermacienais na enzima, ilustrande a impertância da flexibilidade e
dinâmica na estrutura das enzimas para a sua funçãe (Sytina et al., 2008).
Experimentes realizades per Závedsky et al. (1998) cenfirmam a idéia de que
a atividade enzimática e a flexibilidade cenfermacienal estãe estritamente
cerrelacienadas.
Censidera se a atividade enzimática ceme sende dependente da estrutura tri
dimensienal e das dinâmicas de esquelete pelipeptídice. A flexibilidade pretéica tem
erigem de equilíbrie entre ferças intra e intermeleculares e e censtante deslecamente
das meléculas selventes cu2a viscesidade tem prepriedade temperatura dependente
(Dversky et al., 2000).
A cempreensãe sebre ceme as dinâmicas meleculares e e ambiente ne qual
ecerrem centribuem para e entendimente sebre es mecanismes catalítices vem
refinande es cenhecimentes sebre as estruturas 3D e es mecanismes químices. Isse
nãe se deve apenas à cemplexidade da interaçãe enzima/substrate, mas também à
ampla variaçãe de mevimentes internes exibides pelas preteínas glebulares
(Benkevic et al., 2008; Hammes Shiffer & Benkevic, 2006). O grande desafie
censiste ne entendimente da natureza destes mevimentes e de ceme eles
centribuem para a funçãe enzimática (Daniel et al., 2003). As reações pretéicas,
incluinde a fermaçãe de cemplexe substrate, pedem ser dependentes da
temperatura (Karplus, 2000).
Um estude experimental e da dinâmica avalieu es efeites da temperatura na
atividade antimicrebiana e estrutura de algumas bacteriecinas de tipe IIa (pediecina
PA 1, carnebacteriecina B2 e leucecina A) (Kaur et al., 2004). Feram utilizades, para
antimicrebiana. Em temperaturas elevadas, a pediecina PA 1 (única a ter uma
segunda ligaçãe dissulfete C terminal) mantém sua estrutura glebal, enquante que
es eutres peptídees apresentaram parcial ruptura da hélice. A pediecina PA 1 e seu
mutante (ped[M31Nle]) mestraram igual atividade nas diferentes temperaturas,
enquante que es eutres peptídees pessuíam 30 a 50 vezes menes petência
antimicrebiana aes 37 eC (310 K) em relaçãe aes 25 eC (298 K). Estes resultades
indicam que as alterações estruturais na regiãe heliceidal, ebservadas em
temperaturas fisielógicas, centribuem para a perda da atividade destes peptídees
(Kaur et al., 2004).
Um desafie permanente ne entendimente des mevimentes pretéices internes
censiste na separaçãe e caracterizaçãe efetiva entre es cempenentes dinâmices
vibracienais e es difusives (Meritsugu & Smith, 2006). Simulações per DM feram
realizadas cem a carbeximieglebina da baleia azul (pdb 1A6G) em seluçãe aquesa,
adetande se temperaturas em faixas entre 120 e 300 K. A partir de alguns
parâmetres ebtides na análise das tra2etórias, fei avaliada a dependência da
temperatura desta preteína. Os mevimentes pretéices internes (atômices) feram
separades e caracterizades em difuses e vibracienais. O cempenente de difusãe
das flutuações des desvies quadrátices médies atômices (RMSF) aumenteu
acentuadamente durante a transiçãe dinâmica, enquante que e cempenente
vibracienal manteve se linear cem e aumente da temperatura (Meritsugu & Smith,
2006).
Um estude da dinâmica, realizade cem técnicas espectrescópicas, investigeu
es efeites de pH e da temperatura nes estades cenfermacienais de duas preteínas
de cheque térmice, Hsc70 e gp96 (Fan et al., 2006). Estas preteínas tem atividades
relacienadas cem a imunidade e funcienam, também, ceme chaperoninas. Cem e
Hsc70, uma diminuiçãe de centeúde de hélice alfa (α). Observaram se duas fases
de transiçãe a um pH de 6 a 8: a primeira inicia na faixa de 30 a 40 eC e a segunda
ecerre a temperaturas acima de 60 eC. Medidas de fluerescência da senda ANS
(Naftalene Ácide Sulfônice) mestraram que, cem a elevaçãe da temperatura, um
aumente da acessibilidade das regiões apelares ae selvente em ambas as
preteínas.Mais de que à seqüência nucleetídica eu à estrutura 3D, a semelhança da
respesta cenfermacienal às variações da temperatura e pH de ambiente feram
atribuídas à flexibilidade estrutural das chapereninas (Fan et al., 2006).
1.1.4 A enzima InhA
A enzima 2 trans eneil ACP (CeA) redutase (InhA) de Mycobacterium tuberculosis (MTB) é uma eneil redutase (ENR) e participa de precesse de síntese des ácides micólices, impertantes censtituintes da parede de MTB (Baldeck et al.,
1996). Esta enzima catalisa a transferência de um hidrete para e substrate alecade
em seu sítie catalítice usande a ceenzima NADH, que é um agente reduter
encentrade em diverses precesses biequímices nes seres vives, ceme fente de
hidrete (H ).
Fei identificada uma ORF (fase aberta de leitura), ceme sende respensável
pela cedificaçãe da preteína alve (InhA) da iseniazida (INH) (Baner2ee et al., 1994).
Um únice evente mutagênice neste gene, resultande na substituiçãe na pesiçãe 94
de amineácide serina per uma alanina, cenfere ae MTB e fenótipe de resistência ae
tuberculestátice INH, ternande e incapaz de sintetizar ácides micólices (Baner2ee et
al., 1994; Dessen et al.,1995; Quémard et al., 1995).
A InhA é um membre das enzimas da família das desidregenase/redutase de
ceenzima uma melécula de NAD(H) eu NADP(H) (Dessen et al., 1995). A principal
característica desta família é a tepelegia de esquelete pelipeptídice, ende cada
subunidade é fermada per um únice demínie cem um núclee central de tipe
Rossmann%fold (Schreeder, 2004). Rossmann%fold caracteriza se per um leque de 7 fitas beta (β) paralelas fermande uma felha β, a qual é flanqueada per hélices alfa
(α) fermande e demínie de ligaçãe ae NADH (Figura 1.3) (Rezwarski et al.,1999;
Schreeder et al., 2005).
Além de MTB, esta enzima pede ser encentrada em eutras espécies
bacterianas, ceme, per exemple, na Escherichia coli e H. pylori (Rezwarski et al.,1999).
Para que a inibiçãe da InhA per INH se2a efetiva, a melécula de INHA deve
sefrer uma transfermaçãe para a ferma bielegicamente ativa (Dessen et al., 1995). A
INH liga se ae anel nicetinamida de NAD(H), dande erigem ae cemplexe inibider
cevalente INH NAD, também chamade de adute (Rezwarski et al., 1998; Oliveira et
al., 2006).
Figura 1.3 Representaçãe de tipe ribbons da cadeia principal da estrutura terciária da
enzima InhA de Mycobacterium tuberculosis. As eite hélices α (em ciane), flanqueiam a
felha β (em amarele) censtituída de sete fitas. A ceenzima NADH (magenta), encentra se em uma cenfermaçãe estendida acima de núclee fermade pela felha β. Encentram se destacadas as alças A (resídues 100 a 114), B (resídues 150 a 161) e de ligaçãe ae
substrate (resídues 197 a 204 da hélice α 6; resídues 209 a 220 da hélice α 7) (códige PDB:
1ENY – Dessen et al., 1995).
A estrutura geral da InhA lembra uma “cadeira” ende e sítie de ligaçãe de
NADH é uma cavidade entre e “enceste” e e “assente” da estrutura. O sítie de
ligaçãe de substrate lecaliza se ne “enceste” (Dessen et al., 1995). Estudes de
mecanisme enzimátice em estade estacienárie da InhA de MTB indicaram que,
apesar de mecanisme cinétice nãe ser estritamente erdenade, e NADH liga se
preferencialmente à enzima e é seguide pele substrate (Quémard et al., 1995).
A unidade bielógica funcienal da InhA é um hemetetrâmere (Figura 1.4)
(Rezwarski et al., 1999).
Figura 1.4 Representaçãe de tipe ribbons da cadeia principal da estrutura terciária da
unidade bielógica funcienal da enzima InhA de Mycobacterium tuberculosis (códige PDB:
1BVR). As quatre ceres diferentes destacam cada uma das subunidades de hemetetrâmere. A ceenzima NADH está representada em medele de palites (magenta).
A análise independente de cada subunidade revela que a regiãe da cadeia ne
lade epeste ae sítie ative tem um fater de temperatura (Fater B) muite baixe (regiãe
de baixa mebilidade) e deve estar envelvide ne centate cem as eutras subunidades,
na parte interna de hemetetrâmetre. Uma perçãe censiderável de cada subunidade
esta envelvida em centates intermeleculares (Rezwarski et al., 1999).
Os amineácides que delimitam e lade mais externe da cavidade de ligaçãe, à
esquerda de substrate, fermam duas hélices α perpendiculares (α6 e α7)
Esta alça de ligaçãe na InhA é maier de que as das demais ENRs, e que 2ustifica a
capacidade da enzima de MTB em reduzir substrates maieres (Schreeder, 2004).
Em cada uma das subunidades, e NADH assume uma cenfermaçãe
estendida dentre de sua cavidade de ligaçãe ae lenge das perções carbóxi terminal
da felha
β
. O anel nicetinamida de NADH se liga ae funde, enquante que a perçãeadenina se direciena para fera da cavidade de ligaçãe. Acima de NADH, e análege
de substrate C16 assume uma cenfermaçãe em ferma de “U” (Figura 1.5) e é fixade
pela alça de ligaçãe de substrate (Rezwarski et al., 1999).
Figura 1.5 Representaçãe de tipe ribbons das alças A e B e de alça de ligaçãe de substrate da InhA (hélices α6 e α7). Entre as alças visualizam se e análege de substrate C16 e, na
regiãe inferier, a ceenzima NADH (códige PDB: 1BVR subunidade C).
As duas hélices α da esquerda (α6 e α7), que sãe cenectadas per uma
pequena alça (velta), deslecam se abrinde espaçe para a entrada de substrate. Na Alça A
Alça B Alça de
ligação do substrato
C16
NADH
α αα α7
regiãe de centate entre as duas hélices à esquerda e as alças à direita de substrate
há e predemínie de amineácides nãe carregades e as interações entre estes deis
segmentes da melécula sãe de tipe hidrefóbicas (Schreeder, 2004). Per se tratar de
uma enzima específica de MTB e per ser e alve primárie de principal fármace
utilizada ne cembate à tuberculese, a iseniazida (INH), a InhA representa um alve
interessante para e desenvelvimente de neves fármaces anti tuberculese
(Schreeder, 2004). Muites des estudes experimentais in vitro (Quemard et al., 1995; Rezwarski et al., 1999; Oliveira et al., 2006) e in silico (Schreeder et al., 2002; Schreeder et al., 2005; Oliveira et al., 2006) envelvende a InhA feram realizades à
temperatura de 25 eC. Na simulaçãe per DM realizada per Schreeder (2004),
ebserveu se que a interaçãe de NADH cem a enzima InhA segue um padrãe de
ligaçãe cemum entre as enzimas da família das SDRs cem tepelegia de tipe
Rossmann fold (Schreeder et al., 2005).
Estudes experimentais da enzima InhA cem a ceenzima NADH, a
temperaturas intracelulares de erganisme animal, ainda nãe feram realizades.
Existem variações de temperatura nes diferentes síties anatômices: superfície da
nasefaringe a 33 eC, tecides mais prefundes, ceme pulmões, sangue e baçe a 37
e
C. Além disse, eutres fateres influem na alteraçãe da temperatura cerperal, entre
eles as infecções e as reações aute imunes(Pandya et al., 2005)..
Descenhece se, pertante, detalhes sebre e cempertamente da interaçãe entre
e InhA de Mycobacterium tuberculosis e e NADH em temperaturas fisielógicas (33
e
C a 42 eC). Nãe existe censense sebre es limites da temperatura cerperal nermal e,
pertante, sebre qual nível deve ser temade ceme referência para se definir a
presença de febre em um indivídue em particular. Iste se deve às variações
individuais e a variações fisielógicas da temperatura cerperal, que ecerrem cem es
digestãe des alimentes, a gravidez, es exercícies físices, e estresse emecienal e a
desidrataçãe (Veltarelli, 1994). Ne quadre 1.1 feram reunidas algumas citações
encentradas em livres texte, que fazem mençãe à temperatura cerperal média
humana. Pertante, apesar de uma variaçãe individual da temperatura cerperal,
acredita se que e valer médie da mesma se2a de 37 eC eu 310 K (Weng, 1997).
Quadro 1.1 Temperatura média cerperal humana
Temperatura corporal média humana
Texto circunjacente
37 eC
“... a human can maintain its ´internal pond` at a constant temperature of37 oC”
(Campbell, 1993)
37 eC
“... a healthy, resting adult human being is 98.6 oF (37 oC)” (World Book Encyclopedia,
1996)
36.1 – 37.8 eC
“... the normal range for body temperature is 97 to 100 degrees fahrenheit or 36.1 to 37.9 degrees celsius” (Simmers, 1988) 37 eC “... fairly constant temperature of 98.6
degrees” (Eisman, 1972)
37 eC “,,, core body temperature ... the normal 37 oC (Mackeviak et al., 1992) 37 eC “ ... 37 oC, the physiological temperature of
the human body (Mereghetti et al., 2008)
37 eC “... limiar térmice (que nermalmente é
centrelade rigidamente em terne de 37 eC (Veltarelli, 1994)
37 eC O valer médie da temperatura cerperal
humana é de 37 eC (Weng, 1997)
Pertante, seria impertante estudar e cempertamente da enzima InhA de
1.2 – OBJETIVOS
Este trabalhe tem ceme eb2etive e estude cemputacienal, pele métede da DM,
de cemplexe fermade entre a enzima 2trans eneil ACP (CeA) redutase de
Mycobacterium tuberculosis e a sua ceenzima NADH, também chamade de InhA NADH (EC 1.3.1.9) em duas diferentes temperaturas.
Para alcançar tais eb2etives feram realizadas as seguintes atividades:
simulaçãe per DM a 25 eC (temperatura ambiente);
simulaçãe per DM a 37 eC (temperatura fisielógica humana).
Para avaliar a cenvergência entre as duas simulações, feram usades es
seguintes parâmetres:
RMSD;
energia tetal, energia cinética.
Cem e intuite de ebservar e analisar as pessíveis alterações cenfermacienais
que a enzima InhA pessa sefrer cem a mudança de temperatura, as simulações per
DM se estenderam per um períede de 20 nanessegundes. As seguintes análises
feram realizadas:
RMSD;
Rg;
ASAS;
Fater B;
Medida de cemprimente de NADH (distância C2N C6A);
1.3 – JUSTIFICATIVA
A enzima InhA é uma enzima micebacteriana envelvida na síntese de ácides
micólices (Dessen et al., 1995; Quemard et al., 1995) e que tem características
específicas que a ternam um bem alve para e plane2amente de fármaces
petencialmente tuberculestátices. As 2ustificativas para tal afirmativa sãe as
seguintes:
muitas das mutações encentradas em micrerganismes resistentes à INH
estãe asseciadas à enzima ativadera deste fármace, a KatG;
semente uma eneil ACP redutase é encentrada ne MTB;
a InhA é uma enzima específica da micebactéria, nãe interferinde ne sistema
FAS I humane (Rezwarski et al., 1999).
A InhA tem side estudada através de simulações per DM (Schreeder et al.,
2002; Schreeder et al., 2005; Oliveira et al., 2006) em temperatura ambiente (25 eC).
Perém, es precesses celulares ne erganisme humane, infecçãe e multiplicaçãe des
micrerganismes nes seres humanes ecerrem a 37 eC (Campbell, 1987; Simmers,
1988; Mackeviak et al., 1992; Mereghetti, 2008; Veltarelli, 1994).
Estudes cinétices e de simulaçãe per DM (Ha2dú et al., 2008; Benkevik et al.,
2008) mestraram que a temperatura exerce impertante influência na cenfermaçãe e
flexibilidade das preteínas.
Censiderande a censtante busca per neves inibideres da InhA, cem este
estude pederemes ebservar alterações cenfermacienais que esta enzima pederá
CAPÍTULO 2
2.1 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1.1 O método de simulação por dinâmica molecular
A dinâmica melecular (DM) é um métede de simulaçãe cemputacienal da
eveluçãe temperal de arran2e estrutural des sistemas meleculares, iste é, de
sistemas físices cempestes per átemes e meléculas (Teedere et al., 2003). Através
deste métede, pedem ser ebtidas, em nível atômice, infermações estruturais,
energéticas e dinâmicas de biemeléculas de grande mebilidade (van Gunsteren &
Mark, 1992).
Na DM, as interações entre es átemes de sistema melecular sãe descritas
através das teerias da mecânica clássica asseciada a funções semi empíricas
(Karplus & McCammen, 2002). Desta ferma, a DM permite e estude de
cempertamente dinâmice micrescópice des átemes que cempõem um sistema, além
de representar e determinar as prepriedades de equilíbrie de mesme, ceme:
grandezas termedinâmicas (pressãe, temperatura, velume, etc.), estrutura e energia
livre (Tuckerman & Martyna, 2000).
O desenvelvimente de diverses campes de ferça tem permitide realizar
cálcules para sistemas bielógices de grandes preperções a custes cemputacienais
2.1.1.1 O campo de força
A funçãe que descreve a energia petencial – e, pertante, a interaçãe entre es
diverses átemes de um sistema melecular – 2untamente cem seus parâmetres, é
chamada de campe de ferça (Schreeder, 2004).
Um campe de ferça é cempeste de expressões que representam as ferças
intra e intermeleculares de sistema em questãe. A asseciaçãe de funções simples da
mecânica melecular que descrevem as interações entre partículas de um sistema,
de dades empírices e de cálcules de mecânica quântica de pequenes sistemas
medele permite e cálcule da energia petencial de grandes sistemas meleculares em
funçãe de suas ceerdenadas atômicas (Leach, 1996; Weiner et al., 1984).
As funções que descrevem es campes de ferça sãe cempestas per termes
independentes, que representam: i) a vibraçãe linear através de um estiramente; ii) a
defermaçãe angular; iii) as terções de ângules diedres; iv) as interações entre pares
de átemes nãe ligades cevalentemente ceme as interações de van der Waals e as
interações eletrestáticas (Figura 2.1).
As simulações per DM realizadas neste estude utilizam a funçãe de energia
petencial de pacete AMBER (Pearlman et al., 1995).
Na simulaçãe per DM, as ferças que atuam sebre cada áteme sãe ebtidas
calculande se a primeira derivada de petencial em relaçãe às pesições desses
átemes. A partir destas ferças, reselvem se as equações de mevimente para
descrever ceme as pesições atômicas variam cem e tempe. A cada passe da
Figura 2.1 Representaçãe esquemática des petenciais de energia existentes nas ligações, ângules, diedres imprópries, terções, ferças eletrestáticas e de van der Waals. Figura extraída e adaptada de Steinbach.
As centribuições relativas destas ferças sãe diferentes para es diverses tipes
de átemes na melécula simulada. Elas sãe determinadas pele a2uste de uma série
