3 9 6
Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 3 7 ( 5 ) : 3 9 6 -3 9 9 , set-out, 2 0 0 4
1 . Laboratório de B iologia e Fisiologia de Insetos e Xenodiagnóstic o do Instituto de Patologia Tropic al e Saúde Públic a da Universidade Federal de Go iás, Goiânia, GO. 2 .Departamento de Químic a da Universidade Federal de São Carlo s, São Carlo s, SP.
Apo io Financ eiro : CNPq, FAPESP, CAPES, OPAS, FUNAPE.
En d e r e ço p a r a co r r e sp o n d ê n ci a : Dr. Io nize te Gar c ia da Silva. De pto Mic r o b io lo gia, Imuno lo gia, Par asito lo gia e Pato lo gia/IPTSP/UFG, Caixa Po stal 1 3 1 , 7 4 0 0 1 -9 7 0 Go iânia, GO.
Tel: 5 5 6 2 2 0 9 -6 1 2 8 ; Fax:5 5 6 2 2 6 1 -2 0 7 7 . e-mail: io nizete@ iptsp.ufg.br
Rec ebido para public aç ão em 3 1 /5 /2 0 0 4 Ac eito em 1 1 /6 /2 0 0 4
Atividade larvicida de taninos isolados de
Magon ia pu bescen s
St. Hil.
( Sapindaceae) sobre
Aedes aegypti
( Diptera, Culicidae)
Larvicidal activity of tannins isolated of
Ma go nia pube sce ns
St. Hil. ( Sapindaceae)
against
Ae de s a e gypti
( Diptera, Culicidae)
Heloísa Helena Garcia da Silva
1, Ionizete Garcia da Silva
1, Regina Maria Geris dos Santos
2,
Edson Rodrigues Filho
2e
Carmeci Natalina Elias
1RESUMO
Ap re se n ta - se , p e la p ri m e i ra ve z, o e stu d o f i to q u í m i c o d a s f ra ç õ e s la rvi c i d a s, i so la d a s d a Magonia pubesc ens, m o n i to ra d o p e lo e stu d o d e e f i c á c i a so b re la rva s d e 3 ° e stá d i o d e Aedes aegypti, n a b u sc a d e a lte rn a ti va s p a ra o c o n tro le d e sse m o sq u i to e o b te n ç ã o d e e stru tu ra s q u í m i c a s p a ssí ve i s d e a p ri m o ra m e n to d a a ti vi d a d e p e la vi a si n té ti c a d e o u tro s de ri va do s. As f ra ç õ e s b i o a ti va s f o ra m m o n i to ra da s q u i m i c a m e n te a tra vé s de c ro m a to gra f i a de c a m a da de lga da , u ti li za n do c o m o re ve la d o r u m a so lu ç ã o á c i d a d e va n i li n a , e a n a li sa d a s p o r re sso n â n c i a m a gn é ti c a n u c le a r d e h i d ro gê n i o e e sp e c tro m e tri a d e m a ssa s. Os b i o e n sa i o s c o m a s f ra ç õ e s f o ra m re a li za d o s e m q u i n tu p li c a ta , à te m p e ra tu ra d e 2 8 ± 1 ° C, 8 0 ± 5 % d e u m i d a d e re la ti va e f o to f a se d e 1 2 h o ra s. As c o n c e n tra ç õ e s le ta i s e n c o n tra d a s d a f ra ç ã o MP- 9 , q u e a p re se n to u o m a i o r p o te n c i a l la rvi c i d a , CL5 0 e CL9 0, f o ra m d e 3 ,1 e 3 6 ,6 p p m , re sp e c ti va m e n te . To d o s o s e x p e ri m e n to s f o ra m a c o m p a n h a d o s p o r u m a sé ri e c o n tro le , c o n te n d o o m e sm o n ú m e ro d e la rva s.
Pal avr as-chave s: Ta n i n o s. La rvi c i d a . Magonia pubesc ens. Aedes aegypti.
ABSTRACT
Ph yto c h e m i c a l stu d y o f th e la rvi c i d a l f ra c ti o n s wi c h we re c a rri e d o u t f o r th e f i rst ti m e , i so la te d o f th e Magonia pubesc ens, m o n i to re d b y th e stu d y o f e f f i c a c y a ga i n st th e 3rd
la rva l i n sta r o f Aedes aegypti, i n th e se a rc h o f a lte rn a ti ve s f o r th e c o n tro l o f th a t m o sq u i to a n d to o b ta i n stru c tu re s su sc e p ti b le to c h e m i c a l i m p ro vi n g o f th e a c ti vi ty f o r th e syn th e ti c vi a o f o th e r d e ri ve d s. Th e f ra c ti o n s wi th b i o lo gi c a l a c ti vi ty we re m o n i to re d c h e m i c a lly th ro u gh c h ro m a to gra p h y o f th i n la ye r, u si n g a s re ve a li n g a so lu ti o n a c i d o f va n i lli n , a n a lyze d b y n u c le a r m a gn e ti c re so n a n c e o f hydro ge n a n d spe c tro m e try o f m a sse s. Th e b i o a ssa ys wi th th e f ra c ti o n s we re a c c o m p li sh e d wi t f i ve re p li c a ti o n s, c o n tro lle d a t th e te m p e ra tu re o f 2 8 ± 1 ° C, 8 0 ± 5 % o f re la ti ve h u m i d i ty a n d 1 2 h li gh t. Th e f o u n d le th a l c o n c e n tra ti o n s o f th e f ra c ti o n th a t i t p re se n te d th e la rge st p o te n ti a l la rvi c i d a l, MP- 9 , LC50 a n d LC9 0, w e re o f 3 ,1 a n d 3 6 ,6 p p m , re sp e c ti ve ly. All th e e x p e ri m e n ts w e re a c c o m p a n i e d b y a c o n tro l se ri e s, c o n ta i n i n g th e sa m e n u m b e r o f la rva e .
Ke y-words: Ta n n i n s. La rvi c i d a l. Magonia pubesc ens. Aedes aegypti.
Ae d e s a e gyp ti ( Lin,1 7 6 2 ) é atualmente o mosquito que apresenta a maior dispersão em áreas urbanas no mundo. A importânc ia médic a dessa espéc ie está na sua c apac idade vetorial dos quatro sorotipos do vírus da dengue e do vírus a m a r ílic o . As a lta s de n s ida de s e s tã o r e la c io n a da s a o c omportamento sinantrópic o e ao hábito antropofílic o dessa espéc ie. Além disso, sua atividade hematofágic a diurna e a
c o m ple xidade do s c e ntr o s ur b ano s tê m m axim izado o s p r o b l e m a s d o c o m b a te p o r a p l i c a ç õ e s e s p a c i a i s d e insetic idas2 7. Contudo, a perspec tiva de c ontrole desse vetor,
na atualidade, esb ar r a na sua gr ande c apac idade adaptativa a c o ndiç õ es adver sas, c o mo o desenvo lvimento em águas p o l u í d a s2 6, e a q u i e s c ê n c i a d o s o vo s e m a m b i e n te s
inó spito s2 4.
3 9 7 Uma das estratégias para combater a dengue é a eliminação
do vetor através de produtos insetic idas. Como c onseqüênc ia do uso c ontinuado desses produtos surgiram as populaç ões resistentes3 1 3 de A. a e gypti. Além disso, efeitos indesejáveis
desses insetic idas c omo a permanênc ia por longos períodos de te m po no m e io am b ie nte , afe tando o s e c o ssiste m as, estimularam a pesquisa de produtos naturais. Alguns estudos apontam compostos de origem botânica com atividade larvicida e potenc ial para uso no c ontrole5 7 1 0 1 5 1 6 1 9 2 3 2 8 2 9 3 3 de vetores.
A Ma go n i a p u b e sc e n s St. Hil. ( Sapindac e ae ) é uma planta c ar ac ter ístic a do Cer r ado br asileir o1 1 1 2, apr esenta
gr ande de nsidade e m ár e as de te r r e no fr ac o e te m sido aproveitada na c onstruç ão c ivil.
Estudo s anter io r es c o m extr ato s b r uto s etanó lic o s da
M. pub e sce ns mostraram atividade larvicidapara A. a e gypti e
A. a lb o pictus. Mesmo sabendo que as plantas constituem uma fonte incomparável de compostos químicos inovadores, trabalhos envolvendo atividade biológica ou toxicológica de princípios ativos puros18 23 33 são em números inexpressivos, sendo a maioria
das publicações referentes à atividade de extratos brutos7 9 10 28 29 32
o u fr aç õ e s6 1 5 2 8 3 1. Na b ib lio gr afia pe r tine nte , não fo r am
e nc o ntr a do s r e gis tr o s e nvo lve ndo o s e s tudo s s o b r e o s componentes químicos da M. pub e sce ns. Como existe atualmente uma exigênc ia de que pr o duto s de o r igem natur al sej am quimic amente estudado s4, par a e vide nc iar sua e fic ác ia e
segurança de seu uso, este trabalho apresenta pela primeira vez, o estudo fitoquímico da M. pub e sce ns, monitorado pelo estudo de eficácia sobre larvas de A. a e gypti, na busca de alternativas para o c ontrole desse mosquito e obtenç ão de estruturas químic as passíveis de aprimoramento da atividade pela via sintética de outros derivados.
MATERIAL E MÉTODOS
Mater ial vegetal. As c asc as do c aule de M. p u b e sc e n s foram c oletadas na região de Alto Paraíso – Chapada dos Veadeiros – Goiás, no mês de novembro de 2 0 0 1 , e trazidas ao Laboratório de B ioatividade de Plantas, IPTSP/UFG.
Extr ação e fr acio namento . As c asc as foram sec as em estufa de ventilaç ão fo r ç ada, a 4 0 ° C, e mo ídas até b aixa granulo metria. Em seguida, 1 ,4 kg do pó fo i extraído po r p e r c o l a ç ã o c o m e ta n o l ( 7 2 h o r a s ) , p o r du a s ve ze s c onsec utivas, à temperatura ambiente, e o extrato bruto foi filtrado e c onc entrado em evaporador rotativo ( 6 0 ,2 g) . Após os resultados de atividade larvic ida do extrato bruto etanólic o ( e.b.e.)2 8 3 0, sobre A. a e gypti, c erc a de 5 1 ,2 g deste material
foi submetido à c romatografia em c oluna utilizando c omo fase mó ve l o s so lve nte s n-he xano , dic lo r o me tano e me tano l, seguindo a téc nic a de gradiente de polaridade. Foram obtidas nove fraç ões, as quais foram c odific adas c omo MP-1 a MP-9 .
Bio ensaio s. Para a detec ç ão da atividade larvic ida nas fraç ões foram utilizadas larvas de 3 ° estádio de A. a e gyp ti, c r iadas de ac o r do c o m m e to do lo gia j á de finida2 5. Um a
soluç ão-mãe foi preparada c om uma determinada quantidade da fraç ão de interesse, pré-solubilizada em dimetilsulfóxido
( DMSO) e dissolvida em água, numa quantidade sufic iente par a o b te r a c o nc e ntr aç ão de 1 0 0 0 ppm . A par tir de sta so luç ão , a sé r ie de diluiç õ e s fo i pr e par ada par a o b te r soluç ões de c onc entraç ões desejadas. Em 2 5 mL de c ada uma dessas soluç ões foram adic ionadas 2 0 larvas. Os bioensaios fo ram realizado s em quintuplic ata, a 2 8 ± 1 ° C, 8 0 ± 5 % de umidade relativa e fotofase de 1 2 h. Todos os experimentos foram ac ompanhados de uma série c ontrole, c ontendo o mesmo número de larvas em DMSO e água destilada. Os dados obtidos da mortalidade x concentração ( ppm) foram analisados pelo programa SAEG ( Sistema de Análises estatísticas) , em gráfico de Probit, para determinar as concentrações letais ( CL
5 0 e 9 0) e os
respectivos intervalos de confiança.
Análise das fr açõ es bio ativas. As fraç õ es bio ativas foram monitoradas quimic amente através de c romatografia de c amada delgada ( CCD) , utilizando c omo revelador uma soluç ão ác ida de vanilina. Além disso, essas amostras foram analisadas por ressonânc ia magnétic a nuc lear de hidrogênio ( RMN 1H) em um espec trômetro B ruker ARX-2 0 0 , utilizando
c omo solvente c lorofórmio deuterado ( CDCl
3) ou metanol
deuterado ( CD
3OD) , e tetrametilsilano ( TMS) c omo padrão
interno de referência. A análise das frações por espec trometria de massas foi realizada em um espec trômetro QuattroLC – Mic romass, utilizando c omo fonte de ionizaç ão ESI/APCI nos modos negativo e positivo.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Das nove fraç ões obtidas a partir do e.b.e. da M. pub e sc e ns apenas as fraç ões MP-7 , MP-8 e MP-9 apresentaram atividade tóxic a sobre larvas de 3o estádio de A. a e gypti ( Tabela 1 ) .
Com a partiç ão dos extratos e separaç ão c romatográfic a foi possível obter c onc entraç ões letais extremamente baixas em r e laç ão ao s e studo s ante r io r me nte fe ito s c o m o e .b .e .2 8.
Contudo, este apresentou a vantagem de ser hidrossolúvel, simplific ando o preparo da soluç ão para uso.
Ta bela 1 - Ativida de la rvicida da s fra çõ es a tiva s de Magonia pubescens so bre la rva s de terceiro está dio de Aedes aegypti.
Frações CL
50 ( IC 95%) ppm CL90 ( IC 95%) ppm MP7 67,1 ( 60,9 – 71,1) 95,5 ( 90,7 – 104,1) MP8 39,7 ( 22,5 – 26,4) 380,7 ( 250,6 – 477,3) MP9 3,1 ( 0,08 – 6,79) 36,6 ( 25,9 – 89,1) IC 95% - Intervalo de confiança a 95% de probabilidade.
Obs.: não houve morte no grupo controle
Estudos que já evidenc iaram potenc ialidade de uso de fraç ões botânic as para o c ontrole de A. a e gypti, apontam CL5 0 variando de 0 ,1 a 4 9 ppm 1 6 2 3 3 1 3 3, o que permite c onsiderar
que a MP-9 apresentou resultado c oerente c om a literatura.
3 9 8
Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 3 7 ( 5 ) :3 9 6 -3 9 9 , set-out, 2 0 0 4
complexação do agente revelador vanilina com os taninos, é um método fác il e rápido para diagnostic ar a presenç a dessas s ub s tâ n c ia s e m e xtr a to s e fr a ç õ e s , e m b o r a a in da n ã o c onc lusivo para a identific aç ão da c lasse a qual os taninos pertenc em2 2.
Adicionalmente, essas frações também foram submetidas a análises de prospecção para definir a classe de taninos1 4 presentes,
utilizando-se a solução de cloreto férrico. Na presença dessa solução, os taninos hidrolisáveis produzem uma forte coloração azul, enquanto que os taninos condensados ou catéquicos exibem uma forte coloração verde3 4. Nossos testes químicos indicaram a
presença de taninos catéquicos na fração MP-9. Os dados de RMN para essa fração corroboraram os testes químicos. Os espectros de RMN 1H pa r a MP- 9 c o ntê m vá r io s m ultiple to s c o m
deslocamentos químicos para hidrogênios aromáticos entre 6,00 e 8,00ppm, os quais caracterizam os grupos catequinas nestes taninos. Neste mesmo espectro foram também observados sinais para uma série de hidrogênios carbinólicos (
δ
3 ,0 0 a 4 ,5 0 ) correspondendo a hidrogênios H-2 e H-3, bem como a hidrogênios de unidades de carboidratos indicando que parte das catequinas podem estar ocorrendo na forma de glicosídeos. Os espectros de massas obtidos por electrospray nos modos positivos e negativos, mostraram que a fração MP-9 é composta de uma mistura bastante c omplexa de substânc ias. No entanto, uma das substânc ias apresentou [ M+ H]+ a m /z 865 e [ M-H]- a m /z 863. Assim, apartir das análises por espec trometria de massas, uma das substâncias pode ser identificada como uma proantocianidina na forma triméric a ( massa molec ular = 8 6 4 Da) . A estrutura molecular para essa substância, que foi a fração mais promissora da M. pub e sce ns, é mostrada na Figura 1.
As pr o anto c ianidinas são lar game nte distr ib uídas na natureza, em plantas altas, partic ularmente c oníferas, e são também enc ontradas em muitos produtos alimentíc ios8 c omo
c hás, c ac au e sorgo.
Taninos são substâncias fenólicas, solúveis em água, com massa molecular entre 500 e 3000Da. Muitas vezes, são os princípios ativos de plantas empregadas na medicina tradicional para o tratamento de diversas moléstias orgânicas, por apresentarem atividades biológic as c omo a aç ão bac teric ida2 1, fungic ida,
moluscicida e inibição enzimática3 4. Os taninos condensados são
oligômeros e polímeros formados pela policondensação de duas ou mais unidades flavanoídicas e possuem grande importância biológic a por suas fortes interaç ões c om íons metálic os e macromoléculas como os polissacarídeos, além de apresentar a habilidade para formar complexos solúveis3 4 com alcalóides,
gelatinas e diversas proteínas. Essa habilidade que os taninos exibem para interagir c om proteínas torna essa c lasse de substâncias bastante tóxica3 4 a insetos, fungos e bactérias.
Estudo s r e a liza do s2 0 a tr a vé s de c o r te s his to ló gic o s ,
mostraram o efeito tóxic o do ác ido tânic o, um tanino natural hidrolisável, sobre o epitélio do intestino médio de larvas de dípteros. Outros autores1 7, após avaliarem os efeitos tóxic os
de taninos sobre a fauna assoc iada aos c ulic íneos, sugeriram que os taninos vegetais podem ser úteis c omo c omplemento e m pr o gr a m a s de c o n tr o le de e s pé c ie s de m o s q uito s
associados à atividade humana. Mais especificamente sobre a M. pubescens e anteriores à partição, fracionamento e identificação do tanino catéquico, estudos1 2 28 foram realizados com o extrato,
evidenciando os mecanismos de ação e as alterações morfológicas que provocaram as mortes nas larvas de A. aegypti, sendo similares àquelas registradas pelo ác ido tânic o2 8. Além disso, estudos
toxicológicos2 8 do e.b.e. realizados em coelhos, ratos e cobaios
mostraram-se atóxicos de acordo com as normas para produtos vegetais. Testes de campo evidenciaram sua degradação e atoxicidade a partir da quarta semana28. Mesmo com essas informações favoráveis,
estudos toxicológicos adicionais com o tanino catéquico serão feitos para avaliar seu impacto, principalmente em espécies não alvo, e de formulações que dêem estabilidade e praticidade no uso desse fitoinseticida potencial.
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