O presente trabalho refere&se ao primeiro estudo computacional via simulamão por DM que investiga os efeitos da temperatura sobre a estrutura 3D do complexo
enzimático InhA&NADH do . Os parâmetros obtidos de duas
simulamões por DM com a enzima InhA e sua coenzima NADH, a 25 oC e 37 oC, foram analisados e comparados, obtendo&se as seguintes conclusões:
& Existem diferenmas conformacionais estatisticamente significativas entre as estruturas 3D resultantes das simulamões por DM aos 25 oC e 37 oC.
& Na região de ligamão do substrato (alma A, alma B, alma de ligamão do substrato) observou&se um importante aumento da flexibilidade (Fator&B aumentado nos resíduos desta região) aos 37 oC.
& A medida da distância entre as almas do substrato, alma A e alma B mostra que a InhA assume uma conformamão mais aberta aos 25 oC (temperatura ambiente) nesta região. Já, aos 37 oC, estas distâncias se reduzem, tornando a região destas almas, mais reclusa. Um dado interessante a ser observado é que a distância entre a alma de ligamão do substrato e a alma B da InhA na temperatura fisiológica humana é igual a esta distância na estrutura cristalina. A mesma semelhanma ocorre entre a InhA a temperatura ambiente e suas formas mutantes. Este parâmetro, relacionado com a conformamão das almas que estão em contato com o substrato, nos faz alertar sobre o quanto o ajuste de um fator ambiental como a temperatura pode interferir no resultado conformacional da estrutura protéica.
& Nas hélices α6, α7 e α2 da InhA, os Fatores&B de seus resíduos diminuíram aos 37 oC, o que demonstra que a alteramão da temperatura ambiental não interfere de forma linear na flexibilidade da enzima. Uma maior elevamão da estabilidade estrutural das proteínas está relacionada com o aumento de sua rigidez, enquanto que uma maior flexibilidade pode favorecer sua atividade (Meinhold et al., 2008). As hélices α6 e α7 oferecem “sustento” para a alma de ligamão do substrato, mostrando&se mais firmes, aos 37 oC. A hélice α2 faz parte da região de contato com o NADH, justificando sua maior estabilidade com o aumento da temperatura.
& Na região do sítio de ligamão da coenzima, a grande maioria dos resíduos localizados a 4 Å do NADH apresentaram a sua flexibilidade aumentada aos 37 oC, com excemão dos resíduos Ser20, Ile21, Phe41. Os resíduos Ser20 e Ile21 fazem parte da alma rica em glicina e, além do Fator&B diminuído, aos 37 oC deixam de ter interamões de hidrogênio com o NADH.
& Pode&se concluir, portanto, que até mesmo pequenos aumentos de temperatura afetam significativamente a conformamão de uma proteína em regiões importantes para o desempenho de suas funmões. A elevamão da temperatura aumenta a flexibilidade da estrutura protéica, mas de forma heterogênea, preservando regiões que necessitam de maior estabilidade no contexto dinâmico de sua funcionabilidade. A influência da temperatura sobre a flexibilidade, portanto, não se dá de forma global e uniforme, seguindo um padrão de distribuimão que permita um melhor desempenho enzimático naquelas condimões ambientais.
& O comprimento do NADH diminui de 16,7 Å para 15,5 Å com o aumento da temperatura. Isso confirma as mudanmas que ocorrem no nível de coenzima e sítio de ligamão do NADH ao alterar&se a temperatura.
& Quanto às interamões de hidrogênio entre o NADH e os resíduos da InhA, observou&se uma mudanma na disposimão destas ligamões na temperatura fisiológica humana. A mudanma conformacional do NADH aos 37 oC acompanha&se da diminuimão de suas interamões de hidrogênio com a alma rica em glicina. Outra mudanma observa&se na Lys165 que deixa de partilhar suas ligamões de hidrogênio com os átomos O2D e O3D do NADH para interagir com os átomos O1 da adenosina e O1 da nicotinamida. As alteramões na distribuimão das ligamões de hidrogênio entre o NADH e os resíduos da proteína, confirmam as mudanmas conformacionais que ocorrem no sítio de ligamão da coenzima com o aumento da temperatura.
& Um maior entendimento dos eventos mecânicos associados à ligamão do substrato e do NADH à InhA é essencial para permitir a projemão de novos fármacos inibidores desta enzima (Hornak & Simmerling, 2006). As nítidas modificamões da enzima InhA e sua coenzima NADH durante um processo de alteramão de temperatura de 25 oC para 37 oC devem ser consideradas no decorrer do planejamento e de algum fármaco tuberculostático. O conhecimento detalhado das estruturas alvo, portanto, deve levar em conta as condimões ambientais (pressão, temperatura, pH) às quais serão submetidas em in % % .
& O conhecimento detalhado que o estudo computacional com simulamões por DM nos oferece sobre as alteramões estruturais que as macromoléculas biológicas
podem sofrer com as mudanmas dos fatores ambientais pode aprimorar os conhecimentos fisiopatológicos das doenmas.
& Considerando que as alteramões conformacionais das proteínas podem afetar sua habilidade de ligar&se a outras moléculas e que qualquer progresso na modelagem do movimento protéico e flexibilidade contribuirá para o entendimento do mecanismo das funmões biológicas (Fersht, 2008), os resultados do presente trabalho enfatizam a importância do estudo sobre as mudanmas estruturais que as enzimas podem sofrer com a variamão dos fatores ambientais.
Entre as perspectivas futuras que podemos vislumbrar a partir deste trabalho científico, temos:
& Realizamão e análise de outras simulamões por DM com InhA e NADH com temperaturas mais elevadas (3S oC, 40 oC e 42 oC). Vários trabalhos na literatura (Morita et al., 2006) apontam para diferenmas cinéticas, metabólicas, estruturais e dinâmicas das proteínas a temperaturas correspondentes a estado febril (40 oC). Estes dados sugerem um estudo mais detalhado, da InhA e outras enzimas, nestas temperaturas. No estudo de Pritchard (2005) verificou&se que o aumento da temperatura pode funcionar como um elemento facilitador para a síntese de mediadores químicos no processo inflamatório.
& Comparamão do comportamento das águas envolvidas na ligamão entre a InhA e o NADH nas diferentes temperaturas.
& Elaboramão de estudos de & com complexos InhA&NADH provenientes de simulamões a diferentes temperaturas.
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Závodszky P.; Kardos J.; Svingor A.; Petsko G.A. E
5 9 ! "
.f USAf 95f 7406 11f 1998. Zhang J.; Zhang L.; Zhou L 1
& f 21f 657 662f
2004.
Zoidakis J.; Loaiza A.; Vu K.; Abu Omar M.M. , %, 5
f 99f 771 775f 2005.
HM;
V
;
J 3 4
Consiste em reescrever as coordenadas das amostras em outro sistema de eixo mais conveniente para a análise dos dados.
As n variáveis originais geramf através de suas combinações linearesf n componentes principaisf cuja principal característicaf além da ortogonalidadef é que são obtidos em ordem decrescente de máxima variância. A componente principal 1 detém mais informação estatística que a componente principal 2f que por sua vez tem mais informação estatística que a componente principal 3 e assim por diante.
Este método permite a redução da dimensionalidade dos pontos representativos das amostras poisf embora a informação estatística presente nas n variáveis originais seja a mesma dos ncomponentes principaisf é comum obter em apenas 2 ou 3 das primeiras componentes principais mais que 90% desta informação.
J ?@
Assemelham se ao estado de transição da reação.
Uma família de proteínas do choque térmicof dentro da qual é feito o dobramento das proteínas.
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Relação geométrica entre um dado conjunto de átomos.
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Arquitetura tridimensional de uma proteína e relações espaciais de todos os átomos com os demais (Murray et al.f 1998). Conformação refere se à disposição espacial de grupos diversos sem o rompimento de ligaçõesf em conseqüência da rotação em torno de laços simples na molécula (Lehninger et alf 2006). Uma proteína pode apresentar inúmeras conformações. Cada uma delas caracteriza um micro estado (Fonseca et al.f 2006).
$ 8 ' $
É uma forma de espectroscopia que faz uso da absorção diferenciada da luz
polarizada no sentido horário ou no sentido anti horário. Este fenômeno é rotineiramente utilizado no estudo da estrutura secundária de proteínas.
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Em físicaf a $ ?@ 6 - permite calcular a função distribuição para um número fracionário de partículas ! / ! ocupando um conjunto de estados cada um dos quais tem energia ' :
onde 0 é a 6 - f # é a temperatura (admitida como sendo uma quantidade precisamente bem definida)f é a degeneraçãof ou número de estados tendo energia ' f ! é o total do número de partículas:
e 4(#) é chamada função partiçãof a qual pode ser tratada como sendo igual a
As proteínas são polímeros formados por uma seqüência definida de aminoácidos. O material genético de cada célula é capaz de produzir uma única seqüência de aminoácidos de uma maneira bastante reprodutível. Entrentantof esta seqüência unidimensional de aminoácidos necessitaf no entantof sofrer arranjos se dobrando sobre si mesma para quef ao finalf forme se uma proteína com uma estrutura 3D definida dotada de função biológica. Este processo é conhecido como enovelamento protéico e a proteína enovelada é dita nativa. Portantof uma estrutura secundária (alfa hélicesf folhas beta e voltas)f terciárias (arranjo tridimensional) e quaternária completamente definida.
W
Estado termodinâmico que corresponde por um número de átomos Nf volume V e temperatura T constantes (NVT).
J ' F
Estado termodinâmico caracterizado por número de átomos Nf pressão P e temperatura T constantes (NPT).
W
Estado termodinâmico que corresponde a um sistema isoladof e é caracterizado por número de átomos Nf volume V e energia total E constantes (NVE).
É a grandeza física que descreve a energia interna total de um sistema. A unidade da entalpia é o joule (J) no Sistema Internacional de Unidades e sua representação é feita pelo símbolo H.
É uma grandeza termodinâmica que representa o grau de desordem. Ela mede a parte da energia que não pode ser transformada em trabalho.
As técnicas de espalhamento de neutrons desempenham um importante papel no estudo da matéria condensada. Elas complementam as técnicas mas conhecidas de espalhamento de raios Xf elétrons e luz. A utilidade dos nêutrons térmicos provem do fato destas partículas possuírem comprimentos de onda de Broglie (λn) da ordem das distâncias interatômicas na matéria condensadaf ou
seja 1 a 4 Å ef correspondentementef energias da ordem de 5 x 103 a 8 x 102 eVf isto éf da ordem das energias quânticas características excitadas em temperaturas ordinárias. O espalhamento de nêutrons pela matéria condensada é devido a dois tipos de interação: (a) a interação neutron núcleof via forças nuclearesf corresponde a seções de choque σ e amplitiudes de espalhamento bf com σ = π f que são características de um particular núcleof e que devem ser determinadas experimentalmente; (b) o momento do nêutron ( 1f91 magnetons
nucleares) interage com campos magnéticos locais na amostra em estudof em particular com campos de quaisquer momentos magnéticos tais como aqueles relacionados com camadas incompletas nos íons de elementos de transição e terras raras. O espalhamento pode ser elátstico e ineláticof coerente e incoerente. O espalhamento elástico coerente (espalhamento de Bragg) é utilizado no estudo de arranjos de átomos e de spins nos sólidosf enquanto que o espalhamento inelático (com perda ou ganho de energia pelo neutron) é utilizado no estudo de movimentos atômicos (difusãof rotaçõesf vibrações na rede cristalina) e de ondas de spin (magnons). O neutron é mais sensível ao movimento de àtomos leves como o hidrogênio e o carbono sendof portanto uma ponta de prova ideal para o estudo da dinâmica de moléculas orgânicas (Herdadef 1994).
3 &4
É um tipo de espectroscopia de absorção a qual usa a região do ingravermelho do espectro eletromagnético. Ela pode ser usada para identificar um composto ou investigar a composição de uma amostra. A espectroscopia IV baseia se no fato de que as ligações químicas das substâncias possuem freqüências de vibração específicasf as quais correspondem a níveis de energia da molécula (níveis vibracionais). Tais freqüências dependem da forma da superfície de energia potencial da moléculaf da geometria molecularf das massas dos átomos e eventualmente do acoplamento vibrônico.
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Para se superar a energia de ativação de uma reaçãof passa se pela formação de um estado intermediário chamado “estado de transição”f sempre um composto instável e de alta energiaf representado por “Ts”f ligado com altíssima afinidade ao sítio catalítico.
Considerando uma reação de substituiçãof em que um grupo de saída Mf ligadof inicialmentef a f é substituído por um grupo que entraf :
E + R L = E R +L
Essa substituição envolve um estado de transiçãof E... R... Lf cuja formação e subseqüente decomposição pode ser representada por duas “reações parciais”f cada uma com uma variação característica em energia livre:
E...R...L = E R+L GD
com GF = variação em energia livre da formação do estado de transição
GD = variação em energia livre da decomposição do estado de transição
7
É o cálculo das relações quantitativas dos reagentes e produtos em uma reação química equilibrada.
7 ?@
Define a relação logarítmica entre a constante da velocidade e a temperatura: log (k2/ k1) = Ea/2f303R(1/T1 – 1/T2)
?A
A proteína nativa é mantida por um somatório de interações fracas (pontesde hidrogêniof interações iônicasf interações hidrofóbicas).
É uma expressão que traduz um movimento molecular. Significa movimento flexível tipo dobradiça.
! J
A estabilidade das proteínas é controlada para manter suas funções. Em condições fisiológicasf o estado nativo corresponde à conformação termodinamicamente mais estável. O estado nativo é apenas ligeiramente mais estável que o estado desnaturado. Uma estabilidade maior tornaria a proteína pouco flexível.
!
É o estado termodinâmico de qualquer sistema que está exatamente caracterizado pelas medidas das propriedades do sistema e número de moles de cada constituinte. O conjunto (“ + ”) desses micro estados compõe o
!
Refere se a uma “foto estantânea” da localização e momento de cada molécula e átomo em todo macroestado. Na mecânica clássicaf para um sistema constituído por um conjunto {q} de graus de liberdadef seus microestados podem completamente ser especificados através de pontos no espaço de fase definidos ao se conhecer as coordenadas generalizadas das posiçõesf r1f r2 ...rNf e momentosf p1f p2...pNf das N partículas do sistema.
! W
É um movimento periódico em que a lei de variação com o tempo não é uma função harmônica.
Estado em que a proteína apresenta a função para a qual foi produzida (Fonseca et al.f 2006).
8 7
Quinase cuja síntase não depende da presença de um indutor ou substrato específico.
X
Organismos que vivem em baixas temperaturas.
1 #
Em condições Normais de Temperatura e Pressão (NTP) a temperatura é de 25 ºC.
1 X 3 4
Nos endotérmicos (regulação interna da temperatura) ou homeotérmicos (temperaturas pouco variadas)f como o homemf verifica se a temperatura fisiológica. O organismo tem a capacidade de regular a temperatura interna através de mensagens nervosas. Homeotérmicos – Animais que podem manter a temperatura do corpo constantef mesmo com a variação da temperatura ambiente. São as aves e os mamíferos.
L X
São um numeroso grupo de minerais que possuem uma estrutura porosa. Os zeólitos naturais formam se em locais onde camadas de rochas vulcânicas e
cinza vulcânica reagem com água alcalina; também ocorrem em ambientes pós
deposicionais em que cristalizaram ao longo de milhares ou mesmo milhões de anos em bacias marinhas pouco profundas.
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G
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Parâmetros do NADH (Rydef 1995)
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