SILMARA ARAUJO AMARAL DA SILVA
EFEITO DE TITYUSTOXINA GAMA MARCADA COM
TECNÉCIO 99m SOBRE O SISTEMA COLINÉRGICO
SILMARA ARAUJO AMARAL DA SILVA
EFEITO DE TITYUSTOXINA GAMA MARCADA COM
TECNÉCIO 99m SOBRE O SISTEMA COLINÉRGICO
CENTRAL EM RATOS.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Tasso Moraes e Santos
Faculdade de Farmácia UFMG Belo Horizonte, MG
Meus agradecimentos sinceros:
A DEUS pelo dom da vida e pelas oportunidades;
Ao Prof. Dr. Tasso Moraes e Santos pelo exemplo de ser humano, de ética e princípios. Pela orientação e ensinamentos.
À minha mãe pelo exemplo de força e dedicação, pelo apoio e incentivo. Ao meu pai pela paciência e apoio. À minha linda filha pela compreensão da minha ausência, pelo amor e incentivo, às minhas irmãs e ao meu sobrinho pelo incentivo. Ao Fábio, pelo companheirismo.
Ao Prof. Valbert Nascimento Cardoso, pela ajuda e colaboração. Ao Prof. André Ricardo Massensini pela ajuda.
Aos amigos do Laboratório de Nutrição Experimental, Maria das Graças Vilela Torquato, Vinícius Paganini, Wagner Miranda, Renata Abreu, Eliane Moreto, Gustavo Rezende, Marclênia Ramos, Renata Lacerda, Ricardo Dornas, Antônio Massensini, pela colaboração durante a realização deste trabalho e pela amizade.
À veterinária Maria Adelaide Fernandes responsável pelo biotério da Faculdade de Farmácia e ao José Batista Viturino, funcionário do biotério, pela disponibilidade e auxílio na manutenção dos animais utilizados.
... 7
FIGURAS ... 7
TABELAS ... 7
... 8
... 9
... 11
1. ... 13
1. ... 13
... 15
2.1. A BARREIRA HEMATOENCEFÁLICA ... 15
2.2 SINAPSE E LIBERAÇÃO DE NEUROTRANMISSORES ... 17
2.3 TRANSMISSÃO COLINÉRGICA ... 18
2.4 DESNUTRIÇÃO E SISTEMA NERVOSO CENTRAL ... 19
2.5 O VENENO DE ESCORPIÃO ... 20
2.5.1 A Tityustoxina gama ... 22
2.6 A TOXINA E A BARREIRA HEMATOENCEFÁLICA ... 23
3. OBJETIVOS ... 25
... 25
4.1 MATERIAL ... 25
4.1.1 Reagentes ... 25
4.1.2 Equipamentos ... 26
4.2 SOLUÇÕES ... 26
4.3 MÉTODOS ... 30
4.3.2 Obtenção da toxina gama (TiTX-γ) ... 31
4.3.3. Marcação da toxina TiTx-γ com tecnécio- 99m ... 32
4.3.4 Determinação da dose adequada para estimulação da liberação de acetilcolina in vivo com TiTX-γ ... 33
4.3.5 Estimulação da liberação de neurotransmissores em cérebro de ratos por TiTX-γ in vivo e sacrifício ... 36
4.3.6 Preparação das amostras e extração do TCA ... 37
4.3.7 Determinação da acetilcolina ... 38
4.3.8. Determinação de Proteína ... 38
4.3.9. Determinação de DNA ... 39
4.3.10 Análise estatística dos dados ... 40
... 40
5.1 EFEITO DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR SOBRE O PESO CORPORAL E ENCEFÁLICO DOS ANIMAIS ... 40
5.2 INFLUÊNCIA DE RESTRIÇÃO ALIMENTAR NA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA E DNA CEREBRAL ... 42
5.3 EFICIÊNCIA DA MARCAÇÃO DA TITYUSTOXINA GAMA COM TECNÉCIO 99M ... 44
5.4 INFLUÊNCIA DE RESTRIÇÃO ALIMENTAR NA CAPTAÇÃO DE TOXINA RADIOATIVA PELO CÉREBRO. ... 45
5.5 EFEITO DA TOXINA 99mTc-TiTX-γ NO CONTEÚDO DE ACh DO CERÉBRO DE RATOS NORMONUTRIDOS E DESNUTRIDOS APÓS O DESMAME ... 45
... 49
... 52
FIGURAS
1.Recuperação no cérebro da quantidade de [99mTc]-TiTX-γ injetada por via
intraperitoneal em ratos de 21 dias ... 33
2.Crescimento corporal de ratos, do nascimento até o 21o dia de vida ... 37
3.Conteúdo de proteína cerebral de ratos ... 39
4.Conteúdo de DNA cerebral de ratos ... 39
5.Relação proteína por DNA no cérebro de ratos ... 40
6. Perfil de filtração cromatográfica em Sephadex 44 7.Porcentagem de radiação recuperada em cérebro de ratos ... 41
8.Teor de acetilcolina por grama de tecido, expressa em nmol de ACh por g de tecido ... 42
9.Teor de acetilcolina por miligrama de DNA, expressa em nmol de ACh por mg de DNA ... 43
10.Teor de acetilcolina por miligrama de proteína, expressa em nmol de ACh por mg de proteína... 43
11.Teor de acetilcolina total em cérebro de ratos ... 44
99m
Tc Tecnécio – 99 meta estável
99m
TcO2 Dióxido de tecnécio (tecnécio reduzido) 99m
TcO4- Pertecnetato 99m
Tc-TiTX-γ Tityustoxina gama marcada com tecnécio – 99m ACh Acetilcolina
AChE Acetilcolinesterase
BHE Barreira hematoencefálica cpm Contagem por minuto DC Desnutrido controle DE Desnutrido estimulado DNA Ácido desoxirribonucléico GD Grupo desnutrido
GN Grupo normal
ICV Intracerebroventricular IM Intramuscular
IP Intraperitoneal IV Intravenoso
A barreira hematoencefálica é uma junção estática, de células endoteliais especializadas, não fenestradas, unidas firmemente por meio de junções íntimas, rígidas e comprimidas. Ela regula a entrada de macromoléculas e de micromoléculas de solutos do sangue periférico para o sistema nervoso central, formando uma barreira à troca de algumas substâncias entre os capilares e o tecido encefálico (HUBER et al., 2001; VORBRODT e DOBROGOWSKA, 1994). Funcionalmente, não se encontra completamente desenvolvida até os seis meses de idade em humanos (BERTELLI et al., 1994).
O sistema nervoso é especialmente vulnerável se exposto a agentes tóxicos durante a fase inicial de desenvolvimento (período crítico de crescimento e desenvolvimento do cérebro). Não se pode descartar o fácil acesso de componentes tóxicos ao cérebro pela barreira hematoencefálica imatura, como causa do dano neuronal (GOLDSTEIN e BETZ , 1981).
A síndrome de envenenamento por picada de escorpião é um grave problema de saúde pública, com alta prevalência em países tropicais (FUNASA, 2001). As crianças são mais freqüentemente picadas que os adultos e apresentam envenenamento mais grave (FREIRE-MAIA et al., 1994).
Toxinas ativas em canais de sódio têm sido amplamente utilizadas como ferramentas para estudar mecanismos sinápticos sob condições fisiológicas ou patológicas (MASSENSINI et al., 2003). Neurotoxinas agindo em canais de sódio são capazes de induzir liberação de neurotransmissores em fatias de córtex (NICOLATO et al., 2002).
células endoteliais e os astrócitos, determinando que os capilares da BHE tenham uma resistência elevada e sejam impermeáveis à maioria das macromoléculas (RUBIN et al., 1999). Tais uniões formam cinturões intercelulares contínuos estabelecendo múltiplas barreiras (SAUNDERS et al., 2000).
O desenvolvimento da BHE ocorre por um processo complexo que começa no primeiro trimestre de vida fetal humana e realiza-se em duas fases principais (MOLLGARD e SUNDERS, 1975). Na primeira fase, conhecida como angiogênese cerebral, células endoteliais derivadas de vasos permeáveis do plexo vascular perineural invadem a neuroectoderme e formam vasos cerebrais por um processo angiogênico. Durante a segunda fase, ocorre diferenciação do endotélio cerebral envolvendo o estabelecimento de complexas junções entre as células e sistemas de transporte hidrofílicos exigidos pelo cérebro. A função da barreira hematoencefálica não se encontra completamente desenvolvida até os seis meses de idade em humanos (BERTELLI et al., 1994). Em ratos esse processo começa em torno do décimo segundo dia de gestação e continua até cerca do vigésimo dia após o nascimento, a segunda fase é completada entre o vigésimo quarto e trigésimo dia de vida nos ratos (SONG et al., 2002).
A maioria das conexões das células nervosas é conhecida por sinapse química. Nesta, a transmissão do impulso nervoso de um neurônio a outro é realizada por neurotransmissores Os neurônios, constituintes do sistema nervoso, são responsáveis pelos sinais transmitidos de um ponto a outro, virtualmente sem alteração. Quando o neurônio é estimulado, ocorre uma mudança local na condutância da membrana para a passagem de íons sódio e potássio. Para o sinal passar de um neurônio a outro, ele precisa atravessar a fenda sináptica. Essa transmissão é efetuada pela liberação de um composto químico chamado neurotransmissor. Esse processo é denominado transmissão sináptica neuroquímica (DUNANT e ISRAËL, 1985).
A mudança de potencial elétrico na célula pré-sináptica provoca, por exocitose Ca+2 -dependente, a liberação do neurotransmissor na fenda sináptica que se ligará a sítios receptores da membrana do neurônio pós-sináptico, transmitindo desta forma o impulso nervoso. No cérebro humano, a comunicação entre os neurônios se dá por contatos sinápticos que usam na sua maior parte, aminoácidos como transmissores (NICHOLLS et al., 1993).
A acetilcolina (ACh) foi isolada e caracterizada, estrutural e funcionalmente em 1935 por Dale, dessa forma o sistema colinérgico foi o primeiro a ser utilizado nos experimentos que investigam a neurotransmissão. Esse neurotransmissor desempenha papel importante na comunicação celular, evocando respostas dos neurônios pós sinápticos.
A síntese desse neurotrasmissor se dá no terminal pré sináptico a partir da colina e da acetilcoenzima-A (TUCEK, 1978). Primeiramente, a colina, resultante da hidrólise de fosfolipídios e da hidrólise de acetilcolina anteriormente liberada, é transportada para o interior do neurônio pré-sináptico (YAMAMURA et al., 1972; KUHAR et al., 1978). A acetil-CoA, substância derivada do metabolismo da glicose, é o outro substrato necessário para síntese da ACh. A colina acetil-transferase é a enzima responsável pela acetilação da colina (FONNUM, 1968). A acetilcolina então formada no citosol é estocada em vesículas sinápticas do terminal nervoso.
A liberação da acetilcolina é causada por um impulso elétrico que transita pelo axônio até o terminal nervoso. Além da entrada de sódio, o potencial de ação também ocasiona a entrada de cálcio para o interior da célula, e com esse cálcio no terminal há a liberação de ACh na fenda sináptica. O neurotransmissor se difunde através da fenda sináptica e se liga aos sítios receptores na membrana pós-sináptica ocasionando outra alteração elétrica e transmitindo assim o impulso ao neurônio posterior ou fibras musculares (MORGAN e WINICK, 1985).
No sistema nervoso central (SNC), em fases iniciais da vida, especialmente no período do surto de crescimento, quando é mais vulnerável, a desnutrição causa efeitos irreversíveis à sua formação (JONES, 1976). Bioquimicamente, a desnutrição, tem um efeito deletério e irreversível sobre os sistemas neurotransmissores (MAFRA, 1993)
Com relação às células neuronais é no período do surto de crescimento que ocorre o maior incremento dos processos (dendritos e axônios) e formação de sinapses (MORGANE et al., 2002). Estudos morfológicos indicam alterações provocadas pela desnutrição nessas estruturas (BASS, 1970; CRAGG, 1972). Estudos neuroanatômicos realizados em ratos têm demonstrado que a desnutrição, após o nascimento modifica o desenvolvimento cortical, diminuindo o número e amplitude de processos basais dendríticos, o número de dendritos e a proporção neurônio/sinapse, reduzindo a espessura cortical (CORDERO et al., 2003). A restrição alimentar no período de amamentação afeta o desenvolvimento neuronal particularmente os processos ontogenéticos: neurogênese, migração e sinaptogênese (BEDI, 2003).
Com relação ao efeito da desnutrição sobre o metabolismo protéico, nessas células, foi demonstrado que a desnutrição leva á diminuição da síntese protéica, no período de maior crescimento das células neuronais (SANTOS,1979; MORAES-SANTOS, 1981). A reabilitação nutricional posterior não é capaz de reverter o dano na formação do sistema nervoso central (SNC) e na síntese e liberação de neurotransmissores (GONÇALVES, 2001).
modificações bioquímicas, fisiológicas, anatômicas e comportamentais resultando em efeitos de longa duração ou até mesmo permanentes. Assim sendo, sistemas neurotransmissor catecolaminérgicos, colinérgicos, serotoninérgicos, gabaérgico e opiáceos são afetados pela desnutrição (ROTTA, 2003).
No cérebro, a desnutrição em ratos neonatos diminui a capacidade de síntese e liberação de acetilcolina. A síntese e liberação desse neurotransmissor, quando estimuladas por toxina de escorpião !"# #$%%"&' "#( encontram diminuídas em animais desnutridos (ESPÍNDOLA, 1983). Durante o período de amamentação de ratos (21 dias), a desnutrição diminui o teor de acetilcolina e a atividade das enzimas envolvidas no seu metabolismo no córtex cerebral (NASCIMENTO et al., 1991).
A síndrome do envenenamento por escorpião é um grave problema de saúde pública, com alta prevalência em países tropicais. No Brasil, verificam-se 8000 acidentes notificados por ano. A principal espécie envolvida em acidentes de envenenamento por escorpião é o !"# #$%%"&' "#- agente responsável pela maior parte dos acidentes graves (FUNASA, 2001).
ROMERO et al., 2001). Sobre o sistema nervoso central sabe-se que por vezes são observadas convulsões como sintomas clínicos, principalmente em crianças (CARVALHO et al., 1998).
Em crianças os acidentes por envenenamento escorpiônico são freqüentemente mais graves que em adultos (SOFER,1988; AMIN, 1992; FREIRE-MAIA et al., 1994; KRIFI et al., 1998). Manifestações do SNC são mais comuns em crianças mais novas do que em crianças maiores e adultos. A alta sensibilidade das crianças pode ser devido a diferenças na permeabilidade da barreira hemato-encefálica para neurotoxinas (GUERON, 1992; ISMAIL, 1994), uma vez que em ratos quando a quantidade de veneno injetada foi corrigida para peso, ou seja mesma quantidade por Kg de peso, animais jovens apresentaram maior mortalidade que animais adultos (NUNAN et al., 2001)
Polipeptídeos tóxicos foram isolados pela primeira vez, a partir do veneno do escorpião sul americano !"# #$%%"&' "# (GOMEZ e DINIZ, 1966). Essa toxina demonstrou capacidade de liberar neurotransmissores em preparações de íleo de cobaia e foi denominada tityustoxina (TsTX) (GOMEZ et al., 1995)
O veneno de escorpião é constituído de uma mistura complexa de proteínas farmacologicamente ativas. Toxinas do veneno de escorpião têm sido classificadas de acordo com seus efeitos nos canais iônicos de células excitáveis (MARANGONI et al., 1995).
Existem dois tipos principais de toxinas isoladas do veneno do escorpião !"#
#$%%"&' "#: a tityustoxina que é do tipo α-toxina, que atua inibindo a inativação do
terminais nervosos, aumentando a concentração intracelular de Na+, a primeira age principalmente retardando a inativação dos canais, enquanto que a segunda promove uma mudança na corrente de íons sódio, propiciando que ela exista mesmo estando a membrana em potenciais entre -70 e -40 mV (ARANTES et al., 1994).
Toxinas de escorpião ativam os canais de sódio e têm sido amplamente utilizadas como ferramentas para estudar mecanismos sinápticos sob condições fisiológicas ou patológicas (MASSENSINI et al., 2003). Neurotoxinas agindo em canais de sódio são capazes de induzir liberação de neurotransmissores em fatias de córtex (NICOLATO et al., 2002). TsTX e TiTX-γ se ligam em canais de sódio, e seus efeitos sobre a liberação de acetilcolina é semelhante à estimulação elétrica causando aumento da função colinérgica (GOMEZ et al., 1975).
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explorada com sucesso em experimentos bioquímicos (VIJVERBERG et al., 1984; LOMBET; LAZDUNSKI, 1984).
O sistema nervoso central foi inicialmente excluído como sítio de interesse direto para a ação do veneno de escorpião, porque pouca radioatividade foi recuperada a partir de cérebro de ratos adultos que tinham recebido injeção de toxina marcada (OSMAN et al., 1973). Apesar dos poucos relatos encontrados na literatura, a ação de frações tóxicas de veneno escorpião sobre o SNC tem sido de certa forma negligenciada, principalmente devido ao entendimento comum de que esses peptídeos não atravessam a barreira hematoencefálica (REVELO et al., 1996).
atravessar barreira hematoencefálica, e que a distribuição de TsTX no cérebro desses animais jovens era três vezes maior que a encontrada nos animais adultos.
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Diante do exposto, o objetivo nesse trabalho foi o de verificar que a β-toxina do veneno do escorpião !"# #$%%"&' "#, TiTX-γ, atravessa a barreira hematoencefálica de
animais jovens recém desmamados e se apresenta funcional no cérebro.
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• SIGMA CHEMICAL CO., St Louis, MO, USA
Cloreto de acetilcolina, Acetilcolinesterase (C-2888, tipo V-S: de “Eletric Eel”, E.C 3.1.1.7), Peroxidase (P-8250, tipo II de Rabanete, EC 1.11.1.7), Colina-Oxidase (C-5896), Luminol (A-8511), Glicina, Brometo de etídio (Brometo de 2,7-diamino-10-etil-9-fenilfenantrídio), Ácido desoxirribonucléico (Tipo III de salmão), Albumina bovina (Fração V), Ribonuclease A (Tipo II-A de Pâncreas bovino EC 3.1.27.5), Carboximetilcelulose-52, Sephadex G-10 e Sephadex G-25.
• REAGEN – Quimibrás Indústrias Químicas SA, RJ, Brasil, Ácido tricloroacético, Metaperiodato de sódio.
• LABORCLIN – Produtos para laboratórios LTDA
Reativo de Folin-Ciocalteau, Hidróxido de sódio, Tris base (Tris-(hidroximetil)-aminometano)
• LABSYNTH – Produtos para laboratório LTDA.
Éter dietílico, Cloreto de estanho, Borohidreto de sódio, ácido clorídrico.
• INLAB S.A.
Sulfato de Cobre e Tartarato de sódio e potássio
• ECOGRAF – Medicina Nuclear Pertecnetato de sódio
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• Banho de agitação e temperatura regulável, modelo BT 25 da YAMATO SCIENTIFIC CO.
• Espectrofluorímetro SHIMADZU, modelo RF 5301 PC, Japão.
• Espectrofotômetro Hitachi, modelo UV 160 A, Japão.
• Centrífuga refrigerada, modelo CR 21 da HITACHI, Japão.
• Cintilador automático ANSR-Abbot, USA. Intertechnique CG-4000 γ counter
• Homogeneizador de tecidos Potter Elvehjem com motor MARCONI, Brasil.
• Liofilizador, modelo L4KR da EDWARDS DO BRASIL LTDA, SP, Brasil.
• Luminômetro, modelo 12250da BIO ORBIT OY, Turku, Finlândia.
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• Tampão glicina (67 mM pH 8,6)
Glicina ... 5,03 g Água bidestilada...q.s.p... 1000 ml
• Ácido tricloroacético (TCA) 5%
Ácido tricloroacético... 5,0 g Água bidestilada... 100 ml
• Metaperiodato de sódio 0,5%
Metaperiodato de sódio... 0,1250 g Água bidestilada...q.s.p... .25,0 ml
• Luminol (0,9 mg/ml ou 5,0 mM)
Luminol... 2,7 mg NaOH 1M... gotas Tampão glicina... 3,0 ml
• Pool de enzimas para determinação de acetilcolina pelo método quimioluminescente
Colina oxidase ...140U... 10,0 mg Microperoxidase ... 3,0 mg Luminol (0,9µg/µl)... 300 µl Tampão glicina...q.s.p... 3,0 ml
A solução resultante foi aliquotada em frações de 80 µl em tubo eppendorf e congeladas até o momento do uso.
• Acetilcolinesterase (0,08U/µl)
Essa solução de uso foi então aliquotada em frações de 80 µl em frasco eppendorf e congeladas até o momento do uso.
• Acetilcolina padrão (1,82 pmoles/µl)
Foi adicionada ao frasco de origem água bidestilada suficiente para uma concentração de 10 µg/µl (solução original). Posteriormente, foram pipetados 100 µl dessa solução e completados para 10,0 ml com HCl 0,01 N (solução estoque, 0,1 µg/µl). Então foram pipetados 50 µl dessa solução estoque e completado para 15,0 ml com água bidestilada (solução de uso, 330,0 pg/µl ou 1,82 pmoles/µl).
• Solução A (dosagem de proteína)
Tartarato de sódio e potássio... 2,0 g Carbonato de sódio ...100g Hidróxido de sódio 1N...500ml Água bidestilada...q.s.p...1000ml
• Solução B (dosagem de proteína)
Tartarato de sódio e potássio... 2,0 g Sulfato de cobre pentahidratado... 1,0g Hidróxido de sódio 1N... 100,0 ml
• Solução C (dosagem de proteína)
• Padrão de albumina (BSH) Solução de uso 500µg/ml
• Tampão Tris (0,1 M)-NaCl (0,3 M) pH 8,0 (dosagem de DNA) Cloreto de sódio... 4,388 g
Tris... 3,028 g Água bidestilada...q.s.p... 250 ml
O pH foi ajustado para 8,0 com solução de HCl 0,1 N.
• Brometo de etídio
Pesaram-se 0,0200 g de brometo de etídio que foi dissolvido em um béquer com 50 ml de água. O volume foi completado para 100 ml em um balão volumétrico (solução estoque). Foi então pipetado 1,0 ml desta primeira solução e, em um balão volumétrico, completou-se o volume para 100 ml (solução de uso).
• Padrão de DNA
Ácido desoxiribonucléico... 5,0 mg Água bidestilada...q.s.p... 50 ml
A solução foi aliquotada em frações de 1,5 ml em frasco eppendorf e congelada até o momento do uso.
• RNAse (2,0 µg /ml)
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Ratos da raça Wistar, da colônia do Laboratório de Nutrição Experimental da Faculdade de Farmácia da UFMG, foram acasalados e, por volta do 19o dia de prenhez, identificada por esfregaço vaginal, as fêmeas foram transferidas para gaiolas individuais e divididas aleatoriamente em quatro grupos: um grupo normonutrido formado por duas fêmeas que receberam dieta composta por ração de biotério (Labina, Brasil) enriquecida com 20% de ração para cães (Bonzo Mix Carnes - SP, Brasil) para complementar o teor de proteínas e lipídios; um grupo desnutrido, composto por duas fêmeas que receberam 60% da ração consumida pelo grupo normonutrido. Todas as dietas experimentais foram oferecidas a partir do 19º dia após a prenhez. Após o nascimento, os filhotes foram distribuídos aleatoriamente em número de oito por mãe. Durante o período de amamentação duas mães de cada grupo (Normal) foram mantidas recebendo água e comida '* & + ",. Outras duas mães (desnutridas) receberam 60% da quantidade de ração consumida pelas mães controles. Os filhotes foram pesados diariamente até o dia do sacrifício (21 dias de vida), dessa forma os animais utilizados no experimento foram desnutridos indiretamente, pois eram provenientes de mães que sofreram restrição alimentar na prenhez e no aleitamento. Com os 32 filhotes quatro grupos foram formados:
12- grupo normal controle constituído por oito filhotes que no dia do sacrifício (21 dias de vida) foram injetados intraperitonealmente com meio utilizado para marcação com tecnécio.
32 - grupo desnutrido controle constituído por oito filhotes que no dia do sacrifício (21 dias de vida) foram injetados intraperitonealmente com meio utilizado para marcação com tecnécio.
3' - grupo desnutrido estimulado constituído por oito filhotes que no dia do sacrifício (21 dias de vida) foram injetados intraperitonealmente com toxina marcada.
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No escorpionário da Faculdade de Farmácia da UFMG, escorpiões !"#
#$%%"&' "# foram mantidos em caixas plásticas tampadas por telas de nylon e
alimentados com uma dieta líquida à base de fígado bovino cru, peptona, mistura de sais minerais e vitaminas (Rezende, 1991). Periodicamente, veneno desses animais foi extraído aplicando-se estímulo elétrico em sua glândula secretora. O veneno bruto é recolhido em tubo de ensaio, e posteriormente liofilizado e mantido em freezer a -20oC.
A purificação das toxinas presentes no veneno bruto foi realizada seguindo as técnicas de Gomez e Diniz (1966), modificadas por Sampaio e colaboradores (1983). O veneno bruto liofilizado foi extraído com água bidestilada, e o extrato centrifugado a 15 000 G por 10 minutos a 4°C (Centrífuga refrigerada, modelo CR 21 da HITACHI, Japão). O sobrenadante foi aplicado em coluna Sephadex G-25 (120 cm x 2,5 cm), eluída com solução de amônia a 0,05 M e as frações coletadas por 20 minutos cada tubo (cerca de 8,5 ml). Quatro picos foram identificados sendo que as frações tóxicas apareceram nos picos dois e quatro. Os picos contendo toxinas foram coletados e liofilizados. Em seguida, o pó correspondente ao segundo pico tóxico foi dissolvido com solução de 0,01 N de
eluída por gradiente de concentração de NH4HCO3 (0,01 a 0,7 M). Frações
coletadas por 12 minutos cada tubo (cerca de 2,5 ml). O último pico correspondente à toxina TiTX-γ o qual foi coletado e liofilizado.
Após liofilização, a fração correspondente à toxina TiTX-γ foi mantida no freezer até o momento do uso.
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# 99
A marcação da toxina TiTX-γ foi realizada, segundo descrito por Nunan e colaboradores (2003). Uma mistura de 2,0 µl de cloreto de estanho (2mg/ml em ácido clorídrico 0,25 M) e 2,0 µl de borohidreto de sódio (10 mg/ml em NaOH 0,1 M) em 100 µl de solução salina da toxina (com peso de TiTX-γ entre 200 e 250
µg), o pH foi ajustado para 7,0 com HCl 0,1M, utilizando um papel indicador. Foram acrescentados à mistura anterior 200 µl de solução salina de pertecnetato de sódio (0,74 MBq) e a mistura foi mantida em temperatura ambiente por 20 minutos.
A contaminação radioquímica, principalmente TcO2 presente noproduto final,
foi eliminada por filtração em gel usando coluna de Sephadex G-10 (Sigma) de 13,0 x 1,0 cm, equilibrada e eluída com salina. Frações de 1,0 ml foram
coletadas e monitoradas por radioatividade e absorbância a 280nm.
(99mTcO4-) migrou para o topo da tira, determinando-se assim o percentual de 99m
TcO4- livre. Na segunda cromatografia a mistura marcada foi aplicada em tira
de papel Whatman número 1 (5 X 36 cm) previamente saturada em solução de albumina bovina 1%. Solução salina foi usada para eluir a mistura até 15 cm. A tira foi cortada em fragmentos de 1,0 cm cada e contada no cintilador automático. O (99mTcO4-) e [99mTc]-TiTX-γ migraram para o fim da tira (Rf:
0,7-1,0) e o tecnécio reduzido (99mTcO2) ficou na origem, determinando-se dessa
forma o percentual de 99mTcO2- livre. Assim a porcentagem de TiTX-γ marcada
foi calculada da seguinte maneira:
cpm [99mTc]- TiTX-γ
Rendimento (%) = --- x 100 cpm total ([99mTc]- TiTX-γ + 99mTcO4- + 99mTcO2)
+ $ + 3 56 - . 56 4 56
: : 7#γγγγ
Em estudo preliminar, foram aplicadas, em animais com 21 dias de vida, doses crescentes de toxina marcada por via intraperitoneal (IP). Noventa minutos após a injeção os animais foram sacrificados e a radioatividade presente em seus cérebros foi contada em cintilador gama. A quantidade de radiação recuperada foi calculada a partir da fórmula:
Nesse procedimento foi levada em conta a curta meia vida do tecnécio meta estável (T1/2 = 6 h), por isso sempre que foram feitas as injeções nos animais,
um tubo com a mesma quantidade de toxina marcada (padrão de dose) foi deixada em repouso durante todo o tempo do experimento. Esse tubo foi contado junto com os tubos contendo os cérebros dos animais, dessa forma o decaimento da radioatividade foi corrigido com o padrão de dose, de acordo com o esquema abaixo:
Toxina marcada
Determinação da quantidade em µg de toxina (absorbância)
Enchimento das seringas
Leitura da radioatividade das seringas (µCi)
Padrão de dose (média das seringas)
Injeção nos animais
A partir das contagens obtidas nos tubos contendo os cérebros e o padrão de dose foram feitos os cálculos para se determinar a porcentagem de radiação recuperada.
Exemplo:
• Cálculo para 20 µg de toxina marcada Seringa 1 – 14 µCi
Seringa 2 – 13 µCi Padrão de dose – 14 µCi Seringa 3 – 15 µCi (toxina marcada)
Contagem em cpm
PD - 14 µCi – 1,8907333 . 107 S1 - 1,8907333 . 107
S2 - 1,7556809 . 107 S3 - 2,0257856 . 107
Foram então analisados, a partir dos resultados, os efeitos da toxina e a porcentagem de radioatividade recuperada em relação às quantidades crescentes de 99mTc-TiTX-γ injetada. A dose máxima suportada sem que houvesse morte do animal (Fig.1) foi aquela que estava abaixo da dose letal, ou seja, provocava todos os sintomas de envenenamento, mas o animal continuava vivo até 01h30 após a injeção de 99mTc-TiTX-γ, tempo necessário para que houvesse pico máximo de toxina no cérebro (NUNAN et al., 2003)
Para S1: Contagem do cérebro – 1,0576 . 104 1,8907333 . 107 ---- 100 %
1,0576 . 104 ---- X
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
;" !
<
.
Figura 1- Recuperação no cérebro da quantidade de [99mTc]-TiTX-γinjetada
por via intraperitoneal em ratos de 21 dias.
A partir desses dados foi estipulada então a dose máxima de 2,0 mg/Kg de peso que cada animal poderia receber de TiTX-γ marcada.
+ $
' 56 4 56 8 4 .7#γγγγ : : =>
Aos 21 dias de idade, os animais dos grupos NE e DE receberam injeção intraperitoneal (IP) de toxina marcada na dose de 2,0 mg/Kg de peso. Os animais controle NC e DC receberam injeção do mesmo de meio utilizado para marcação da toxina.
(todos os tubos foram previamente pesados), os quais foram pesados novamente e seus valores anotados. A metade do cérebro que estava no tubo contendo TCA 5% foi utilizada no ensaio quimioluminescente de acetilcolina; a metade que se encontrava no tubo vazio foi utilizada para os ensaios de proteína e DNA. Os tubos foram mantidos no gelo e a radioatividade cada um foi contada em cintilador gama, e os valores de radioatividade resultante dos dois tubos, de cada animal, foram somados para se obter o valor de radioatividade recuperada em cada cérebro, os tubos foram então congelados a -70oC até o momento das análises.
O mesmo procedimento foi realizado com o controle.
+ $ ?
@ . 56 ! 56 2Os cérebros foram homogeneizados em 500 µl de solução de TCA a 5 %. O homogenato foi aquecido a 100°C por 10 min. e centrifugado por 10 min. a 10.000 g.
ml de metaperiodato de sódio 0,5 % com a finalidade de oxidar qualquer agente que pudesse interferir na dosagem posterior da acetilcolina.
+ $ A 3 56
Para essa determinação foi usada a técnica desenvolvida por Israel e Lesbasts (1981), modificada por Prado e colaboradores (1990).
O ensaio quimioluminescente foi realizado em tubo inserido na câmara escura do luminômetro, que foi acoplado a um banho, formando uma jaqueta em torno da cubeta, cuja função era manter a temperatura constante a 37°C, essencial para a atividade das enzimas.
Ao tubo foi adicionado 960 µl de tampão glicina, 40 µl do pool enzimático e 200 µl de amostra. O primeiro pico da reação luminosa foi devido principalmente à oxidação da colina já presente do meio. Quando a linha de base foi restabelecida, foi registrado um novo pico devido a luminescência proveniente da oxidação da colina formada pela a hidrólise da ACh, após a adição de 40 µl de solução de acetilcolinesterase 1,6 U. ACh foi quantificada medindo-se a altura dos picos, usando padrões de ACh submetidos ao mesmo tratamento das amostras.
+
$ 3 56 @ >A dosagem de proteína seguiu o método de Lowry (1951), modificado por Hartree (1972).
por 1 hora e resfriada totalmente. Desta solução foram feitas alíquotas de 125 µl em tubos de ensaio em duplicata. Completou-se o volume com água destilada para um volume final de 1,0 ml. Foi adicionado, a cada tubo, um volume de 0,9 ml da solução A (2,0 g de tartarato de sódio e potássio; 100,0 g de carbonato de sódio e 500,0 ml de solução de NaOH 1N) e a mistura aquecida em banho maria a 50 ºC por 10 minutos. Após resfriamento, foi adicionado um volume de 0,1 ml da solução B (2,0 g de tartarato de sódio e potássio; 1,0 g de CuSO4.5H2O e
10,0 ml de 1N NaOH), seguindo-se homogeneização. Após repouso por 10 minutos,à temperatura ambiente, foi adicionado 3,0 ml da solução C (um volume de Folin-Ciocalteau (~2N) para cada quinze volumes de água destilada) em jatos, seguido de agitação vigorosa. Logo após, foi incubado em banho aquecido (50°C) por mais 10 minutos. Após resfriamento, realizou-se a leitura das amostras no espectrofotômetro a 650 nm. Albumina bovina sérica (BSH) foi utilizada como padrão.
+ $ 9 3 56 31
A determinação do DNA foi realizada procedendo-se de acordo com o método de Prasad et al. (1972), que se baseia na medida da fluorescência desenvolvida pelo brometo de etídio ao interagir com os ácidos nucléicos.
agitação, aqueceram-se os tubos em banho a 50ºC, por uma hora. A fluorescência resultante foi lida em espectrofluorímetro, utilizando o comprimento de onda de excitação 365 nm e de emissão 590 nm. Os resultados foram expressos em miligramas de DNA por grama de tecido, utilizando DNA de salmão como padrão.
+ $
>
Foi utilizado ANOVA com a discriminação das médias pelo teste de Duncan.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0 5 10 15 20 25
3 . /" 0 Normal Desnutr.
" – Crescimento corporal de ratos, do nascimento até o 21o dia de vida.
Grupo normal representa ratos filhos de mães normonutridas que receberam
dieta '* & + ", e grupo desnutrido ratos filhos de mães que foram submetidas a
40% de restrição de alimentos em relação à dieta das normonutridas. O peso dos animais desnutridos foi menor a partir do 7º dia (p≤0,05).
O peso encefálico dos animais dos dois grupos também apresentou alteração devido à restrição alimentar. Os animais submetidos a essa restrição apresentaram, aos 21 dias de vida, peso encefálico significativamente menor que os animais sem restrição. O peso encefálico dos animais do grupo desnutrido foi em torno de 85% do peso encefálico dos animais do grupo normal.
4 - Massa corporal e encefálica, medida ao sacrifício, de ratos normonutridos e submetidos à restrição de alimentos. n= 8 Grupo Peso corporal (g) Peso encefálico (g) Normal 41,62±7,01a 1,09±0,04c Desnutrido 24,63±1,13b 0,94±0,06d
"
#
Os conteúdos de proteína e de DNA no cérebro dos animais dos dois grupos (normonutridos e desnutridos), nas figuras 3 e 4, expressos em miligrama de proteína por grama de tecido ou DNA por grama de tecido, não foram diferentes estatisticamente, apesar de os valores dos grupos desnutridos terem sido um pouco menores.
b a
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00
Normal Desnutrido
@
>
/
"
0B
"
" $ – Conteúdo de proteína cerebral em ratos submetidos a dietas
quantitativamente diferentes. Grupo normal representa ratos filhos de mães
normonutridas que receberam dieta '* & + ", e grupo desnutrido ratos filhos de
b a 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 Normal Desnutrido 3 1 / " 0B "
" + – Conteúdo de DNA cerebral em ratos submetidos a dietas
quantitativamente diferentes. Grupo normal representa ratos filhos de mães
normonutridas que receberam dieta '* & + ", e grupo desnutrido ratos filhos
de mães que foram submetidas a 40% de restrição de alimentos em relação à dieta das normonutridas. As médias não foram estatisticamente diferentes (p≤0,05)
A relação entre a quantidade de proteína por DNA, figura 5, expressa em miligrama de proteína por miligrama de DNA, não foram estatisticamente diferentes nos grupos normonutridos e desnutridos.
b a 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 Normal Desnutrido @ > B3 1 / " B " 0
" – Relação proteína por DNA no cérebro de ratos submetidos a dietas
quantitativamente diferentes. Grupo normal representa ratos filhos de mães
normonutridas que receberam dieta '* & + ", e grupo desnutrido ratos filhos de
" $ %%
A marcação da Tityustoxina gama foi eficiente e parece não alterar o tamanho da molécula, uma vez que aparece um único pico coincidente tanto para a avaliação da proteína (absorbância) quanto para a radioatividade (cpm) (figura 6), mostrando que a toxina foi efetivamente marcada, pois só há uma quantidade significativa de radioatividade nos tubos que contém toxina.
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
4
4
0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000
. Abscpm
" ? CPerfil de filtração de 99mTc-Tityustoxina-γ em coluna de gel Sephadex G-10
(13,0 cm x 1,0 cm ), eluída com salina. Abs – absorbância em 280 nm. Cpm – contagem por minuto dos tubos contendo, cada um, 1,0 ml da solução eluída.
Quanto ao rendimento da marcação esse também foi satisfatório, obteve-se em torno de 86% de rendimento de marcação. Uma vez que feitas as cromatografias para separação dos contaminantes a amostra de tityustoxina gama marcada apresentou cerca de 2% de tecnécio não reduzido livre ( 99mTcO4- )e cerca de 12%
de tecnécio reduzido livre (99mTcO2) . E após a cromatografia em Sephadex G10
"
A quantidade de toxina radioativa que fica retida no cérebro dos animais desnutridos é menor que nos animais normonutridos. Os animais desnutridos os quando receberam a mesma dose (2,0 mg/kg de peso corporal) administrada por via intraperitoneal.
a
b
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40
NE DE
<
5
6
" A – Porcentagem de radiação recuperada em cérebro de ratos
submetidos a dietas quantitativamente diferentes (grupo NE representa ratos
filhos de mães normonutridas que receberam dieta '* & + ", e grupo DE os
ratos filhos de mães que foram submetidas a 40% de restrição de alimentos em relação à dieta das normonutridas), injetados intraperitoneamente com
mesma dose de TiTX-γ marcada com 99mTc (2,0 mg/Kg). As barras
sobrescritas com letras distintas apresentam diferença estatística (p ≤ 0,05).
%%&
'( ) (
γγγγ
* +,
menor (32%) do que aquela encontrada nos animais do grupo NC (grupos de animais controle, sem estímulo de 99mTc-TiTX-γ). Efeito semelhante da desnutrição se observa quando o sistema colinérgico foi estimulado por 99mTc-TiTX-γ. A quantidade de ACh encontrada foi significativamente menor (31%) em DE do que a encontrada em NE (grupos de animais estimulados).
Os teores de ACh encontrados nos cérebros dos animais, expressos em nmol de ACh por grama de tecido, figura 8, foram estatisticamente maiores (cerca de 45%) nos animais que receberam estímulo de 99mTc-TiTX-γ do que nos animais que receberam injeção de meio utilizado para marcação com tecnécio.
a b a c 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00
NC NE DC DE
D
/
0B
"
" – Teor de acetilcolina ACh (nmol) por grama de tecido, na ausência
(controle) e presença (estimulado) de 99mTc-TiTX-γ no cérebro de ratos
submetidos a dietas quantitativamente diferentes (grupo normal representa ratos filhos de mães normonutridas que receberam dieta ad libtum e grupo desnutrido os ratos filhos de mães que foram submetidas a 40% de restrição de alimentos em relação à dieta das normonutridas). NC e NE representam os animais normais controle e estimulado respectivamente e DC e DE representam os animais desnutridos controle e estimulado respectivamente. As barras sobrescritas com letras distintas apresentam diferença estatística (p ≤ 0,05).
Expressando-se quantidade de ACh cerebral em nmol por mg de DNA (figura 9) e em nmol de ACh por mg de proteína (figura 10), de modo semelhante ao ocorrido com os valores por grama de tecido, os animais desnutridos, estimulados por
99m
Tc-TiTX-γ, apresentaram menores teores de acetilcolina no cérebro do que os normonutridos estimulados e maiores do que os não estimulados.
c a b a 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50
NC NE DC DE
D B3 1 / B " 0
" 9 – Teor de acetilcolina expressa em nmol de ACh por mg de DNA,
na ausência (controle) e presença (estimulado) de 99mTc-TiTX-γ, no cérebro de
d a
b
a
0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
NC NE DC DE
D
B@
>
/
B
"
0
" – Teor de acetilcolina expressa em nmol de ACh por mg de proteína,
na ausência (controle) e presença (estimulado) de TiTX-γ marcada 99mTc, no
cérebro de ratos submetidos a dietas quantitativamente diferentes (grupo
normal representa ratos filhos de mães normonutridas que receberam dieta '*
& + ", e grupo desnutrido os ratos filhos de mães que foram submetidas a 40%
de restrição de alimentos em relação à dieta das normonutridas). NC e NE representam os animais normais controles e estimulados respectivamente e DC e DE representam os animais desnutridos controles e estimulados respectivamente As barras sobrescritas com letras distintas apresentam diferença estatística (p ≤ 0,05).
a c b a 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00
NC NE DC DE
2
E
D
" – Teor de acetilcolina total em cérebro de ratos, expresso em nmols
de ACh, na ausência (controle) e presença (estimulado) de 99mTc-TiTX-γ. Os
animais foram submetidos a dietas quantitativamente diferentes (grupo normal
representa ratos filhos de mães normonutridas que receberam dieta '* & + ", e
grupo desnutrido os ratos filhos de mães que foram submetidas a 40% de restrição de alimentos em relação à dieta das normonutridas). NC e NE representam os animais normais controles e estimulados respectivamente e DC e DE representam os animais desnutridos controles e estimulados respectivamente. As barras sobrescritas com letras distintas apresentam diferença estatística (p ≤ 0,05).
normonutridos, como descrito na literatura (WINICK e NOBLE, 1966). Nessa fase, período da amamentação, ocorre o “surto do crescimento” e é o período em que há maior crescimento e divisão celular. Em ratos, esse período cessa na época do desmame (WINICK, 1970), portanto, a restrição alimentar imposta nessa fase leva a diminuição da síntese protéica, número e tamanho das células (WINICK e NOBLE, 1966; SANTOS e MORAES-SANTOS, 1979).
Desta forma, poder-se-ia esperar que entre os efeitos adversos da desnutrição a barreira hematoencefálica se encontrasse mais permeável. Hipótese que não pôde ser confirmada no presente estudo, uma vez que não foram feitos estudos de permeabilidade da barreira.
Quando se observou a concentração de proteína e a de DNA por grama de tecido percebeu-se que não houve diferença significativa entre os grupos normonutridos e desnutridos. Isso é de se esperar, já que se trata de um cérebro menor nos animais desnutridos, mas de constituição macromolecular semelhante. Os dados semelhantes da relação proteína/DNA confirmam essa conclusão. Observações semelhantes foram relatadas anteriormente (DOBBING, 1968; MORAES-SANTOS, 1980).
A porcentagem de captação da toxina radioativa pelos cérebros dos animais desnutridos mostrou-se bem menor que nos animais normonutridos. Apesar de esse dado contrariar a hipótese de uma possível alteração na barreira hematoencefálica, o resultado não surpreende, uma vez que os animais desnutridos teriam menor quantidade de sítios de ligação de alta afinidade para a TiTX- γ , os canais de sódio (BASS, 1970; CRAGG, 1972), presentes nas sinapses que por sua vez dependem da arborização dendrítica do neurônio (CORDERO et al., 2003). Esses canais são proteínas transmembranas presentes na membrana celular dos neurônios e estão agrupados em discretas áreas da membrana axonal, nos nodos de Ranvier, onde a bainha de mielina é interrompida (MASSACRIER et al., 1990). Durante a fase crítica do desenvolvimento ocorre o maior incremento dos processos (dendritos e axônios) e formação de sinapses (CALLEY e MAXWELL, 1968). Estudos morfológicos indicam alterações provocadas pela desnutrição nestas estruturas (BASS, 1970; CRAGG, 1972) com diminuição das ramificações dendríticas (MORGAN e WINICK, 1985). Dessa forma, pode-se aceitar que neurônios de animais desnutridos possam existir em menor quantidade e terão menos locais para ligação da toxina do escorpião, portanto, retendo menor quantidade de toxina proveniente da circulação sangüínea. Essa conclusão é corroborada pelo fato de que menor número de sinapses levaria a uma menor concentração de neurotransmissores no cérebro dos animais desnutridos. Este fato foi demonstrado pela avaliação de maior quantidade de acetilcolina no tecido nervoso dos animais normonutridos do que em animais desnutridos.
alteração que diminui a eficiência da síntese de acetilcolina (NASCIMENTO et al., 1991).
Dessa forma nossos dados indicam que a TiTX-γ atravessa a barreira hematoencefálica de animais jovens, promove acúmulo de acetilcolina, e estão de acordo com os estudos de Guidine et al (2008) que sugere que toxinas do veneno do escorpião !"# #$%%"&' "#( sobre o sistema nervoso central, desempenham um papel mais importante no aparecimento de sintomas graves, o que explica o aumento da incidência de envenenamentos graves em pacientes jovens.
A desnutrição neonatal diminuiu o teor de acetilcolina no cérebro provavelmente por diminuir a arborização dendrítica e por conseqüência o número de sinapses colinérgicas.
A estimulação do sistema central colinérgico pela 99mTc-TiTX-γ, avaliado pelo teor de acetilcolina, foi menos intensa no animal desnutrido do quem no animal normonutrido.
TiTX-γ atravessa a barreira hematoencefálica e acumula-se em maior quantidade no cérebro de animais normonutridos do que no cérebro de animais desnutridos, provavelmente porque esses últimos possuem menos sítios de ligação para a toxina.
.
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