EFEITOS DA OBESIDADE NO SISTEMA
CALICREÍNA-CININAS:
ESTUDO DOS RECEPTORES B
1E B
2DE CININAS EM TECIDO
ADIPOSO HUMANO E MURINO.
SÃO PAULO 2006
ALINE MOURÃO HILZENDEGER
EFEITOS DA OBESIDADE NO SISTEMA
CALICREÍNA-CININAS:
ESTUDO DOS RECEPTORES B
1E B
2DE CININAS EM TECIDO
ADIPOSO HUMANO E MURINO.
SÃO PAULO 2006
HILZENDEGER, ALINE MOURÃO
EFEITOS DA OBESIDADE NO SISTEMA CALICREÍNA-CININAS: ESTUDO DOS RECEPTORES B1 E B2 DE CININAS EM TECIDO ADIPOSO HUMANO E MURINO. Aline Mourão Hilzendeger – São Paulo, 2006.
XXII, 90 f.
Tese (Mestrado) – Universidade federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular.
Título em Inglês: Effects of obesity on the kallikrein-kinin system: Studies of human and murine B1 and B2 kinin receptors in adipose tissue.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE BIOFÍSICA
Chefe do Departamento de Biofísica: Dr.a Viviane Louise Andree Nouailhetas
Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular:
EFEITOS DA OBESIDADE NO SISTEMA
CALICREÍNA-CININAS:
ESTUDO DOS RECEPTORES B1 E B2 DE CININAS EM TECIDO ADIPOSO
HUMANO E MURINO.
Presidente de Banca: Prof. Dr. João Bosco Pesquero
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Cláudio Miguel da Costa Neto Prof.a Dr.a Lila Missae Oyama
“É melhor tentar e falhar, que preocupar-se a ver a vida passar. É melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se fazendo nada até o final. Eu prefiro na chuva caminhar, que
em dias tristes em casa me esconder. Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver!"
“A gratidão é uma das poucas coisas que, se efetivamente reconhecida, nos
conforta e nos realiza, pela satisfação que temos em saber que alguém nos é grato. Espero que este conforto e esta satisfação se apoderem de meus queridos mestres ao receberem minha gratidão e meu apreço.”
Agradeço ao Doutor Antônio Cechelli de Mattos Paiva por toda sua dedicação à UNIFESP/EPM, ao Departamento de Biofísica e aos alunos.
Dedico este trabalho aos meus pais, Sidney e Ana Maria,
os quais sempre incentivaram todos os esforços para que
Dedico este trabalho a minha querida irmã Audrey,
por todo carinho, atenção e amizade, e
Dedico ao professor João Bosco Pesquero
que possibilitou a realização deste trabalho
ao lutar pela pesquisa no Brasil e
Ao Dr. João Bosco Pesquero pela orientação, e principalmente por acreditar e confiar em meu trabalho.
À Dra. Therezinha B. Paiva pelo exemplo de seriedade e dedicação à pesquisa.
A Dra. Suma I. Shimuta pela atenção e colaboração neste trabalho.
A todos os professores colaboradores do Departamento de Biofísica.
Aos funcionários do Departamento de Biofísica.
Ao Técnico de Laboratório Nelson A. Mota, pela fundamental colaboração na realização dos experimentos e pelo grande exemplo de dedicação e humildade.
Aos colegas do laboratório Alessander, Ana Camila, Edson, Elton, Fabiana, Felipe, Juliana, Kely, Liliam, Paola, Raphael, Regiane e Vanessa e aos colegas de outros laboratórios Carolina, Edgar, Eliete, Jamille, Nelson Pacheco e Renan pela amizade e colaboração na realização do trabalho.
Ao professor José Antônio, à Daniela e ao Eduardo pelo auxílio com os tecidos humanos.
À Karina Abe e ao Marcelo Mori, pela fundamental colaboração neste trabalho.
DEDICATÓRIA ... VII
AGRADECIMENTO ... XI
SUMÁRIO ... XIII
ÍNDICE DE FIGURAS ... XV
RESUMO ... XXIII
1. INTRODUÇÃO ... 2
2. REVISÃO DA LITERATURA ... 5
2.1 Sistema Calicreína-Cininas ... 5
2.2 Leptina ... 9
3. OBJETIVOS ... 13
3.1 Geral: ... 13
3.2 Específicos: ... 13
4. MATERIAIS ... 15
4.1 Tecido adiposo humano ... 15
5. MÉTODOS ... 23
5. 2 Western Blotting ... 28
5.3 Estudo funcional dos receptores de cininas em tecidos de camundongo ... 30
5.4 Estatística ... 33
6. RESULTADOS ... 35
6.1 Expressão dos receptores de cininas em camundongos ... 35
6.2 Expressão dos receptores de cininas em tecido humano ... 39
6.3 Quantificação dos receptores por Western Blotting ... 46
6.4 Estudo Fisiológico em Músculo Liso de Camundongo ... 48
7. DISCUSSÃO ... 63
8. CONCLUSÃO ... 75
Figura 1: Esquema ilustrativo do sistema calicreínas-cinina ... 06
Figura 2: Esquema ilustrativo da ação da leptina ... 10
Figura 3: Expressão do RNAm de B1 em diferentes órgãos e tecidos de camundongos
selvagens (magro) e ob/ob. ... 36
Figura 4: Expressão do RNAm de B2 em diferentes órgãos e tecidos de camundongos
selvagens (magro) e ob/ob. ... 37
Figura 5: Expressão do RNAm do receptor B2 de cininas em tecido adiposo branco
visceral humano ... 40
Figura 6: Expressão do RNAm do receptor B2 de cininas em tecido adiposo branco
Figura 7: Expressão do RNAm do receptor B1 de cininas em tecido adiposo branco
visceral humano ... .42
Figura 8: Expressão do RNAm do receptor B1 de cininas em tecido adiposo
subcutâneo humano ... 43
Figura 9: Expressão do RNAm dos receptores B1 e B2 de cininas em TAB visceral
humano em relação a idade ... 44
Figura 10: Expressão do RNAm dos receptores B1 e B2 de cininas em TAB subcutâneo
humano em relação a idade ... 45
Figura 11: Western Blotting: quantificação do receptor B1 em tecido muscular liso
(fundus de estômago) de camundongos WT e ob/ob ... 47
Figura 12: Western Blotting: quantificação do receptor B2 em tecido muscular liso
(artéria aorta) de camundongos WT e ob/ob ... 48
Figura 14: Curva cumulativa de BK em artéria aorta abdominal de camundongos selvagens e ob/ob ... 50
Figura 15: Gráfico representando a resposta máxima à BK por curva cumulativa do agonista em artéria aorta abdominal de camundongos WT e ob/ob ... 50
Figura 16: Curva cumulativa de BK em artéria aorta abdominal de camundongos magros e tratados com dieta hiperlipídica por 90 dias (sobrepeso) ... 52
Figura 17: Resposta máxima de curva cumulativa em resposta à BK em artéria aorta abdominal de camundongos selvagens (magros) e selvagens tratados com dieta hiperlipídica por 90 dias. ... 52
Figura 19: Resposta máxima dos valores obtidos através de curva cumulativa de DBK em artéria aorta abdominal de camundongos selvagens tratados com dieta normal e com dieta hiperlipídica por 90 dias ... 54
Figura 20: Curva cumulativa de BK em fundus de estômago de camundongos selvagens e obesos ... 56
Figura 21: Resposta máxima dos valores de curva cumulativa de BK em fundus de estômago de camundongos selvagens e obesos ... 56
Figura 22: Curva cumulativa de DBK em fundus de estômago de camundongos magros e obesos ... 57
Figura 23: Resposta máxima da curva cumulativa de DBK em fundus de estômago de camundongos selvagens e obesos ... 58
camundongos WT e WT tratados com dieta hiperlipídica ... 59
Figura 26: Curva cumulativa de DBK em fundus de estômago de camundongos WT e WT tratados com dieta hiperlipídica ... 60
Figura 27: Resposta máxima da curva cumulativa de DBK em fundus de estômago de camundongos WT e WT tratados com dieta hiperlipídica ... 60
Figura 28: Curva controle de norepinefrina em aorta ... 61
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ABESO Associação Brasileira para o Estudo da Obesidade e da Síndrome Metabólica
BK Bradicinina
CCh Carbacol
CEDEME Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para a Medicina e Biologia
DBK Des-Arg9-Bradicinina
DEPC Dietilpirocarbonato
DNA Ácido desoxirribonucléico
DNAse Deoxirribonuclease
dNTPs Desoxirribonuleotídeos trifosfatado
ECA Enzima conversora de angiotensina
GAPDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
H2O Água
IL-1 Interleucina 1-Beta
LBK Lis-Bradicinina
LPS Lipopolissacarídeo
M Molar
mA mili Amperes
NF-B Fator de transcrição nuclear - kappa B
NE Norepinefrina
NO Óxido nítrico
ob/ob Camundongo deficiente em leptina por alteração do gene ob
ob-R Receptor de leptina
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PGs Prostaglandinas
RNA Ácido ribonucléico
RNAm Ácido ribonucléico mensageiro
RNAse Nuclease que catalisa a hidrólise de RNA
RT Transcritase reversa
RT-PCR Reação em Cadeia da Polimerase com transcrição reversa
TAB Tecido Adiposo Branco
TAM Tecido Adiposo Marrom
TNF- Fator de Necrose Tumoral - tipo alfa
V Volts
RESUMO
Objetivo: Estudar o efeito da obesidade na regulação do sistema calicreína-cininas por meio da expressão dos receptores B1 e B2 de cininas em humanos e camundongos, e
as alterações na síntese e funcionalidade dos receptores em tecidos murinos.
Métodos: Foram coletados tecido adiposo branco humano e diferentes tecidos de camundongo. Desses tecidos foi extraído o RNA e analisada a expressão dos receptores de cinina por meio da reação em cadeia da polimerase em tempo real. Tecidos como estômago e aorta de camundongos ob/ob e selvagens foram utilizados para extração de proteínas e estudos fisiológicos. Por Western Blotting estudou-se a quantidade de receptor produzida nos animais. O fundus de estômago e aorta abdominal foram utilizados para se obter registros de contrações isométricas para determinação da potência e eficácia dos agonistas em camundongos obesos e magros. Foram aplicadas doses crescentes cumulativas dos agonistas peptídicos dos receptores B1 e B2, bradicinina e des-Arg9-bradicinina. Resultados: Nos experimentos
de PCR em tempo real, a expressão gênica dos receptores B1 e B2 de cininas foi
mostrada alterada em alguns tecidos dos animais deficientes na produção do hormônio leptina em relação ao controle. Nos tecidos: adiposo branco, aorta, fígado, hipotálamo e estômago, a expressão do receptor B1 apresentou-se aumentada, porém em tecido
cardíaco e tecido adiposo marrom, essa estava diminuída. O receptor B2 teve
expressão diminuída em tecido adiposo branco e hipotálamo. Nos demais tecidos estudados não houve alteração da expressão do receptor B2. Em humanos, esses
Resumo
Nos tecidos dos camundongos obesos a resposta aos agonistas dos receptores B1 e
B2, bradicinina e des-Arg9-bradicinina, respectivamente, foi mostrada diminuida. Em
fundus de estômago foi observada diminuição significativa na resposta ao agonista BK
em animais obesos e tratados com dieta hiperlipídica. Tais efeitos podem ser devido às conseqüências do aumento excessivo de peso, como inflamação crônica apresentada nesses animais, ou mesmo devido a diabetes tipo II, a qual consiste em uma patologia diretamente relacionada à obesidade, sugerida neste trabalho como fator capaz de alterar a ação do sistema calicreína-cininas em determinados tecidos. Conclusão:
Análises de expressão gênica mostraram que a obesidade afeta os receptores de cinina em diversos tecidos de camundongo, assim como em humanos. Análises fisiológicas funcionais mostraram diminuição na resposta ao agonista de B1 em animais
Introdução
1. INTRODUÇÃO
A obesidade é um problema crescente, em sua maioria resultante de vários fatores ambientais, porém apresenta uma suscetibilidade genética determinada. É uma síndrome complexa que envolve inúmeros defeitos de sinalização de vários fatores reguladores do apetite e da energia homeostásica. Essa síndrome é um grande fator de risco para o desenvolvimento de diabetes tipo II, entre outros distúrbios, como doença coronária cardíaca (Scott, 2003), abalos no sistema nervoso e hipertensão (Ramos e cols., 2003). A leptina consiste em um hormônio secretado pelo tecido adiposo branco que possui ação central hipotalâmica e relaciona-se com o controle da ingestão de alimentos, representando um laço funcional entre os sistemas endócrino e imune (Siegmund e cols., 2002). Camundongos ob/ob se tornam obesos por não produzir leptina devido à alteração em seu gene ob. O tratamento destes animais com substâncias exógenas como a leptina reverte o quadro de hiperfagia e obesidade (Pelleymounter e cols., 1995).
pelo tecido adiposo era de estoque de energia na forma de triglicerídeos. No entanto, o
clássico “feedback” endócrino (Kennedy, 1953) propôs pela primeira vez uma regulação endócrina mediada por esse tecido. Atualmente, o tecido adiposo é considerado um órgão endócrino (Trayhurn, Beattie, 2001) ao secretar hormônios como leptina, resistina e adiponectina.
As proteínas secretadas por adipócitos podem participar em vários sistemas, incluindo homeostase glicêmica, inflamação, balanço energético, metabolismo lipídico, fibrinólise e no controle do tônus vascular (Arner, 2003).
Algumas citocinas, como a leptina, IL-6 e TNF-, são produzidas no tecido adiposo branco. Alguns trabalhos mostram que interleucinas e o TNF- reduzem o comportamento de procura de alimentos após administração periférica e central dessas citocinas (Langhans, Hrupka, 1999), o que poderia sustentar a hipótese de mediadores inflamatórios estarem relacionados à ingestão de alimentos.
O sistema calicreína-cininas relaciona-se, dentre muitos outros processos, com a captação de glicose pela célula muscular esquelética e adipócitos (Dietze, 1982), controle da pressão arterial (Schölkens, 1996), bem como a indução e manutenção do processo inflamatório (Bhoola e cols., 1992). Os efeitos agudos desse sistema devem-se, principalmente, à ligação da bradicinina ao seu receptor do subtipo B2. No entanto, os efeitos pró-inflamatórios crônicos devem-se, em grande parte, à
ação da des-Arg9-bradicinina em um subtipo de receptor de cininas denominado receptor B1. Resultados recentes de nosso laboratório mostraram a presença deste
Introdução
podem estar alteradas em indivíduos obesos. Dessa forma, o objetivo deste trabalho consistiu em estudar possíveis implicações da obesidade na expressão dos receptores de cininas em tecido adiposo humano e murino. Procurou-se também analisar as alterações nas respostas fisiológicas destes receptores em camundongos selvagens e
ob/ob, assim como a funcionalidade dos receptores B1 e B2 de cininas no tecido
2.
REVISÃO
DA
LITERATURA
2.1 Sistema Calicreína-Cininas
O sistema calicreína-cininas está envolvido nos processos de transmissão de dor (Dray; Perkins, 1993), controle da pressão arterial (Schölkens, 1996), no processo de geração e manutenção do estado inflamatório (Bhoola e cols., 1992), atuando também no trato gastrointestinal (Allogho e cols., 1998). Além disto, este sistema tem um importante papel no processo de captação de glicose (Dietze, 1982). Fazem parte deste sistema: 1- os substratos protéicos precursores, chamados de cininogênios; 2 - as enzimas que hidrolisam estes substratos, denominadas calicreínas; 3 - as cininas, peptídeos efetores desse sistema, que são os produtos da ação das calicreínas sobre os cininogênios; 4 - dois receptores distintos que foram caracterizados farmacológica e molecularmente, denominados receptores B1 e B2 de
cininas; 5- enzimas que degradam as cininas (cininases) liberando os agonistas do receptor B1 ou peptídeos inativos.
Todas as enzimas denominadas calicreínas são capazes de liberar cininas a partir do substrato cininogênio. A cinina liberada pela calicreína plasmática humana, de rato e camundongo é a bradicinina (BK). As calicreínas de tecido humano liberam lis-bradicinina (LBK ou calidina), e a dos roedores liberam BK (Bhoola e cols., 1992). A bradicinina, como a calidina, é agonista do receptor B2, podendo ser degradada pelas
Revisão da Literatura
principal cininase do tipo I presente em tecidos é a carboxipeptidase M, enquanto no plasma é a ação da carboxipeptidase N que induz a liberação das des-Arg-cininas. É amplamente conhecido que os peptídeos vasoativos BK e DBK, agonistas dos receptores B2 e B1 de cininas, respectivamente, causam acentuada vasodilatação via
liberação do fator relaxante endotelial, o óxido nítrico (NO) (Marceu, 1995).
Fig. 1: Esquema ilustrativo do sistema calicreínas-cininas, englobando a síntese das cininas a partir do cininogênio, a degradação pelas cininases I e II, e os receptores B1 e B2 apresentando agonistas e antagonistas distintos. Baseado em Ramalho, 2000.
Acredita-se que a maior parte das ações da BK e LBK seja mediada pelo receptor B2. Esse receptor possui baixa afinidade à DBK ou des-Arg10-calidina. Foi
determinada a seqüência desse gene verificando-se que o mesmo codifica para uma proteína de 366 aminoácidos, com massa molecular de 41 kDa, pertencendo à família
dos receptores que apresentam 7 domínios transmembrânicos acoplado à proteína G (McEachern e cols., 1991).
Esse receptor tem se mostrado envolvido no controle da pressão arterial, na excreção de sal e também no volume de água a ser excretado (Mukai e cols., 1996). Emanueli e colaboradores (1999) demonstraram que os animais nocaute B2 tornam-se
hipertensos aos 60 dias de nascimento, apresentando também taquicardia e hipertrofia cardíaca.
Além da presença de ambos os tipos de receptores de cininas em vasos, o receptor B2 também está localizado em células de músculo esquelético de ratos
(Figueroa e cols., 1996). É conhecido que a BK é liberada pelo músculo esquelético humano durante o exercício (Wicklmayr e cols.,1988), sendo que uma importante função descrita para o receptor B2 é a sua relação com a captação de glicose em
tecido muscular esquelético (Dietze, 1982). Recentemente demonstrou-se que a captação de glicose em alguns tecidos periféricos atribuida à leptina (Minokoshi e cols., 1999) parece ser mediada por BK e NO (Shiuchi e cols., 2001).
O receptor B1 tem sido descrito em várias espécies, principalmente em
músculos lisos de coelho, rato, camundongo, cão, porco e também de humanos (Hall, 1992), porém na maior parte dos tecidos sua expressão não é constitutiva. Em camundongos esse receptor tem grande afinidade pela des-Arg9-bradicinina e des-Arg9-Leu8-bradicinina, antagonista do receptor B1.
O receptor B1 de camundongo foi clonado e caracterizado pelo nosso grupo em
Revisão da Literatura
para uma proteína de 334 aminoácidos e exibindo sete domínios transmembrânicos, estrutura molecular parecida com a do receptor B2. Foi ainda demonstrado que os
camundongos tratados com LPS (lipopolissacarídeo presente em bactérias Gram-negativas) exibiram um aumento da transcrição desse receptor no coração, fígado e pulmão.
Em 2000, Pesquero e colaboradores geraram o camundongo nocaute para o receptor de cininas, observando que estes animais apresentavam hipoalgesia e resposta inflamatória alterada.
Os receptores B1 das diferentes espécies descritas têm alta similaridade entre
si, como também têm a sua expressão aumentada em processos inflamatórios. Vários autores tendem a classificar o receptor B1 como um receptor de processos
inflamatórios (Bhoola e cols., 1992). O aparecimento desse receptor após o tratamento com LPS (Pesquero e cols., 1996), além da ativação do principal fator de inflamação o NF-B, pelo agonista do receptor B1 (Schanstra e cols., 1998), sugerem um papel
desse receptor na inflamação. Estudos demonstraram que a transcrição do receptor B1
é ativada pelo TNF (fator de necrose tumoral) e o agonista B1 é também capaz de
liberar o TNF e IL-1 de macrófagos de camundongo (Tiffany; Burch, 1989).
Além de suas conhecidas funções, recentemente nosso grupo demonstrou uma participação do receptor B1 de cininas na modulação endócrina. Foi observado que
camundongos nocaute para o receptor B1 de cininas apresentam uma baixa expressão
aumentar os níveis plasmáticos de leptina em camundongos selvagens. Foi visto também que o receptor B1 pode, ainda, modular as ações da insulina em adipócitos.
Porém, o mecanismo responsável por esse processo, bem como a função fisiológica do receptor B1 no tecido adiposo branco, são aspectos que ainda precisam ser estudados.
2.2 Leptina
A leptina é um hormônio secretado pelo tecido adiposo branco e relacionado com o controle da ingestão de alimentos pela sua ação central no hipotálamo ventro-medial, onde inibe a biossíntese e a secreção de neuropeptídeo Y, o mais importante estimulador do apetite (Stephens e cols., 1995). O gene que codifica o hormônio leptina, denominado gene ob, foi amplamente estudado e seqüenciado, mostrando que uma mutação pontual nesse gene resulta em um fenótipo de obesidade mórbida com grande incidência de diabetes tipo II (Zhang e cols., 1994).
Revisão da Literatura
Os camundongos portadores da mutação em homozigose no gene da leptina são denominados animais ob/ob e apresentam, além de um grau exagerado de obesidade, hiperfagia, hipotermia, hiperinsulinemia, resistência à insulina e infertilidade (Muoio e cols., 2002). Há demonstrações de que o camundongo deficiente de leptina
(ob/ob) possui crescente suscetibilidade ao choque endotóxico (Madiehe e cols., 2003),
cujo receptor B1 relaciona-se intrinsecamente, sugerindo uma suposta relação entre
leptina e sistema calicreína-cinina nos processos de obesidade, inflamação e diabetes tipo II.
Figura 2: Leptina e regulação do tecido adiposo. A leptina age centralmente para diminuir a ingestão de alimentos e modular os metabolismos de glicose e de gordura. Efeitos periféricos em células-T, ilhotas pancreáticas e outros tecidos também foram demonstrados. A leptina age principalmente no hipotálamo. Outras conexões existem entre o hipotálamo e outras regiões do cérebro. Retirado de Friedman; Halaas, 1998.
Objetivos
3.
OBJETIVOS
3.1 Geral:
Estudar o efeito da obesidade na regulação do sistema calicreína-cininas por meio da expressão dos receptores B1 e B2 de cininas em humanos e camundongos e
ensaios fisiológicos em tecidos murinos.
3.2 Específicos:
Analisar as diferenças na expressão dos receptores de cininas em tecido adiposo branco humano de indivíduos obesos e magros.
Estudar as diferenças na expressão e tradução dos receptores de cininas em diferentes tecidos de camundongos selvagens e ob/ob.
Avaliar possíveis alterações nas respostas fisiológicas aos agonistas dos receptores B1 e B2 de cininas em tecidos com diferença de expressão de camundongos
Materiais
4.
MATERIAIS
4.1 Tecido adiposo humano
Utilizou-se tecido adiposo de pacientes do sexo feminino. Os grupos foram divididos de acordo com o índice de massa corpórea (IMC) dos indivíduos.
Pacientes com presença de comorbidades como diabetes, uso de corticóide, metformina, tiazolinedionas e anoréxigenos não foram incluídos no estudo.
As amostras teciduais foram obtidas de pacientes referidos eletivamente para cirurgia por laparotomia aberta ou videolaparoscopia na Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Hospital Geral de Goiânia (HGG), Hospital do Servidor Público Estadual do Estado de São Paulo, Hospital do Brigadeiro e Hospital da Beneficência Portuguesa.
Consentimento livre e informado
Os pacientes que preencham os critérios acima foram abordados durante internação para cirurgia eletiva. Tais indivíduos foram esclarecidos sobre o procedimento de retirada das amostras: espécimes cirúrgicos de 1,0 - 2,0g, extraídos durante a indução anestésica, sem prejuízo do ato cirúrgico e para a saúde do paciente. Também foram informados sobre os inúmeros estudos prévios que usaram material semelhante em diferentes países. O modelo do termo de consentimento livre e informado consistiu naquele fornecido pela Comissão de Ética em Pesquisa da UNIFESP (Projeto n. 0638/06).
Materiais
Na noite anterior à cirurgia eletiva, o paciente foi entrevistado para preenchimento de protocolo com dados de identificação e antropométricos. Dados sobre valores de exames laboratoriais diagnósticos, exames radiológicos, comorbidades e drogas em uso foram extraídos do prontuário médico.
Durante o ato cirúrgico, após anestesia geral, extraíram-se amostras de tecido adiposo de aproximadamente 2,0g ao nível da cicatriz umbilical ou infra-costal (tecido adiposo subcutâneo) e gordura omental (tecido adiposo visceral). As amostras tissulares foram imediatamente armazenadas em gelo seco e estocadas a -800 C.
4. 2 Tecidos adiposo e muscular liso de camundongo
4. 2. 1 Animais
Foram utilizados nos experimentos camundongos da linhagem C57Bl/6 magros (heterozigotos ou homozigotos selvagens) e obesos ob/ob (homozigotos para a mutação no gene ob), machos, idade aproximada de 3 meses.
O grupo de animais tratados com dieta hiperlipidica consistiu em camundongos da linhagem C57Bl/6, machos, com idade aproximada de 4 meses.
4.3 Procedência dos Materiais, Reagentes e Compostos.
Materiais
Materiais plásticos como tubos de polipropileno (Corning).
Dieta Hiperlipídica:
Foram utilizadas: ração hiperlipídica com 45% Kcal de gordura e ração controle com 10% Kcal de gordura. A ração foi fornecida pela empresa americana Research Diets Inc. (20 Jules Lane New Brunswich, NJ 08901).
Sais e reagentes:
- Sigma Chemical Co.
albumina de soro bovina (BSA); DEPC (dietilpirocarbonato); DTT (ditiotreitol);
- Gibco BRL/ Life Techonologies
hexanucleotídeos randômicos (RH); TRizolReagent;
- Merck S/A
Ácido clorídrico fumegante (HCl); EDTA (ácido etilenodiamino tetraacético); álcool isopropílico; cloreto de cálcio dihidrogenado (CaCl2.2H2O); cloreto de magnésio
(MgCl2); cloreto de potássio (KCl); cloreto de sódio (NaCl); clorofórmio; duodecil sulfato
de sódio (SDS); etanol absoluto; fosfato de potássio monobásico (KH2PO4); fosfato de
sódio dibásico (Na2HPO4); fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4); hidróxido de sódio
Materiais
- Amersham Pharmacia Biotech
dNTPs (deoxiribonucleotídeos);
- Outros
TEMED e persulfato de amônio (APS) (Amresco).
Óligonucleotídeos:
Invitrogen, Life Techonologies, IDT – Integrated DNA Technologies
Anticorpos:
Santa Cruz Biotechnology, Inc.
Eletroforese:
Marcadores de massa molecular: Raimbow (Life Techonologies); Poliacrilamida (Long Ranger)(Biowhittaker Molecular Applications);
Tampão de corrida Blue Dextran (PE Applied Biosystems);
Membrana de polivinildifluoreto - PVDF (Hybond-P, Amersham Pharmacia Biotech);
Filme Fotográfico (Amersham Pharmacia Biotech);
Soluções: reveladora e fixadora (Kodak)
Kits:
Kit TaqMan - Applied Biosystems
Kit de reagentes (dosagem de proteínas) da BIORAD - baseado na metodologia de Lowry.
Kit de detecção para Western Blotting da Amersham - ECL Plus™ Western
Blotting Detection Reagents.
4.4 Composição das Soluções
- Tris-EDTA (TE 1x): Tris-HCl 10 mM pH 7,4; EDTA 1 mM (pH 8,0).
- Água DEPC (0,1%): Para 1 L de água deionizada adiciona-se 1mL de DEPC e autoclava.
-Krebs-bicarbonato: NaCl 122.0mM, KCl5.90mM, MgCl2 1.25mM, NaHCO3
15.0mM, C6H12O6 11.0mM, CaCl2 1,25mM (preparada previamente a cada
experimento) pH 7,4.
Western Blotting:
-Tampão Concentrador: 6,06g de Tris, 0,4g de SDS, H2O MilliQ q.s.p. 100m
(pH 6,8).
-Tampão Separador: 36,33g de Tris, 0,8g de SDS, H2O MilliQ q.s.p. 200mL
(pH 8,8).
-Bis-acrilamida 30%: 10 g de Acrylamida/Bis 29:1 em 30 mL de H2O MilliQ .
Materiais
-Tampão de Corrida 10x: 30g de Tris, 144g de Glicina, 10g de SDS, H2O
MilliQ q.s.p 1L (pH 8,3).
-Tampão de Transferência: 100 mL de Tampão de Corrida 10x, 200 mL de Metanol, 700 mL de H2O MilliQ.
-PBS–T (0,1% Tween 20): 200 mL de PBS 5x, H2O MilliQ q.s.p. 1L.
Adiciona-se 1 mL de Tween 20.
-Solução de bloqueio: 1g de Leite Molico Desnatado (Nestlé), diluído em 20 mL de PBS-T.
-Solução de Anticorpo Primário 1:1000: 10uL de anticorpo primário diluído em 10 mL de PBS-T.
-Solução de Anticorpo Secundário 1:2000: 5uL de anticorpo secundário diluído em 10 mL de PBS-T (protegido da luz).
-Solução de Streptavidina-HRP 1:10000: 1uL de Streptavidina-HRP diluído em 10 mL de PBS-T (protegido da luz).
-Tampão de amostra (Tris-HCL 500 mM, pH 6.8, glicerol, SDS (sódio dodecil
sulfato, Sigma Co, EUA) 10%, -mercaptoetanol (Merk Co, EUA), bromofenol azul
0,05%).
4.5 Agonistas
Os peptídeos bradicinina (RPPGFSPFR) e des-Arg9-bradicinina (RPPGFSPF) foram adquiridos da Calbiochem (EMD Biosciences, Inc.). O carbacol (CCh), a norepinefrina (NE) da Sigma Chemical Co.
Métodos
5.
MÉTODOS
5.1 Expressão dos receptores de cininas humano e murino
5. 1. 1 Extração de RNA total
RNA de Camundongo
Para a extração do RNA total, os camundongos foram anestesiados com uretana (6L/g de peso corporal) e seguiu-se a retirada de sangue do plexo orbital. Após serem sacrificados, retirou-se por abertura da caixa torácica os seguintes órgãos: tecido adiposo branco epididimal, tecido adiposo marrom interescapular, fígado, fundo de estômago, baço, músculo gastrocnêmio, coração, artéria aorta, rim, hipotálamo. Todos os tecidos foram congelados imediatamente em nitrogênio líquido. Posterirormente, os tecidos foram homogenizados, separadamente, em presença de TRizol (Life Technologies) na proporção de 100 mg de tecido por mL de TRizol. Para a separação de proteínas, DNA e RNA presentes nos homogenatos dos tecidos, 200 l de clorofórmio por mL de TRizol utilizado foi adicionado. Essa mistura foi agitada por inversão por 15 segundos e centrifugada a 4000 giros por 15 minutos a 4 ºC. Após centrifugação, a fase superior que contém o RNA foi recolhida, sendo adicionado 500 L de isopropanol 99% por mL de TRizol, e novamente centrifugado por 20 min a 4°C.
O RNA precipitado foi então lavado com etanol 70% preparado em H20 tratada com
dietilpirocarbonato 0,1% (H20 DEPC), seco a temperatura ambiente e ressuspendido
Métodos
RNA Humano
Os tecidos coletados em cirurgia e imediatamente congelados, foram posteriormente homogeneizados em presença de TRizol (Life Technologies) na proporção de 100mg de tecido por mL de TRizol. Seguiu-se o mesmo protocolo de extração realizado nos tecidos de camundongo.
5. 1. 2 Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
O RNA extraído foi tratado com DNAse I (Invitroven) para excluir a presença de DNA genômico na amostra. Utilizou-se 1 g de RNA tratado com DNAse I para a reação de transcrição reversa (RT) com 1 L da enzima M-MLV RT (Invitrogen) a fim de se obter o cDNA. Adicionou-se à amostra 2 L de tampão de PCR (10x), 1,0 L de desoxirribonucleotídeos (dNTPs) na concentração de 10 mM, 1,0 L de MgCl2 (50 mM),
primers randômicos, para uma concentração final de 50 g, 40 unidades de RNAse OUT (inibidor de RNAse), e água DEPC completando 20 L em cada reação.
O programa realizado no termociclador (Eppendorf) consistiu em uma etapa de dez minutos mantendo as amostras a 20°C, seguida por 42°C, durante 45 min e 95°C por 5 min. Após a reação de obtenção do cDNA a partir do RNA extraído, as amostras foram mantidas a 4°C por 10 minutos.
associada a um fluoróforo FAM (5 M) específicos para B1 ou B2 ou GAPDH e água
milliQ autoclavada para completar 15 L de volume final. O programa utilizado consistiu em uma etapa de dois minutos a 50°C e dez minutos a 95°C. Posteriormente, eram feitos quarenta ciclos de 95 ºC por 15 segundos e 60 ºC por 1 minuto.
Para amplificação do cDNA correspondente ao receptor B1 e B2 utilizou-se
dois oligonucleotídeos específicos e uma sonda, também específica, marcada com o
fluoróforo FAM e associada ao “quencher MGB”. Como controle endógeno foi realizado
o mesmo protocolo com oligonucleotídeos e sonda específicos para o cDNA de -actina (para murinos) e GAPDH (para cDNA humano). O que diferencia essa técnica de um PCR comum é a presença de uma sonda complementar à seqüência do amplicon e que está associada a um agente fluorescente. Devido a atividade exonucleásica da DNA polimerase, a cada fragmento amplificado, uma molécula fluorescente é liberada no meio. Com isso, ciclo a ciclo, a intensidade de fluorescência pode ser medida pelo aparelho ABI 7000 (Applied Biosystems), correspondendo à quantidade de moléculas amplificadas e, proporcionalmente, ao número de cópias iniciais.
Esse método possibilitou a análise em tempo real da amplificação de um fragmento específico dos genes em estudo, permitindo a quantificação refinada da expressão do RNA mensageiro desses genes.
Os dados foram expressos como Ciclo limite (Ct ou “Cycle treshold”), ou
Métodos
O primeiro parâmetro utilizado é o valor de limiar da curva de amplificação obtida pela amplificação do cDNA de interesse (valor foi chamado de Ct). Houve a normalização dos valores subtraindo-se o Ct obtido da amplificação específica do receptor B1 do valor do controle endógeno, com obtenção do Ct. Devido à
característica logarítmica desse valor, houve utilização do parâmetro 2-Ct, para expressão dos dados em análises. O mesmo procedimento foi utilizado para a expressão do receptor B2 de cininas.
Para a amplificação de uma região específica dos genes dos receptores de cininas, oligonucleotídeos que são complementares a diferentes éxons desses genes foram utilizados. Posteriormente foi realizada a reação de transcrição reversa ou reação de polimerase em cadeia quantitativa (RT-PCR). Para a normalização da reação, bem como um controle da qualidade e quantidade de RNA utilizado, uma reação multiplex foi realizada, utilizando-se também oligonucleotídeos e sonda fluorescente específicos para genes endógenos.
Oligonucleotídeos e sonda para receptores de cininas murino no Real Time:
Oligo Forward: 5’-CCCTTCCTCTGGGTCCTCTT-3’
Oligo Forward: 5’-CCATACAAAACCCCAGCTGAA-3’
Receptor B1 Reverse: 5’-CTTTGGTTAGAAGGCTGTAGCTTCA-3’
Sonda: 5’-CACAGGAACCCAGACAG-3’
Oligo Forward: 5’-CCCTTCCTCTGGGTCCTCTT-3’
Receptor B2 Reverse: 5’-GAAGAACACGCTGAGGACAAAGA-3’
Sonda: 5’-CCGCACTGGAGAAC-3’
Oligonucleotídeo e sonda para actina (controle endógeno) de murino no Real Time:
Oligo Forward: 5’- CTGGCCTCACTGTCCACCTT-3’
actina Reverse: 5’- CGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3’
Sonda: 5’- CTGATCCACATCTGCT -3’
Oligonucleotídeos e sonda para receptores de cininas humano no Real Time:
Oligo Forward: 5’-ACCTCAGCCTCTCGAGTTGCT -3’
Receptor B1 Reverse: 5’-TGGTTGGAGGATTGGAGCTCTA -3’
Sonda: 5’-CTGTGCATGGCATCAT- 3’
Métodos
Oligo Forward: 5’-CAGGATGTGAACCCAGTAGGACTAT -3’
Receptor B2 Reverse: 5’-AGCACTGAAGATGATTGGAGGATAC -3’
Sonda: 5’-TGCAAAGTCCCCACCC -3’
Oligonucleotídeos e sonda para GAPDH (controle endógeno) humana no Real Time:
Oligo Forward: 5’- GGGCAGCCCAGAACATCAT-3’
GAPDH Reverse: 5’- CCGTTCAGCTCTGGGATGAC-3’
Sonda: 5’- TTGGCAGCACCAGTGG -3’
5. 2 Western Blotting
Com intuito de se determinar a quantidade relativa e massa molecular dos receptores nos tecidos como fundus de estômago, aorta abdominal e tecido adiposo, foi realizada a técnica de Western Blotting.
Os tecidos foram então homogenizados em tampão RIPA (50mM de Tris-Hcl pH 6,8, 1mM EDTA, 1% NP40, 0,25% de deoxilato sódico, 150mM NaCl) e inibidor de protease. A concentração de proteína presente nos diferentes tecidos foi determinada utilizando-se um kit de reagentes da BIORAD, baseado na metodologia de Lowry e cols. (1951). Neste procedimento, 25 L da amostra a ser dosada foi colocada em contanto com 125 L de uma solução alcalina de tartarato de cobre (solução A da BIORAD) e 1000 L do reagente de Folin (solução B). A intensidade de absorbância da mistura resultante foi determinada a 750 nm, após 15 minutos de reação.
5.2.1 Eletroforese em gel SDS/Poliacrilamida
A eletroforese foi desenvolvida segundo o método descrito por LaemmLi (1970). Alíquotas de 50 µg de proteínas extraídas dos tecidos foram posteriormente adicionadas ao tampão de amostra (Tris-HCL 500 mM, pH 6.8, glicerol, SDS 10% (sódio dodecil sulfato- Sigma Co, EUA), -mercaptoetanol e bromofenol azul 0,05%. A seguir, as amostras foram aquecidas em banho seco, a 100 C, por 4 minutos. O mesmo procedimento foi empregado com as soluções padrão. As amostras assim preparadas foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida 13% sob uma tensão de 90 V.
5.2.2 Transferência e Revelação
Métodos
incubada com solução bloqueadora 5% de leite desnatado (Molico, Nestlé) em tampão Tris 200mM, pH 7,5, NaCl 500mM, contendo 0,1% de detergente Tween 20, durante 1 hora à temperatura ambiente. Posteriormente, realizou-se incubação overnight a 4 C, com o anticorpo policlonal (produzido em cabra) anti-B1 (1:1000) ou anti-B2 (1:1000)
sob agitação orbital fraca. Após a incubação com o anticorpo primário, a membrana foi lavada cinco vezes com tampão PBS-tween e incubada com o anticorpo secundário (1:2000) anti-cabra marcado com estreptavidina-peroxidase (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) por 3 horas sob agitação orbital fraca. A enzima ligada ao anticorpo secundário foi utilizada em conjunto com um agente quimioluminescente do kit ECL. A incubação com o kit proporciona uma reação, a qual produz fluorescência proporcional à quantidade de proteína ligada a membrana. Após 5 minutos de incubação da membrana com o kit realizou-se a revelação. Um filme fotográfico foi colocado contra a membrana permitindo que a exposição do filme à luz da reação criasse a imagem dos anticorpos ligados as respectivas proteínas. O filme foi posteriormente revelado e fixado.
5.3 Estudo funcional dos receptores de cininas em tecidos de camundongo
Este estudo foi realizado a partir de registros isométricos da variação da tensão nos tecidos, vascular (aorta) e não vascular (fundus de estômago).
5. 3. 1 Preparações de Músculo Liso
Registro de Contração Isométrica - Aorta Abdominal
Após a decaptação do animal, o tórax foi aberto, a aorta abdominal foi removida e colocada em uma placa de Petri contendo solução de Krebs-bicarbonato (NaCl 122,0mM, KCl 5,90mM, MgCl2 1,25mM, NaHCO3 15,0mM, C6H12O6 11,0mM,
CaCl2 1,25mM), pH 7,4 a 37 C. Após a remoção de tecidos gordurosos e conjuntivos
adjacentes, anéis de 1 cm de comprimento, com endotélio foram cortados e montados em cubetas de 5,0 mL de capacidade, contendo solução de Krebs mantida a 37 0,5 ºC e borbulhada com uma mistura gasosa de O2 (95%) e CO2 (5%). O segmento de
anel do tecido foi suspenso entre alças de tungstênio, a qual se inseriu na luz do anel aórtico. A preparação foi submetida à tensão de 1g. Os anéis foram posteriormente equilibrados por um período de 30 minutos.
Após esse período de equilíbrio da preparação, os anéis de aorta abdominal foram tratados com KCl (60 mM) para estimulação dos receptores e estabilização da preparação. A contração máxima do tecido foi obtida com o tratamento com norepinefrina (NE) a 10-6M.
Os anéis da aorta foram estimulados pela adição de concentrações crescentes do agonista em estudo, sem intervalo ou lavagens entre as doses (curva cumulativa). A concentração dos agonistas (BK e DBK) administrada na preparação variou entre 10-11M e 10-5M. A presença de endotélio foi determinada ao final de cada
experimento pela adição de NE (1M) e registro de relaxamento pela acetilcolina (10
Métodos
Os cálculos de resposta ao agonista foram realizados considerando máxima a resposta a NE, ou seja, 100%. O valor obtido nos experimentos foi apresentado em relação a essa resposta máxima.
Registro de Contração Isométrica - Fundus de Estômago
Após a decaptação do animal, o fundus do estômago foi removido, preservando-se mucosa e nervos. O órgão foi dividido em duas tiras, lavado em solução de Krebs-bicarbonato e suspenso em cuba de vidro de 5 mL, preenchida com solução de Krebs-bicarbonato a 37C e aerada (95% de O2 e 5% de CO2) com tensão
de 0,5g. As tiras de estômago permaneceram sob estas condições por 90 minutos, e posteriormente foram estimuladas com KCl (80mM) até atingir a estabilização da preparação.
Para a construção das curvas concentração-resposta foram adicionadas concentrações crescentes do agonista em estudo. Tais curvas foram cumulativas, consistindo em concentrações aplicadas de forma crescentes do agonista sem lavagem entre as doses administradas.
O tecido foi estimulado com concentração dos agonistas (BK e DBK) variando entre 10-11M e 10-5M. Os cálculos de resposta ao agonista foram realizados
considerando-se a resposta ao Carbacol (Cch) como máxima, 100%, sendo o valor da resposta ao agonista apresentado em relação a esta resposta máxima.
Os gráficos obtidos em ambos os experimentos (aorta e fundus de estômago) foram analisados utilizando-se o programa “GraphPad Prism” 3.0
cada experimento, o valor de EC50 (equivalente à concentração que produz 50% do
efeito máximo), o valor de LogEC50 (logaritmo negativo da concentração molar do
agonista que produz 50% do efeito máximo) e o efeito máximo induzido pelo agonista (Emax).
Com a finalidade de demonstrar que a alteração nas respostas eram específicas aos agonistas e respectivos receptores em estudo, foi realizada uma curva com NE (em aorta) e Cch (em estômago) com concentrações variando de 10-11M e 10
-5M.
5.4 Estatística
Os resultados foram expressos pela média (nos experimentos de funcionalidade) e erro (nos gráficos de expressão gênica e contração de tecido murino em curva-cumulativa dos agonistas dos receptores de cininas). As diferenças entre os grupos foram determinadas utilizando-se test “t” não pareado e ANOVA. Os valores de
Resultados
6.
RESULTADOS
Obesidade, diabetes tipo II e hipertensão compõem a síndrome metabólica em humanos, a qual envolve defeitos de sinalização de vários fatores reguladores do apetite e da energia homeostásica. Camundongos que não produzem leptina (ob/ob) se tornam obesos por serem hiperfágicos e apresentarem gasto energético menor.
Os experimentos realizados nesse estudo consistiram em analisar a regulação do sistema calicreína-cininas em modelos de obesidade por meio de alterações de expressão, quantidade de proteína (quantificação dos receptores) e atividade dos receptores de cininas em modelo de camundongos obesos ob/ob. Também foi analisada a expressão dos receptores B1 e B2 de cininas em tecido
adiposo branco visceral e subcutâneo de humanos.
6.1 Expressão dos receptores de cininas em camundongos
Inicialmente o RNA mensageiro (RNAm) de diferentes tecidos dos camundongos magros e obesos foi utilizado para se demonstrar a presença dos receptores B1 e B2 de cininas. A quantidade expressa foi analisada com a finalidade de
se estudar as alterações em conseqüência da obesidade em camundongos ob/ob.
Resultados
Figura 4. Expressão do RNAm de B2 em diferentes órgãos e tecidos de camundongos selvagens (magro) e ob/ob. Camundongo selvagem (barras brancas; n=5), camundongo ob/ob (barras pretas; n=7). ND = não detectado. Os dados são mostrados através do cálculo da expressão relativa entre o RNAm de B2 e o controle endógeno actina. *=P<0,05.
Em tecido adiposo branco epididimal, observou-se um aumento significante (*P<0,05) na expressão do receptor B1 nos camundongos ob/ob comparado aos
controles (Fig. 3). Entretanto, para o receptor B2, houve uma diminuição significante da
Resultados
A expressão do receptor B1 em animais ob/ob, quando comparado aos
controles, mostra diminuição significante no tecido adiposo marrom. Já a expressão do receptor B2 não apresentou diferenças significantes entre os grupos.
Na artéria aorta, o aumento da expressão do receptor B1 em camundongos
ob/ob comparado aos controles foi significante (*P<0,05), mas em relação ao receptor
B2 não houve diferença.
No coração houve diminuição significante (*P<0,05) na expressão do receptor B1 em camundongos ob/ob, quando comparados aos controles, o que não
ocorreu com a expressão do receptor B2.
Não foi possível detectar a expressão do receptor B1 no fígado de
camundongos selvagens, porém observou-se uma indução significante da expressão desse receptor em camundongos obesos. Para o receptor B2 não houve diferenças
entre os grupos.
A determinação da expressão do receptor B1 em músculo esquelético de
camundongos ob/ob demonstrou uma tendência a um menor valor em relação aos controles, entretanto este valor não foi significante. Da mesma forma não houve diferença na expressão do receptor B2.
No hipotálamo, observou-se um aumento significante na expressão do receptor B1 (*P<0,05) e uma diminuição significante da expressão do receptor B2 nos
camundongos ob/ob em relação aos controles.
B1. Entretanto, não foi observada nenhuma diferença na expressão do receptor B2
nesse tecido.
6.2 Expressão dos receptores de cininas em tecido humano
Para o estudo da expressão de receptores B1 e B2 de cininas em tecido
adiposo humano, amostras do tecido foram coletadas em cirurgia e sendo essas imediatamente congeladas. Estes tecidos foram posteriormente homogeneizados separadamente, feito o DNA complementar e realizada a reação em cadeia da polimerase em tempo real, seguindo o mesmo protocolo utilizado nos tecidos de camundongo.
Os indivíduos foram classificados segundo o índice de massa corpórea (IMC) que consiste em numa relação entre peso e altura, sendo um cálculo que possibilita a sua correlação com a quantidade de gordura corporal. De acordo com a ABESO (Associação Brasileira para o Estudo da Obesidade e da Síndrome Metabólica), o IMC é calculado dividindo-se o peso corporal (em kilogramas) pela altura (em metros) elevada ao quadrado. O valor é expresso em Kg/m2. Indivíduos com IMC <18,5 Kg/m2 têm baixo peso e risco aumentado de doenças; o IMC entre 18,5 e 25
Kg/m22 é considerado normal; a faixa entre 25 e 29,9 Kg/m2 é denominada pré-obesidade ou sobrepeso sendo os riscos de complicações ainda baixos. A partir do IMC de 30 Kg/m2 pode-se considerar obesidade propriamente dita com morbidade e
mortalidade aumentando exponencialmente. Entre 30 e 34,9 Kg/m2 denomina-se obesidade grau I. De 35 a 39,9 Kg/m2 considera-se obesidade grau II. A obesidade
Resultados
O estudo foi realizado em tecido adiposo visceral e subcutâneo humano com o intuito de se analisar a expressão dos receptores B1 e B2 de cinina em indivíduos
magros (IMC < 30 Kg/m2), obesos graus I e II (IMC entre 30 e 39,9 Kg/m2), e obesos grau III (IMC 40 Kg/m2), seguindo a classificação acima citada.
magros obesos I e II obesos III
0 2 4 6 8 10 12 Ex pr es sã o re la tiv a do re ce pt or B2 /GAP DH (u .a .)
Figura 5: Expressão do RNAm do receptor B2 de cininas em tecido adiposo branco visceral humano. Os grupos foram determinados de acordo com o grau de obesidade calculado pelo IMC. Os dados são mostrados através do cálculo da expressão relativa entre o RNAm de B2 e o controle endógenoGAPDH.
Em tecido adiposo visceral o receptor B2 apresentou em indivíduos magros
uma expressão média, relativa ao controle endógeno, de 2,79 unidades arbitrárias (u.a.). Em indivíduos obesos graus I e II, a expressão do receptor tendeu a diminuição, sendo em média 2,38 u.a. Na obesidade grau III ou obesidade mórbida o receptor B2
No tecido adiposo subcutâneo (Fig. 6), a expressão do receptor B2 de cininas
se mostrou, em média, maior no grupo controle (com IMC < 30), correspondendo a 3,85 u.a. Neste grupo com IMC <30 Kg/m2, os valores de expressão foram bastante variados devido a fatores individuais dos pacientes. No grupo de indivíduos com obesidade graus I e II, a expressão de B2 foi, em média de 2,13 u.a. Os obesos
mórbidos apresentaram diminuídos em relação ao controle apresentando uma média de expressão relativa de 1,2 u.a.
magro obeso I e II obeso III
0 2 4 6 8 10 Ex pr es sã o re la tiv a de B2/ G AP DH (u .a .)
Figura 6: Expressão do RNAm do receptor B2 de cininas em tecido adiposo branco subcutâneo humano. Os grupos foram determinados de acordo com o grau de obesidade calculado pelo IMC. Os dados são mostrados através do cálculo da expressão relativa entre o RNAm de B2 e o controle endógenoGAPDH.
O mesmo experimento foi realizado analisando-se a expressão do receptor B1 de cininas no tecido adiposo branco visceral e subcutâneo desses pacientes. Foi
Resultados
com índice de massa corpórea menor que 30 Kg/m2, apresentou a expressão do receptor B1 em média 11,95 u.a. (Fig. 7).
M agro obesos I e II obesos III
0 10 20 30 40 50 Ex pr es sã o re la tiv a do re ce pt or B1 /G AP DH (u .a .)
Figura 7: Expressão do RNAm do receptor B1 de cininas em tecido adiposo branco visceral humano. Os grupos são relativos ao grau de obesidade calculado pelo IMC. Dados mostrados através do cálculo da expressão relativa entre o RNAm de B1 e o controle endógenoGAPDH.
O tecido adiposo branco subcutâneo também foi utilizado para o estudo de expressão do receptor B1. Esse receptor mostrou-se diminuído nos indivíduos com IMC
entre 30 e 40 Kg/m2, apresentando em média uma expressão de 2,95 u.a.
Observou-se, porém, um leve aumento do valor nos obesos mórbidos, em relação ao grupo de obesos graus I e II, em média 5,7 u.a. Os indivíduos magros apresentaram uma grande variação na expressão do receptor B1 em tecido adiposo
magro obeso I e II obeso III 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Ex pr es sã o re la tiv a de B1 /G A PD H (u .a .)
Figura 8: Expressão do RNAm do receptor B1 de cininas em tecido adiposo subcutâneo humano. Os grupos são relativos ao grau de obesidade calculado pelo IMC. Dados mostrados através do cálculo da expressão relativa entre o RNAm de B1 e o controle endógenoGAPDH.
O grupo de indivíduos magros apresentou, em 50% dos indivíduos estudados, maior expressão do receptor de cinina B2, quando comparados aos demais.
Apesar do grupo em estudo ser formado por somente mulheres, cada pessoa pode possuir outros fatores capazes de alterar a expressão do receptor. Dessa forma, também foi estudado o efeito da idade no mesmo grupo de pacientes (Figuras 9 e 10).
Resultados
IMC< 30 Kg/m2 30 < IMC< 39,9 Kg/m2 IMC > 40 Kg/m2 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040
Receptor B1 idade < 45 anos Receptor B2 idade < 45 anos Receptor B1 idade > 45 anos Receptor B2 idade > 45 anos
E xp re ss ão d o s re ce p to re s/ GAP DH ( u .a .)
Figura 9: Expressão do RNAm dos receptores B1 e B2 de cininas em tecido adiposo branco visceral humano. Os dados foram analisados segundo a idade dos indivíduos (inferior ou superior a 45 anos) e em relação ao IMC. Dados mostrados através do cálculo da expressão relativa entre o RNAm de B1 e B2 e o controle endógenoGAPDH.
Os pacientes estudados com IMC menor que 30, ou pertencentes ao grupo de indivíduos magros, apresentaram, em geral, uma expressão semelhante dos receptores de cinina. Dois dos pacientes estudados, com idades de 46 e 81 anos, apresentaram maior expressão de B1 em relação às demais. O paciente mais idoso
apresentou também expressão aumentada de B2 em relação ao grupo. Tais alterações
podem ser devidas a outros fatores que deverão ser estudados no prontuário das pacientes.
Obesos nos graus I, II e III tiveram a expressão relativa do receptor B1
variando independente da idade das pacientes em estudo. Porém, o receptor B2
IMC< 30 Kg/m2 30 < IMC< 39,9 Kg/m2 IMC > 40 Kg/m2 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014
0.016 Receptor B
1 idade < 45 anos Receptor B2 idade < 45 anos Receptor B1 idade > 45 anos Receptor B2 idade > 45 anos
E xp re ss ão d o s re ce p to re s/ GAP DH ( u .a .)
Figura 10: Expressão do RNAm dos receptores B1 e B2 de cininas em tecido adiposo branco subcutâneo humano. Os dados foram analisados segundo a idade dos indivíduos (inferior ou superior a 45 anos) e em relação ao IMC. Dados mostrados através do cálculo da expressão relativa entre o RNAm de B1 e B2 e o controle endógenoGAPDH.
A expressão dos receptores de cininas em tecido adiposo branco subcutâneo dos mesmos indivíduos também foi analisada (Fig. 10).
Nos pacientes magros, a expressão relativa do receptor B2 variou de acordo
com idade, sendo que indivíduos com idade inferior a 45 anos apresentaram maior expressao do receptor no tecido adiposo subcutâneo.
Resultados
6.3 Quantificação dos receptores por Western Blotting
Através da técnica de Western Blotting, a quantidade de receptores de cininas foi estudada com o intuito de se analisar a produção das proteínas correspondentes aos receptores em tecidos de animais magros (camundongo WT) e obesos (ob/ob) em homogenato de aorta e estômago.
A presença do receptor B1 foi detectada em animais WT e ob/ob e foi
observado um aumento de cerca de quatro vezes na produção desse receptor em animais obesos (Fig. 11). Este resultado está de acordo com o aumento significativo na expressão do B1 nestes animais (Fig. 3). Portanto, os processos intermediários entre a
produção do RNA mensageiro, que ocorre no núcleo celular, e sua tradução (de RNAm a proteína) no citoplasma, ocorrem de forma que a quantidade de proteína produzida, assim como a sua expressão, seja mantida aumentada em camundongos obesos ob/ob.
WT1 WT2 WT3 ob/ob1 ob/ob2 ob/ob3
Figura 11: Western Blotting: quantidade do receptor de B1 em tecido muscular liso (fundus de estômago) de camundongos C57Bl6 WT (magros; n=3) e ob/ob (obesos; n=3). Foi utilizado o anticorpo primário anti- B1 na proporção 1:1000 e secundário na proporção 1:2000.
Pelo resultado mostrado na figura 12 podemos observar que a expressão do receptor B2 em fundus de estômago dos animais magros e obesos foi observado que
cerca de duas vezes na produção do receptor B2 em animais ob/ob. Este resultado não
corresponde aos valores observados de expressão do RNA mensageiro deste receptor (Figura 4), onde foi obtida uma expressão relativa semelhante entre os grupos. Esta discrepância poderia ser explicada como uma conseqüência da obesidade, onde o processamento do RNA mensageiro pode estar alterado, causando diminuição na tradução, e por conseqüência produção menor da quantidade de receptores nestes camundongos ob/ob. Minn e colaboradores, em 2005, demonstraram que fatores transcricionais, como a variação no splicing, interferem na produção de proteínas em casos de obesidade, resistência insulínica e diabetes, como visto pelo grupo em relação ao aumento na produção de insulina.
WT1 WT2 WT3 WT4 ob/ob1 ob/ob2 ob/ob3 ob/ob4 ob/ob5
Figura 12: Western Blotting: quantidade do receptor B2 em tecido muscular liso (fundus de estômago) de camundongos C57Bl6 WT (magros; n=3) e ob/ob (obesos; n=3). Foi utilizado o anticorpo primário anti- B2 na proporção 1:1000 e secundário na proporção 1:2000.
Em artéria aorta foi estudada a presença do receptor B2. Por meio da técnica
utilizada observou-se que neste tecido a produção do receptor B2 apresenta-se
semelhante em animais magros e obesos (Fig. 13). Tal informação mostra que as etapas entre a produção do RNA mensageiro (Fig. 4) e a tradução deste em proteína não proporcionaram alterações significativas devido a obesidade nos camundongos
Resultados
WT1 WT2 WT3 ob/ob1 ob/ob2 ob/ob3
Figura 13: Western Blotting: quantidade do receptor B2 em tecido muscular liso (artéria aorta) de camundongos C57Bl6 WT (magros; n=3) e ob/ob (obesos; n=3). Foi utilizado o anticorpo primário anti- B2 na proporção 1:1000 e secundário na proporção 1:2000.
6.4 Estudo Fisiológico em Músculo Liso de Camundongo
Registro de Contração Isométrica - Aorta Abdominal
Anéis de aorta abdominal foram utilizados para o estudo fisiológico da atividade dos receptores de cinina neste tipo de tecido muscular liso de camundongos magros (WT) e obesos (ob/ob). Os animais utilizados nesse trabalho apresentaram em média o peso de 61,18g no grupo de camundongos deficientes em leptina (n=7) e em média 32,75g nos animais selvagens (n=7).
A contração (resposta) considerada máxima foi obtida com o tratamento com norepinefrina (NE) a 10-6 molar (M). A NE tem ação no sistema cardiovascular relacionando-se ao aumento do influxo de cálcio e causando vasocontrição periférica mediada por receptores alfa adrenérgicos.
Em aorta abdominal observou-se que os camundongos obesos apresentam uma menor resposta ao receptor B2 de cininas, ao se comparar com os camundongos controle
(selvagens, magros).
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0 10 20 30 40 50 WT ob/ob
log [BK]10M
P or ce nt ag em d o ef ei to d e B K /NE ( % )
Figura 14: Curva cumulativa de Bradicinina em artéria aorta abdominal de camundongos selvagens (magros) e ob/ob (obesos). Camundongo selvagem (n=7), camundongo ob/ob (n=7). Os dados mostrados correspondem ao cálculo do valor obtido através da resposta à BK em relação ao valor de NE (resposta máxima). WT ob/ob 0 10 20 30 40 50 60 70 * E fe ito M áx im o de B K e m a or ta B K /NE (% )
Figura 15: Gráfico representando a resposta máxima à Bradicinina por curva cumulativa do agonista em artéria aorta abdominal de camundongos selvagens (n=7), e ob/ob (n=7). Os dados mostrados correspondem ao cálculo do valor obtido através da resposta à BK em relação ao valor de 10µM de NE (resposta máxima). p= 0,0375, portanto p < 0.05.
Resultados
A afinidade do agonista pelo seu receptor (LogEC50) foi semelhante entre os
grupos, sendo de -6,8 para os WT e ob/ob. Este valor de LogEC50 demonstra que a
diferença de resposta entre os grupos não foi devida a afinidade do agonista BK com o receptor B2. (Fig. 14). A resposta máxima ao agonista do receptor B2 correspondeu a
dose 10-5M de bradicinina (em relação à NE), sendo o valor em WT equivalente a 45,93%, e em obesos, 31% (*P <0,05, fig. 15).
Quando o agonista do receptor B1, des-Arg9-bradicinina foi administrado em
artéria aorta abdominal de camundongos selvagens e ob/ob não foi detectada nenhuma resposta da preparação, demonstrando a ausência do receptor B1.
Foram realizados registros de contração isométrica em preparações de animais selvagens tratados por noventa dias com dieta hiperlipídica. Tais animais apresentam, após três meses, um aumento de peso, porém não atingiram níveis de obesidade mórbida como os animais deficientes em leptina (ob/ob). O peso dos animais selvagens tratados com ração controle consistia em média 27 gramas e após o tratamento passou a 30 gramas (n=5). Os animais tratados com dieta hiperlipídica possuíam no início do estudo peso semelhante ao grupo controle, porém atingiram em média 40 gramas (n=5) após três meses ingerindo dieta hiperlipídica. Dessa forma, estes animais selvagens tratados com dieta rica em gorduras apresentaram um aumento de 33% do seu peso.
No gráfico de resposta à bradicinina em anéis de aorta de camundongos WT tratados ou não (controle) com dieta hiperlipídica, observou-se que animais tratados apresentaram uma resposta máxima diminuída, porém não significativa, ao agonista do receptor B2 (Fig. 16).
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0 50 100 150 dieta hiperlipidica controle
log [BK]10M
P or ce nt ag em d o ef ei to d e B K /NE ( % )
Figura 16: Curva cumulativa de Bradicinina em artéria aorta abdominal de camundongos selvagens (magros) e selvagens tratados com dieta hiperlipídica por 90 dias (sobrepeso). Camundongo selvagem (n=4), camundongo em dieta hiperlipídica (n=4). Os dados mostrados correspondem ao cálculo do valor obtido através da resposta à BK em relação ao valor de NE (resposta máxima).
controle dieta hiperlipidica
0 20 40 60 80 100 120 Ef ei to Má ximo d e BK e m ao rta B K/ N E (% )
