EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO DE VITAMINA C (vit. C)
SOBRE AS ALTERAÇÕES NUTRICIONAIS DECORRENTES
DA CIRROSE BILIAR SECUNDÁRIA
Estudo experimental em ratos jovens
.
EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO DE VITAMINA C
(vit. C) SOBRE OS EFEITOS DECORRENTES DAS
ALTERAÇÕES NUTRICIONAIS NA CIRROSE
BILIAR SECUNDÁRIA
Estudo experimental em ratos jovens
Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em “Fisiopatologia em Clínica Médica” - Área de concentração: Metabolismo e Nutrição- Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” - Campus de Botucatu, para obtenção do título de mestre.
Orientador: Prof. Dr. Cláudio Antonio Rabello Coelho
Botucatu- SP
Quando nada parece ajudar, eu vou e olho o cortador de
pedras martelando sua rocha, talvez cem vezes sem que
nem uma só rachadura apareça. No entanto, na centésima
primeira martelada, a pedra se abre em duas, e eu sei que
não foi aquela a que conseguiu, mas todas as que vieram
antes.
“
A sabedoria não nos é dada, é preciso descobri-la por nós
mesmos, depois de uma viagem que ninguém nos pode
poupar ou fazer por nós”
Aos meus pais, exemplo de luta e de trabalho,
que possuem como meta principal de suas vidas a formação
das filhas, e em nossas conquistas, a principal recompensa.
indiretamente, não só para a realização deste trabalho, mas
também para a concretização de um sonho.
Em especial, ao Dr. Cláudio pela orientação
segura e competente por toda dedicação, respeito e
confiança depositada em mim.
Aos funcionários do Laboratório Experimental
do Departamento de Pediatria da Faculdade de Medicina de
Botucatu-Unesp: Regina M. de Oliveira; Alvina F. Ramos,
Neusa M. Ferreira, Paulo S. Dionizio e Cristina M. T. F.
Rezende pela colaboração e disponibilidade na realização dos
trabalhos laboratoriais.
Aos funcionários do Departamento de
Pediatria: Adriana, Maria do Carmo, Fabiano, Paulo e
Marcelo, pela receptividade e amizade durante a realização
desta tese.
Aos
funcionários
do
Departamento de Pós-
Graduação, em especial a Regina e o Natanael, pela atenção
prestada.
realização deste trabalho.
Á Salete e Clóvis funcionários do Departamento
de Patologia, pela realização de exames bioquímicos.
Á biblioteca da Unesp, campus Botucatu, pela
colaboração e agilidade na revisão de literatura.
Á amiga Adriane, que compartilhou comigo
momentos alegres, de conquistas, de ansiedades e de
preocupações se revelando uma pessoa essencial em toda
esta trajetória.
As amigas Paula e Regina pela ajuda e presteza
durante toda a duração do meu curso de mestrado.
As amigas Karina, Clara e Roberta pelo
companheirismo e desabafos.
A minha irmã Letícia, que mesmo a distância,
sempre torceu por mim.
Á Lúcia, Lílian, Marta, Dona Maura e Seu
Sanson que me acolheram em Botucatu como membro de suas
famílias.
ÍNDICE
RESUMO ... iii
ABSTRACT... iv
LISTA DE FIGRAS... vi
LISTA DE TABELAS - QUADROS - GRÁFICOS ... vii
LISTA DE ABREVIATURAS - SIGLAS - SÍMBOLOS ... viii
I. INTRODUÇÃO: ... 1
I.1. COLESTASE: ... 1
I.2. IMPORTÂNCIA DA COLESTASE: ... 2
I.3. CAUSAS DE COLESTASE:... 2
I.4. CONSEQÜÊNCIAS CLÍNICAS E LABORATORIAIS DA HEPATOPATIA COLESTÁTICA CRÔNICA:... 9
I.5. CONSEQÜÊNCIAS NUTRICIONAIS DA DOENÇA COLESTÁTICA CRÔNICA:... 12
I.5.1. VITAMINAS: ... 16
I.5.1.1. VITAMINAS LIPOSSOLÚVEIS:... 16
I.5.1.1.1. VITAMINA A: ... 16
I.5.1.1.2. VITAMINA E:... 18
I.5.1.2. VITAMINAS HIDROSSOLÚVEIS: ... 20
I.5.1.2.1. VITAMINA C (ÁCIDO ASCÓRBICO): ... 21
I.6. ALTERAÇÃO NO METABOLISMO DOS LIPÍDIOS NA COLESTASE: ... 24
I.7. MODELOS EXPERIMENTAIS DE COLESTASE: ... 26
I.8. APRESENTAÇÃO DO PROBLEMA: ... 27
II. OBJETIVO: ... 28
III. MATERIAIS E MÉTODOS: ... 29
III.1. DELINEAMENTO DO EXPERIMENTO: ... 29
III.1.1. VARIÁVEIS: ... 29
III.2. GRUPOS EXPERIMENTAIS: ... 30
III.2.1. DESCRIÇÃO DOS GRUPOS: ... 31
III.3. EXECUÇÃO DO EXPERIMENTO:... 32
III.3.1. CUIDADO E MANUTENÇÃO DOS ANIMAIS: ... 32
III.3.2. ACASALAMENTO E DIAGNÓSTICO DE PRENHEZ: ... 33
III.3.3. LIGADURA E RESSECÇÃO DO DUCTO BILIAR COMUM:. 33 III.3.4. OPERAÇÃO SIMULADA: ... 35
III.3.5. OBSERVAÇÃO E MEDIDAS REALIZADAS APÓS A OPERAÇÃO: ... 36
III.3.6. ADMINISTRAÇÃO DA VITAMINA C: ... 36
III.3.7. SACRIFÍCIO: ... 36
III.3.8. EXAMES BIOQUÍMICOS: ... 37
III.3.9. PESO FRESCO DOS ÓRGÃOS E DA CARCAÇA:... 39
III.3.10. TEOR DE ÁGUA NA CARCAÇA E NO CÉREBRO: ... 39
III.3.11. TEOR DE GORDURA NO CÉREBRO E NA CARCAÇA: ... 40
III.4.2. ESTATÍSTICA DESCRITIVA: ... 44
III.4.3. ESTATÍSTICA COMPARATIVA: ... 45
IV. DISCUSSÃO DOS MATERIAIS E MÉTODOS:... 47
IV.1. ANIMAL UTILIZADO: ... 47
IV.2. TÉCNICA DA LIGADURA:... 47
IV.3. GANHO DE PESO DOS ANIMAIS: ... 49
IV.4. AJUSTE DOS PESOS À FUNÇÃO LOGÍSTICA:... 49
V. RESULTADOS:... 56
VI. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS: ... 138
VII. CONCLUSÕES: ... 160
VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:... 161
RESUMO
EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO DE VITAMINA C SOBRE OS EFEITOS DECORRENTES DAS ALTERAÇÕES NUTRICIONAIS NA CIRROSE BILIAR SECUNDÁRIA - estudo experimental em ratos jovens.
Introdução: A colestase obstrutiva por atresia biliar em lactentes jovens é a condição hepática mais importante em Pediatria, pela alta mortalidade e por ser a principal indicação de transplante hepático na infância. Suas conseqüências nutricionais, devidas à má absorção de Triacilgliceróis e de vitaminas lipossolúveis, são importantes pois influem no resultado do transplante do fígado. Considerando que a absorção da vit. C não está alterada na colestase, pois é hidrossolúvel, e que possui efeitos sobre o aproveitamento de nutrientes e sobre o crescimento, nos propusemos a testar seu efeito benéfico sobre as alterações nutricionais da colestase.
Material e métodos: Foram estudados 40 ratos da raça Wistar desmamados aos 21 dias e divididos aleatoriamente em 4 grupos, sendo submetidos, a um dos tratamentos apresentados no quadro abaixo:
Grupos Operação (21o dia)
Gavagem (diariamente)
Sacrifício (idade)
LA * L.R.D.B.C. veículo aquoso 49 LD * L.R.D.B.C. vitamina C 49
SA operação simulada veículo aquoso 49
SD operação simulada vitamina C 49
* L.R.D.B.C-.Ligadura e ressecção do ducto biliar comum.
A cirrose biliar secundária foi provocada por ligadura e ressecção do ducto biliar comum. A vitamina C foi administrada por gavagem em solução aquosa na dose de 1mg/g de peso do animal. No sacrifício, foi colhido sangue para
determinação dos níveis séricos de vitamina A e E, de colesterol total e frações e de Triacilgliceróis. Após o sacrifício, o cérebro e a carcaça foram dissecados e seus teores de água e gordura, determinados.
Resultados: A Ligadura e ressecção do ducto biliar comum no modelo experimental utilizado, leva a: diminuição do crescimento; diminuição do
tamanho cerebral, diminuição dos níveis séricos da vitamina A e E; diminuição da gordura corporal; elevação do teor de água corporal; elevação dos níveis de colesterol-total e LDL- colesterol. A vitamina C influe sobre a nutrição
independentemente da presença ou não de colestase, promovendo: estimulo sobre o crescimento de animais não- colestáticos semelhante ao efeito observado em animais colestáticos; diminuição dos níveis séricos de colesterol total; LDL- colesterol; VLDL- colesterol; Triacilgliceróis. A vitamina C interfere nos efeitos da colestase sobre a nutrição evitando: diminuição do tamanho cerebral;
diminuição do teor de gordura na carcaça; diminuição dos níveis séricos da vitamina E; aumento da LDL- colesterol.
ABSTRACT
EFFECTS OF VITAMIN C SUPPLEMENTATION ON THE NUTRITIONAL CONSEQUENCES OR SECONDARY BILIARY CIRRHOSIS - an experimental study in young rats
Introduction: Biliary cirrhosis secondary to biliary atresia is the most important liver disease in young infants. This importance is due to its 100% mortality without treatment. And to the fact that it is the main indication for liver transplantation in infants and children. Its nutritional effects secondary to mal absorption of triacylglicerols and of liposoluble vitamins have important implications on the final results of liver transplantation. The absorption of vitamin C is not hampered in cholestatic disease since it is hydro soluble and therefore does not depend for its absorption on the presence of bile in the intestine. It also has effects on the intermediate metabolism and on growth. Therefore its supplementation could be useful in the treatment of the nutritional consequences of cholestasis.
Material and methods: We studied fourth Wistar rats immediately after weaning in the 21rst day of life. Each rat was allocated to one our following treatments
Treatment
groups Surgical procedure (21
st day) Daily administration
by gavage
Sacrifice (age)
LA ligature and resection of the common
bile duct water 49
LD ligature and resection of the common
bile duct vitamin C 49
SA Sham operation water 49
SD Sham operation vitamin C 49
Secondary biliary cirrhosis was brought about by double ligature and resection of the common bile duct. Vitamin C was delivered as 1mg /g of weight as a aqueous solution. At sacrifice blood was drawn for determination of seric concentration vitamins A and E, total and fractionated cholesterol.
Results- The ligature and resection of common biliary duct in the used experimental model, lead the: reduction of the growth; reduction of the cerebral size, reduction of the séricos levels of the vitamin and the E; reduction of the corporal fat; rise of the corporal water; rise of the levels of cholesterol-total and LDL- cholesterol. The vitamin C infuse on the nutrition independently of the presence or not of colestase, promoting: stimulate on the growth of non cholestatics animals similar to the effect observed in cholestatics animals; reduction of the séricos total cholesterol levels; LDL cholesterol; VLDL-cholesterol; Triacilgliceróis. The vitamin C intervenes with the effect of colestase on the nutrition preventing: reduction of the cerebral size; reduction of the corporal fat; reduction of the séricos levels of vitamin E; increase of the LDL- cholesterol.
LISTA DE FIGURAS:
Figura 1: Procedimentos da Operação ... 35
Figura 2: Execução do experimento... 37
Figura 3: Representação gráfica das curvas e retas da função logística ... 43
Figura 4: Curva logística... 50
Figura 5: Ponto de inflexão da curva logística... 51
Figura 6: Curva representativa da velocidade de crescimento... 53
Figura 7: Reta representativa da Aceleração do crescimento ... 54
LISTA DE TABELAS - QUADRO- GRÁFICOS
Tabelas e gráficos 1,2 e 3- Análises estatística descritivas e comparativas
dos valores dos parâmetros α, e da função logística... 58
Tabelas e gráficos 4 a 11- Análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de velocidade de crescimento. ... 64
Tabelas e gráficos 12 a 19- Análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de aceleração de crescimento. ... 80
Tabela e gráfico 20- Análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de constante de variação de crescimento. ... 96
Tabela e gráfico 21- Análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores ganho de peso dos 21 aos 49 dias... 98
Tabela e gráfico 22- Análises estatísticas descritivas e comparativas do peso final dos animais. ... 100
Tabelas e gráficos 23 a 25- Análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de peso fresco, teor de água e teor de gordura na carcaça... 102
Tabelas e gráficos 26 a 28- Análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de peso fresco, teor de água e teor de gordura no cérebro... 109
Tabela e gráfico 29- Análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de níveis séricos de vitamina A... 116
Tabela e gráfico 30- Análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de níveis séricos de vitamina E. ... 118
Tabela e gráfico 31- Análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de níveis séricos de colesterol total... 121
Tabela e gráfico 32- Análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de níveis séricos de LDL- colesterol... 123
Tabela e gráfico 33- Análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de níveis séricos de HDL- colesterol. ... 126
Tabela e gráfico 34- Análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de níveis séricos de VLDL- colesterol. ... 128
Tabela e gráfico 35- Análises estatísticas descritivas e comparativa dos valores de níveis séricos de triacetilgliceról ... 130
Quadro 1: Conseqüências fisiopatológicas da colestase prolongada. ... 10
Quadro 2: Testes comuns da função hepática e auxiliares na avaliação do estado nutricional. ... 11
Quadro 3: Suplementação de vitamina A, E e C para crianças com colestase ] crônica ... 24
Quadro 4: Grupos experimentais ... 31
Quadro 5: Esquematização da figura 2. ... 43
Quadro 6: Resumo dos resultados... 132
ABREVIATURAS - SIGLAS- SÍMBOLOS
- Negativo
˚C Graus centígrados + Positivo
< Menor que
= Igual
> Maior que
® Marca registrada
µg/g Micrograma/grama µg/ml Micrograma/mililitro A.A.A Aminoácidos aromáticos A.A.C.R Aminoácidos de casdeia ramificada A.A. Aminoácidos
A.C. Aceleração de crescimento ANOVA Análise de Variância
Apo-1 Apolipoproteina A1 C.V. Coeficiente de Variação
CBAT canalicular bile acid tranporter (ing.) transporte canalicular dos ácidos boliáres
CEEA Comissão de Ética em Experimentação Animal COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal CVAC Constante de variação de aceleração do crescimento d-1 1/dia (unidade da constante de variação da aceleração do crescimento)
D.P. Desvio Padrão Et al Et alii (latim) e outros f(x) Função de x
FMB Faculdade de Medicina de Botucatu G Gramas
g/d Gramas/dias (unidade da velocidade do crescimento) g/d2 Gramas/dias2 (unidade da aceleração do crescimento) GH Hormônio de crescimento
HDL Hight-Density Lipoprotein (ing.) Lipoproteina de alta densidade
HPLC high pressure liquid chromatography (ing.) cromatografia líquida de alta pressão
IGF-1 Insulin- like growth factors (ing.)Fator de crescimento semelhante à insulina
L Ligadura do ducto biliar
L.R.D.B.C Ligadura e ressecção do ducto biliar comum. LA Grupo com ligadura do ducto biliar com água LCAT Atividade da aciltranferase colesterol
LD Grupo com ligadura do ducto biliar com administração de vitamina C
MDR3 multidrug resistence factor number (ing.) fator de resistência a multiplas drogas número 3
Mg/d Miligrama/dia Mg/dl Miligrama/mililitro
SA Grupo com operação simulada com água
SD Grupo com operação simulada com administração de vitamina C T.A.P. Tempo de atividade de protrombina
T.T.P.A Tempo de protrombina parcial ativada VC Velocidade de crescimento
VLDL Very low density lipoprotein (ing.) Lipoproteína de muito baixa densidade
α Alfa
Beta Gama
I. INTRODUÇÃO:
I.1. COLESTASE:
I.2. IMPORTÂNCIA DA COLESTASE:
A importância e o grande interesse que o estudo da colestase tem despertado deve-se à freqüente incidência tanto na prática clínica de crianças, quanto na de adultos e a grande variedade de causas identificadas até o momento (SHERLOCK, 1989; WATSON & GIACOIA, 1983; ZIMMERMAN, 1979). É a condição hepatobiliar mais comum no período neonatal e nos primeiros meses de lactância (REICHEN & SIMON, 1994). A incidência chega a ser de 1 em 500 nascimentos (MOWAT, 1987; MOWAT, 1991b), sendo em crianças a evolução das doenças colestáticas para cirrose biliar mais rápida do que em adultos (BURDELSKI, 1995).
I.3. CAUSAS DE COLESTASE:
Uma grande variedade de causas pode induzir a colestase em crianças e adultos. As crianças são particularmente vulneráveis a colestase em parte por imaturidade dos mecanismos de formação da bile.
A relação abaixo apesenta as causas de colestase classificadas segundo sejam extra ou intra-hepáticas e conforme incidam antes ou após os 4 meses de idade (WHITINGTON, 1996 com modificações):
− Causas de colestase extra - hepática em crianças com menos de 4 meses de idade:
• Cisto do colédoco
• Coledocolitíase
• Colangite esclerosante primária (forma neonatal)
• Colangite infecciosa
• Colangite associada a histiocitose de células de Langerhans
• Perfuração do colédoco
• Estenose congênita do colédoco
• Tumor de vias biliares
• Infiltração leucêmica do pâncreas (RAUSCH et al, 2002)
− Causas de colestase intra - hepática em crianças com menos de 4 meses de idade:
• Colestase fisiológica do recém nascido
• Prematuridade
• Hipóxia e / ou isquemia hepática perinatal (JACQUEMIN et al., 1998; VAJRO et al., 1997)
• Infecções congênitas Sífilis
Rubéola
Citomegalovírus Herpes simples Parvovírus B19 Herpesvírus tipo 6 Doença de Chagas Listeriose
Hepatite de células gigantes com inclusões semelhantes a Paramixovírus (HICKS et al., 2001; ISHAK, 2002)
• Infecções adquiridas
Bacterianas (endotoxinas)
Virais (vírus das hepatites A ,B e C)
• Doenças metabólicas genéticas
Deficiência de α1- antitripsina Galactosemia
Intolerância hereditária à frutose Tirosinemia congênita
Síndrome de Zellweger
Deficiência da redutase-5β dos Δ4
–3-oxosteróide.
Deficiência da dehidrogenase / isomerase dos esteróides-3β -hidroxi Δ5–C27
Deficiência de 7α hidroxilase dos oxiesteróides (SETCHELL et al.,1998)
Hemocromatose neonatal (SIAFAKAS et al., 1997)
Coagulopatia e hipoproteinemia congênitas associadas a hipertirosinemia (KAWAI et al., 1998)
Doença de Nieman- Pick tipo C (YERUSHALMI et al, 2002)
Deficiência de transportador mitocondrial de aspartato glutamate (citrina) (SAHEKI & KOBAYASHI, 2002)
• Colestases intrahepáticas familiares progressivas:
Tipo 1 - doença dos Byler - mutação do gen FIC1 (ARNELL et al., 1997; BULL et al., 1997; JANSEN & MULLER, 1998; RONALD & 0UDE, 1998; STRAUTNIEKS & KAGAWALLA, 1997)
Colestase dos Esquimós da Groenlândia - mutação do gen FIC1 - (KLOMP et al, 2000)
Colestase das ilhas Faeroe - mutação do gen FIC1 (TYGSTRUP et al, 1999)
STRAUTNIEKS & KAGAWALLA, 1997; STRAUTNIEKS & BULL, 1998)
Tipo 3 - deficiência de MDR3- multidrug resistence factor number - fator de resistência a multiplas drogas número 3 (BULL et al., 1998; DE VREE et al., 1998; JANSEN & MULLER, 1998; HOLLAND & RIVIERA- PEDROGO,1998)
• Colestase associada à nutrição parenteral total
• Colestase por drogas administradas à mãe ou à criança - por exemplo clorpromazina, cetoconazale, carbamazepina (FREY et al, 2002)
• Colestase associada à incompatibilidade sanguínea materno fetal (por hipóxia ?; por siderose hepática ?)
• Colestase dos Índios Norte-Americanos
• Colestase intrahepática neonatal associada a siderose e esteatose hepática (TAZAWA, et al.,1998)
• Doença de Aagenaes
• Colestase neonatal associada a displasia medular focal dos rins (BERGER et al., 1998)
• Colestase crônica com nefropatia tubulointersticial (MONTINI et al., 1997)
• Hepatite neonatal idiopática, colestase neonatal benígna ou colestase transitória do recém nascido
• Síndromes ductopênicos: Síndrome de Alagille
Ductopenia não sindrômica – por drogas, genética ?
− Causas da colestase extrahepática em crianças com mais de 4 meses de idade e em adultos:
• Cisto do colédoco
• Litíase de vias biliares
• Neoplasias extrabiliar
• Estenose pós-cirúrgica
• Parasitoses (ascaridíase)
• Compressão extrínseca
• Colangite esclerosante primária
− Causas da colestase intrahepática em crianças com mais de 4 meses de idade e em adultos:
• Colestase intra - hepáticas hepatocítica Drogas
• Fenotiazinas
• Vasoconstritores
• Estolato de eritromicina Nutrição parenteral total Hipotireoidismo
Induzida por sépses ou endotoxinas Hepatites alcoólica
Colestase da gestação Choque
Insuficiência cardíaca congestiva
Colestase intrahepática benigna recorrente (mutação do gene FIC 1) Hepatites virais A (hepatite colestática ou fase colestática de uma
hepatite bifásica), B e C Hepatites auto-imunes Sarcoidose
Doença de Caroli Cirrose biliar primária Colangite esclerosante
Vírus da imunodeficiência adquirida
• Colangiopatia por Citomegalovírus
• Colangiopatia por Criptosporidium Doença enxerto versoshospedeiro
Histiocitose de células de Langerhans Síndrome ductopênica idiopática do adulto Síndrome ductopênica tipo adulto por drogas
Das doenças relacionadas acima, a atresia das vias biliares (AVB), as doenças intra-hepáticas e a deficiência de α1 - antitripsina constituem as principais causas de colestase crônica na infância (TELLES & TANNURI,1994).
I.4. CONSEQÜÊNCIAS CLÍNICAS E LABORATORIAIS DA
HEPATOPATIA COLESTÁTICA CRÔNICA:
A colestase está associada a prejuízo de diferentes aspectos da função hepática (REICHEN & SIMON, 1994).
retardo de crescimento, deficiências nutricionais (ver quadro 1) e problemas psicoemocionais na criança em desenvolvimento.
QUADRO -1: Conseqüências Fisiopatológicas da Colestase Prolongada
Anormalidades Efeito
Retenção dos constituintes da bile
-Bilirrubina -Icterícia, colúria
-Sais biliares e/ou osteoides endógenos?
-Prurido - Colesterol -Xantelasmas Diminuição dos sais biliares no
intestino
- Má absorção de triacilgliceróis de cadeia longa
-Desnutrição e deficiência de AGE - retardo de crescimento; Má absorção de vitaminas
lipossolúveis:
-Deficiência de vitamina A -Cegueira noturna e/ou ceratomalácia;
-Deficiência de vitamina D -osteoporose com raquitismo ou osteomalácia;
-Deficiência de vitamina E -degeneração neuromuscular, anemia hemolítica;
-Deficiência de vitamina K -diátese hemorrágica; -Translocação bacteriana e
absorção de endotoxinas
-Agravamento da lesão dos hepatócitos
-Suscetibilidade aumentada a infecções.
-Lesão e disfunção hepatocelular -Cirrose com: hipertensão portal insuficiência hepática
Observam-se também alterações de variáveis laboratoriais empregadas na avaliação da síntese hepática, na absorção intestinal e nos distúrbios metabólicos (ver quadro 2).
QUADRO 2- Testes comuns de "função hepática" e auxiliares na avaliação do estado nutricional:
Testes diagnósticos Avaliação funcional
- Transaminases (AST e ALT) -Bilirrubina urinária;
-Bilirrubina sérica (total, conjugada e não conjugada)
-Fosfatase alcalina
-Fosfatase alcalina (cálcio e fósforo) - Gamaglutamiltransferases
-Lesão hepática
-Transporte de ânions orgânicos do sangue para a bile pelos hepatócitos.
-Retenção de ácidos biliares; -Má absorção de vitamina D.
-Colestase com lesão ductal pós- canalicular– proliferação ou hipoplasia ductal
-Proteínas totais -Albumina -Fibrinogênio
-Globulina total e frações (α1 e α2 e β) -γ globulina
-Metabolismo protéico e formação de albumina, globulinas, fibrinogênio, capacidade sintética protéica.
-Processos inflamatórios e hiperlipoproteinemias
-Estimulação imune por translocação bacteriana ou hiperendotoxinemia
-Tempo de atividade de protrombina T.A.P.)
-Tempo de protrombina parcial ativada (T.T.P.A.)
-Produção de protrombina, capacidade sintética de fatores coagulantes dependentes da vitamina K.
-Produção de protrombina, capacidade sintética de fatores coagulantes independentes da vitamina K.
Continuação... -Uréia e creatinina -Ácido úrico -Amônia
-Tolerância à glicose -Tolerância à galactose -Tolerância ao glucagon
-Formação de uréia e ácido úrico e remoção da amônia, capacidade de remoção da amônia transformando-a em uréia,
-Captação de glicose pelo hepatócito -Fosforilação da galactose
-Glicogenólise -Fosfolipídios
-Triacilgliceróis séricos
-Secreção biliar -Metabolismo lipídico
-Colesterol -Secreção biliar
-Síntese de colesterol -Cetonemia e cetonúrica -Glicopenia celular
-Hemograma completo -Avaliação das condições gerais do paciente e deficiências de ferro e ácido fólico
Fonte: MAHAN, K.L. et al , 1995c; MILLER, 2002(com modificações).
I.5. CONSEQÜÊNCIAS NUTRICIONAIS DA DOENÇA
COLESTÁTICA CRÔNICA:
1. Diminuição na ingestão da dieta:
Contribuem para a baixa ingestão de nutrientes, a dieta com paladar desagradável (restrita em sódio e eventualmente em proteínas); anorexia (infecção, déficit de zinco) e compressão de vísceras abdominais (organomegalia e/ou ascite), levando a saciedade precoce ou a refluxo gastroesofágico (MEZEY, 1978; SOKOL & STALL, 1990).
2. Aumento das necessidades basais:
No paciente pediátrico com colestase crônica o gasto energético basal é 30% maior que nas crianças normais (McCULLOUGH, 1999; PIERRO et al, 1989). Há um predomínio de utilização de energia proveniente do catabolismo protéico, levando a um balanço protéico negativo, a perdas musculares e a padrões de aminoacidograma plasmático diferentes do normal - os aminoácidos de cadeia ramificada (leucina, isoleucina e valina) estão diminuídos e os aminoácidos aromáticos (tirosina e fenilalanina) estão aumentados (PIETRO et al., 1993) .
3. Alterações do metabolismo intermediário:
O IGF-1 e o GH são intimamente relacionados e são importantes para o crescimento e desenvolvimento modulando o metabolismo de proteínas, lipídios e carboidratos (BLOMSMA et al, 1997).
Em condições normais, GH estimula o fígado a produzir IGF-1. O IGF-1 promove a síntese protéica. Em crianças no estágio final de doença hepática o IGF-1 cai a níveis quase indetectáveis, agravando ou contribuindo para a redução da massa celular corporal. O GH está aumentado, estimulando a lipólise e aumentando a perda dos estoques de gordura. A deficiência de IGF-1 e a resistência ao GH podem contribuir para o déficit de crescimento e para a caquexia (BUCAVALAS et al, 1990; RAMIRES & SOKOL, 1994; QUIRK et al, 1994).
4. Má absorção:
Nas crianças com doença colestática a diminuição de sais biliares na luz intestinal interfere na solubilização normal de lipídios (ácidos graxos de cadeia longa, colesterol e vitaminas lipossolúveis), resultando em sua má absorção econseqüentemente, esteatorréiae deficiências vitamínicas (BOOK, 1984; NOMPLEGGI & BONKOUUSKY, 1994, SOKOL & HEUBI, 1983; WEBER, 1972).
do crescimento, hiperqueratose e descamação da pele, cabelos finos e quebradiços com áreas de alopécia, trombocitopenia e prejuízo da função imunológica (BARR et al., 1981).
5. Interação entre drogas e nutrientes:
Anormalidades na função intestinal também podem ser causadas por medicações utilizadas no controle da doença hepática e resultar em alterações no estado nutricional (BPR - Guia de Remédios, 2001, CARDOSO, 1988, KLEIMAN & WARMAN, 1994; TERAN, 1999).
Efeitos específicos decorrentes destas interações refletem inter-relações que dependem da dosagem da droga, do tipo e da quantidade dos alimentos ingeridos, do tempo decorrido, do grau da colestase e do grau de desnutrição(MAHAN, 1995a).
Á desnutrição presente na colestase tem se atribuído: 1ª) a diminuição do crescimento do cérebro (SOKOL, 1990); 2ª) o retardo do desenvolvimento mental (STEWART et al, 1989); 3ª) a diminuição da imunocompetência com aumento da
suscetibilidade às infecções (O’KEEFE et al, 1980).
I.5.1. VITAMINAS:
O fígado é o principal local de estoque de vitaminas e biotransformação para sua forma ativa (SHEPERED, 1994). Na doença hepática há aumento da necessidade de algumas vitaminas em decorrência da lesão hepática, podendo agravar deficiências vitamínicas.
I.5.1.1. VITAMINAS LIPOSSOLÚVEIS:
A absorção das vitaminas lipossolúveis A, D, E e K depende essencialmente da presença de ácidos biliares na luz intestinal (MEZEI, 1984). Quando a concentração intraluminal desses ácidos está abaixo da concentração micelar crítica ocorre má absorção de vitaminas lipossolúveis.
I.5.1.1.1. VITAMINA A:
colestase crônica. Em pacientes com colangite esclerosante primária a deficiência é de 43% (HARNOIS & LINDOR, 1997).
O nível sérico de vitamina A está geralmente em torno do normal até que a reserva do fígado esteja esgotada. Concentrações plasmáticas abaixo de 0,35 a 0,70 μmol/L (10 a 20 μg/ml) ou concentrações hepáticas de retinóides menores de 5 a 10 μg/g de tecido; geralmente indicam deficiência de vitamina A.
A utilização do nível sérico de retinol como único dado a respeito dos níveis da vitamina no organismo, não fornece resultados precisos, por isso, a razão entre o retinol sérico e a RBP poderia refletir com mais fidelidade e de uma forma não invasiva, os estoques hepáticos de vitamina. Uma razão entre retinol/ RBP de 0,62 ± 0,15 indicaria deficiência e valores de 1,04 ± 0,06 indicariam reserva tissular adequada (MOREY et al, 1990).
anemia por supressão da série eritróide da medula óssea, ginecomastia e paralisia do nervo facial(BLOMHOFF, 1991; PIERRO, 1989).
EDUARDO 2002, utilizando suplementação de vitamina A em modelo experimental de colestase obstrutiva observou diminuição da mortalidade, da fibrose hepática e da proliferação ductal em ratos jovens com colestase obstrutiva que receberam uma preparação hidromiscível de vitamina A sugerindo que a deficiência de vitamina A agrava a lesão hepática decorrente da colestase e sua correção não só evita as manifestações acima relatadas dessa deficiência mas também protege o fígado.
I.5.1.1.2. VITAMINA E:
As manifestações clínicas de deficiência de vitamina E em crianças com doença colestática neonatal se caracterizam por degeneração neuromuscular progressiva que se manifestar por ataxia, neuropatia periférica, fraqueza muscular e oftalmoplegia, durante a primeira década de vida (GUGGENHEIN et al.1982, PUGLIESE et al, 1994). A síndrome neurológica é mais rara em adultos com colestase e deficiência desta vitamina do que em crianças. Por sua ação antioxidante, a carência desta vitamina, na colestase, diminui a capacidade de eliminação de radicais livres que levam a reação em cadeia da peroxidação lipídica (MUNOZ, et al., 1989).
A caracterização de deficiência de vitamina E é feita através de variáveis clínicas e laboratoriais e (PUGLIESE et al, 1994):
∗ determinação da concentração sérica de vitamina E;
∗ teste de hemólise pelo peróxido maior que 10%;
∗ sinais neurológicos típicos;
Durante a colestase, níveis elevados de lipídios circulantes permitem a presença no plasma de vitamina E não hidrolizada, não polar podendo indicar um falso aumento da concentração sérica (FARREL et al, 1978).
I.5.1.2. VITAMINAS HIDROSSOLÚVEIS:
Na literatura trabalhos sobre deficiências de vitaminas hidrossolúveis (complexo B e vitamina C) em crianças colestáticas são raros. Deficiências de vitaminas hidrossolúveis têm sido descritas em pacientes com doença hepática grave (WILLIANS et al, 1978).LEEVY et al (1970), referem que alterações nos níveis circulantes das vitaminas A, C, E, B6 e ácido fólico, estavam regularmente presentes em seus pacientes com doença hepática crônica ou aguda. ROSSOW (1978), relata deficiências de vitaminas hidrossolúveis, incluindo B1 e B6 em pacientes com cardiomiopatia nutricional e neuropatia periférica.
I.5.1.2.1. VITAMINA C (ÁCIDO ASCÓRBICO):
A vitamina C (ácido ascórbico), é hidrossolúvel e está presente principalmente em frutas cítricas e vegetais verdes (BEATTIE & SHERLOCK, 1976; FERRINE et al, 1995).
O ácido ascórbico é facilmente absorvido a partir do intestino delgado para o sangue por um mecanismo ativo e provavelmente também por difusão. O ácido ascórbico passa rapidamente às supra-renais, rins, fígado e baço. Na maioria desses órgãos o conteúdo de vitamina C parece estar em equilíbrio com os níveis séricos. Quantidades excessivas ingeridas até o nível de saturação de vários tecidos são excretadas na urina como ácido oxálico; ingestões maiores que 100g/dia levam a eliminação do excesso como ácido ascórbico ou como dióxido de carbono exalado (MAHAN, 1985b).
Entre suas variadas funções fisiológicas destacam-se:
1ª) ação antioxidativa e varredora de radicais livres (BENDICH et al, 1986);
2ª) regulação da síntese de colágeno (FETT, 2000);
3ª) atuação sobre a síntese de hormônios adrenais, aminas vasoativas e carnitina (BENDICH, 1986);
5ª) estimulo da resistência às infecções (FETT, 2000);
6ª) aumento da absorção e utilização de ferro bem como permissão da trans formação do Fe férrico em Fe ferroso (BENDICH et al, 1986; CUKIER & MAGNON, 2001);
7ª) prevenção de doenças ósseas (McALINDON et al, 1996);
8ª) aceleração da regeneração de fraturas ósseas (SARISOZEM et al, 2001).
O papel antioxidante da vitamina C baseia-se na reação com os radicais hidroperoxil, produzindo radicais ascórbicos (WEBER et al, 1996). Ela também serve como co-antioxidante, interagindo com a vitamina E (BURTON & TRABER, 1990) por redução do radical α-tocoferil para α-tocoferol regenerado (BENDICH, 1986).
Em pacientes com cirrose, a diminuição nos níveis sanguíneos de glutationa e aumento no nível de dehydroascorbato, sugere a presença de estresse oxidativo, para o qual contribue a baixa ingestão e utilização deficiente de vitamina C (MARTENSSON, 1992).
Os principais sinais de deficiência de vitamina C além do escorbuto são:
3ª) cicatrização lenta e deficiente (SUGIMOTO et al, 1998); 4ª) desenvolvimento ósseo anormal (SIMON & HUDES, 2001);
5ª) aumento da prevalência e retardo da regeneração de fraturas ósseas (SIMON, & HUDES 2001);
6ª) fadiga (BETTIE,1976; FETT, 2000).
Deficiência de ácido ascórbico pode levar à diminuição hepática do citocromo P-450 e, assim, afetar a atividade hepática da metabolização enzimática de drogas (ZANNONI et al, 1982).
QUADRO 3- Suplementação de vitaminas A, E e C para crianças com hepatopatia colestática crônica:
Vitaminas Recomendações
A Forma lipossolúvel - 50.000 UI/mês/IM
Forma hidrossolúvel: 5.000 a 25.000 UI/dia/VO E α-tocoferol: 1 a 2 UI/dia/IM ou 25 a 50 UI/dia/VO
TPGS: 15 a 25 UI/Kg/dia C Dobro da RDA.
Fonte: Silveira, 2001.(com modificações)
I.6. ALTERAÇÃO NO METABOLISMO DOS LIPÍDIOS NA
COLESTASE:
O fígado é a principal fonte de colesterol e de lipoproteínas (VLDL, HDL) e é, portanto, essencial para o transporte normal dos lipídios séricos.
absorção das gorduras ingeridas com a dieta se realize com o máximo de aproveitamento.
Os lipídios sintetizados pelo fígado são transportados ligados a lipoproteínas no plasma até o tecido adiposo e demais órgãos (BORGES & WAITZBERG, 1995a).
A diminuição da síntese de lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) contribue para o acúmulo de gordura no fígado como resultado de um decréscimo da exportação de triacilgliceróis do hepatócito (SHERLOCK & DOOLEY, 2002).
ângulo interno do olho, os xantelasmas ou xantomas planos ou de xantomas eruptivos nos braços e nas pregas das palmas das mãos. Posteriormente, costumam formar-se numerosas protuberâncias nodulares e diferenciadas (xantomas tendinosos ou tuberosos), que normalmente aparecem agrupadas sobre as superfícies de extensão das extremidades, particularmente nos punhos, cotovelos, tornozelos e também nas nádegas. O colesterol se deposita, em casos muito isolados, nos nervos periféricos originando sintomas neurológicos. Os xantelasmas regridem com o tratamento da hipercolesterolemia e após o transplante de fígado (MOURIK, 2001).
O risco de aterosclerose em crianças com colestase crônica não é conhecido mas a hipercolesterolemia na Síndrome de Alagille tem sido associada à lipidose renal causando falência renal (ALLAGILLE, 1987).
Modelos experimentais utilizando ratos com ducto biliar ligado, apresentam mudanças nas lipoproteínas séricas similares às observadas em humanos com doença colestática (HINTON,1978).
I.7. MODELOS EXPERIMENTAIS DE COLESTASE:
Estes modelos experimentais de colestase resultam em prejuízo funcional da captação hepatocelular, da excreção canalicular e do transporte de sais biliares e de vários outros ânions orgânicos (BOSSARD et al., 1993: BOLDER et al., 1997; TRAUNER et al., 1997).
I.8. APRESENTAÇÃO DO PROBLEMA:
Considerando que a colestase ocasiona alterações nutricionais como: má absorção de vitaminas lipossolúveis e alteração no metabolismo de lipídios, resolvemos estudar a influência da vitamina C, que é hidrossolúvel, portanto melhor absorvida na colestase e que tem entre muitas outras funções ação antioxidante.
II. OBJETIVO:
Testar a seguinte hipótese:
III. MATERIAIS E MÉTODOS:
III.1. DELINEAMENTO DO EXPERIMENTO:
Para testar a hipótese acima, formulamos as hipóteses auxiliares: 1ª hipótese - A colestase influe sobre a nutrição, independentemente da administração ou não da vitamina C;
2ª hipótese - A vitamina C influe sobre a nutrição independentemente da presença ou não de colestase;
3ª hipótese - A vitamina C interfere nos efeitos da colestase sobre a nutrição.
III.1.1. VARIÁVEIS:
Para testar essas hipóteses foram consideradas as seguintes variáveis:
Variáveis independentes:
-Presença ou não de colestase obstrutiva (ligadura com secção do colédoco ou operação simulada).
-Administração ou não de vitamina C (ácido ascórbico ou veículo).
Variáveis dependentes:
* parâmetros da função logística ajustada aos pesos (α, e );
*ganho de peso observado de cada animal de cada grupo dos 21 aos 49 dias;
*velocidade de crescimento de cada animal de cada grupo em cada momento;
* aceleração do crescimento de cada animal de cada grupo em cada momento;
*constante de variação da aceleração do crescimento; *peso da carcaça;
*teor de água da carcaça; *teor de gordura da carcaça; *peso do cérebro;
*teor de água do cérebro; *teor de gordura do cérebro; *dosagem sérica de vitamina A; * dosagem sérica de vitamina E;
*dosagem sérica de colesterol total e frações; *dosagem sérica de triacilgliceróis.
III.2. GRUPOS EXPERIMENTAIS:
Medicina de Botucatu. No 21º dia de vida, foram selecionados os animais com peso entre 45 a 48g os quais foram alocados aleatoriamente a um dos 4 grupos de 10 animais, cada grupo sendo submetido, a um dos tratamentos apresentados no quadro 3:
Quadro 4: Grupos experimentais Grupos Operação
(21o dia)
Gavagem (diariamente)
Sacrifício (dias)
LA * L.R.D.B.C. veículo aquoso 49 LD * L.R.D.B.C. vitamina C 49
SA operação simulada veículo aquoso 49
SD operação simulada vitamina C 49 * L.R.D.B.C. - Ligadura e ressecção do ducto biliar comum.
III.2.1. DESCRIÇÃO DOS GRUPOS:
Grupo LA: ligadura e secção do colédoco no 21º dia de vida e
sacrifício no 49° dia de vida. Administração diária de água por gavagem, no volume de 1mg/g de peso do animal.
Grupo LD: ligadura e secção do colédoco no 21º dia de vida e
sacrifício no 49° dia de vida. Administração diária de vitamina C na quantidade de 1mg/g de peso do animal.
Grupo SD: operação simulada no 21º dia de vida e sacrifício no 49° dia de vida. Administração de solução aquosa de vitamina C, por gavagem, no mesmo volume que os grupos anteriores.
III.3. EXECUÇÃO DO EXPERIMENTO:
III.3.1. CUIDADO E MANUTENÇÃO DOS ANIMAIS:
O procedimento experimental foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentaçào Animal – CEEA - FM de Botucatu / UNESP, protocolo número 148, estando de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). Todos os cuidados com a manutenção dos animais, procedimentos anestésicos, cirurgia e sacrifício foram executado segundo as recomendações constantes no guia do
Canadian Council of Animal Care (1984) e no Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals National Research Council – USA (1996).
Os animais usados no experimento eram da raça Wistar, nascidos de fêmeas nulíparas, pesando de 180 a 220g, fornecidas pelo Biotério central da Faculdade de Medicina de Botucatu, Unesp, acasaladas no biotério do Laboratório Experimental de Pesquisa do Departamento de Pediatria. Os animais, desde o nascimento até o tratamento foram amamentados em grupos de 6, sendo cada par de ratos machos provenientes de uma mesma ninhada.
Medicina de Botucatu, em gaiolas individuais, com controle de temperatura (em torno de 22 a 23°C) e de luminosidade (ciclo claro / escuro de 12 horas). Foram desmamados, passaram a receber ração comercial Purina ® e água ad libitum a partir do dia da cirurgia.
III.3.2. ACASALAMENTO E DIAGNÓSTICO DE PRENHEZ:
Para o acasalamento, as ratas foram distribuídas duas a duas em gaiolas de polietileno, onde foi colocado um rato macho. Os animais permaneceram juntos durante toda noite. Na manhã subseqüente, os machos foram separados das fêmeas e realizada a coleta do material vaginal das ratas. Os fatores indicativos de prenhez foram à presença de espermatozóides nesse material e o diagnóstico da fase estral. Desta forma, este dia foi considerado como dia zero da gestação.
Estes procedimentos foram repetidos até que o número desejado de ratos fosse alcançado.
III.3.3. LIGADURA E RESSECÇÃO DO DUCTO BILIAR COMUM:
A ligadura e ressecção do ducto biliar comum (L.R.D.B.C.) foi realizada segundo a técnica descrita por Cameron e Oakley (1932) com algumas modificações:
∗ posicionamento dos animais em decúbito dorsal horizontal na mesa de cirurgia;
∗ tricotomia da parede abdominal anterior;
∗ incisão da pele na linha mediana, desde o apêndice xifóide até a cicatriz umbelical;
∗ exposição das camadas musculares e da linha alba;
∗ incisão da linha alba do mesmo tamanho da abertura da pele;
∗ abertura do peritônio com tesoura e exposição dos órgãos abdominais;
∗ rebatimento do bordo do fígado para cima e para trás;
∗ exposição do colédoco com abaixamento do duodeno;
∗ dissecção do colédoco desde abaixo da entrada do último ducto biliar até a sua porção distal, próxima ao duodeno;
∗ dupla ligadura do colédoco, sendo colocadas as ligaduras o mais proximal e mais distalmente possível;
∗ ressecção da porção do colédoco entre as duas ligaduras;
Figura 1: Procedimentos na operação
III.3.4. OPERAÇÃO SIMULADA:
III.3.5. OBSERVAÇÃO E MEDIDAS REALIZADAS APÓS A
OPERAÇÃO:
Os animais foram pesados diariamente desde o desmame até o dia do sacrifício, utilizou-se balança semi-analítica Mettler Toledo (modelo PB 3002, peso máximo = 3.100 g, peso mínimo = 0,5 g, sensibilidade de 0,1 g).
III.3.6. ADMINISTRAÇÃO DA VITAMINA C:
Os animais dos grupos LD e SD receberam diariamente dos 21 aos 48 dias de vida, por gavagem solução aquosa de vitamina C Roche®, na dosagem de 1mg de vitamina C por g de peso do animal e os grupos LA e SA receberam veículo aquoso em igual volume.
III.3.7. SACRIFÍCIO:
Figura 2: Execução do experimento. PROCE D IMENTO CIR Ú R GI CO E DESM A M E AC ASA L A M EN TO NA SC IM EN TO
0
21
49
DIAS
III.3.8. EXAMES BIOQUÍMICOS:
Após sacrifício foram realizados:
1) Dosagem de colesterol e frações e triacilgliceróis:
Na dosagem sérica de colesterol total e triacilgliceróis, foi utilizado o método enzimático colorimétrico. Na dosagem sérica de HDL colesterol, a técnica de determinação homogênia direta.
Os valores de VLDL colesterol foram obtidos dividindo os valores de triacilgliceróis por 5. Os valores de LDL colesterol subtraindo os valores de HDL mais VLDL dos valores do colesterol total.
2) Dosagem sérica de vitaminas A e E:
Para extração das vitaminas lipossolúveis foi utilizada a técnica de extração descrita por ARNAULD, 1991 modificada aumentando sua sensibilidade. A técnica está descrita abaixo:
∗ utilizou-se 0,25ml de soro ou plasma;
∗ acrescentou-se 0,25 ml de etanol (HPLC);
∗ agitou-se por 5 minutos;
∗ acrescentou-se 0,5 ml hexano (HPLC);
∗ agitou-se por 10 minutos;
∗ centrifugou-se por 4 minutos em micro centrífuga;
∗ retirou-se o sobrenadante (fase hexano);
∗ lavou-se 3 vezes com hexano (0,25 ml cada etapa);
∗ evaporado no SpeedVac por 40 minutos;
∗ ressuspendido com 0,25 ml da fase móvel;
∗ agitado no ultra-som por 24 minutos;
∗ injetado imediatamente no aparelho de HPLC.
liquid chromatography - HPLC), em aparelho da marca VARIAN. A fase móvel utilizada neste método é uma solução de 70% (v/v) de Acetonitrila, 20% (v/v) de diclorometano e 10% (v/v) de metanol. Foi utilizada a coluna C18 para HPLC da marca VARIAN especialmente designada para a separação de vitaminas. Seu diâmetro é de 4,6mm, seu comprimento de 25cm e o diâmetro de suas partículas é de 5 µm, O fluxo utilizado foi de 1,2 ml/minuto.
Foi elaborado um padrão interno para solução de etanol (HPLC) no qual foi utilizado 1 volume de α tocoferol solução 150 ml/l + 1 volume de palmitato 24,4 µm/l, ficando assim um de 75µm/l de α tocoferol e 12,2 µm/l de palmitato. Looping de 100 µm/l.
III.3.9. PESO FRESCO DO CÉREBRO E DA CARCAÇA:
Após o sacrifício foi pesado o cérebro em balança analítica Mettler (modelo H35; peso máximo = 160g). As carcaças foram pesadas em balança semi-analítica Mettller Toledo (modelo PB 3002, peso máximo = 3100g, peso mínimo = 0,5g, sensibilidade de 0,1g). Os pesos foram expressos em gramas.
III.3.10. TEOR DE ÁGUA NA CARCAÇA E NO CÉREBRO:
encontrada entre o peso fresco e peso seco, foi calculado, o conteúdo de água expresso em g/ 100g de peso fresco.
III.3.11. TEOR DE GORDURA NO CÉREBRO E NA CARCAÇA:
Após a secagem, a carcaça foi triturada em graal, e assim como o cérebro, embrulhada em papel de filtro a gordura foi extraída por éter etílico por um período de 12 horas, num aparelho de Soxhlet. O éter etílico foi evaporado em ar ambiente por 24 horas, secado em estufa a 100 ºC por 12 horas e pesado novamente. Com a diferença do peso calculou-se, em g/100g de peso fresco, o conteúdo de gordura da carcaça e do cérebro.
III.4. ANÁLISE DOS RESULTADOS:
Os cálculos foram executados utilizando os programas Microssoft Excel®, Sigma Stat versão 2.0®.
III.4.1. AJUSTE DOS PESOS À FUNÇÃO LOGÍSTICA:
calculado o momento de maior velocidade de crescimento e a constante de variação da aceleração (ver anexos).
Com os valores de pesos estimados e os parâmetros α e estimados, foram calculados os valores da primeira derivada da função logística para cada animal de cada grupo, dos 21 aos 49 dias, de 4 em 4 dias, segundo a fórmula:
df x
dx VC P P
( ) $
$ $.($ $)
= = −γ −
α α
Onde:
df x
dx VC
( )
= = Primeira derivada da função logística (velocidade de crescimento).
$
P= Peso estimado para cada um dos animais, em cada um dos momentos.
α, e = Parâmetros da função logística estimados para cada um dos animais, em cada um dos grupos.
Usando os valores estimados de pesos e os parâmetros α e γ estimados, foram calculados os valores da segunda derivada da função logística para cada animal, de cada grupo, em cada momento segundo a fórmula:
d f x
dx AC P
2
2 2
( ) $
$ .$ $
= = − γ +
d f x dx
2
2
( )
= A.C. = Segunda derivada da função logística (Aceleração do crescimento).
Por fim, usando os parâmetros α e γ estimados, foram calculados os valores da terceira derivada da função logística para cada animal segundo a fórmula:
d f x
dx CVA 3 3 2 ( ) $ $
= = − γ
α .
Onde:
d f x
dx CVA
3
3
( )
= = Terceira derivada da função logística (Constante de variação da aceleração de crescimento em dias-2).
O valor simétrico da CVA exprime a constante de desaceleração do processo (CD), então: CD= - C.V.
Foi também calculado o ponto de inflexão da curva logística, correspondente ao momento de maior crescimento dos animais utilizado para fins de comparação
γ β
− .
graficamente por computador, pelo programa Excel®, aos valores destas derivadas calculados a partir das médias dos pesos observados, de cada grupo em cada momento e dos parâmetros estimados para cada grupo.
Retas representativas da terceira derivada (é uma constante) foram ajustadas graficamente aos valores calculados a partir dos parâmetros estimados para cada grupo a partir da média dos pesos observados.
Figura 3 – Representação gráfica das curvas e retas da função logística
Peso Peso α α −β/γ −β/γ P P VC VC AC AC Idade Idade Idade Idade Idade Idade α/2 α/2 −β/γ −β/γ −β/γ −β/γ −γ −γ VC VC α.γ/4 α.γ/4 AC AC −γ −γ γ γ γ γ CVAC CVAC −2.(γ/α) −2.(γ/α) Peso Peso α/2 α/2 α/2 α/2 α α α α
Quadro 5– Esquematização da figura 3:
Idade Peso Velocidade de
crescimento
Aceleração de
crescimento
Constante
C.V.A.C
-
∞
0 0 + γfunção da
idade γ
β − 2 α − 4 2α
0 α
γ
III.4.2. ESTATÍSTICA DESCRITIVA:
Foram calculadas medidas de tendência central (médias e medianas) e medidas de dispersão (desvio padrão, coeficiente de variação, amplitude de variação, valores máximo e mínimo) das variáveis dependentes estudadas para cada grupo experimental:
∗ parâmetros da função logística ajustada aos pesos (α, e );
∗ velocidade de crescimento de cada animal de cada grupo de 4 em 4 dias;
∗ aceleração do crescimento de cada animal de cada grupo de 4 em 4 dias;
∗ constante de variação da aceleração do crescimento;
∗ ganho de peso estimado de cada animal de cada grupo dos 21 aos 49 dias;
∗ peso final dos animais;
∗ peso da carcaça;
∗ teor de água por 100g da carcaça;
∗ teor de gordura por 100g da carcaça;
∗ peso do cérebro;
∗ teor de água por 100g do cérebro;
∗ teor de gordura por 100g do cérebro;
∗ dosagem sérica de vitamina A;
∗ dosagem sérica de vitamina E;
∗ dosagem sérica de colesterol total e frações;
III.4.3. ESTATÍSTICA COMPARATIVA:
1) Os resultados de cada variável para cada grupo experimental, foram submetidos à verificação da normalidade e da igualdade de variância das amostras .
2) Caso essas condições fossem satisfeitas, foi aplicada análise de variância para dois fatores, sendo o primeiro fator, a administração ou não de vitamina C, com dois níveis: 1) administração de vitamina C; 2) administração do veículo sem vitamina C , o segundo fator, presença de colestase ou não, com dois níveis 1) ligadura do colédoco; 2) operação simulada. Esse teste analisou os efeitos associados a cada fator sobre as variáveis dependentes estudadas, independentemente do efeito do outro, bem como a interação dos dois fatores.
3) Havendo interação significativa entre os fatores (p≤ 0,05), foram realizadas comparações múltiplas pareadas pelo método de Student-Newman-Keuls (S.N.K), identificando-se os grupos que apresentassem diferenças significativas entre si (p do α≤ 0,05).
IV. DISCUSSÃO DOS MATERIAIS E MÉTODOS:
IV.1. ANIMAL UTILIZADO:
Sabe-se que o rato tem sido tradicionalmente usado no estudo experimental da desnutrição. DONALDSON (1924) organizou extensa revisão do assunto com o objetivo de obter um modelo experimental em que a relação entre nutriente e crescimento fosse a mais perfeita possível. O autor buscava uma curva de crescimento que fosse expressão pura das características e potencialidades de crescimento. Este trabalho tinha por objetivo mais o estudo das características endócrinas de crescimento do que estudar os efeitos de diferentes dietas. Posteriormente DUNN et all. (1947) ampliaram esta revisão e discutiram, estudando o crescimento de diferentes linhagens, quais os requerimentos mínimos para um crescimento ótimo. Dentro desta perspectiva aprofundaram-se os estudos de diferentes linhagens de ratos, entre elas, a Yale, a Long-Evans e a Wistar (DUNN et all, 1947).
Desde esta época os ratos, e principalmente os da linhagem Wistar, têm ocupado lugar de destaque em experimentos, particularmente estudos nutricionais. Seguindo esta tendência utilizamos ratos dessa linhagem.
IV.2. TÉCNICA DA LIGADURA:
significativa da arquitetura hepática, áreas de necrose periportais, infiltração de polimorfonucleares e intensa proliferação ductal. As alterações bioquímicas também foram mais pronunciadas. Neste trabalho, procuramos proceder à ligadura e transecção do colédoco o mais proximalmente do hilo hepático possível. Além do cuidado em manter a mesma distância a partir do hilo hepático em todos os animais operados, procurou-se não realizar a ligadura acidental de vasos sanguíneos próximos ao hilo hepático embora, como referido acima, tal ocorrência possa não agravar a lesão hepática.
IV.3. GANHO DE PESO DOS ANIMAIS:
O ganho de peso tem sido empregado na avaliação do estado nutricional de animais submetidos ao uso de dietas.
Em nosso modelo experimental foi realizado um cálculo para a determinação do ganho de peso dos 21º ao 49º dias de vida para cada grupo experimental.
IV.4. AJUSTE DOS PESOS À FUNÇÃO LOGÍSTICA:
Por esta razão ela foi por nós adotada para descrever o ganho de peso dos ratos no período dos 21 aos 49 dias de vida e comparar o comportamento de ratos submetidos à colestase ou á operação simulada e a administração ou não de vitamina C.
Figura 4 –CURVA LOGÍSTICA
f(x)
α
Ponto de inflexão
x
A curva logística é definida pela seguinte função (função logística) (Hoffmann & Vieira, 1977):
f x P
e x
( )= = ( . )
+ − +
α
β γ
1 (1) Onde:
f(x), na nossa aplicação, representa o peso em gramas (P), x a
abscissas e a reta de ordenada constante é igual a α. Este parâmetro, que é a distância entre as duas assíntotas, é denominado “nível de saturação”. Biologicamente corresponde ao potencial de crescimento, de um indivíduo ou de um grupo de indivíduos, dado pelas características genéticas e pela disposição ambiental podendo ser influenciado por doenças crônicas.
β é um parâmetro de posição, isto é, mudando-se o valor de β enquanto os outros parâmetros são mantidos fixos, a curva se desloca horizontalmente.
Figura 5 – Ponto de inflexão da curva logística.
f(x)
α
Ponto de inflexão
x
f(x) α
Ponto de inflexão
x
enquanto no rato, conforme nossas observações, ocorre em torno dos 42 dias de vida.
O ponto de inflexão da função (1) tem como abscissa x= − β
γ .
Portanto, essa abscissa é diretamente proporcional e simétrica a
β e inversamente proporcional a γ. Ou seja, quando a capacidade de crescimento é maior, o ponto de inflexão é atingido mais cedo. Nesse ponto, a derivada da função (1) é máxima, ou seja, a velocidade de crescimento atinge nesse momento, o valor máximo, tendendo a decrescer em seguida.
A primeira derivada de (1) em função do peso representa a velocidade de crescimento (V.C.) e pode ser expressa por:
df x
dx VC P P
( )
(
= = γ − )
α α (2)
Portanto, a relação entre os parâmetros α e γ é a constante de proporcionalidade entre V.C. e o peso em cada momento e a distância entre o peso neste momento e o limite de crescimento.
A diferença entre esse peso e o peso máximo atingível (nível de saturação), que é dado por α, é dado por α-P.
Assim, V.C. é proporcional ao peso atingido e ao peso ainda a ser ganho.
V C. .= −γ P + .P
α 2 γ (3)
Figura 6– Curva representativa da velocidade de crescimento.
V.C.
α γ.
4
α/2 P
O vértice da parábola corresponde ao ponto de velocidade máxima α γ.
4
⎛
⎝⎜ ⎞⎠⎟ e ocorre quando P é igual a
α
2 .
A segunda derivada de (1) expressa a aceleração do crescimento (A.C.) e escrita como função de P, é:
d f x
dx AC P
2
2 2
( )
= = − γ +
α γ (4)
Figura 7 – Reta representativa da aceleração do crescimento.
AC
γ
α/2 α P
-γ
α γ αγ
α 2
2
= =
tg
A A.C. é igual ao parâmetro γ quando P vale 0 e t= -∞ . A A.C. é igual a -γ quando P=α e t +∞. Quando P=α
2 (peso quando a velocidade máxima é atingida, correspondendo ao ponto de inflexão da curva logística) a A.C. atinge zero e continua diminuindo até -γ, cujo valor tende a atingir quando P tende α. Portanto, o parâmetro γ representa o módulo da A.C. nos extremos da curva logística ou nos pontos em que a parábola, vista acima, corta o eixo das abscissas.
A terceira derivada da equação (1) é a constante de variação da aceleração do crescimento (C.V.A.C.). Pode-se observar que esta constante corresponde à tangente do ângulo formado pela reta da figura 8 com o eixo das abscissas.
A velocidade de crescimento e a aceleração do crescimento variam em função da idade seguindo curvas mais complexas, respectivamente uma curva semelhante à curva de Gauss e uma curva sigmóide tendendo a +γ em -
C.V.A.C =−2γ
α
É representada por uma reta paralela ao eixo dos P cuja ordenada vale −2γ
α .
Figura 8 – Reta representativa da constante de variação da aceleração do crescimento.
CVA
P
−2γ
α
V. RESULTADOS:
Tabelas e gráficos 1,2 e 3 - apresentam as análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores dos parâmetros α, e da função logística.
Tabelas e gráficos 4 à 11 - apresentam as análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de velocidade de crescimento.
Tabelas e gráficos 12 à 19 - apresentam as análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de aceleração de crescimento.
Tabela e gráfico 20 - apresentam as análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de constante de variação de crescimento.
Tabela e gráfico 21 - apresentam as análises estatísticas descritiva e comparativa dos valores ganho de peso dos 21 aos 49 dias.
Tabela e gráfico 22 - apresentam as análises estatísticas descritivas e comparativas do peso final dos animais.
Tabelas e gráficos 23 à 25 - apresentam as análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de peso fresco, teor de água e teor de gordura na carcaça.
Tabelas e gráficos 26 à 28 - apresentam as análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de peso fresco, teor de água e teor de gordura no cérebro.
Tabela e gráfico 30 - apresentam as análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de níveis séricos de vitamina E.
Tabela e gráfico 31 - apresentam as análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de níveis séricos de colesterol total.
Tabela e gráfico 32 - apresentam as análises estatísticas descritivas e comparativas dos valores de níveis séricos de LDL-colesterol.
Tabela e gráficos 33 - apresentam as análises estatísticas descritiva e comparativa dos valores de níveis séricos de HDL-colesterol.
Tabela e gráfico 34 - apresentam as análises estatísticas descritivas e comparativa dos valores de níveis séricos de VLDL-colesterol.
Tabela e gráfico 35 - apresentam as análises estatísticas descritivas e comparativa dos valores de níveis séricos de triacilgliceróis.
Tabela 1: Valores do parâmetro α, em gramas. Análise estatística descritiva (média, mediana, D.P., C.V. e valores máximo e mínimo).
SA LA SD LD
Média 151,119 103,78 170,95 134,287 Mediana 162,769 110,206 165,755 133,248 DP 25,844 41,132 16,588 38,488 CV (%) 17,102 39,634 9,703 28,661 Máximo 178,624 171,624 208,586 189,677 Mínimo 97,344 36,788 152,743 75,816
n 10 10 10 10
S.A. - Operação simulada com veículo; L.A. - Ligadura do colédoco com veículo; S.D. - Simulado com vitamina C; L.D. - Ligadura com vitamina C;
D.P. - Desvio padrão; C.V. - Coeficiente de variação.
ANÁLISE DE VARIÂNCIA COM DOIS FATORES.
A diferença entre as médias dos dois níveis do fator OPERAÇÃO (Ligado e Simulado) é maior do que seria esperado pelo acaso, (p≤ 0,001), independente do efeito do fator TRATAMENTO (Veículo e Vitamina C).
A diferença entre as médias dos diferentes dois níveis de TRATAMENTO (Veículo e Vitamina C) é maior do que seria esperado pelo acaso (p= 0,018), independentemente do efeito dos diferentes fatores de OPERAÇÃO (Ligado e Simulado).
1)Representação gráfica dos grupos experimentais:
Parâ
me
tr
o
α
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
(SA+ SD) > (LA+ LD) p< 0,05 – significante. (SA + LA) < (SD + LD)p< 0,05 – significante.
Portanto, houve efeito da colestase sobre o parâmetro α.(a colestase diminuiu os valores do parâmetro α) e houve interferência da vitamina C sobre os valores do parâmetro α. (avitamina C aumentou os valores do parâmetro
α, tanto na presença quanto na ausência da colestase).
Valores do parâmetro α da curva logística.
SA LA SD LD
Parâmetro
α
Tabela 2: Valores do parâmetro da curva logística, em dias.Análise estatística descritiva (média, mediana, D.P., C.V. e valores máximo e mínimo).
SA LA SD LD
Média -7,843 -9,273 -6,99 -7,83 Mediana -7,365 -8,213 -6,974 -7,502
DP 0,374 0,915 0,107 0,406
CV (%) -4,769 -9,867 -1,531 -5,185 Máximo -6,317 -6,131 -6,493 -6,886 Mínimo -10,247 -15,442 -7,507 -11,257
n 10 10 10 10
S.A. - Operação simulada com veículo; L.A. - Ligadura do colédoco com veículo; S.D. - Simulado com vitamina C; L.D. - Ligadura com vitamina C;
D.P. - Desvio padrão; C.V. - coeficiente de variação.
ANÁLISE DE VARIÂNCIA COM DOIS FATORES (resultados substituídos
pelo Rank dos seus valores).
A diferença entre as médias dos diferentes dois níveis do fator OPERAÇÃO (Ligado e Simulado) é maior do que seria esperado pelo acaso, (p= 0,020), independente do efeito do fator TRATAMENTO (Veículo e Vitamina C).
A diferença entre as médias dos dois níveis de TRATAMENTO (Veículo e Vitamina C) é maior do que seria esperado pelo acaso (p= 0,022), independentemente do efeito dos diferentes fatores de OPERAÇÃO (Ligado e Simulado).
2) Representação gráfica dos grupos experimentais:
SA LA SD LD
Pa
râ
me
tr
o
β
-18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2
(SA+ SD) > (LA+ LD) -p< 0,05 – significante. (SA + LA) < (SD + LD)- p< 0,05 – significante.
Portanto, houve efeito da colestase sobre o parâmetro .(a colestase diminuiu os valores do parâmetro ) e houve interferência da vitamina C sobre os valores do parâmetro (a vitamina C aumentou os valores do parâmetro
, tanto na presença quanto na ausência da colestase).
Valores do parâmetro da curva logística.
SA LA SD LD
Parâmetro
(d
