UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
ASPECTOS CITOLÓGICOS E MICROBIOLÓGICOS NA MASTITE
EM OVELHAS DA RAÇA BERGAMÁCIA EM LACTAÇÃO
MELISSA HARTMAN
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
ASPECTOS CITOLÓGICOS E MICROBIOLÓGICOS NA MASTITE
EM OVELHAS DA RAÇA BERGAMÁCIA EM LACTAÇÃO
MELISSA HARTMAN
Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Mestre.
Orientador: Prof.Dr. Paulo Francisco Domingues
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Hartman, Melissa.
Aspectos citológicos e microbiológicos na mastite ovina, durante toda a lactação em ovelhas da raça bergamácia / Melissa Hartman. – Botucatu : 59p., 2007
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2007.
Orientador: Paulo Francisco Domingues Co-orientador: Hélio Langoni
Assunto CAPES: 50501062
1. Ovino - Doenças 2. Mastite
CDD 636.30896
ii
Nome do Autor: Melissa Hartman
Título: ASPECTOS CITOLÓGICOS E MICROBIOLÓGICOS NA MASTITE EM OVELHAS DA RAÇA BERGAMÁCIA EM LACTAÇÃO
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof.Dr. Paulo Francisco Domingues Orientador
Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ – UNESP - Botucatu
Prof.Dr. Márcio Garcia Ribeiro Membro Titular
Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ – UNESP - Botucatu
ProfªDrª Alice Maria Melville Paiva Della Libera Membro Titular
Departamento de Clínica Médica FMVZ – USP – São Paulo
DEDICATÓRIA
Dedico o presente trabalho
Aos meus pais
Sonia Mendes de Almeida e
Cláudio Fernando Hartman
Ao meu irmão
Caio Augusto Hartman
Por todo amor, motivação e compreensão.
E em especial,
Ao meu avô
Benedito Mendes de Almeida (in memorian)
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus.
E deixo meus sentimentos de gratidão,
Ao Prof. Dr. Paulo Francisco Domingues, meu orientador, pela oportunidade e confiança depositadas em mim.
Ao Prof. Titular Hélio Langoni, meu co-orientador, pela motivação e dedicação imprescindíveis.
Aos demais Docentes do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública, e que me acompanharam em disciplinas:
Prof. Márcio Garcia Ribeiro, pela significativa participação até o presente momento;
Prof. Antonio Carlos Paes, pela integridade e exclusivo coração de ouro;
Prof. José Paes de Almeida Nogueira Pinto, pelo carinho e acolhimento às minhas idas à Inspeção;
Profª. Jane Megid, pela atenção e incentivo ao ingressar no mestrado;
Aos Funcionários do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública:
Benedito Donizeti Menozzi, pela colaboração no processamento de amostras e lavagem e preparo de material, utilizados no presente estudo.
Aos amigos e colegas de faculdade:
Tatiana Salerno, por mais uma, dentre muitas jornadas ao meu lado;
Juliana Machado, pelas risadas e laços de amizade;
Ana Paula Flamínio, pelos conselhos e significante presença;
Rodrigo Costa da Silva, pela prontidão de sempre e conversas intermináveis;
Roberto Ximenes Bolsanello, pela parceria e humor durante o mestrado;
Felipe de Freitas Guimarães, pela amizade e carinho firmados;
Luiz Carlos Teixeira, pela admiração, carinho e respeito que tenho, e pelos cafés que não tomei, mas que deixaram saudades.
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Distribuição do número de amostras de leite (N) e porcentagem (%) de acordo com a reação do California
Mastitis Test – CMT, em ovelhas da raça Bergamácia.
Botucatu, 2007... 38 Tabela 2 - Distribuição dos microrganismos, em número absoluto e
respectiva porcentagem, encontrados no cultivo bacteriológico de amostras de leite de acordo com a reação
do California Mastitis Test – CMT, em ovelhas da raça
Bergamácia. Botucatu, 2007... 41 Tabela 3 - Contagem bacteriana total (CBT) expressa em unidades
formadoras de colônias (ufc), de acordo com valores mínimos e máximos encontrados, mediana, média e desvio padrão, em amostras de leite positivas ao CMT, provenientes de ovelhas da raça Bergamácia, durante oito
semanas de lactação. Botucatu, 2007... 42 Tabela 4 - Contagem de células somáticas avaliadas de acordo com os
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Distribuição dos microrganismos (%) isolados em cultura pura e em associação das amostras de leite ovino positivas ao CMT em pelo menos em uma colheita, durante o período de estudo. Botucatu, 2007... 39 Figura 2 - Distribuição dos microrganismos (%) isolados em
amostras de leite de ovelhas da raça Bergamácia, de acordo com a dinâmica durante oito semanas de lactação. Botucatu, 2007... 40 Figura 3 - Perfil de sensibilidade bacteriana frente a diferentes
antimicrobianos em microrganismos isolados do leite de ovelhas da raça Bergamácia. Botucatu, 2007... 43 Figura 4 - Contagem de células somáticas (CCS) eletrônica, de
acordo com a média encontrada em amostras de leite provenientes de úberes sadios e inflamados nos escores 1+, 2+ e 3+, de ovelhas da raça Bergamácia, durante oito
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
CBT - Contagem bacteriana total
CCS - Contagem de células somáticas
CMT - California Mastitis Test
mL - Mililitro
ufc - Unidades formadoras de colônias
x
SUMÁRIO
Página
1 INTRODUÇÃO... 14
2 REVISÃO DA LITERATURA... 17
2.1 Mastite... 20
2.1.1 Definição e Complexidade Etiológica... 20
2.1.2 Aspectos Epidemiológicos e Importância Econômica... 21
2.1.3 Patogenia e Imunidade da Glândula Mamária... 23
2.1.4. Diagnóstico... 24
2.1.5. Parâmetros de Qualidade do Leite... 27
3 OBJETIVOS... 29
3.1 Geral... 30
3.2 Específicos... 30
4 MATERIAL E MÉTODOS... 31
4.1 Animais e Propriedade... 32
4.2 Colheita das amostras de leite para análises microbiológicas e contagem de células somáticas... 32
4.2.1 Triagem das amostras de leite para análises microbiológicas... 33
4.2.1.1 California Mastitis Test (CMT)... 33
4.3 Processamento das amostras de leite... 33
4.3.1 Procedimentos microbiológicos... 34
4.3.1.1 Cultivo microbiológico... 34
4.3.1.2 Contagem bacteriana total (CBT)... 34
4.3.2 Contagem de células somáticas (CCS)... 34
4.3.3 Teste de sensibilidade microbiana... 35
4.4 Análise Estatística... 35
5 RESULTADOS... 37
5.1 Ocorrência da mastite ovina no rebanho... 38
5.2.1 Cultivo microbiano... 39
5.2.2 Contagem bacteriana total... 42
5.3 Perfil de sensibilidade microbiana... 43
5.4 Contagem de células somáticas... 44
6 DISCUSSÃO... 46
6.1 Prevalência e aspectos microbiológicos da mastite ovina... 47
6.2 Perfil de sensibilidade microbiana... 49
6.3 Contagem de células somáticas... 50
7 CONCLUSÕES... 51
8 BIBLIOGRAFIA... 53
9 TRABALHO CIENTÍFICO... 01
xii
HARTMAN, M. Aspectos citológicos e microbiológicos na mastite em ovelhas da raça bergamácia em lactação. Botucatu, 2007. 59p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
RESUMO
O presente estudo objetivou determinar a prevalência da mastite ovina, avaliar o perfil microbiológico, perfil de sensibilidade microbiana e estabelecer parâmetros de interpretação diagnóstica mediante os resultados do California Mastitis Test (CMT), análises microbiológicas, contagem bacteriana total (CBT) e contagem de células somáticas (CCS). Estudaram-se 37 ovelhas da raça Bergamácia, durante oito semanas de lactação, avaliando-se 482 amostras de leite. Procedeu-se ao CMT para determinação de mastite subclínica e grau de inflamação glandular mamário. Encaminharam-se amostras de leite reagentes ao CMT ao cultivo microbiano e CBT. A CCS foi avaliada em aparelho eletrônico, em amostras de leite provenientes de úberes sadios e inflamados. Os patógenos isolados foram submetidos ao teste de sensibilidade microbiana para verificação do perfil de sensibilidade. A prevalência de infecção intramamária foi de 11,70%. Observaram-se ao cultivo bacteriológico: Staphylococcus spp. (61,11%), Streptococcus spp. (16,66%), Bacillus spp. (13,89%), Corynebacterium spp.
(5,56%) e Serratia spp. (2,78%). Dos antimicrobianos testados, ceftiofur
apresentou 80,77% de efetividade, seguido de enrofloxacina (69,23%), gentamicina (69,23%), oxacilina (61,54%) e florfenicol (57,70%). À CBT, constatou-se desenvolvimento bacteriano em amostras de leite procedentes de úberes com mastite, entre 20 e 3.030.000 colônias/mL de leite. A CCS apresentou média de 36.285 células/mL no leite de animais sadios. Nas amostras positivas ao CMT observou-se média de 267.579 células/mL na ausência de microrganismos e 489.400 células/mL em meios mamários com isolamento bacteriano. Infere-se a associação entre positividade ao CMT, presença microbiana e aumento da CCS, ressaltando a importância destes procedimentos no diagnóstico da mastite ovina.
HARTMAN, M. Cytological and microbiological aspects in mastitis in Bergamácia ewes on lactation. Botucatu, 2007. 59p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
ABSTRACT
The present study aimed to determine the prevalence of mastitis in the ewes, evaluate the microbiological profile, microbial sensitivity, and to establish the diagnostic interpretation parameters through of the results of the California Mastitis Test (CMT), microbiological analysis, total bacterial count (TBC), and somatic cell count (SCC). Thirty-seven Bergamacia ewes were studied, during eight weeks of lactation, with a total of 482 milk samples. CMT was realized to the determination of the subclinical mastitis and the mammary gland inflammation degree. CMT reacting milk samples was directed to the microbial culture and TBC. SCC was evaluated in an electronic machine, in milk samples from healthy and inflamed udders. The isolated pathogens were submitted to microbial sensitivity test for the verification of the susceptible profile. The prevalence of the mammary infection was 11.70%. To the bacteriological culture was found Staphylococcus spp.
(61.11%), Streptococcus spp. (16.66%), Bacillus spp. (13.89%), Corynebacterium
spp. (5.56%) and Serratia spp. (2.78%). Of the antimicrobials tested, ceftiofur
presented 80.77% of effectiveness, followed for enrofloxacin (69.23%), gentamicin (69.23%), oxacilin (61.54%) and florphenicol (57.70%). To TBC, bacterial development in milk samples from mammary glands with mastitis was evidenced, with 20 to 3,030,000 colonies per milliliter of milk. CCS presented average of 36,285 cells/mL of milk of healthy animals. In positive samples to CMT was observed an average of 267,579 cells/mL in the absence of microorganisms and 489,400 cells/mL in mammary conditions with isolation of bacteria. Thus, we can infer the association among the positivity to CMT, the presence of microorganisms and the increase of SCC, standing out the importance of these analysis in the diagnosis of ovine mastitis.
1. INTRODUÇÃO
A mastite é definida como processo inflamatório da glândula mamária, caracterizada por alterações físico-químicas e microbiológicas do leite, e patológicas do tecido glandular mamário. Apresenta complexidade etiológica, ocasionada principalmente por bactérias que resultam no desenvolvimento de infecção intramamária (LANGONI e DOMINGUES, 1998). Pode ser classificada, de acordo com sua origem ou habitat dos microrganismos e forma de transmissão, em ambiental e contagiosa, e conforme a intensidade da resposta inflamatória, em clínica ou subclínica. A mastite subclínica tem sido considerada a forma mais preocupante, pois não manifesta sinais evidentes da doença, mas resulta em perdas significativas na composição do leite e produção leiteira. Representa fundamental importância em animais destinados à produção de leite e é a afecção que mais onera a pecuária leiteira. As perdas econômicas são decorrentes à diminuição na produção de leite, custos com mão de obra, honorários profissionais, gastos com medicamentos, descarte precoce e morte dos animais, diminuição na qualidade do produto final e rendimento industrial para a fabricação de derivados (LANGONI, 1999). As alterações na composição do leite mastítico quanto aos teores de gordura, proteína e lactose interferem no rendimento de subprodutos, o que pode ser constatado no processo de fabricação de queijos (LUCHEIS et al., 2005). Devem-se considerar além dos aspectos relacionados à sanidade do animal, a significativa importância no que se refere à saúde pública, pois o leite pode veicular microrganismos patogênicos e, ainda, resíduos de antimicrobianos (SILVA, 1999), uma vez que representa constituinte indispensável de proteínas, vitaminas e sais minerais na dieta do homem (LANGONI, 1999).
16
métodos diagnósticos à mastite ovina subclínica através de provas diagnósticas como California Mastitis Test (CMT), cultivo bacteriológico,
18
2. REVISÃO DE LITERATURA
A criação ovina tem aumentado significativamente, tanto numericamente referente aos rebanhos, e número de cabeças, bem como à exploração leiteira, para o mercado de derivados lácteos, como os queijos. Os países europeus, asiáticos e norte-africanos são tradicionais na produção e consumo de queijos de leite de ovelha. A produção leiteira, estabelecida industrialmente, tem se concentrado nos países mais desenvolvidos do Mediterrâneo, e crescido na Austrália e em Israel. Atualmente, o rebanho ovino mundial destinado à produção leiteira compreende mais de 100 milhões de cabeças, com uma produção estimada de 7,8 milhões de litros de leite ao ano (FAO, 2001).
A exploração de leite de ovelhas representa aspecto econômico importante na cadeia produtiva desta espécie animal, e está diretamente relacionada à produção e consumo de queijos, iogurtes, sorvetes e, uma pequena proporção, na forma de leite fluido. O leite ovino apresenta o dobro no rendimento na produção de queijo, e o iogurte é aproximadamente 50% mais nutritivo se comparados ao leite de vaca. Assim, o leite ovino tem sido cada vez mais consumido por crianças com intolerância à lactose do leite de vaca. Sendo assim, com o aumento na demanda de insumos derivados do leite de ovelhas, deve-se ressaltar a importância das enfermidades da glândula mamária, principalmente em rebanhos que apresentam maior aptidão leiteira (FAO, 2001).
morte de cordeiros por inanição, além do descarte precoce das ovelhas e, ocasionalmente, morte dos animais acometidos (DOMINGUES e LEITE, 2005).
Devido ao número limitado de estudos, ainda são escassos os relatos na literatura de casos de mastites na espécie ovina. De acordo com Blood e Radostits (1991), estudo realizado no Reino Unido referiu a mastite como responsável por 8,4% das mortes de ovelhas e mais de 34% das mortes de cordeiros. A incidência da mastite ovina no Brasil é pouco conhecida (LADEIRA, 1998). O primeiro relato foi descrito por Fernandes e Cardoso, em 1985, no Rio Grande do Sul, no qual surto da enfermidade acometeu rebanho de 80 ovelhas da raça Hampshire Down, das quais 10% apresentaram mastite clínica, com 8,75% de fibrose da glândula mamária, agalaxia e isolamento de
Staphylococcus aureus em todos os casos da doença. Outro estudo realizado
no Rio Grande do Sul constatou mastite gangrenosa em rebanho de 400 ovinos pertencentes às raças Texel, Ideal, Corriedale, Romney Marsh e Merino, com morbidade entre 10 e 20% e letalidade de 50% (SCHILD et al., 1994).
20
2.1. Mastite
2.1.1. Definição e Complexidade Etiológica
A mastite é a inflamação da glândula mamária conseqüente a inúmeros processos, dentre os quais, traumáticos, alérgicos, psicológicos, metabólicos, fisiológicos e, principalmente, infecciosos, caracterizada por alterações químicas, físicas e bacteriológicas do leite, e patológicas do tecido glandular mamário (LANGONI e DOMINGUES, 1998).
As bactérias são os microrganismos mais comumente encontrados e identificados nos casos de mastite ovina, embora fungos, leveduras e algas sejam relatados com menor freqüência. Os principais agentes etiológicos compreendem: S. aureus, Mannheimia (Pasteurella) haemolytica,
Streptococcus spp., Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Arcanobacterium pyogenes, Staphylococcus coagulase negativos,
Corynebacterium spp., Clostridium spp. (LAS HERAS et al., 1999). Estudos
relatam S. aureus e M. haemolytica, isoladamente ou associados a outros
microrganismos, em 80% dos casos de mastite aguda (JONES, 1991).
Dentre os agentes causadores da infecção intramamária em ovinos, os estafilococos são descritos como a principal causa da enfermidade, seguido do isolamento de microrganismos pertencentes ao gênero Bacillus,
enterobactérias e corinebactérias. S. aureus pode ser diagnosticado em
aproximadamente 43% dos casos e A. pyogenes entre 12 e 23% (SILVA,
1999).
No Brasil e em outros países, Staphylococcus coagulase negativos e
Corynebacterium spp. são responsáveis pela maioria dos casos de mastite
subclínica (LAS HERAS et al., 1999).
No Rio Grande do Sul e Santa Catarina foram examinadas 3128 ovelhas pertencentes a 22 propriedades, verificando-se prevalência média de 5% de infecção subclínica em pelo menos dos meios mamários. De 645 ovelhas, 14,1% foram reagentes ao CMT, das quais 4,49% apresentaram isolamento bacteriano, constatando-se a presença dos microrganismos Staphylococcus
M. haemolytica (3,7%), Corynebacterium spp. (3,7%), Micrococcus spp. (3,7%)
e 7,41% não identificados (VAZ, 1996).
Ribeiro et al. (1999) analisaram 321 amostras de leite de ovelhas, em que 76% se apresentaram negativas ao cultivo microbiológico e 24%, com isolamento de Staphylococcus spp. (12,93%), S. aureus (3,27%), Corynebacterium spp. (2,65%), Micrococcus spp. (2,18%), Streptococcus spp.
(1,4%), Enterobacteriaceas (0,95%) e Candida spp. (0,62%).
Nas mastites clínicas agudas M. haemolytica tem sido referida como
principal agente etiológico, perfazendo até 60% dos casos de infecção mamária ovina (SHOOP e MYERS, 1984).
2.1.2. Aspectos Epidemiológicos e Importância Econômica
A mastite pode ser classificada conforme a origem dos microrganismos e vias de transmissão, em ambiental ou contagiosa. A mastite ambiental ocorre principalmente entre - ordenhas, embora possa ocorrer durante a lactação, sendo ocasionada por microrganismos ubíquos, dentre os quais, os coliformes, presentes nas fezes, e Streptococcus uberis, presente no ambiente e corpo do
animal. Já a mastite contagiosa se caracteriza pela ocorrência durante o processo de ordenha, a partir das mãos do ordenhador, acopladores de ordenhadeira e fômites contaminados, sendo comumente relatados como agentes causadores S. aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Corynebacterium bovis,entre outros (AMARAL, 1999).
22
alterações evidentes do úbere e da secreção láctea, embora apresente efeitos significativos na composição do leite e queda na produção leiteira (BLOOD e RADOSTITS, 1991).
As perdas econômicas referentes à produção leiteira são estimadas entre 22,8% e 27,3% nas ovelhas de primeira cria e 37,3% nas ovelhas de segunda cria. As infecções unilaterais representam 11,5% na perda da produção total, enquanto as infecções bilaterais, até 58,3% do total de produção do leite (SILVA, 1999). Fthenakis e Jones (1990) observaram que ovelhas com mastite subclínica resultaram decréscimo de 37% na produção de leite, além dos cordeiros apresentarem menor ganho de peso diário comparados aos amamentados por ovelhas sadias.
Dentre os fatores predisponentes associados à mastite ovina são citados surtos de ectima contagioso, traumatismos e lesões no úbere e na pele do teto, conformação e tamanho do úbere, alta densidade do rebanho, idade avançada, alto nível de produção leiteira, precárias condições higiênico-sanitárias. Podem-se considerar, ainda, como fatores de risco para as mastites, o número de partos, estágio da lactação, manejo inadequado de ordenha (manual ou mecânica) com destaque à mastite subclínica por Staphylococcus epidermidis
na ordenha manual e fatores de resistência genética (LANGONI, 2004).
LUCHEIS et al. (2005) ao avaliarem o perfil microbiológico de amostras de leite de ovelhas da raça Bergamácia, estabeleceram a freqüência da mastite ovina na presença de cordeiros lactentes e em ovelhas com cordeiros desmamados. Na presença de cordeiros em amamentação, 20,25% das amostras estudadas se revelaram positivas, com o isolamento de
Staphylococcus coagulase negativo (71,87%), Staphylococcus coagulase
positivo (14,06%), Bacillus spp. (10,94%) e Streptococcus spp. (3,13%). Das
amostras provenientes de ovelhas que não estavam amamentando, 12,9% resultaram no isolamento de microrganismos como Staphylococcus coagulase
positivo (5,40%), Staphylococcus coagulase negativo (78,4%), Streptococcus
spp. (8,10%), Corynebacterium spp. (2,70%) e Micrococcus spp. (2,70%).
De acordo com Vaz (1996), são consideradas duas situações distintas. Naquela em que a ovelha está com o cordeiro ao pé, a presença de M. haemolytica na microbiota da boca e faringe do cordeiro viabiliza a transmissão
mantido afastado da ovelha, destaca-se maior importância do S. aureus, uma
vez que a M. haemolytica não está sendo carreada pelos cordeiros. A mastite
por M. haemolytica é mais comumente encontrada em ovelhas lactantes com
cordeiros de dois a três meses de idade (BLOOD e RADOSTITS, 1991).
A mastite em ovinos acomete principalmente raças de aptidão leiteira (DOMINGUES e LEITE, 2005), com maior incidência entre a terceira e quarta semana após o parto (VAZ, 1996), fato possivelmente relacionado com o pico de produção de leite. Apesar de ocorrer mais comumente no início e final da lactação, pode ocorrer em qualquer fase da produção leiteira (DOMINGUES e LEITE, 2005).
2.1.3. Patogenia e Imunidade da Glândula Mamária
As mastites clínicas ou subclínicas, decorrentes do estabelecimento de microrganismos na glândula mamária, resultam no desencadeamento do processo inflamatório considerando-se seqüencialmente as seguintes etapas: penetração, instalação e multiplicação microbiana. A principal porta de entrada dos patógenos é o orifício do canal do teto por via ascendente. A via descendente ou hematógena é menos comum. Entretanto, é referida nos casos de mastites intersticiais crônicas, observadas nas enfermidades como brucelose, tuberculose e listeriose (COSTA, 2003).
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Microrganismos como S. aureus, um dos principais agentes causadores
de mastite, instalam-se no parênquima mamário por meio de adesinas que se aderem à fibronectina. As enterobactérias, além de promoverem lesão dos alvéolos, possuem lipopolissacárideos (LPS) na parede celular, endotoxina que determina geralmente mastite aguda ou hiper-aguda e pode ocasionar choque endotóxico com conseqüente óbito. Bactérias como Nocardia spp. e
Arcanobacterium pyogenes resultam na formação de abcessos e granulomas
que dificultam a ação dos antimicrobianos, constituindo-se mastites de difícil recuperação (COSTA, 2003).
Havendo lesão das células alveolares, ocorre ativação da cascata de ácido aracdônico - fosfolípede de membrana - resultando na formação dos mediadores do processo inflamatório - os leucotrienos e prostaglandinas - com ação tanto benéfica quanto deletéria, sendo necessário, às vezes, o uso de anti-inflamatório (COSTA, 2003).
2.1.4. Diagnóstico
A mastite clínica aguda ou crônica pode ser evidenciada pelo exame físico da glândula mamária, pela detecção dos sinais primordiais da inflamação, como aumento de temperatura, volume, rubor e dor à palpação, formação de nódulos e abscessos, e fibrose do tecido glandular mamário. A inflamação geralmente é unilateral, e o primeiro sintoma observado é a claudicação. Na progressão para o quadro gangrenoso, o que é comum em ovelhas, o úbere se apresenta edematoso e com coloração cianótica ou azulada devido à necrose. O curso da doença é rápido e pode resultar na morte da ovelha em 4 ou 5 horas ou em 48 a 72 horas, devido ao processo toxêmico que se estabelece, ou ainda, após um período clínico de até cinco dias (BLOOD e RADOSTITS, 1991).
Dentre os testes indiretos, indicadores da ocorrência da mastite subclínica no rebanho, que avaliam a presença de células somáticas no leite, destacam-se o Califórnia Mastitis Test (CMT), o Wisconsin Mastitis Test (WMT), Teste de
Whiteside e, como teste direto, a Contagem de Células Somáticas (CCS). O CMT, desenvolvido por Schalm e Noorlander (1957), é considerado um dos métodos mais simples e eficaz de diagnóstico, e indica a presença de células somáticas pela viscosidade e alteração de cor do indicador utilizado no teste. É um teste prático, pode ser feito a campo, sendo eficaz no monitoramento da mastite no rebanho. O WMT é um teste resultante do aprimoramento do CMT, em que a contagem é expressa em tubo graduado que tem por finalidade eliminar a subjetividade de interpretação dos resultados do CMT. O CMT utilizado para detecção de infecções intramamárias em ovelhas é menos seguro que em vacas, e depende da prevalência e dos microrganismos presentes no rebanho (KEISLER et al., 1992), pois o teste foi idealizado para o leite bovino, e difere na interpretação, como verificado em cabras, em que as células epiteliais, em maior quantidade no leite de pequenos ruminantes, reagem ao teste, aumentando o número de reações falso-positivas (BARCELLOS et al., 1987). A CCS pode ser procedida tanto em aparelhos eletrônicos, como o Somacount, Coulter, Fossomatic (SCHMIDT, 1975), quanto por exame microscópico, seguindo-se a técnica padronizada por Prescott e Breed (1910). A CCS microscópica tem a vantagem de se conhecer de fato a resposta celular das amostras examinadas, sendo possível a diferenciação das células de defesa, e, por vezes, visualização do microrganismo envolvido.
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contagem de células somáticas é considerado como a principal característica para a determinação do diagnóstico de mastite subclínica (PERSONN et al., 1992).
A literatura ainda é escassa principalmente no que se refere aos limites de normalidade da CCS para o leite de ovelhas, e relata valores divergentes entre autores. A comparação da contagem celular eletrônica e microscópica em lâminas do leite ovino, relacionando seus resultados com os outros exames, objetiva a padronização da CCS eletrônica, com possível estabelecimento de parâmetros diagnósticos para a mastite subclínica ovina. Keisler et al. (1992), estudaram amostras de leite de ovelhas e verificaram significativa relação da CCS obtida em aparelho eletrônico em comparação à CCS observada em microscopia direta (P<0,01). Em contrapartida, comparando-se ao CMT houve variação em 30 a 34% na CCS. Gomes et al. (2006) procederam à contagem comparativa de células somáticas em aparelho eletrônico Somacount 300
(Bentley Instruments®) e microscopia direta em 200 amostras de leite de
ovelhas da raça Lacaune, no Rio Grande do Sul, e relataram médias de 110.000 células/ mL e 160.000 células/ mL, respectivamente, não observando diferenças estatísticas entre os dois métodos utilizados. Constatou-se predominância de leucócitos mononucleares nas amostras de leite provenientes de úberes sadios.
Alguns estudos têm mostrado níveis de células somáticas em amostras de leite provenientes do úbere sadio de ovelhas de até 1.600.000 células/ mL de leite. Outras pesquisas têm relatado CCS em amostras de leite de glândulas mamárias sadias equivalentes a 250.000 células/mL (MENZIES, 2000; PENGOV, 2001). El-Masannat (1987) pela contagem eletrônica em aparelho como o Somacount, estabeleceu como limite de normalidade 1.000.000 células/ mL. Em estudo realizado utilizando-se citometria de fluxo e técnicas de fluorescência foram encontradas contagens entre 3.000 células/ mL e 100.000.000 células/ mL de leite, estabelecendo-se valores médios para glândulas mamárias normais de 150.000 células/ mL, e nos casos de infecção subclínica, de 14.000.000 células/ mL de leite (MCFARLAND et al., 2000).
são relatados ainda valores similares aos obtidos com amostras de leite de vacas (0,2x106 a 0,3x106 células/ mL) (BELTRAN DE HEREDIA e ITURRITZA, 1988; DE LA CRUZ et al., 1994; ZARZYCKI et al., 1983).
Outros fatores podem influenciar no aumento do número de células somáticas, como: estágio de lactação (com níveis mais elevados ao final da lactação); número de lactações, porém de menor significado; o período do dia, constatando-se que durante o periodo da manhã há um aumento de 7 a 22%, comparando-se ao final do dia; congelamento e tempo de armazenamento, das amostras. O ideal é o exame imediato das amostras de leite e a fresco, sem congelamento. A estocagem por mais de sete dias pode resultar em significativo decréscimo dos valores de CCS (14%) (MENZIES, 2000).
2.1.5. Parâmetros de Qualidade do Leite
Para determinação de parâmetros de qualidade higiênica do leite são consideradas, além da contagem de células somáticas, a contagem bacteriana total (CBT) e a presença de substâncias inibidoras do desenvolvimento bacteriano como resíduos de produtos químicos como, antimicrobianos, detergentes e desinfetantes, que devem estar ausentes incondicionalmente no leite destinado ao consumo humano (PIRISI et al., 2007).
A CBT se refere ao número de microrganismos aeróbios que se desenvolvem a temperatura de 30ºC, expresso em unidades formadoras de colônias (ufc) por mililitro de leite. A União Européia estabeleceu valores limites aceitos no leite cru de cabras e ovelhas abaixo de 500.000 ufc/ mL para o leite destinado a produtos consumidos crus e abaixo de 1.500.000 ufc/ mL para o leite destinado a produtos que recebem tratamento térmico. A falta de ordenhadeiras mecânicas e tanques de refrigeração, e o transporte do leite em condições inadequadas propiciam o aumento da contagem bacteriana (PIRISI et al., 2007).Considera-se mastite subclínica úberes que apresentam amostras de leite reagentes ao CMT e contagem bacteriana total acima de 200.000 ufc/ mL de leite (STEFANAKIS et al., 1995).
28
30
3. OBJETIVOS
3.1. Geral
Considerando-se a importância significativa da mastite referente à qualidade e produção do leite, e os aspectos de saúde pública e animal, com relevante impacto econômico, o presente estudo objetivou avaliar o perfil microbiológico da mastite ovina e respectivo diagnóstico através de análises citológicas e bacteriológicas em amostras de leite provenientes de ovelhas da raça Bergamácia.
3.2. Específicos
Os objetivos especificos do presente estudo foram:
1. Determinar a ocorrência da mastite ovina no rebanho durante o período de lactação, equivalente a oito semanas.
2. Verificar os microrganismos mais freqüentes nos casos de mastite ovina no rebanho durante as oitos semanas de lactação.
3. Avaliar o perfil de sensibilidade bacteriana frente a diferentes antimicrobianos estabelecidos.
32
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Animais e Propriedade
Foram estudadas ovelhas da raça Bergamácia, pertencentes à Fazenda Edgárdia, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP, Botucatu, SP, recém-paridas até o final da lactação, correspondendo ao período de oito semanas, ordenhadas mecanicamente, uma vez ao dia, com presença do cordeiro ao final da ordenha. Refere-se a uma propriedade de criação de ovelhas da raça Bergamácia, produtoras de leite, arraçoadas durante o processo de ordenha.
As ovelhas foram submetidas inicialmente ao teste da caneca de fundo escuro e Califórnia Mastitis Test (CMT) para diagnóstico da mastite subclínica.
Posteriormente, coletaram-se amostras de leite provenientes de úberes sadios e com mastite subclínica para contagem de células somáticas, procedida em aparelho eletrônico, Somacount 300 - Bentley. As amostras de leite reagentes ao CMT, considerando inclusive as que apresentaram fracamente positivas à reação, foram encaminhadas para análises microbiológicas para cultivo bacteriano e contagem bacteriana total, com posterior realização do teste de sensibilidade microbiana. As amostras que se apresentaram negativas ao CMT, mas que foram positivas em ao menos uma colheita anterior, foram coletadas nas semanas seguintes e submetidas a novo cultivo microbiológico. Ao final do estudo totalizaram 482 amostras de leite, provenientes de 37 ovelhas, as quais não estiveram presentes necessariamente em todas as colheitas realizadas.
4.2. Colheita das amostras de leite para análises microbiológicas e contagem de células somáticas
descartados os primeiros jatos de leite para eliminação de sujidades presentes no orifício e canal do teto, e resíduos do anti-séptico. Foram ordenhados aproximadamente 10 mL de leite em tubos de vidro estéreis para análises microbiológicas, mantidos sob refrigeração em caixas de isopor contendo gelo reciclável, e aproximadamente 20 mL de leite em frascos plásticos contendo conservante bronopol para contagem de células somáticas, encaminhados ao Núcleo de Pesquisa em Mastites (NUPEMAS), do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública – FMVZ – UNESP, Botucatu.
4.2.1. Triagem das amostras de leite para análises microbiológicas
4.2.1.1. Teste da caneca de fundo escuro e California Mastitis Test (CMT) Anteriormente à colheita das amostras foram realizados o Teste da Caneca de Fundo Escuro, que consiste na ejeção do leite sobre uma superfície escura para visualização de alterações macroscópicas na secreção láctea, e o CMT, através da ejeção de aproximadamente 2 mL de leite, após descarte dos primeiros jatos, em placa no formato raquete com receptáculos individuais para cada teto, adicionados 2 mL do reagente CMT, procedendo-se suaves movimentos circulares para subseqüente homogeneização e interpretação da reação segundo Schalm e Noorlander (1957). Os resultados foram classificados como negativos (-), fracamente positivos (+), positivos (2+) e fortemente positivos (3+), de acordo com a viscosidade e intensidade da coloração.
Todas as amostras de leite que constaram alterações detectáveis ao teste da caneca de fundo escuro e foram positivas ao CMT foram higienicamente coletadas e encaminhadas a análises microbiológicas.
4.3. Processamento das amostras de leite
34
4.3.1. Procedimentos microbiológicos
4.3.1.1. Cultivo microbiológico
Foram realizados cultivos de amostras de 0,1 mL de leite, semeando-se em Placas de Petri contendo os meios ágar-sangue ovino desfibrinado a 5% e ágar MacConkey. De forma usual, as placas permaneceram incubadas à temperatura de 37ºC, procedida leitura após 24, 48 e 72 horas, com observação do isolamento microbiano. Os microrganismos foram identificados de acordo com as características macroscópicas das colônias, morfo-tintoriais pela coloração de Gram e por prova bioquímica de acordo com Carter e Cole Júnior (1990).
4.3.1.2. Contagem bacteriana total (CBT)
A contagem bacteriana total foi realizada a partir da observação das unidades formadoras de colônias, procedida pelo método de diluições sucessivas, cultivando-se 0,1 mL das diluições 10-1, 10-2 e 10-3 em Placas de Petri, contendo 20 mL de meio de ágar cérebro-coração. Após a distribuição homogênea do inoculo por toda a superfície do meio com auxílio de Triângulo de Drigalsky, as placas permaneceram incubadas durante 24 horas para contagem macroscópica das colônias. Os resultados foram expressos multiplicando-se o número de colônias isoladas pelo fator de diluição da respectiva diluição considerada, e revertidos para o volume padrão de 1 mL (CARTER e COLE JÚNIOR, 1990).
4.3.2. Contagem de células somáticas (CCS)
A contagem de células somáticas foi determinada em amostras de leite compostas dos meios mamários, individual para cada ovelha, provenientes de glândulas mamárias sadias e com mastite subclínica, utilizando-se aparelho eletrônico1. Os resultados foram expressos em número de células, na potência 103, encontradas em um mililitro de leite.
4.3.3. Teste de sensibilidade microbiana
Os microrganismos de origem bacteriana isolados foram submetidos ao teste de sensibilidades microbiana – difusão com discos – de acordo com Bauer et al. (1966), utilizando as seguintes drogas, selecionadas conforme o espectro de ação e disponibilidade de uso durante o estudo: ampicilina (10 µg), oxacilina (1 µg), tetraciclina (30 µg), cefalotina (30 µg), amoxacilina (10 µg), neomicina (30 µg), enrofloxacina (5 µg), gentamicina (10 µg), florfenicol (30 µg). Pela utilização da técnica de difusão com discos em ágar Müller-Hinton, foi possível avaliar o perfil de sensibilidade microbiana, estabelecendo, assim, as drogas mais efetivas para casos de tratamento no rebanho estudado.
4.4. Análise estatística
O estudo da ocorrência e etiologia da mastite ovina e perfil de sensibilidade microbiana foi realizado considerando-se a estatística descritiva dos dados apresentados por meio de distribuição de freqüência (absoluta – número de casos, e percentual), representadas em tabelas ou figuras, e por medidas descritivas de posição e variabilidade quando a variável em consideração foi quantitativa (NORMAN e STREINER, 1994).
Para a avaliação dos dados de contagem de células somáticas foi utilizado o procedimento GLIMMIX do programa SAS (SAS, 2002) com base em análise de variância (ANOVA) em que médias foram consideradas significativas quando P≤ 0.05.
Utilizou-se o modelo experimental Yijk = µ +αi + βk + (αβ)ik +εijk onde: Yijk = valor de CCS obtido sobre influência ou não da presença de microrganismos k
e sobre influência ou não de mastite i, µ = media total, αi = valor adicional
determinado pela presença ou não de mastite i, βk = valor adicional
determinado pela influência ou não de microrganismos k, (αβ)ik = valor adicional da interação mastite i x microrganismo k e εijk = erro total do
36
38
5. RESULTADOS
5.1. Ocorrência da mastite ovina no rebanho
A ocorrência da mastite ovina no rebanho, avaliada de acordo com o grau de inflamação da glândula mamária, no período de lactação, correspondente a oito semanas, pode ser verificada na Tabela 1. Das 482 amostras de leite avaliadas durante todo estudo, procedentes de 37 ovelhas acompanhadas do início ao final da lactação, 21 (4,35%) apresentaram reação ao CMT, independente do grau de inflamação.
TABELA 1. Distribuição do número de amostras de leite (N) e porcentagem (%) de acordo com a reação do California Mastitis Test – CMT, em ovelhas da raça
Bergamácia. Botucatu, 2007.
REAÇÃO
CMT Amostras(N) % Amostras (N) %
D E
- 231 95,85 230 95,44
1+ 2 0,83 5 2,07
2+ 4 1,66 4 1,66
3+ 4 1,66 2 0,83
Total 241 100 241 100
5.2. Análises microbiológicas
5.2.1. Cultivo microbiano
Os microrganismos isolados foram: Staphylococcus spp. - 22 (61,11%), Streptococcus spp. - 6 (16,66%), Bacillus spp. - 5 (13,89%), Corynebacterium
spp. - 2 (5,56%) e Serratia spp. - 1 (2,78%), como pode ser observado na
Figura 1.
Bacillus spp. 13,89%
Corynebacterium spp.
5,56%
Serratia spp. 2,78%
Staphylococcus spp. 61,11% Streptococcus
spp. 16,66%
40
De acordo com as oito semanas avaliadas, os microrganismos apresentaram a seguinte distribuição (Figura 2).
0,0 0,0 62,5 58,3 100,0 66,6 100,0 100,0 50,0 66,6 25,0 8,3
0,0 0,0 0,0 0,0
50,0
33,0
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
0,0 0,0 12,5 25,0 0,0 33,3 0,0 0,0 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
1 2 3 4 5 6 7 8
Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Corynebacterium spp. Bacillus spp. Serratia spp. % Semanas
FIGURA 2. Distribuição dos microrganismos (%) isolados em amostras de leite de ovelhas da raça Bergamácia, de acordo com a dinâmica durante oito semanas de lactação. Botucatu, 2007.
Staphylococcus spp. foi o microrganismo encontrado com maior
frequência, e esteve presente em seis das oito colheitas realizadas. Na primeira e segunda semana houve acometimento de Streptococcus spp. e Corynebacterium spp. , sendo que Streptococcus spp. permaneceu presente
por mais duas semanas consecutivas. Bacillus spp. foi diagnosticado em três
colheitas e Serratia spp., apenas em uma semana.
Pôde-se ainda correlacionar o grau de inflamação da glândula mamária aos microrganismos isolados nas amostras de leite. As amostras positivas ao CMT foram coletadas e avaliadas nas semanas seguintes, podendo-se verificar que amostras negativas ao CMT revelaram-se positivas microbiologicamente (Tabela 2). Os patógenos encontrados ao longo do estudo foram
e Serratia spp., isolados ou em associação. Das 482 amostras de leite,
constatou-se a presença de microrganismos em 56 (11,7%) amostras.
TABELA 2. Distribuição dos microrganismos, em número absoluto e respectiva porcentagem, encontrados no cultivo bacteriológico de amostras de leite de acordo com a reação do California Mastitis Test – CMT, em ovelhas da raça
Bergamácia. Botucatu, 2007.
LEITE REAÇÃO
CMT D E
Microrganismos - 1+ 2+ 3+ - 1+ 2+ 3+ Ausente 207
(89,61%) 1 (50%) 2 (50%) 3 (75%) 208 (90,43%) 3 (60%) 1 (25%) 1 (50%) Staphylococcus
spp. (6,06%) 14 (50%)1 (25%)1 (25%)1 (5,65%) 13 (20%) 1 (50%) 2 (50%)1 Streptococcus
spp.
4 (1,73%)
0 0 0 4 (1,74%)
0 0 0
Streptococcus ssp. e Corynebacterium
spp.
1
(0,43%) 0 1 (25%) 0 2 (0,87%) 0 0 0
Staphylococcus spp. e Bacillus spp.
4
(1,73%) 0 0 0 2 (0,87%) (20%) 1 (25%) 1 0
Staphylococcus spp., Bacillus spp. e
Serratia spp.
1
(0,43%) 0 0 0 1 (0,43%) 0 0 0
TOTAL 231 2 4 4 230 5 4 2
42
5.2.2. Contagem bacteriana total
Pela contagem bacteriana total (CBT) pôde-se determinar o número de unidades formadoras de colônias por mililitro de leite, conforme apresentado na Tabela 3.
TABELA 3. Contagem bacteriana total (CBT) expressa em unidades formadoras de colônias (ufc), de acordo com valores mínimos e máximos encontrados, mediana, média e desvio padrão, em amostras de leite positivas ao CMT, provenientes de ovelhas da raça Bergamácia, durante oito semanas de lactação. Botucatu, 2007.
SEMANA
CBT
(ufc/mL) 1 2 3 4 5 6 7 8
Valor
mínimo 40,0 20,0 230,0 210,0 9.500,0 70,0 7.500,0 30,0 Mediana 100,0 20,0 3.500,0 605,0 9.500,0 485,0 1.518.750,0 350,0
Valor máximo
110,0 20,0 72.000,0 1.000,0 9.500,0 900,0 3.030.000,0 52.000,0
Média 83,3 20,0 35.743,4 605,0 9.500,0 485,0 1.518.750,0 13.182,5 Desvio
padrão 37,8 0 35.890,8 558,6 0 586,9 2.137.231,0 25.879,6
5.3. Perfil de sensibilidade microbiana
As amostras de leite que apresentaram desenvolvimento microbiano foram submetidas ao teste de sensibilidade microbiana para determinação do perfil de sensibilidade das bactérias frente aos antimicrobianos testados. No decorrer do estudo constatou-se que frente aos microrganismos isolados, em geral, o ceftiofur foi o antimicrobiano mais efetivo, com 80,77% de sensibilidade bacteriana, seguido de enrofloxacina (69,23%), gentamicina (69,23%), oxacilina (61,54%) e florfenicol (57,70%) (Figura 3). Os microrganismos apresentaram maior resistência à amoxacilina (84,61%), penicilina G (80,77%) e neomicina (61,54%). À tetraciclina, apenas 50% das bactérias foram sensíveis.
Staphylococcus spp. apresentaram maior sensibilidade ao ceftiofur, igualmente
à gentamicina, com 73,34% de susceptibilidade bacteriana.
15,39 19,23 38,86 50,00 57,70 61,54 69,23 69,23 80,77
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
Amoxacilina
Penicilina G
Neomicina
Tetraciclina
Florfenicol
Oxacilina
Gentamicina
Enrofloxacina
Ceftiofur
%
44
5.4. Contagem de células somáticas
Através da contagem de células somáticas (CCS), pode-se determinar o número de células presente em 1 mililitro de leite. Pode-se ainda correlacionar o número de células encontrado por mililitro de leite aos resultados do CMT, de acordo com o grau de inflamação da glândula mamária, conforme se pode observar na Figura 4.
36,285 70,600 288,714 653,285 0 100 200 300 400 500 600 700
- 1+ 2+ 3+
CCS
(
10
3 c
élu la s/ m L ) CMT
FIGURA 4. Contagem de células somáticas (CCS) eletrônica, de acordo com a média encontrada em amostras de leite provenientes de úberes sadios e inflamados nos escores 1+, 2+ e 3+, de ovelhas da raça Bergamácia, durante oito semanas de lactação. Botucatu, 2007.
Pôde-se verificar, de acordo com o grau de inflamação, representado pelos escores 1+, 2+ e 3+, uma média equivalente a 70.600 células/ mL, 288.714 células/ mL e 653.285 células/ mL, respectivamente.
Pode-se ainda avaliar a CCS de acordo com os resultados obtidos ao CMT, independentemente do grau de inflamação da glândula mamária, e do cultivo microbiológico, conforme ilustra a Tabela 4.
TABELA 4. Contagem de células somáticas avaliadas de acordo com os resultados do CMT, independente do grau de inflamação da glândula mamária, e cultivo microbiológico, em amostras de leite de ovelhas da raça Bergamácia. Botucatu, 2007.
CCS Microrganismo
Ausente Presente
CMT Positivo 267.579A*b** 489.400Bb
Negativo 36.285Aa 77.760Ba
* Letras maiúsculas diferentes na mesma linha indicam diferença estatística significativa na contagem de células somáticas em relação à presença ou não de microrganismos.
** Letras minúsculas diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística significativa na contagem de células somáticas em relação à CMT positivo ou negativo.
46
6. DISCUSSÃO
6.1. Ocorrência e aspectos microbiológicos da mastite ovina
No presente estudo, das 482 amostras de leite avaliadas, 21 foram reagentes ao CMT, independente do grau de inflamação, correspondendo a 4,35% de casos de mastite subclínica no rebanho. Amostras de leite que apresentaram positividade ao CMT em pelo menos uma colheita foram coletadas e avaliadas (mesmas ovelhas) nas semanas seguintes, e mesmo resultando no CMT negativo foram encaminhadas ao cultivo bacteriológico, constatando-se a presença de microrganismos em 28 amostras (11,7%).
Verificou-se que o microrganismo mais comumente encontrado foi a bactéria pertencente ao gênero Staphylococcus. Este achado concorda com a
maioria dos estudos de mastite na espécie ovina conduzidos no Brasil nos quais o gênero Staphylococcus também foi o mais freqüente na infecção
intramamária ovina (RIBEIRO et al., 1999; LANGONI et al., 2004, LUCHEIS et al., 2005,DOMINGUES et al., 2006,HERNANDES e LUCHEIS, 2007).
Hernandes e Lucheis (2007) relataram o isolamento de bactérias pertencentes ao gênero Staphylococcus em 31,4% das amostras de leite
analisadas em estudo sobre monitoramento microbiológico da mastite ovina na região de Bauru. Domingues et al. (2006) avaliaram o perfil microbiológico de amostras de leite provenientes de ovelhas da raça Santa Inês e constataram a presença de Staphylococcus spp. em 53,1%, seguido de Streptococcus spp.,
correspondendo a 19,1%.
Pôde-se identificar também, durante o estudo, o acometimento da glândula mamária pelos microrganismos Streptococcus spp., Bacillus spp., Corynebacterium spp. e Serratia spp., em cultura pura ou em associação.
48
Streptococcus spp. foi o segundo microrganismo mais comumente
encontrado e tem sido relatado com freqüência na literatura, como nos trabalhos de Langoni et al. (2004); Lucheis et al. (2005); Domingues et al. (2006). A prevalência de microrganismos considerados contagiosos, observados com maior freqüência no rebanho estudado, também foi relatada por Ribeiro et al. (1999), em pesquisa realizada na região de Botucatu, SP.
A prevalência de Staphylococcus spp., com maior isolamento ao final do
estudo, fato observado na sétima semana de lactação, bem como a presença significativa de Streptococcus spp., e outros microrganismos contagiosos, no
presente estudo, possivelmente está relacionada à característica contagiosa destes patógenos associada ao processo de ordenha. O uso de equipamentos de ordenha ou mesmo mãos do ordenhador contaminados durante a manipulação dos tetos possibilita que os patógenos sejam veiculados de um animal para o outro durante a realização de ordenha.
Embora as ovelhas mantivessem contato com seus cordeiros após a ordenha, ao longo do acompanhamento dos animais não houve isolamento de
M. haemolytica, fato igualmente observado por Lucheis et al. (2005).
Contrariamente, Vaz (1996) relatou a presença do microrganismo em 3,7% das amostras de leite ovino. A literatura relata que a presença de M. haemolytica é
mais comum em ovelhas que se encontram no segundo e terceiro meses de lactação (BLOOD e RADOSTITS, 1991), e o presente estudo abrangeu um período equivalente a dois meses de lactação, o que pode explanar o não isolamento do microrganismo.
Lucheis et al. (2005) a partir da análise microbiológica de leite de ovelhas da raça Bergamácia, na presença de cordeiros em lactação, constataram isolamento microbiano em 20,25% das amostras, com o isolamento de 71,87% de Staphylococcus coagulase negativos, 14,06% de Staphylococcus coagulase
positivos, 10,94% de Bacillus spp. e 3,13% de Streptococcus spp..
Pela contagem bacteriana total, observou-se que o número máximo de unidades formadoras de colônias foi de 3.030.000 ufc/ mL, em caso de amostra de leite com isolamento de Staphylococcus spp., na sétima semana de estudo.
estabelecidos pela União Européia para leite destinado a produtos de consumo crus (até 500.000 ufc/ mL) e para produtos que recebem tratamento térmico previamente ao consumo (até 1.500.000 ufc/ mL). Sendo assim, a prevalência de baixas contagens nas amostras de leite analisadas denota boas condições de qualidade no rebanho estudado, uma vez que este leite se enquadra nos parâmetros de qualidade estipulados pela União Européia (PIRISI et al., 2007).
6.2. Perfil de sensibilidade microbiana
No Brasil há poucos estudos investigando a sensibilidade antimicrobiana
in vitro a partir de isolamentos de microrganismos em amostras de leite de
ovelhas com mastite (DOMINGUES et al., 2006).
No presente estudo, o ceftiofur foi o antimicrobiano mais efetivo frente à maioria dos patógenos isolados, com 80,77% de sensibilidade bacteriana, seguido de gentamicina (69,23%), enrofloxacina (69,23%), oxacilina (61,54%) e florfenicol (57,70%). Os microrganismos apresentaram maior resistência à amoxacilina (84,61%), penicilina G (80,77%) e neomicina (61,54%). Para a tetraciclina, constatou-se 50% de sensibilidade microbiana. Referente aos
Staphylococcus spp., microrganismo que foi isolado com maior freqüência,
verificou-se maior sensibilidade ao ceftiofur e à gentamicina, com 73,34% de susceptibilidade bacteriana para cada antimicrobiano.
A resistência bacteriana frente a determinados antimicrobianos se deve, provavelmente, à seleção promovida devido ao uso contínuo e/ ou indevido dos antimicrobianos, resultando, assim, na resistência de algumas linhagens. Conforme a efetividade apresentada, ao decorrer do estudo, os antimicrobianos ceftiofur, enrofloxacina, gentamicina, oxacilina e florfenicol podem ser eleitos na escolha da terapia de animais com infecções intramamárias.
Domingues et al. (2006), estudando a etiologia e sensibilidade bacteriana na mastite subclínica em ovelhas da raça Santa Inês observaram que para os microrganismos Staphylococcus spp., Corynebacterium spp. e Streptococcus
50
Na Grécia, Fthenakis (1998) isolou Staphylococcus spp. em amostras de
leite ovino, e verificou 100% de sensibilidade do microrganismo frente à cefoperazona, cefuroxima, cloxacilina, enrofloxacina e meticilina, e 59%, referente à gentamicina.
6.3. Contagem de células somáticas
Pela contagem de células somáticas (CCS) no leite pôde-se determinar o número de células em um mililitro de leite. No presente estudo, pôde-se observar valores entre 1.000 e 3.368.000 células/ mL. Amostras de leite provenientes de glândulas mamárias sadias revelaram valores entre 1.000 e 816.000 células/ mL, com média correspondente a 36.285 células/ mL. Amostras de leite reagentes ao CMT, independente do grau de inflamação, revelaram valores entre 2.000 e 3.368.000 células/ mL, com médias de 267.579 células/ mL, na ausência de microrganismos e 489.400 células/ mL nas condições de infecção intramamária, ou seja, quando houve o isolamento de pelo menos um microrganismo. Das amostras de leite positivas microbiologicamente, apenas uma (4%) relatou CCS acima de 1x106 células/ mL, com reação de 3+ ao CMT.
Lafi (2006) verificou que dentre as amostras negativas ao cultivo microbiológico, 91% apresentaram contagem de células somáticas inferiores a 1.000.000 células/ mL e 80%, com reações 2 + ao CMT. Das amostras com desenvolvimento microbiano, apenas 9% apresentaram contagem de células somáticas inferior a 1.000.000 células/ mL, e nenhuma, com reação inferior a 3 + ao CMT.
52
7. CONCLUSÕES
Pôde-se concluir no presente estudo:
A ocorrência da mastite de origem infecciosa no rebanho ovino estudado foi de 11,7%, ressaltando-se a importância de assegurar medidas higiênico-profiláticas para a obtenção de um produto de qualidade, sob o ponto de vista microbiológico;
Os microrganismos mais comumente encontrados nas amostras de leite examinadas foram Staphylococcus spp. seguidamente de Streptococcus spp., Bacillus spp., Corynebacterium spp. e Serratia spp, havendo maior ocorrência
de mastite de origem contagiosa, provavelmente atribuída ao uso de ordenhadeira no rebanho estudado;
A contagem bacteriana total (CBT) mostrou valores dentro dos parâmetros de qualidade estabelecidos pela União Européia em 94,5% das amostras analisadas, denotando boas condições de qualidade no rebanho estudado que certamente refletem na baixa CBT;
Os antimicrobianos que apresentaram melhor eficácia frente aos microrganismos isolados foram ceftiofur, enrofloxacina, gentamicina, oxacilina e florfenicol, sugerindo que os mesmos podem ser utilizados como escolha na terapia de animais com infecções intramamárias;
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