4 MATERIAL E MÉTODOS
5.2.2 Contagem bacteriana total
Pela contagem bacteriana total (CBT) pôde-se determinar o número de unidades formadoras de colônias por mililitro de leite, conforme apresentado na Tabela 3.
TABELA 3. Contagem bacteriana total (CBT) expressa em unidades formadoras de colônias (ufc), de acordo com valores mínimos e máximos encontrados, mediana, média e desvio padrão, em amostras de leite positivas ao CMT, provenientes de ovelhas da raça Bergamácia, durante oito semanas de lactação. Botucatu, 2007. SEMANA CBT (ufc/mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 Valor mínimo 40,0 20,0 230,0 210,0 9.500,0 70,0 7.500,0 30,0 Mediana 100,0 20,0 3.500,0 605,0 9.500,0 485,0 1.518.750,0 350,0 Valor máximo 110,0 20,0 72.000,0 1.000,0 9.500,0 900,0 3.030.000,0 52.000,0 Média 83,3 20,0 35.743,4 605,0 9.500,0 485,0 1.518.750,0 13.182,5 Desvio padrão 37,8 0 35.890,8 558,6 0 586,9 2.137.231,0 25.879,6
Ao decorrer das oito semanas, a CBT revelou valores mínimo de 20 ufc/ mL e máximo de 3.030.000 ufc/ mL de leite. Na primeira semana houve três isolamentos bacterianos referindo contagens de 40 ufc/ mL, 100 ufc/ mL e 110 ufc/ mL. Na segunda e quinta semanas houve apenas um isolamento correspondendo a 20 ufc/ mL e 9.500 ufc/ mL, respectivamente. Na terceira semana, constatou-se isolamento em três placas com 230 ufc/ mL, 35.000 ufc/ mL e 72.000 ufc/ mL. Nas quarta e sétima semanas fez-se a contagem, respectivamente, de 210 e 1.000 ufc/ mL e 7.500 e 3.030.000 ufc/ mL. Na oitava semana foi observado isolamento em quatro placas, com 30 ufc/ mL, 100 ufc/ mL, 600 ufc/ mL e 52.000 ufc/ mL cada.
5.3. Perfil de sensibilidade microbiana
As amostras de leite que apresentaram desenvolvimento microbiano foram submetidas ao teste de sensibilidade microbiana para determinação do perfil de sensibilidade das bactérias frente aos antimicrobianos testados. No decorrer do estudo constatou-se que frente aos microrganismos isolados, em geral, o ceftiofur foi o antimicrobiano mais efetivo, com 80,77% de sensibilidade bacteriana, seguido de enrofloxacina (69,23%), gentamicina (69,23%), oxacilina (61,54%) e florfenicol (57,70%) (Figura 3). Os microrganismos apresentaram maior resistência à amoxacilina (84,61%), penicilina G (80,77%) e neomicina (61,54%). À tetraciclina, apenas 50% das bactérias foram sensíveis.
Staphylococcus spp. apresentaram maior sensibilidade ao ceftiofur, igualmente
à gentamicina, com 73,34% de susceptibilidade bacteriana.
15,39 19,23 38,86 50,00 57,70 61,54 69,23 69,23 80,77
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
Amoxacilina
Penicilina G
Neomicina
Tetraciclina
Florfenicol
Oxacilina
Gentamicina
Enrofloxacina
Ceftiofur
%
FIGURA 3. Perfil de sensibilidade bacteriana frente a diferentes antimicrobianos em microrganismos isolados do leite de ovelhas da raça Bergamácia. Botucatu, 2007.
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5.4. Contagem de células somáticas
Através da contagem de células somáticas (CCS), pode-se determinar o número de células presente em 1 mililitro de leite. Pode-se ainda correlacionar o número de células encontrado por mililitro de leite aos resultados do CMT, de acordo com o grau de inflamação da glândula mamária, conforme se pode observar na Figura 4. 36,285 70,600 288,714 653,285 0 100 200 300 400 500 600 700 - 1+ 2+ 3+ CCS ( 10 3 c élu la s/ m L ) CMT
FIGURA 4. Contagem de células somáticas (CCS) eletrônica, de acordo com a média encontrada em amostras de leite provenientes de úberes sadios e inflamados nos escores 1+, 2+ e 3+, de ovelhas da raça Bergamácia, durante oito semanas de lactação. Botucatu, 2007.
Pôde-se verificar, de acordo com o grau de inflamação, representado pelos escores 1+, 2+ e 3+, uma média equivalente a 70.600 células/ mL, 288.714 células/ mL e 653.285 células/ mL, respectivamente.
Das amostras de leite positivas ao cultivo microbiológico, apenas uma (4%) mostrou CCS acima de 1x106 células/ mL, com escore 3+ ao CMT. As demais amostras que revelaram isolamento bacteriano exibiram contagem média de 139.500 células/ mL de leite.
Pode-se ainda avaliar a CCS de acordo com os resultados obtidos ao CMT, independentemente do grau de inflamação da glândula mamária, e do cultivo microbiológico, conforme ilustra a Tabela 4.
TABELA 4. Contagem de células somáticas avaliadas de acordo com os resultados do CMT, independente do grau de inflamação da glândula mamária, e cultivo microbiológico, em amostras de leite de ovelhas da raça Bergamácia. Botucatu, 2007. CCS Microrganismo Ausente Presente CMT Positivo 267.579A*b** 489.400Bb Negativo 36.285Aa 77.760Ba
* Letras maiúsculas diferentes na mesma linha indicam diferença estatística significativa na contagem de células somáticas em relação à presença ou não de microrganismos.
** Letras minúsculas diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística significativa na contagem de células somáticas em relação à CMT positivo ou negativo.
Amostras de leite provenientes de úberes sadios relataram média de 36.285 células/ mL, enquanto amostras positivas ao CMT e microbiológico apresentaram média de 489.400 células/ mL, observando-se correlação entre CMT, microbiológico e CCS.
46
6. DISCUSSÃO
6.1. Ocorrência e aspectos microbiológicos da mastite ovina
No presente estudo, das 482 amostras de leite avaliadas, 21 foram reagentes ao CMT, independente do grau de inflamação, correspondendo a 4,35% de casos de mastite subclínica no rebanho. Amostras de leite que apresentaram positividade ao CMT em pelo menos uma colheita foram coletadas e avaliadas (mesmas ovelhas) nas semanas seguintes, e mesmo resultando no CMT negativo foram encaminhadas ao cultivo bacteriológico, constatando-se a presença de microrganismos em 28 amostras (11,7%).
Verificou-se que o microrganismo mais comumente encontrado foi a bactéria pertencente ao gênero Staphylococcus. Este achado concorda com a maioria dos estudos de mastite na espécie ovina conduzidos no Brasil nos quais o gênero Staphylococcus também foi o mais freqüente na infecção intramamária ovina (RIBEIRO et al., 1999; LANGONI et al., 2004, LUCHEIS et al., 2005,DOMINGUES et al., 2006,HERNANDES e LUCHEIS, 2007).
Hernandes e Lucheis (2007) relataram o isolamento de bactérias pertencentes ao gênero Staphylococcus em 31,4% das amostras de leite analisadas em estudo sobre monitoramento microbiológico da mastite ovina na região de Bauru. Domingues et al. (2006) avaliaram o perfil microbiológico de amostras de leite provenientes de ovelhas da raça Santa Inês e constataram a presença de Staphylococcus spp. em 53,1%, seguido de Streptococcus spp., correspondendo a 19,1%.
Pôde-se identificar também, durante o estudo, o acometimento da glândula mamária pelos microrganismos Streptococcus spp., Bacillus spp.,
Corynebacterium spp. e Serratia spp., em cultura pura ou em associação.
Verificou-se isolamento microbiano em amostras de leite negativas ao CMT, sugestivo de que os ovinos possam ter atuados como reservatórios destas bactérias, e desta forma, não foi constatado positividade das amostras frente ao teste.
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Streptococcus spp. foi o segundo microrganismo mais comumente encontrado e tem sido relatado com freqüência na literatura, como nos trabalhos de Langoni et al. (2004); Lucheis et al. (2005); Domingues et al. (2006). A prevalência de microrganismos considerados contagiosos, observados com maior freqüência no rebanho estudado, também foi relatada por Ribeiro et al. (1999), em pesquisa realizada na região de Botucatu, SP.
A prevalência de Staphylococcus spp., com maior isolamento ao final do estudo, fato observado na sétima semana de lactação, bem como a presença significativa de Streptococcus spp., e outros microrganismos contagiosos, no presente estudo, possivelmente está relacionada à característica contagiosa destes patógenos associada ao processo de ordenha. O uso de equipamentos de ordenha ou mesmo mãos do ordenhador contaminados durante a manipulação dos tetos possibilita que os patógenos sejam veiculados de um animal para o outro durante a realização de ordenha.
Embora as ovelhas mantivessem contato com seus cordeiros após a ordenha, ao longo do acompanhamento dos animais não houve isolamento de
M. haemolytica, fato igualmente observado por Lucheis et al. (2005).
Contrariamente, Vaz (1996) relatou a presença do microrganismo em 3,7% das amostras de leite ovino. A literatura relata que a presença de M. haemolytica é mais comum em ovelhas que se encontram no segundo e terceiro meses de lactação (BLOOD e RADOSTITS, 1991), e o presente estudo abrangeu um período equivalente a dois meses de lactação, o que pode explanar o não isolamento do microrganismo.
Lucheis et al. (2005) a partir da análise microbiológica de leite de ovelhas da raça Bergamácia, na presença de cordeiros em lactação, constataram isolamento microbiano em 20,25% das amostras, com o isolamento de 71,87% de Staphylococcus coagulase negativos, 14,06% de Staphylococcus coagulase positivos, 10,94% de Bacillus spp. e 3,13% de Streptococcus spp..
Pela contagem bacteriana total, observou-se que o número máximo de unidades formadoras de colônias foi de 3.030.000 ufc/ mL, em caso de amostra de leite com isolamento de Staphylococcus spp., na sétima semana de estudo. Do total, 17 (94,5%) apresentaram contagens inferiores a 500.000 ufc/ mL, e apenas 1 (5,5 %), superior a 1.500.000 ufc/ mL, valores de referência máximos
estabelecidos pela União Européia para leite destinado a produtos de consumo crus (até 500.000 ufc/ mL) e para produtos que recebem tratamento térmico previamente ao consumo (até 1.500.000 ufc/ mL). Sendo assim, a prevalência de baixas contagens nas amostras de leite analisadas denota boas condições de qualidade no rebanho estudado, uma vez que este leite se enquadra nos parâmetros de qualidade estipulados pela União Européia (PIRISI et al., 2007).
6.2. Perfil de sensibilidade microbiana
No Brasil há poucos estudos investigando a sensibilidade antimicrobiana
in vitro a partir de isolamentos de microrganismos em amostras de leite de
ovelhas com mastite (DOMINGUES et al., 2006).
No presente estudo, o ceftiofur foi o antimicrobiano mais efetivo frente à maioria dos patógenos isolados, com 80,77% de sensibilidade bacteriana, seguido de gentamicina (69,23%), enrofloxacina (69,23%), oxacilina (61,54%) e florfenicol (57,70%). Os microrganismos apresentaram maior resistência à amoxacilina (84,61%), penicilina G (80,77%) e neomicina (61,54%). Para a tetraciclina, constatou-se 50% de sensibilidade microbiana. Referente aos
Staphylococcus spp., microrganismo que foi isolado com maior freqüência,
verificou-se maior sensibilidade ao ceftiofur e à gentamicina, com 73,34% de susceptibilidade bacteriana para cada antimicrobiano.
A resistência bacteriana frente a determinados antimicrobianos se deve, provavelmente, à seleção promovida devido ao uso contínuo e/ ou indevido dos antimicrobianos, resultando, assim, na resistência de algumas linhagens. Conforme a efetividade apresentada, ao decorrer do estudo, os antimicrobianos ceftiofur, enrofloxacina, gentamicina, oxacilina e florfenicol podem ser eleitos na escolha da terapia de animais com infecções intramamárias.
Domingues et al. (2006), estudando a etiologia e sensibilidade bacteriana na mastite subclínica em ovelhas da raça Santa Inês observaram que para os microrganismos Staphylococcus spp., Corynebacterium spp. e Streptococcus spp., isolados com maior freqüência, os antimicrobianos de melhor eficácia foram florfenicol (87,5%), gentamicina (81,2%), cefalexina (79,5%) e enrofloxacina (70,5%).
50
Na Grécia, Fthenakis (1998) isolou Staphylococcus spp. em amostras de leite ovino, e verificou 100% de sensibilidade do microrganismo frente à cefoperazona, cefuroxima, cloxacilina, enrofloxacina e meticilina, e 59%, referente à gentamicina.
6.3. Contagem de células somáticas
Pela contagem de células somáticas (CCS) no leite pôde-se determinar o número de células em um mililitro de leite. No presente estudo, pôde-se observar valores entre 1.000 e 3.368.000 células/ mL. Amostras de leite provenientes de glândulas mamárias sadias revelaram valores entre 1.000 e 816.000 células/ mL, com média correspondente a 36.285 células/ mL. Amostras de leite reagentes ao CMT, independente do grau de inflamação, revelaram valores entre 2.000 e 3.368.000 células/ mL, com médias de 267.579 células/ mL, na ausência de microrganismos e 489.400 células/ mL nas condições de infecção intramamária, ou seja, quando houve o isolamento de pelo menos um microrganismo. Das amostras de leite positivas microbiologicamente, apenas uma (4%) relatou CCS acima de 1x106 células/ mL, com reação de 3+ ao CMT.
Lafi (2006) verificou que dentre as amostras negativas ao cultivo microbiológico, 91% apresentaram contagem de células somáticas inferiores a 1.000.000 células/ mL e 80%, com reações 2 + ao CMT. Das amostras com desenvolvimento microbiano, apenas 9% apresentaram contagem de células somáticas inferior a 1.000.000 células/ mL, e nenhuma, com reação inferior a 3 + ao CMT.
Pôde-se observar através dos resultados do CMT e cultivo microbiológico, efeito significativo (P<0,0001) na contagem de células somáticas. A inflamação da glândula mamária, avaliada pelo CMT, associada à presença de microrganismos, ou seja, nas condições de infecção intramamária, propicia um aumento na contagem de células somáticas.
52
7. CONCLUSÕES
Pôde-se concluir no presente estudo:
A ocorrência da mastite de origem infecciosa no rebanho ovino estudado foi de 11,7%, ressaltando-se a importância de assegurar medidas higiênico- profiláticas para a obtenção de um produto de qualidade, sob o ponto de vista microbiológico;
Os microrganismos mais comumente encontrados nas amostras de leite examinadas foram Staphylococcus spp. seguidamente de Streptococcus spp.,
Bacillus spp., Corynebacterium spp. e Serratia spp, havendo maior ocorrência
de mastite de origem contagiosa, provavelmente atribuída ao uso de ordenhadeira no rebanho estudado;
A contagem bacteriana total (CBT) mostrou valores dentro dos parâmetros de qualidade estabelecidos pela União Européia em 94,5% das amostras analisadas, denotando boas condições de qualidade no rebanho estudado que certamente refletem na baixa CBT;
Os antimicrobianos que apresentaram melhor eficácia frente aos microrganismos isolados foram ceftiofur, enrofloxacina, gentamicina, oxacilina e florfenicol, sugerindo que os mesmos podem ser utilizados como escolha na terapia de animais com infecções intramamárias;
A contagem de células somáticas referiu valores entre 1.000 e 816.000 células/ mL, com média de 36.285 células/ mL de leite provenientes de glândulas mamárias sadias. Amostras de leite que apresentaram reação ao CMT revelaram valores entre 2.000 e 3.368.000 células/ mL, com médias de 267.579 células/ mL na ausência de microrganismos e 489.400 células/ mL nas condições de infecção intramamária. Ou seja, pode-se afirmar que o número de células somáticas no leite é diretamente proporcional à inflamação da glândula mamária, acentuando-se nos casos de mastite infecciosa.
54
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