(Ly c o pe rsic o n e sc ule ntum CV MICRO-TOM)
ROGÉRIO FALLEIROS CARVALHO
Disse rta ç ã o a p re se nta d a à Esc o la Sup e rio r d e Ag ric ultura “ Luiz d e Q ue iro z” , Unive rsid a d e d e Sã o Pa ulo , p a ra o b te nç ã o d o título d e Me stre e m C iê nc ia s, Áre a d e C o nc e ntra ç ã o : Fisio lo g ia e Bio q uímic a d e Pla nta s.
P I R A C I C A B A Esta d o d e Sã o Pa ulo – Bra sil
USO DE MUTANTES FOTOMORFOGENÉTICOS NO ESTUDO DA COMPETÊNCIA
PARA REGENERAÇÃO in vitro EM MICRO- TOMATEIRO
(Ly c o pe rsic o n e sc ule ntum CV MICRO- TOM)
ROGÉRIO FALLEIROS CARVALHO
Bió lo g o
O rie nta d o r: Pro f. Dr.
LÁZARO EUSTÁQUIO PEREIRA PERESDisse rta ç ã o a p re se nta d a à Esc o la Sup e rio r d e Ag ric ultura “ Luiz d e Que iro z”, Unive rsid a d e d e Sã o Pa ulo , p a ra o b te nç ã o d o título d e Me stre e m C iê nc ia s, Áre a d e C o nc e ntra ç ã o : Fisio lo g ia e Bio q uímic a d e Pla nta s.
P I R A C I C A B A Esta d o d e Sã o Pa ulo – Bra sil
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/ USP
Carvalho, Rogério Falleiros
Uso de m utantes fotom orfogenéticos no estudo da com petência para regeneração in vitro em micro -tom ateiro (Lycopersicon esculentum cv micro -tom) / Rogério Falleiros. - - Piracicaba, 2004.
69 p. : il.
Dissertação (m estrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2003. Bibliografia.
1. Cultura de tecido 2. Fotoperiodism o 3. Linhagem vegetal 4. Morfogênese vegetal 5. Mutação genética 6. Regeneração in vitro 7. Tom ate I. Título
CDD 635.642
Aos me us pa is Pé rsio e Ma ria Amé lia
c om todo m e u a m o r
OFEREÇO
Ao me u irmã o G uilhe rme , a o s me us
sobrinhos Ma ria na e Ra fa e l e a os me us a vós Dié , Fina , Zito e Lá la
AGRADECIMENTOS
Ag ra d e ç o a to d a s a s p e sso a s q ue d e fo rma d ire ta o u ind ire ta c o ntrib uíra m p a ra a re a liza ç ã o d e ste tra b a lho , e sp e c ia lme nte :
Ao Pro f. Dr. Lá za ro Eustá q uio Pe re ira Pe re s p e la o rie nta ç ã o , a miza d e , p a c iê nc ia e inc e ntivo d ura nte a re a liza ç ã o d e ste tra b a lho .
Ao Pro f. Dr. Luiz Antô nio G a llo p e la utiliza ç ã o d o La b o ra tó rio d e C ultura d e Te c id o s e d a Ca sa d e Ve g e ta ç ã o d o Ce ntro d e Bio te c no lo g ia Ag ríc o la (CEBTEC) e p e la p re ste za d ura nte to d o o te mp o .
Ao Pro f. Dr. Ma ssa no ri Ta ka ki d a UNESP-Rio C la ro p e la d isp o nib ilid a d e d o La b o ra tó rio d e Fo to mo rfo g ê ne se p e lo c o nsta nte a c o mp a nha me nto d a s a tivid a d e s d e ste tra b a lho .
Ao Pro f. Dr. Ric a rd o Alfre d o Klug e p e la o rie nta ç ã o no iníc io d o c urso .
A se c re tá ria d o Pro g ra ma d e Fisio lo g ia e Bio q uímic a d e Pla nta s, Ma ria So lize te , p e la a miza d e e e fic iê nc ia p ro fissio na l.
Ao g ra nd e a mig o Enio Thia g o O live ira p e la p ro ntid ã o e c o mp a nhe irismo e m to d a s a s e ta p a s d e ste tra b a lho .
Ao s Pro fs. Drs. Murilo Me lo , Ric a rd o Fe rra z d e O live ira e Be a triz Ap p e zza to d a G ló ria p e la s a tivid a d e s à fre nte d o Pro g ra ma d e Fisio lo g ia e Bio q uímic a d e Pla nta s
e ta mb é m p e la a miza d e .
A e sta g iá ria d o La b o ra tó rio d e C ultura d e Te c id o s d o C EBTEC , Ta tia na “ Ta ti”, p e la c o la b o ra ç ã o e p a c iê nc ia d ura nte a minha p a ssa g e m p o r a q ue le la b o ra tó rio . A té c nic a d o La b o ra tó rio d e Me lho ra me nto d e Pla nta s d o C ENA – USP, Inê s, p e la re c e p tivid a d e e d isp o nib ilid a d e d o la b ó ra tó rio .
d e me us e xp e rime nto s e m c a sa d e ve g e ta ç ã o .
Ao ta mb é m me mb ro d o G rup o d e Estud o d e Fisio lo g ia , G e né tic a e Me lho ra me nto d e To ma te iro , Jo ny, q ue muita s ve ze s d e ixo u se us a fa ze re s p a ra a uxilia r-me na s a tivid a d e s d e c ultura d e te c id o in vitro. Va le u!
A Ana Pa ula Pime nta p e la inc e ssa nte to rc id a me smo d e lo ng e .
As minha s e xtra o rd iná ria s a mig a s Ama nd inha e C a ra c o l p e la o p o rtunid a d e d e tê -la s c o mo a mig a s, to rna nd o o tra b a lho ma is g ra tific a nte .
Ao s a mig o s d o Pro g ra ma d e Fisio lo g ia e Bio q uímic a d e Pla nta s, Ama ra l,
Ad ria no , Ana He le na , Da nie la , Fa b ia na , Fla vinha , He nriq ue , Ma ria Luiza , Ma ria Te re za , Pa tríc ia , Pa ty G a ya , Pa ulinha , Sa ulo e Simo ne p e la a g ra d á ve l c o nvivê nc ia . Ao s mo ra d o re s d a Re p úb lic a Blue Ho use , C PI, Ne i, Mura , Pe lé , Sa nd a l, Se ve rino e a o s e x-mo ra d o re s, De nis e Ric a rd o , p o r nã o d e ixa r q ue vid a se to rna sse ro tina , o u se ja , p e la s me mo rá ve is fe sta s.
Ao s mo ra d o re s d a Re p úb lic a PNC , K-b ra l, Sub , Sa ko la , Se uno mi, Urtig a e Pre sid e nte p e la c urta , p o ré m ine sq ue c íve l p a ssa g e m p o r a q ue la c a sa .
A to d o s o s a luno s, p ro fe sso re s e func io ná rio s d o Pro g ra ma d e Fisio lo g ia e Bio q uímic a d e Pla nta s ESALQ -USP.
A FAPESP (p ro c . 01/ 11074-8) p e lo s re c urso s fina nc e iro s c o nc e d id o s.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ABREVIATURAS ... viii
RESUMO ... ix
SUMMARY ... xi
1INTRO DUÇ ÃO ... 1
2 REVISÃO DA LITERATURA ... 3
2.1 Fo to mo rfo g ê ne se ... 3
2.1.1 Fito c ro mo s ... 3
2.1.2 Muta nte s fo to mo rfe g e né tic o s ... 8
2.2 Mic ro -To m c o mo mo d e lo fisio ló g ic o ... 14
2.3 Va ria ç ã o g e né tic a na c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o in vitro e m to ma te iro .. 15
2.4 C o mp e tê nc ia p a ra re g e ne ra ç ã o in vitro ... 17
2.5 Re g e ne ra ç ã o in vitro c o mo uma re sp o sta fo to mo rfo g e né tic a ... 18
2.6 Inte ra ç ã o e ntre fo to mo rfo g ê ne se e ho rmô nio s ... 22
2.6.1 Fito c ro mo e e tile no ...22
2.6.2 Fito c ro mo e c ito c inina s ... 22
2.6.3 Fito c ro mo e g ib e re lina s ... 23
2.6.4 Fito c ro mo e a uxina ...24
2.6.5 Fito c ro mo e á c id o a b sc ísic o ... 25
2.6.6 Fito c ro mo e b ra ssino e ste ró id e ... 25
3 O BJETIVO ...27
4 MATERIAL E MÉTO DO S ... 28
4.1 Ma te ria l ve g e ta l ... 28
4.4 Se le ç ã o d o s g e nó tip o s o b tid o s d e mic ro -muta nte s fo to mo rfo g e né tic o s e
mic ro -MsK ...30
4.5 C ultivo e m c a sa d e ve g e ta ç ã o ... 31
4.6 Te ste s p a ra p re se nç a d e muta ç õ e s fo to mo rfo g e né tic a s ... 31
4.6.1 Muta nte s hp ...31
4.6.2 Muta nte s fri e tri ...32
4.7 Ava lia ç ã o d o a lo ng a me nto d o hip o c ó tilo e d o e ntre nó d o muta nte mic ro -a u ...32
4.8 Te ste d a c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o in vitro ... 32
4.8.1 C ultivo in vitro ...32
4.8.2 Te ste d e re g e ne ra ç ã o ... 33
5 RESULTADO S E DISC USSÃO ... 36
5.1 O b te nç ã o d e mic ro -muta nte s fo to mo rfo g e né tic o s ... 36
5.2 O b te nç ã o d o mic ro -MsK ...42
5.3 O b te nç ã o d a s g e ra ç õ e s ... 44
5.3.1 G e ra ç õ e s d e mic ro -muta nte s fo to mo rfo g e né tic o s ... 44
5.3.2 G e ra ç õ e s d e mic ro -MsK ... 45
5.4 Te ste d e re g e ne ra ç ã o in vitro ... 45
5.4.1 Efe ito d o V e VE na re g e ne ra ç ã o d e ra íze s d e mic ro -MsK ... 46
5.4.2 Efe ito d a s muta ç õ e s fo to mo rfo g e né tic a s e d o lo c us Rg 1 na c a p a c id a d e d ere g e ne ra ç ã o d e ra íze s in vitro so b luz b ra nc a ... 46
5.4.3 Efe ito d o V e VE na c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o d e e xp la nte s c a ulina re s e fo lia re s in vitro d o MT e mic ro-MsK ... 47
5.4.4 Efe ito d a s muta ç õ e s fo to mo rfo g e né tic a s e do lo c us Rg 1 na c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o d e e xp la nte s c a ulina re s e fo lia re s in vitro so b luz b ra nc a 48
6 CONCLUSÕES E PERSCPECTIVAS ... 55
LISTA DE ABREVIATURAS
a tv = muta nte a tro vio la c e a a u = muta nte a ure a
B = a zul
fri = muta nte fa r re d inse nsitive Fv = fo rma ina tiva d o fito c ro mo Fve = fo rma a tiva d o fito c ro mo
hp = muta nte hig h p ig me nt
Ip = muta nte Inte nse p ig me nt LB = luz b ra nc a
MT = Mic ro -To m
PHY = g e ne d o fito c ro mo
PHY = a p o p ro te ína d o fito c ro mo p hy = fito c ro mo
Rg 1 = lo c us d a a lta c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o tri = muta nte te mp o ra ry re d inse nsitive
V = ve rme lho
USO DE MUTANTES FOTOMORFOGENÉTICOS NO ESTUDO DA
COMPETÊNCIA PARA REG ENERAÇÃO in vitro EM MICRO- TOMATEIRO
(Ly c o pe rsic o n e sc ule ntum CV MICRO-TOM)
Auto r: ROGÉRIO FALLEIROS CARVALHO O rie nta d o r: Pro f. Dr. LÁZARO EUSTÁQ UIO PEREIRA PERES
RESUMO
Pa ra le la me nte a o mo d e lo Ara b id o p sis tha lia na, o to ma te iro
(Lyc o p e rsic o n e sc ule ntum) te m sid o c re sc e nte me nte utiliza d o s e m a b o rd a g e ns
g e né tic a s d e q ue stõ e s fisio ló g ic a s. Uma d a s p rinc ip a is va nta g e ns d e Ara b id o p sis c o mo
“ p la nta d e la b o ra tó rio ” te m sid o se u p e q ue no p o rte e c ic lo d e vid a c urto . C o ntud o , a c ultiva r Mic ro -To m (MT) d e to ma te iro p o ssui ta ma nho muito re d uzid o (8 c m) e p o d e p ro d uzir a té 5 g e ra ç õ e s p o r a no . Muta nte s fo to mo rfo g e né tic o s e m to ma te iro d e fic ie nte s na sínte se d o c ro mó fo ro d o fito c ro mo (a u), muta nte s d e fic ie nte s na sínte se
d a s a p o p ro te ína s PHYA e PHYB1 (fri e tri, re sp e c tiva me nte ) e muta nte s
sup e re xp re ssa nd o o fito c ro mo (hp, a tv e Ip) c o nstitue m -se e m um mo d e lo p a ra e stud o s
d a fo to mo rfo g ê ne se . No q ue se re fe re à c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o in vitro c o mo
uma re sp o sta fo to mo rfo g e né tic a , p o uc o s tra b a lho s tê m sid o re a liza d o s. O p re se nte tra b a lho te ve c o mo o b je tivo tra nsfe rir a s muta ç õ e s a u, fri, tri, hp, Ip e a tv, b e m c o mo o lo c us d e re g e ne ra ç ã o (Rg 1) d a c ultiva r MsK, p a ra a c ultiva r Mic ro-To m. As linha g e ns
o b tid a s fo ra m utiliza d a s p a ra ve rific a r o e fe ito d a fo to mo rfo g ê ne se na c o mp e tê nc ia p a ra re g e ne ra ç ã o in vitro. Pa ra ta nto , fo ra m re a liza d o s tra ta me nto s c o m luz b ra nc a ,
c ultiva r MT c o mo c o ntro le . So b V, a s ra íze s d e mic ro -MsK a pre se nta ra m -se d ife re nc ia d a s, e nq ua nto so b VE nã o o c o rre u d ife re nc ia ç ã o . O ma io r núme ro d e g e ma s fo rma d a s ta nto p a ra c a ule q ua nto p a ra fo lha s d e mic ro-MsK o c o rre u so b V, e nq ua nto so b VE fo i o b se rva d o um d e c ré sc imo na fo rma ç ã o d e g e ma s. A p a rtir d e ste s re sulta d o s sug e re-se q ue a fo rma a tiva d o fito c ro mo , ind uzid a p e lo V, inte ra g e c o m o
Rg 1 na a q uisiç ã o d e c o mp e tê nc ia p a ra re g e ne ra ç ã o . No s tra ta me nto s c o m luz
b ra nc a , ra íze s d e mic ro-MsK e d e muta nte s mic ro -hp, m ic ro -a tv e mic ro -Ip
a p re se nta ra m-se d ife re nc ia d a s, e nq ua nto nã o ho uve d ife re nc ia ç ã o p a ra o muta nte mic ro -a u o u p a ra o c o ntro le MT. O núme ro d e g e ma s fo rma d a s a lc a nç o u ma io re s
va lo re s p a ra fo lha s d e mic ro -hp e mic ro -Ip e a p a ra c a ule s d e mic ro -a tv. Ap e na s um
núme ro muito re d uzid o d e g e ma s fo i fo rma d o a p a rtir d e fo lha s d e mic ro -a u. C o m
b a se na a lta c o mp e tê nc ia p a ra re g e ne ra ç ã o d e mic ro -MsK e d e muta nte s q ue sup e re xp re ssa m o fito c ro mo , sug e re-se q ue o fito c ro mo p ro mo ve , e m uma via d e sina liza ç ã o , a ind uç ã o d e fa to re s d e re g e ne ra ç ã o (Rg 1). Alte rna tiva me nte , o lo c us Rg 1
USE OF PHOTOMORPHOGENENIC MUTANTS IN THE STUDY OF THE COMPETENCE FOR in vitro REGENERATION IN MICRO- TOMATO
(Ly c o pe rsic o n e sc ule ntum CV MICRO- TOM)
Autho r: RO G ÉRIO FALLEIRO S CARVALHO Ad vise r: Pro f. Dr. LÁZARO EUSTÁQ UIO PEREIRA PERES
SUMMARY
Pa ra lle l to Ara b id o p sis tha lia na mo d e l, the to ma to (Lyc o p e rsic o n
e sc ule ntum) ha s b e e n inc re a sing ly use d a s a g e ne tic a p p ro a c h to a d d re ss p hysio lo g ic a l q ue stio ns. O ne o f the ma in a d va nta g e s o f Ara b id o p sis a s a “ la b o ra to ry p la nt” ha s b e e n its sma ll size a nd sho rt life c yc le . Ho we ve r, the to ma to c ultiva r Mic ro -To m (MT) p o sse sse s re d uc e d size (8 c m) a nd c a n p ro d uc e up to 5 g e ne ra tio ns p e r ye a r. To ma to p ho to mo rp ho g e nic muta nts d e fic ie nt fo r the synthe sis o f p hyto c hro me c hro mo p ho re (a u) o r the a p o p ro te in PHYA a nd PHYB1 (fri a nd tri, re sp e c tive ly), a s we ll a s muta nts sup e re xp re ssing p hyto c hro me (hp, a tv a nd
Ip) c o nsist o n a mo d e l to stud y p ho to mo rp ho g e ne sis. Co nc e rning the in vitro
we re inc ub a te d in MS p lus 5µM BAP und e r white lig ht. Und e r R, ro o ts o f mic ro-MsK we re p re se nte d d iffe re ntia tio n, while und e r FR the d iffe re ntia tio n d id no t o c c ur. Und e r R, ste m e xp la nts fro m mic ro -MsK fo rme d mo re sho o ts tha n d id le a f e xp la nts, while und e r FR wa s o b se rve d a d e c re a se in sho o t fo rma tio n fo r a ll typ e s o f e xp la nts. The se re sults sug g e st tha t the a c tive fo rm o f p hyto c hro me , ind uc e d b y R, inte ra c ts with the Rg 1 in the a c q uisitio n o f c o mp e te nc e fo r re g e ne ra tio n. In the tre a tme nts with white lig ht, ro o ts o f mic ro -MsK a nd o f muta nts mic ro-hp, mic ro -a tv a nd mic ro -Ip p re se nte d d iffe re ntia tio n, while no d iffe re ntia tio n wa s o b se rve d fo r the muta nt
1 INTRO DUÇÃO
O e fe ito p rimá rio d a muta ç ã o é a e xp re ssã o d e fe c tiva o u a lte ra d a d e um g e ne . De ste mo d o , a d isp o nib ilid a d e d e g e nó tip o s muta nte s to rna -o s instrume nto s imp o rta ntíssimo s p a ra e stud a r o s e ve nto s fisio ló g ic o s e mo rfo ló g ic o s q ue c o mp õ e m a p la nta . A utiliza ç ã o e xte nsiva d e muta nte s e m e stud o s d e fisio lo g ia ve g e ta l é re la tiva me nte re c e nte , p o ré m, uma rá p id a e xp a nsã o na utiliza ç ã o d e sta s fe rra me nta s p o d e se r o b se rva d a no s último s a no s (Ke nd ric k & Kro ne nb e rg , 1994).
Muta nte s e xib ind o d e fic iê nc ia no fito c ro mo e m to ma te iro (Lyc o p e rsic o n
e sc ule ntum) tê m sid o um mo d e lo p a ra e stud o s d a fo to mo rfo g ê ne se. O muta nte a u (a ure a) a p re se nta d e fic iê nc ia na sínte se d o c ro mó fo ro d o fito c ro mo . O s muta nte s
fri (fa r re d inse nsitive ) e tri (te mp o ra ry re d inse nsitive) a p re se nta m d e fic iê nc ia na sínte se d a a p o p ro te ína PHYA e PHYB1, re sp e c tiva me nte . Po r último , a sup e re xp re ssã o d o fito c ro mo p o d e se r e nc o ntra d a no s muta nte s hp (hig h
p ig me nt), a tv (a tro vio la c e a) e Ip (Inte nse p ig me nt) d e to ma te iro (Ke nd ric k e t a l., 1994).
No q ue se re fe re à c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o in vitro c o mo uma re sp o sta fo to mo rfo g e né tic a , p o uc o s tra b a lho s tê m sid o re a liza d o s (Le rc a ri e t a l., 1999; Be rtra m & Le rc a ri, 2000; Tyb urski & Tre tyn, 1999). So me nte um re d uzid o núme ro d e g e nó tip o s d e Lyc o p e rsic o n po ssui a c a p a c id a d e d e re g e ne ra r no va s p la nta s a p a rtir d e e xp la nte s ra d ic ula re s (Pe re s e t a l., 2001). Ko o rnne e f e t a l., (1993) c o nsta ta ra m q ue a c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o e m e xp la nte s ra d ic ula re s e m
Lyc o p e rsic o n p e ruvia num é c o ntro la d a p o r um únic o lo c us (Rg1), o q ua l fo i intro g re d id o na c v MsK.
p ro d uz fruto s e se me nte s viá ve is e m va so s d e a p e na s 50-150ml d e sub stra to , c o mp le ta nd o se u c ic lo d e vid a e m 70-90 d ia s. A c ultiva r Mic ro -To m fo i re c e nte me nte p ro p o sta p o r Me issne r e t a l. (1997) c o mo um mo d e lo g e né tic o .
As linha g e ns o b tid a s ne ste tra b a lho fo ra m utiliza d a s p a ra e stud a r o p a p e l d a fo to mo rfo g ê ne se no s p ro c e sso s d e re g e ne ra ç ã o in vitro. A inte rp re ta ç ã o d o s re sulta d o s a q ui a p re se nta d o s p o d e c o ntrib uir p a ra uma me lho r c o mp re e nsã o d a c o mp e tê nc ia p a ra re g e ne ra ç ã o in vitro, b e m c o mo to rna r me no s e mp íric o o d e se nvo lvime nto d e p ro to c o lo s p a ra c ultura d e te c id o s, a q ua l é a mp la me nte utiliza d a e m d ive rsa s a p lic a ç õ e s b io te c no ló g ic a s. Alé m d isso , a s linha g e ns
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Fotomorfog ê ne se
Dura nte o c ic lo d e vid a d a p la nta , re sp o sta s c o mo g e rmina ç ã o d e se me nte s, inib iç ã o d o a lo ng a me nto d o hip o c ó tilo e d o c a ule , sínte se d e c lo ro fila e a nto c ia nina , e xp a nsã o fo lia r, flo ra ç ã o e tub e riza ç ã o , e stã o e nvo lvid a s d ire ta me nte c o m a d ura ç ã o e q ua lid a d e d a luz (Ne ff e t a l., 2000). O p ro c e sso p e lo q ua l a luz re g ula o d e se nvo lvime nto d a p la nta é d e no mina d o fo to mo rfo g ê ne se (Ke nd ric k & Kro ne nb e rg , 1994).
No p ro c e sso fo to mo rfo g e né tic o há p e lo me no s q ua tro c la sse s d e fo to rre c e p to re s: fito c ro mo s, o s q ua is a b so rve m p re d o mina nte me nte o c o mp rime nto d e o nd a d o ve rme lho (V, 650-680nm) e ve rme lho-e xtre mo (VE,
710-740nm), fo to rre c e p to re s q ue a b so rve m a luz a zul/ UV-A (320-400nm), d e no mina d o s c rip to c ro mo s, e fo to rre c e p to re s q ue a b so rve m o UV-B (280-320nm). Fo to tro p ina s sã o ta mb é m fo to rre c e p to re s q ue a b so rve m luz a zul (400-490) e e stã o e nvo lvid o s no p ro c e sso d e fo to tro p ismo .
2.1.1 Fitoc romos
Os fo to rre c e p to re s ma is e stud a d o s sã o o s fito c ro mo s. Este s p ig me nto s p o ssue m uma ma ssa mo le c ula r d e a p ro xima d a me nte 150 KDa c o nsistind o e m um p o lip e p tíd io (a p o p ro te ína ) c a rre g a nd o um c ro mó fo ro , a fito c ro mo b ilina , a q ua l é
Há d ua s fo rma s inte rc o nve rsíve is d e fito c ro mo , uma a tiva e o utra ina tiva . A fo rma ina tiva d o fito c ro mo (Fv) a b so rve o c o mp rime nto d e o nd a d o ve rme lho (V) e é c o nve rtid a à fo rma b io lo g ic a me nte a tiva (Fve ). A re ve rsã o d e Fve a Fv se d á p e la a b so rç ã o d o ve rme lho-e xtre mo (VE) p e lo Fve , p o ré m, a c o nve rsã o nã o é to ta l, p o is VE c o nve rte so me nte 97% d e Fve a Fv, e V c o nve rte so me nte 85% d e Fv a Fve . A re ve rsã o d e Fve a Fv ta mb é m p o d e o c o rre r no e sc uro (La g a ria s & La g a ria s, 1989). Alé m d isso , a mb a s a s fo rma s d o fito c ro mo p o d e m a b so rve r o c o mp rime nto d e o nd a d o a zul (Fig ura s 1 e 2). De ste mo d o , o s e fe ito s d o fito c ro mo p o d e m se r fo rne c id o s p e lo a zul, o q ua l ta mb é m c o nve rte Fv a Fve , p o ré m, a
Fig ura 1 - Pic o s d e a b so rç ã o d e Fv (V, 650-680nm) e Fve (VE, 710-740). No e nta nto , Fv ta mb é m a b so rve um p o uc o na fa ixa d o VE, e Fve a b so rve uma q ua ntid a d e c o nsid e rá ve l d o V. No te q ue a lé m d a fa ixa d o ve rme lho , a s fo rma s d e fito c ro mo ta mb é m p o ssue m p ic o s d e a b so rç ã o no s c o mp rime nto s d e o nd a d o a zul (320-400nm) e ultra vio le ta (280nm)
Evid ê nc ia s d e q ue a s a ng io sp e rma s p o ssue m vá ria s e sp é c ie s d e fito c ro mo s c o d ific a d o s p o r uma p e q ue na fa mília d e g e ne s fo ra m ve rific a d a s inic ia lme nte e m e stud o s c o m Ara b id o p sis tha lia na (Sha rro c k & Q ua il, 1989), a q ua l é um d o s p rinc ip a is mo d e lo s g e né tic o s p a ra o e stud o d e d ive rso s p ro c e sso s fisio ló g ic o s. O s e stud o s c o m Ara b id o p sis sã o fa c ilita d o s p o r se u c ic lo d e vid a c urto e ta ma nho re d uzid o , a lé m d e p o ssuir um g e no ma muito p e q ue no . C inc o g e ne s d o fito c ro mo fo ra m iso la d o s ne sta e sp é c ie : PHYA, PHYB, PHYC, PHYD e PHYE, q ue c o d ific a m a s a p o p ro te ína s PHYA, PHYB, PHYC, PHYD e PHYE, a s q ua is a p ó s se lig a re m a o c ro mó fo ro fo rma m o s fito c ro mo s p hyA, p hyB, p hyC, p hyD e p hyE, re sp e c tiva me nte .
Em to ma te iro (Lyc o p e rsic o n e sc ule ntum Mill.) ta mb é m fo ra m e nc o ntra d o s c inc o g e ne s p a ra a p o p ro te ína s PHYA, PHYB1, PHYB2, PHYE e PHYF (Pra tt e t a l., 1997). Entre ta nto , o to ma te iro te m sid o um e xc e le nte mo d e lo p a ra e stud a r a funç ã o d o fito c ro mo . A fa mília d e g e ne s d o fito c ro mo te m sid o c a ra c te riza d a (Pra tt e t a l., 1997), e e stud o s c o m muta nte s e stã o re ve la nd o q ue o s fito c ro mo s d e to ma te iro tê m funç õ e s simila re s, ma s nã o id ê ntic a s à s d e Ara b id o p sis (Ke nd ric k e t a l., 1997).
O s fito c ro mo s p o d e m a g ir d e trê s d ife re nte s mo d o s, d e ac o rd o c o m a q ua lid a d e e a d ura ç ã o d a luz re q ue rid a p a ra ind uzir re sp o sta s na p la nta : re sp o sta s d e fluê nc ia muito b a ixa (RFMB), re sp o sta d e b a ixa fluê nc ia (RBF) e re sp o sta s d e a lta irra d iâ nc ia (RIA).
Em RFMB, a fluê nc ia ne c e ssá ria p a ra ind uzir uma re sp o sta inic ia -se c o m a p e na s 0.1nmo l.m-2, e sa tura c o m 50nmo l.m-2. A q ua ntid a d e d e luz ne c e ssá ria p a ra ind uzir RFMB c o nve rte me no s d o q ue 0.02% d o fito c ro mo to ta l na fo rma a tiva . De ste mo d o , o VE, q ue p o d e ria re ve rte r o e fe ito d o V, c o nve rte 97% d o Fve a Fv, e o s 3% d o fito c ro mo q ue p e rma ne c e na fo rma a tiva é sufic ie nte p a ra ind uzir RFMB (Fig ura 3). Isto o c o rre d e vid o a o fa to d a fo rma ina tiva d o fito c ro mo (Fv) ta mb é m
a b so rve r um p o uc o d e VE e se to rna r a tiva , me smo so b sa tura ç ã o d e VE, re sulta nd o e m 3% d e Fve . Essa p e q ue na q ua ntid a d e d e fito c ro mo na fo rma a tiva é b e m ma io r d o q ue o s 0,02% ne c e ssá rio s p a ra ind uzir RFMB. Po rta nto , o VE nã o p o d e re ve rte r à s re sp o sta s d e fluê nc ia muito b a ixa (Ma nd o li & Brig g s, 1984).
re ve rsã o p o r VE (Ta iz e Ze ig e r, 1998). De ste mo d o , so b c o ntínua e xp o siç ã o a o V o u p ulso s d e V, uma g ra nd e p ro p o rç ã o d e mo lé c ula s d e p hyB (85%) c o nve rte -se na fo rma a tiva (Fig ura 3).
As RIA ne c e ssita m d e p ro lo ng a d a o u c o ntínua e xp o siç ã o à luz, se nd o sa tura d a s e m q ua ntid a d e s p e lo me no s 100 ve ze s a fluê nc ia a p re se nta d a p o r RBF. Este mo d o d e re sp o sta d o fito c ro mo ta mb é m nã o mo stra re ve rsib ilid a d e (Ta iz e Ze ig e r, 1998).
Fig ura 3 - Inte ra ç ã o e ntre fluê nc ia e c o mp rime nto d e o nd a d a luz no s tip o s d e re sp o sta s d o fito c ro mo . Pla nta s c re sc id a s so b V a c umula m p re fe re nc ia lme nte p hyB. Ne sta s c o nd iç õ e s, a fo rma Fv de ste tipo d e fito c ro mo (p hyBv) irá a b so rve r V e se c o nve rte r na fo rma a tiva (p hyBve ). Co ntud o , a fo rma p hyBve (Fve ) ta mb é m a b so rve um p o uc o d e V , se c o nve rte nd o no va me nte e m p hyBv. No e q uilíb rio fo to e sta c io ná rio , 85% d e p hyB e sta rá na fo rma ativa, o q ue é sufic ie nte p a ra ind uzir re sp o sta s d e b a ixa fluê nc ia (RBF). Do me smo mo d o , na sa tura ç ã o c o m VE, o tip o d e fito c ro mo q ue a c umula ne sta s c o nd iç õ e s (p hyA) e sta rá c o m 97% d e sua s mo lé c ula s na fo rma ina tiva (p hyAv) e so me nte 3% na fo rma a tiva (p h yAve ). Co ntud o , e sta q ua ntid a d e d e p hyA a tivo é ma is d o q ue sufic ie nte p a ra ind uzir re sp o sta d e fluê nc ia muito b a ixa (RFMB)
a c úmulo d e p hyA. So b c o ntínuo VE, a p ro p o rç ã o d e p hyB na fo rma a tiva é muito b a ixa p a ra ind uzir RBF (C a sa l, 1998).
2.1.2 Muta nte s fotomorfog e né tic os
A b a se g e né tic a d a fo to mo rfo g ê ne se p o d e se r inve stig a d a utiliza nd o-se muta nte s e sp e c ífic o s ta nto p a ra a b io ssínte se d e fo to rre c e p to re s q ua nto p a ra a via d e tra nsd uç ã o d e sina l d e se nc a d e a d a p o r e le s. Ta is muta nte s p o d e m a uxilia r na e luc id a ç ã o d e p ro c e sso s fisio ló g ic o s d e p e nd e nte s d ire ta o u ind ire ta me nte d a
luz (Va n Tuine n e t a l., 1997).
Muta nte s d e fic ie nte s na sínte se d a s a p o p ro te ína s PHYA e PHYB d o fito c ro mo , muta nte s c o m d e fic iê nc ia na sínte se d o c ro mó fo ro , o s q ua is sã o d e fic ie nte s p a ra to d o s o s tip o s d e fito c ro mo , e muta nte s c o m p ro váve is a lte ra ç õ e s na via d e tra nsd uç ã o d e sina l tê m sid o d e sc rito s e m vá ria s e sp é c ie s (Ke nd ric k & Kro ne nb e rg , 1994). Em to ma te iro , Va n Tuine n e t a l., (1995a ) d e sc re ve ra m muta nte s c o m d e fic iê nc ia na sínte se d a a p o p ro te ína PHYA (fri), e Va n Tuine n e t a l., (1995b ) d e sc re ve ra m muta nte s na sínte se d a a p o p ro te ína PHYB1 (tri). Ke rc kho ffs, e t a l., (1999) c a ra c te riza ra m muta nte s d e to ma te iro d e fic ie nte s na sínte se d a a p o p ro te ína PHYB2. Muta nte s a p re se nta nd o d e fic iê nc ia na sínte se d o c ro mó fo ro (a u e yg-2) fo ra m d e sc rito s p o r Te rry & Ke nd ric k, (1996). Po ste rio rme nte , Ke nd ric k e t a l., (1997) re la ta ra m muta nte s c o m a lte ra ç õ e s na via d e tra nsd uç ã o d e sina l (hp -1,
Fig ura 4 - De fic iê nc ia na sínte se e na e xp re ssã o d o fito c ro mo e m muta nte s de to m a te iro. O s muta nte s fri e tri sã o d e fe ituo so s p a ra a fa b ric a ç ã o d a s
a p o p ro te ína s PHYA e PHYB1, re sp e c tiva me nte . As muta ç õ e s a u e yg -2
p o ssue m a lte ra ç õ e s na via d e b io ssínte se d o c ro mó fo ro . O s g e ne s ne c e ssá rio s p a ra a b io ssínte se d o c ro mó fo ro e stã o no núc le o , p o ré m, sua mo lé c ula é mo nta d a no p la stíd io . As a lte ra ç õ e s fo to mo rfo g e né tic a s no s muta nte s hp , hp -2 d g ,a tv e Ip o c o rre m na via d e tra nsd uç ã o d e sina l d o
fito c ro mo (Ad a p ta d o d e Ke nd ric k e t a l. 1997)
Plâ ntula s d e a u c re sc id a s no e sc uro p e rd e m, p e lo me no s, 95% d o fito c ro mo d e te c ta d o imuno lo g ic a me nte (Pa rks e t a l., 1987) e e sp e c tro fo to me tric a me nte (Ko o rnne e f e t a l., 1985, Ad a mse e t a l., 1988, Lip uc c i Di Pa o la e t a l., 1988). Pla nta s a d ulta s d e a u tê m a p re se nta d o uma re d uç ã o d e 50% no s níve is d e fito c ro mo q ua nd o c o mp a ra d a s a o s d o tip o se lva g e m (Ad a mse e t a l., 1988, Ló p e z-Jue z e t a l., 1990). O s níve is d e c lo ro fila ne ste s muta nte s, ve rific a d o s p o r Ko o rnne e f e t a l. (1985) e Ló p e z-Jue z e t a l. (1990), va ria ra m e ntre 33% a 61% d a q ue le s a p re se nta d o s p e lo tip o se lva g e m, d e p e nd e nd o d a s c o nd iç õ e s d e luz e te mp e ra tura . Surp re e nd e nte me nte , a ta xa fo to ssinté tic a d o s muta nte s a u fo i simila r
a d o tip o se lva g e m, a p e sa r d o re d uzid o te o r d e c lo ro fila (Ló p e z-Jue z e t a l., 1990; Be c ke r e t a l., 1992). O utro a sp e c to a p re se nta d o no s muta nte s a u é a b a ixa ta xa g e rmina ç ã o d e se me nte s no e sc uro c o mp a ra d o à d o tip o se lva g e m (Ko o rnne e f e t a l., 1985). Entre ta nto , e ste g e nó tip o é uma fe rra me nta muito utiliza d a p a ra e stud a r fo to rre c e p to re s p o r c o mp a ra ç ã o q ua ntita tiva a o tip o se lva g e m (Ad a mse e t a l., 1988, Ló p e z-Jue z e t a l., 1990).
O utra s muta ç õ e s re c e ssiva s c o m d e fic iê nc ia na p e rc e p ç ã o d a luz p o d e m se r o b se rva d a s e m Lyc o p e rsic o n. O muta nte fri (fa r re d inse nsitive) a p a re c e e m p la nta s inse nsíve is a o c o mp rime nto d e o nd a d o ve rme lho -e xtre mo . A funç ã o d o p hyA re ve la d a no s muta nte s fri é e q uiva le nte à q ue la fo rne c id a p e lo s muta nte s d e fic ie nte s no a c úmulo d e p hyA e m Ara b id o p sis. O a c úmulo d e fito c ro mo (p hyA) e m p la nta s c ultiva d a s so b VE é a te nta tiva d e inib ir o a lo ng a me nto d o hip o c ó tilo d ura nte o estio la me nto (White la m & Ha rb e rd , 1994) e a d e fic iê nc ia no a c úmulo d e p hyA so b VE, a p ó s o p e río d o d e g e rmina ç ã o no e sc uro , c a usa um e stio la me nto p ro e mine nte ne ste s muta nte s (Fig ura 5), p o ré m, q ua nd o c re sc id o s so b luz b ra nc a , o fe nó tip o d e fri é q ua se ind isting uíve l a o d o tip o se lva g e m (Va n Tuine n e t a l.,
1995). De ste mo d o , p hyA p a re c e te r uma funç ã o limita d a na fo to mo rfo g ê ne se , re strita à s re sp o sta s so b VE. Po r e xe mp lo , p o d e ria se r imp o rta nte p a ra se me nte s q ue g e rmina m so b uma d e nsa c o b e rtura ve g e ta l, o u e nte rra d a s no so lo , c o nd iç õ e s q ue a p re se nta m p ro p o rç õ e s e le va d a s d e VE (Ta iz & Ze ig e r, 1998).
a p re se nç a d e PHYA e m te c id o s d e to ma te iro , c o nsta ta ra m a b und â nc ia d e ste p o lip e p tíd io na s ra íze s. A p re se nç a d e PHYA ta mb é m va rio u a o lo ng o d o d ia . Pró ximo a o me io-d ia e à me ia -no ite , a q ua ntid a d e d e sta a p o p ro te ína a lc a nç o u o mínimo e má ximo , re sp e c tiva me nte . Mo lle r e t a l., (2002) re la ta ra m q ue , a p e sa r d a a b und â nc ia d e p hyA e m p la nta s q ue c re sc e m no e sc uro , a d e g ra d a ç ã o d e ste tip o d e fito c ro mo é rá p id a . Se g und o Q ua il e t a l., (1995) a e xp ressã o d o g e ne PHYA é re p rimid a p e la luz.
Pla nta s d e fic ie nte s te mp o ra ria me nte na p e rc e p ç ã o d o c o mp rime nto d e o nd a d o ve rme lho , muta nte s re c e ssivo s tri (te mp o ra ry re d inse nsitive), ta mb é m
fo ra m e nc o ntra d a s e m to ma te iro . O fito c ro mo tip o B (p hyB) é o p ig me nto e nvo lvid o na p e rc e p ç ã o d e p la nta s c re sc id a s so b V, c o m o me smo o b je tivo d e inib ir o a lo ng a me nto d o hip o c ó tilo . Muta nte s d e to ma te iro q ue e stio la m so b e ste c o mp rime nto d e o nd a sã o d e fic ie nte s no a c úmulo d e p hyB1 (Fig ura 5), e um a tra so te mp o rá rio p o r a p ro xima d a me nte d o is d ia s na inib iç ã o d o a lo ng a me nto d o hip o c ó tilo p o d e se r o b se rva d o a p ó s a tra nsfe rê nc ia d o e sc uro p a ra o V. Em e xtra to s d e p lâ ntula s d e tri, fo ra m d e te c ta d o s b a ixo s níve is d a a p o p ro te ína PHYB1, p o ré m o s níve is d e PHYA a p re se nta ra m-se se me lha nte s a o s d o tip o se lva g e m (va n Tuine n e t a l., 1995b ).
Pla nta s d e tri c re sc id a s so b luz b ra nc a sã o p o uc o ma io re s d o q ue a s d o tip o se lva g e m. Em c o nd iç õ e s d e a lta s p ro p o rç õ e s d e VE, o s muta nte s tri sã o c o nsid e ra ve lme nte ma io re s d o q ue o tip o se lva g e m, ind ic a nd o q ue p hyB1 fo rne c e uma funç ã o q ua ntita tiva na re g ula ç ã o d o a lo ng a me nto e m p la nta s d e to ma te iro (Ke rc kho ffs e t a l., 1997c ). A funç ã o a trib uíd a a o p hyB na inib iç ã o d o a lo ng a me nto d o hip o c ó tilo so b V é ta mb é m o b se rva d a e m Ara b id o p sis, p o ré m, a simila rid a d e é me no s e vid e nte d o q ue à q ue la a p re se nta d a e ntre o s muta nte s d e fic ie nte s no a c úmulo d e p hyA d e to ma te iro e Ara b id o p sis (Va n Tuine n e t a l., 1995b ).
O fito c ro mo tip o B p a re c e ta mb é m re g ula r a g e rmina ç ã o d e se me nte s,
um fe nô me no q ue o rig ina lme nte le vo u a d e sc o b e rta d o fito c ro mo . Se me nte s d e
Ara b id o p sis d o tip o se lva g e m a p re se nta m re ve rsib ilid a d e V/ VE d ura nte a g e rmina ç ã o . Muta nte s d e sta s p la nta s q ue p e rd e m o p hyA re sp o nd e m no rma lme nte à luz ve rme lha . Entre ta nto , muta nte s d e fic ie nte s no a c úmulo d e p hyB sã o inc a p a ze s d e re sp o nd e r a o V. Este e ve nto sug e re q ue p hyB mo d ula a fo to rre ve rsib ilid a d e d ura nte a g e rmina ç ã o d e se me nte s (Shino mura e t a l., 1996).
Va n Tuine n e t a l., (1995) a va lia ra m no s muta nte s tri o c o mp rime nto d o
hip o c ó tilo , a á re a d o c o tilé d o ne e o s níve is d e c lo ro fila e a nto c ia nina so b c o mp rime nto s d e o nd a d o V, VE e B (a zul), a lé m d o e sc uro . So b VE e e sc uro , ne nhuma d ife re nç a fo i o b se rva d a p a ra a s va riá ve is. So b B, o s muta nte s a p re se nta ra m p o uc o a lo ng a me nto d o hip o c ó tilo c o mp a ra d o a o d o tip o
se lva g e m. No s tra ta me nto s c o m V, o s muta nte s tri a p re se nta ra m um ma io r
a lo ng a me nto d o hip o c ó tilo , re d uç ã o no a c úmulo d e a nto c ia nina no hip o c ó tilo e , a p e sa r d a re d uç ã o d a á re a d o s c o tilé d o ne s, e ste s te c id o s a c umula ra m b a sta nte c lo ro fila . Se g und o e ste s a uto re s, a re la ç ã o inve rsa e ntre a á re a d o s c o tilé d o ne s e o s níve is d e c lo ro fila , sug e re q ue a muta ç ã o p o uc o a fe ta a p ro d uç ã o d e ste
p ig me nto .
sup e re xp re ssã o d o s fito c ro mo s d ura nte a fo to mo rfo g ê ne se (Ke rc kho ffs e t a l., 1997b ).
O muta nte re c e ssivo hp é c a ra c te riza d o p e la p ro d uç ã o d e a lto s níve is d e c a ro te no s (β-c a ro te no e lic o p e no ) e c a ro te nó id e s (xa nto fila s), a lé m d e a p re se nta r e le va d o s te o re s d e vita mina C e m fruto s ma d uro s. A c o lo ra ç ã o ve rd e e sc ura d o c a ule , fo lha s e fruto s ima turo s é d e vid o à a lta c o nc e ntra ç ã o d e c lo ro fila , c o mp a ra d a a d o tip o se lva g e m (Tho mp so n e t a l., 1962; Ke rr, 1965; Vo n We ttste in-Kno wle s, 1968a , 1968b ). O a ume nto no a c úmulo d e p ig me nto s fo to ssinté tic o s no s muta nte s hp fo i p ro p o sto p o r Ye n e t a l., (1997) se r d e vid o a o e le va d o núme ro d e
c ó p ia s d o g e no ma p la stid ia l o b se rva d o ne ste s muta nte s. Ta mb é m e ste s a uto re s a trib uíra m à c o nc e ntra ç ã o sig nific a tiva d e c a rb o id ra to s no s fruto s d e ste s muta nte s, o fa to d e a c umula re m p ig me nto s fo to ssinté tic o s. Entre ta nto , o s muta nte s d e hp sã o instrume nto s inte re ssa nte s p a ra e xp lo ra r g e ne tic a me nte a q ua lid a d e d o s fruto s d e to ma te iro (Da rb y, 1978).
O hip o c ó tilo d o s muta nte s hp a p re se nta p o uc o a c úmulo d e a nto c ia nina a p e na s e m c o nd iç õ e s d e b a ixa lumino sid a d e (Ke rr, 1965). Entre ta nto , so b c o mp rime nto s d e o nd a d o V o u a ma re lo , o hip o c ó tilo a c umula ma is a nto c ia nina e inte nsific a a inib iç ã o d o a lo ng a me nto q ua nd o c o mp a ra d o a o tip o se lva g e m (Ke rr, 1965; Mo c hizuki & Ka mimura , 1985; Pe te rs e t a l., 1989).
O utra s a lte ra ç õ e s fisio ló g ic a s tê m sid o o b se rva d a s e m p lâ ntula s d e hp. Tra b a lho s c o m e nzima s c o mo fe nila la nina a mo niô-lia se (G o ud e t a l., 1991), nitra to re d uta se , nitrito re d uta se e a mila se (G o ud & Sha rma , 1994) sug e re m o fito c ro mo c o mo re g ula d o r d a a tivid a d e d e sta s e nzima s (G o ud e t a l., 1991; G o ud & Sha rma , 1994).
O a c úmulo d e fito c ro mo e m p lâ ntula s e stio la d a s d e hp e no tip o se lva g e m
é simila r. De ste mo d o , a s d ife re nç a s o b se rva d a s ne ste s d o is g e nó tip o s nã o p o d e m se r e xp lic a d a s p e lo s níve is d e fito c ro mo na fo rma a tiva , sug e rind o q ue a muta ç ã o
O s muta nte s atv e Ip sã o simila re s e m a lg uns a sp e c to s a o muta nte hp (Ke nd ric k e t a l., 1994). O muta nte a tv a p re se nta e le va d o s níve is d e a nto c ia nina p rinc ip a lme nte e m b a ixa s te mp e ra tura s, no c a ule , va so s c o nd uto re s d a fo lha e no s fruto s ima turo s (Ric k e t a l., 1968; Vo n We ttste in-Kno wle s, 1968a , 1968b ). O muta nte
Ip a sse me lha -se a o hp, p o ré m, e m Ip, a muta ç ã o é d o mina nte e o s a sp e c to s d a sup e re xp re ssã o d o fito c ro mo sã o ma is e vid e nte s (Ric k, 1974).
Ke rc kho ffs e t a l., (1997b ) c a ra c te riza ra m c o mp a ra tiva me nte o s muta nte s
hp, a tv e Ip. Pa ra a a ná lise d e fito c ro mo to ta l a p ó s 4h d e V, o s g e nó tip o s hp e a tv a p re se nta ra m níve is simila re s c o mp a ra d o a o s d o tip o se lva g e m. Po ré m, o muta nte
Ip a p re se nto u me no re s níve is. Dura nte a inib iç ã o d o a lo ng a me nto d o hip o c ó tilo so b V, VE e B, o s trê s muta nte s re sp o nd e ra m d e mo d o se me lha nte , a p re se nta nd o uma fo rte inib iç ã o d e ste te c id o . Ma io re s te o re s d e c lo ro fila e a nto c ia nina fo ra m e nc o ntra d o s, re sp e c tiva me nte no s muta nte s hp e a tv.
2.2 Mic ro - To m c o mo mo de lo fisio ló g ic o
A utiliza ç ã o d o to ma te iro (Lyc o p e rsic o n e sc ule ntum) c o mo um mo d e lo p a ra estud a r p ro c e sso s b io ló g ic o s o fe re c e vá ria s va nta g e ns e m re la ç ã o a
Ara b id o p sis tha lia na. A d ive rsid a d e d e me ta b ó lito s se c und á rio s (Ta nksle y, 1992) e te c id o s q ue fa c ilita m a ná lise s b io q uímic a s, a lé m d o p ró p rio p a d rã o mo rfo g e né tic o d ife re nte d e Ara b ido p sis, co lo c a m o to ma te iro c o mo um mo d e lo a d ic io na l d e d ic o tile d ô ne a e m e stud o s c o mp a ra tivo s (Pra tt e t a l., 1997). C o mo Ara b id o p sis, o to ma te iro p o ssui um g e no ma re la tiva me nte p e q ue no e p o uc a s se q üê nc ia s re p e titiva s d e DNA (Za mir &Ta nksle y, 1988), c a ra c te rístic a s q ue fa c ilita m o c o nhe c ime nto d a s e strutura s g e nô mic a s. Emb o ra muito s g e ne s imp o rta nte s
p o d e m se r iso la d o s e c a ra c te riza d o s e m Ara b id o p sis, o to ma te iro p o ssui vá rio s g e ne s d e imp o rtâ nc ia e c o nô mic a , o s q ua is nã o e stã o d isp o níve is e m Ara b ido p sis (Wing e t a l., 1994). De vid o à a lta c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o p o r hip o c ó tilo e c o tilé d o ne s, Lip uc c i d i Pa o la e t a l., (1983) d e sta c a m o to ma te iro c o mo um e xc e le nte mo d e lo p a ra e stud o s d e c ultura d e te c id o s in vitro.
ta ma nho e d ura ç ã o d o c ic lo d e vid a , o s q ua is, e mb o ra se ja m re la tiva me nte p e q ue no s, e stã o e m fra nc a d e sva nta g e m q ua nd o c o mp a ra d o s a o s d e
Ara b id o p sis. To ma nd o-se va nta g em d a p ró p ria riq ue za d o g e rmo p la sma d e to ma te iro , há p o ssib ilid a d e d e se c ria r um siste ma d e e stud o s ne ssa e sp é c ie s no s mo ld e s q ue se te m ho je e m Ara b id o p sis. De ste mo d o , a c ultiva r minia tura d e to ma te iro , re c e nte me nte p ro p o sta p o r Me issne r e t a l. (1997) c o mo mo d e lo g e né tic o , p ro d uz fruto s e se me nte s viá ve is e m va so s d e a p e na s 50-150ml d e sub stra to , c o mp le ta nd o se u c ic lo d e vid a e m 70-90 d ia s. C o m e ssa s c a ra c te rístic a s, a c ha ma d a c ultiva r Mic ro -To m p o d e c re sc e r e m la b o ra tó rio na me sma e strutura
mínima re q ue rid a p a ra Ara b id o p sis. O c ic lo d e vid a c urto d a c v Mic ro -To m po ssui a va nta g e m a d ic io na l d e fa c ilita r a o b te nç ã o d e mic ro -p la nta s ne c e ssá ria s a o s e stud o s fisio ló g ic o s.
Muta nte s d e to ma te iro tê m sid o usa d o s c o mo uma e fic ie nte fe rra me nta e m g e né tic a p a ra c o m p re e nd e r o s g e ne s e sua s funç õ e s. Po uc a s muta ç õ e s fo ra m b e m c a ra c te riza d a s a níve l mo le c ula r ne sta e sp é c ie , a p e sa r d e te re m sid o c o le ta d a s p o r muita s d é c a d a s, c o mo muta ç õ e s e sp o ntâ ne a s e ind uzid a s (Emma nue l e t a l., 2002). Exe mp lo s d e ta is muta ç õ e s sã o a s na sínte se e e xp re ssã o d o fito c ro mo já d e sc rita s, muta ç õ e s na sínte se e se nsib ilid a d e a ho rmô nio s, c o mo muta nte s p a ra a uxina (Ke lly & Bra d fo rd , 1986), p a ra e tile no (Fujino e t a l., 1988; Wilkinso n e t a l., 1995), p a ra G A (Be nse n & Ze e va a rt, 1990), p a ra ABA (Burb id g e e t a l., 1999) e p a ra b ra ssino e ste ró id e (Ko ka e t a l., 2000). O c o rre ta mb é m muta nte s q ue a lte ra m a c o mp e tê nc ia p a ra a re g e ne ra ç ã o in vitro (Ko o rnne e f e t a l., 1993), a lé m d e o utra s muta ç õ e s q ue e nvo lve m vá rio s a sp e c to s d o d e se nvo lvime nto d e to ma te iro e va ria ç õ e s g e né tic a s q ue p ro mo ve m a a lta c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o in vitro d e sta e sp é c ie .
2.3 Va ria ç ã o g e né tic a na c a pa c ida de de re g e ne ra ç ã o in vitro e m toma te iro
um a va nç o imp o rta nte p a ra c o mp re e nd e r ta is me c a nismos (Ko o rnne e f e t a l., 1993).
A b a se g e né tic a d a s va ria ç õ e s q ue o c o rre m na c ultura d e te c id o s te m sid o e stud a d a e m vá ria s e sp é c ie s. Este s e stud o s mo stra ra m sig nific a nte s ha b ilid a d e s d e sta s e sp é c ie s e m re g e ne ra r p la nta s in vitro (Ko o rnne e f e t a l., 1993). No q ue se re fe re a o e stud o d a c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o in vitro, d ife re nç a s g e né tic a s ta mb é m tê m sid o a mp la me nte re la ta d a s e m to ma te iro (Kut & Eva ns, 1982; Ko o rnne e f e t a l., 1987; Sto mme l & Sind e n, 1991; Fa ria & Illg , 1996; Pe re s e t a l., 2001), se nd o a me sma c o ntro la d a p o r p o uc o s g e ne s (Ko o rnne e f e t a l., 1987; Fa ria
& Illg , 1996). So me nte um re d uzid o núme ro d e g e nó tip o s d e Lyc o p e rsic o n p o ssui a c a p a c id a d e d e re g e ne ra r no va s p la nta s a p a rtir d e e xp la nte s ra d ic ula re s (Pe re s e t a l., 2001). Ko o rnne e f e t a l. (1993) c o nsta ta ra m q ue a c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o d e e xp la nte s ra d ic ula re s e m L. p e ruvia num é c o ntro la d a p o r um únic o lo c us (Rg 1), o q ua l fo i intro g re d id o na c v MsK (L. e sc ule ntum). Dura nte a intro g re ssã o , e ste s a uto re s o b se rva ra m na s g e ra ç õ e s o b tid a s a p re se nç a d a c o r a ma re la d o fruto , e c o nsta ta ra m q ue e ste e fe ito é p ro mo vid o p o r uma muta ç ã o re c e ssiva r (ye llo w fle sh), a q ua l c o sse g re g a c o m o lo c us Rg 1, d e vid o a me sma lo c a liza ç ã o no c ro mo sso mo 3. Esta c a ra c te rístic a d o fruto é p o rta nto um ma rc a d o r mo rfo ló g ic o p a ra o lo c us d a a lta c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o (Fig ura 6).
Fig ura 6 - O lo c us Rg 1 e a muta ç ã o ye llo w fle sh (r) e stã o no
A p re se nç a d e um fa to r q ue p ro mo va a a lta c o mp e tê nc ia p a ra re g e ne ra ç ã o in vitro e m ta ma te iro p o d e rá p e rmitir uma me lho r a p lic a ç ã o d a s té c nic a s d a b io lo g ia c e lula r e mo le c ula r b e m c o mo o me lho ra me nto d e g e nó tip o s e c o no mic a me nte imp o rta nte s (Ko o rnne e f e t a l., 1987).
2.4 Compe tê nc ia pa ra re g e ne ra ç ã o in vitro
Dura nte a c ultura d e te c id o s ve g e ta is in vitro, c é lula s so má tic a s p o d e m se r c a p a ze s d e fo rma r ó rg ã o s, c o mo c a ule s e ra íze s, d e p e nd e nd o d o s fa to re s
p re se nte s no me io . C o mo é b e m c o nhe c id o , uma va rie d a d e d e fa to re s b io ló g ic o s, q uímic o s e físic o s a fe ta o p a d rã o d a o rg a no g ê ne se in vitro (Tho rp e , 1994). O b se rva nd o a fo rma ç ã o d e ó rg ã o s a p a rtir d e e xp la nte s d e ta b a c o , Sko o g e Mille r, (1957) mo stra ra m q ue a o rg a no g ê ne se é g o ve rna d a p e lo b a la nç o d e a uxina e c ito c inina p re se nte s no me io . Este s a uto re s d e mo nstra ra m q ue a p ro p o rç ã o d e a uxina e c ito c inina , fa vo rá ve l à a uxina , ind uziu a fo rma ç ã o d e ra íze s, p o r o utro la d o , a p ro p o rç ã o fa vo rá ve l a c ito c inina , ind uziu a fo rma ç ã o c a ule s. A p ro p o rç ã o inte rme d iá ria e ntre o s d o is ho rmô nio s fo rmo u a p e na s c a lo s.
Se g und o C hristia nso n & Wa rnic k (1988), a fo rma ç ã o d e g e ma s e m e xp la nte s fo lia re s d e C o nvulvulus a rve nsis p o d e se r d ivid id a e m trê s fa se s: a q uisiç ã o d e c o mp e tê nc ia , ind uç ã o e d ife re nc ia ç ã o (Fig ura 7). Na p rime ira fa se , a d e sd ife re nc ia ç ã o inic ia l d e c é lula s d o s e xp la nte s re sulto u na fo rma ç ã o d e c a lo s c o m c é lula s o u g rup o s d e c é lula s c o mp e te nte s, o u se ja , c a p a ze s d e re sp o nd e r a o s e fe ito s e stimula tó rio s d o me io d e c ultura p a ra a fo rma ç ã o d e g e ma s, c o mp re e nd e nd o a fa se d e ind uç ã o . Na te rc e ira fa se , a tra nsfe rê nc ia d e sta s c é lula s já c o mp e te nte s p a ra me io s ind uto re s d e g e ma s to rno u-a s d e te rmina d a s,
vá rio s fa to re s a mb ie nta is p o d e m e sta r e nvo lvid o s no p ro c e sso d e re g e ne ra ç ã o , a lte ra nd o muita s ve ze s o p a d rã o mo rfo g e né tic o in vitro. De ntre o s fa to re s a mb ie nta is e nvo lvid o s na re g e ne ra ç ã o , a luz e xe rc e um p a p e l fund a me nta l ne ste p ro c e sso , e e stud o s re c e nte s tê m re ve la d o o e nvo lvime nto d e fo to rre c e p to re s na a q uisiç ã o d e c o mp e tê nc ia p a ra re g e ne ra ç ã o (Be rtra m & Le rc a ri, 2000).
Fig ura 7 - Mo d e lo d e C hristia nso n e Wa rnic k (1985, 1988) a p lic a d o a o tra b a lho d e Sko o g e Mille r (1957). O b a la nç o e ntre a uxina (AIA) e c ito c inina (C Ks) p ro mo ve a ind uç ã o d e te c id o s e c é lula s p a ra fo rma r ra íze s o u c a ule s
2.5 Re ge ne raç ão in vitro c omo uma re sposta fotomorfog e né tic a
A funç ã o d e p ig me nto s fo to mo rfo g e né tic o s no p ro c e sso d e re g e ne ra ç ã o
in vitro é a ind a uma q ue stã o a b e rta , a p e sa r d e e stud o s mo stra nd o q ue a d ura ç ã o e a q ua lid a d e d a luz influe nc ia m a fo rma ç ã o d e c a ule s e ra íze s (Hug he s, 1981; Le rc a ri e t a l., 1986; Ec o no mo u e t a l., 1987; Ma rc e na ro e t a l., 1994). A na ture za do s fo to rre c e p to re s e nvo lvid o s no fo to c o ntro le d ura nte a d ife re nc ia ç ã o d e c é lula s in
ind e p e nd e nte me nte d a fo to ssínte se , to rna -se um siste ma inte re ssa nte p a ra e stud a r a funç ã o d o s fo to rre c e p to re s ne ste siste ma (Le rc a ri e t a l., 1986).
Estud o s c o m c a lo s d e ta b a c o re a liza d o s p o r We is & Ja ffe (1968) e Se ib e rt e t a l. (1975) re ve la ra m q ue a fo rma ç ã o d e g e ma s c a ulina re s é a ume nta d a p o r tra ta me nto s c o m luz a zul, p o ré m, a luz ve rme lha nã o pro mo ve e sta re sp o sta . O c o mp rime nto d e o nd a d o V, p o r o utro la d o , p ro mo ve a fo rma ç ã o g e ma s a d ve ntíc ia s e m a lg uma s e sp é c ie s (Wa rd & Va nc e , 1968). O e fe ito re ve rsíve l d o V/ VE na o rg a no g ê ne se d e c o tilé d o ne s d e a lfa c e fo i o b se rva d o p o r Ka d ka d e & Se ib e rt, (1977). Este s a uto re s ve rific a ra m q ue o V a ume nta sig nific a nte me nte a
fo rma ç ã o d e c a ule s, sug e rind o a p a rtic ip a ç ã o d o fito c ro mo ne ste e ve nto .
Exp o nd o c a lo s d e Ac tinidia de lic io sa so b re V, VE e B, Mule o & Mo rini (1990) o b se rva ra m uma q ua ntid a d e sig nific a tiva d e c a ule s fo rma d o s so b V, c o mp a ra d a a o s tra ta me nto s c o m B e VE. A fo rma ç ã o d e ra íze s ta mb é m fo i o b se rva d a p a ra to d o s o s tra ta me nto s, p o ré m, so b V ho uve uma re sp o sta ma is rá p id a . Le rc a ri e t a l. (1986), re la ta ra m q ue tra ta me nto s c o m V e luz b ra nc a a ume nta ra m a p o rc e nta g e m d e re g e ne ra ç ã o a p a rtir d e c o tilé d o ne s d e to ma te iro .
Em e stud o s c o mp a ra tivo s d a c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o a p a rtir d e e xp la nte s d e hip o c ó tilo s d e muta nte s a u e d o tip o se lva g e m, Le rc a ri e t a l. (1988) mo stra ra m q ue o s d o is g e nó tip o s a p re se nta m d ife re nç a s na re sp o sta re g e ne ra tiva na p re se nç a d e luz b ra nc a . O muta nte a u re g e ne ro u c a ule s a p e na s d e se g me nto s d o á p ic e d o hip o c ó tilo , e nq ua nto ne nhuma d ife re nç a fo i o b se rva d a e ntre o s se g me nto s b a sa l, inte rme d iá rio e a p ic a l d o hip o c ó tilo d o tip o se lva g e m. Alé m d isso , e xp la nte s d e hip o c ó tilo s d e to ma te iro nã o re g e ne ra ra m c a ule s no e sc uro , me smo na p re se nç a d e d ife re nte s c o nc e ntra ç õ e s d e a uxina e c ito c inina . De sta fo rma , e ste s a uto re s a ssume m q ue a luz é um fa to r imp re sc ind íve l na
o rg a no g ê ne se a p a rtir d e hip o c ó tilo s d e to ma te iro .
Po ste rio rme nte , Le rc a ri e t a l. (1999), a va lia ra m o e fe ito d o V, VE, B e luz b ra nc a na c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o d o hip o c ó tilo d e p lâ ntula s d e muta nte s
a u nã o a p re se nta ra m re g e ne ra ç ã o d o hip o c ó tilo , e nq ua nto no tip o se lva g e m ho uve re g e ne ra ç ã o e m me no re s p ro p o rç õ e s. So b V o u VE, a p e na s uma g e ma c a ulina r fo i fo rma d a d e ntre 500 e xp la nte s re tira d o s d e hip o c ó tilo d e muta nte s a u c ultiva d o s na luz. O s me smo s c o mp rime nto s d e o nd a p ro mo ve ra m a lta c a p a c id a d e re g e ne ra tiva d a p o rç ã o a p ic a l d o s hip o c ó tilo s d o tip o se lva g e m. As re sp o sta s a o B fo ra m simila re s à q ue la s e nc o ntra d a s so b V e VE p a ra o tip o se lva g e m. Pa ra o s muta nte s a u, o B p ro mo ve u d ife re nç a s na c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o d a p o rç ã o b a sa l, inte rme d iá ria e a p ic a l, se nd o a última a re g iã o q ue a p re se nto u ma io r re g e ne ra ç ã o . C o nsid e ra nd o o e fe ito d o s d ife re nte s
c o mp rime nto s d e o nd a na c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o d e hip o c ó tilo s d o muta nte a u e tip o se lva g e m, o s re sulta d o s sup o rta m a sug e stã o d e q ue fito c ro mo s p o ssue m uma funç ã o c ruc ia l na re g e ne ra ç ã o d e hip o c ó tilo s d e to ma te iro . Po ré m, o muta nte a u é d e fic ie nte e m to d o s o s tip o s d e fito c ro mo (Te rry & Ke nd ric k, 1996), nã o se nd o p o ssíve l c o mp a ra r iso la d a me nte a funç ã o d e c a d a tip o d e fito c ro mo e m to ma te iro (Be rtra n & Le rc a ri, 2000).
Pa ra ve rific a r o e nvo lvime nto d o s fito c ro mo s p hyA e p hyB1 na a q uisiç ã o d e c o mp e tê nc ia p a ra fo rma ç ã o d e g e ma s a p a rtir d e hip o c ó tilo s d e to ma te iro , Be rtra n & Le rc a ri (2000) utiliza ra m muta nte s d e fic ie nte s no a c úmulo d e p hyA (fri) e no a c úmulo d e p hyB1 (tri), c o mp a ra nd o-o s a o tip o se lva g e m. Em p la nta s p ré-c ultiva d a s no e sré-c uro , to d o s o s g e nó tip o s a p re se nta ra m ré-c a p a ré-c id a d e sig nifiré-c a tiva d e re g e ne ra ç ã o so b luz b ra nc a , a p e na s e m se g me nto s a p ic a is d o hip o c ó tilo . Po uc o fo i o b se rva d o p a ra a p o rç ã o b a sa l e inte rme d iá ria , mo stra nd o o e fe ito d o e stio la me nto no d e c ré sc imo d a c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o . Po r o utro la d o , uma q ua ntid a d e sub sta nc ia l d e g e ma s fo rma d a s d a s trê s re g iõ e s d o hip o c ó tilo fo i o b se rva d a no s trê s g e nó tip o s q ua nd o p ré -c ultiva d o s na luz b ra nc a . Tra ta me nto s
c o m V, VE e luz b ra nc a tê m o me smo e fe ito p a ra p la nta s d o tip o se lva g e m.
Po ré m, o s muta nte s tri p ré -tra ta d o s c o m V o u VE mo stra ra m um g ra d ie nte d e
a p re se nta ra m simila rid a d e d ura nte a re g e ne ra ç ã o b a sa l, inte rme d iá ria e a p ic a l d o s e xp la nte s d o hip o c ó tilo . Po ré m, q ua nd o tra ta d a s c o m VE, o s muta nte s fri, a p e sa r d a b a ixa c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o , a p re se nta ra m ma io re s re sp o sta s d o q ue q ua nd o a s me sma s fo ra m c ultiva d a s no e sc uro , sug e rind o q ue um fito c ro mo d ife re nte d e p hyA a p re se nto u-se na fo rma a tiva d ura nte a re g e ne ra ç ã o .
C o mo já re la ta d o , o s muta nte s tri ta mb é m mo stra ra m um g ra d ie nte d e
re g e ne ra ç ã o q ua nd o p ré-c ultiva d o s so b VE, c o nfirma nd o a ne c e ssid a d e d e p hyB1 na fo rma a tiva d ura nte a a q uisiç ã o d e c o mp e tê nc ia p a ra re g e ne ra ç ã o . Esta s o b se rva ç õ e s ind ic a m q ue a p e rc e p ç ã o d o VE p e lo p hyA ind uz a o má ximo a
c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o d e se g me nto s d a p o rç ã o b a sa l, inte rme d iá ria e a p ic a l d o hip o c ó tilo so me nte na p re se nç a d o p hyB1. Este s re sulta d o s sug e re m q ue a a q uisiç ã o d e c o mp e tê nc ia p a ra re g e ne ra ç ã o d e c a ule s a p a rtir d e hip o c ó tilo s é me d ia d o , p e lo me no s, p o r d ua s fo rma s d istinta s d e fito c ro mo s, phyA e p hyB1 (Be rtra n & Le rc a ri, 2000).
Tyb urski & Tre tyn (1999) p ud e ra m a va lia r a c a p a c id a d e o rg a no g e né tic a c o mo uma re sp o sta à luz utiliza nd o muta nte s d e to ma te iro q ue sup e re xp re ssa m o fito c ro mo (hp) e o muta nte a u, o q ua l é d e fic ie nte e m to d o s o s tip o s d e fito c ro mo . Fo i o b se rva d o q ue a fo rma ç ã o d e g e ma s c a ulina re s no s muta nte s hp e no tip o se lva g e m o c o rre u so me nte na luz, e q ue a re g e ne ra ç ã o fo i ma io r p a ra hp e m to d o s o s tra ta me nto s d e luz. A fo rma ç ã o d e c a ule s no s muta nte s a u o c o rre u o c a sio na lme nte a p e na s na p re se nç a d e V o u luz b ra nc a . Re sulta d o s d ife re nte s fo ra m o b se rva d o s p o r Kra e p ie l e t a l. (1995) q ua nd o o s me smo s ve rific a ra m q ue muta nte s p e w1 d e ta b a c o , e q uiva le nte a o muta nte a u d e to ma te iro , e o tip o se lva g e m re g e ne ra ra m c a ule s ta nto na luz q ua nto no e sc uro .
O e nvo lvime nto d e fo to rre c e p to re s no p ro c e sso d e re g e ne ra ç ã o in vitro
2.6 Inte ra ç ã o e ntre fotomorfog ê ne se e hormônios
A luz c o ntro la q ua se to d o s a s e ta p a s d o d e se nvo lvime nto d a p la nta . Entre ta nto , a se q üê nc ia d e e ve nto s q ue o c o rre a p ó s a p e rc e p ç ã o d a luz a ind a é muito p o uc o e luc id a d a (Furuya , 1993). Te m sid o p ro p o sto a p a rtic ip a ç ã o d e ho rmô nio s ve g e ta is no s me c a nismo s q ue tra d uze m o s sina is d a luz. Se g und o C ho ry e t a l., (1994), d e p e nd e nd o d a e sp é c ie e c o nd iç õ e s d e e xp e rime nto , luz e ho rmô nio s p o d e m p a rtic ip a r d o s me smo s e ve nto s d o d e se nvo lvime nto d a p la nta . Co mo fo to rre c e p to re s, fito c ro mo s p o d e m me d ia r muito s p a sso s d a inte ra ç ã o e ntre
luz e ho rmô nio s (Ha llid a y & Fra nc kha use r, 2003).
2.6.1 Fitoc romo e e tile no
Te m sid o o b se rva d o q ue luz e e tile no ind uze m re sp o sta s o p o sta s no d e se nvo lvime nto d a p la nta . Po r e xe mp lo , a a p lic a ç ã o d e e tile no a nula o e fe ito e stimula tó rio d a luz, c o mo o b se rva d o p o r G o e sc hl e t a l., (1967) d ura nte a e xp a nsã o d o s c o tilé d o ne s e m p lâ ntula s d e e rvilha . Fo i o b se rva d o ta mb é m um d e c ré sc imo na ta xa d e e tile no q ua nd o e sta s p lâ ntula s fo ra m tra ta d a s c o m luz, sug e rind o q ue a luz inib e a sínte se d e e tile no , p e lo me no s ne ste c a so . Em
Ara b ido p sis, o me c a nismo p a re c e o c o rre r d e ma ne ira d ife re nte , p o is a a b e rtura d o g a nc ho p lumula r o c o rre e m re sp o sta a luz me smo e m a lta s c o nc e ntra ç õ e s d e e tile no , sug e rind o q ue a p e rc e p ç ã o , ma is d o q ue a p ro d uç ã o d o e tile no é mo d ula d a p e la luz (Kne e e t a l., 2000).
Ap e sa r d o c o nhe c ime nto d a inte ra ç ã o e ntre luz e e tile no d ura nte vá rio s e stá g io s d o c ic lo d a p la nta , a na ture za mo le c ula r d e ste s e ve nto s a ind a nã o fo i
e sc la re c id a (Ha llid a y & Fra nc kha use r, 2003).
2.6.2 Fitoc romo e c itoc inina s
d ife re nc ia ç ã o d o c lo ro p la sto , inib iç ã o d o a lo ng a me nto d o hip o c ó tilo e e xp a nsã o d o s c o tilé d o ne s e d a fo lha (C ho ry e t a l., 1994). Po ré m, o muta nte a m p 1 d e
Ara b id o p sis, o q ua l a c umula a lto s níve is d e c ito c inina s, a p re se nta o s me smo s a sp e c to s d e p la nta s se lva g e ns q ua nd o c re sc id a s no e sc uro (C hin-Atkins e t a l., 1996). Po rta nto , a a p lic a ç ã o d e c ito c inina s nã o p a re c e te r o me smo e fe ito e m to d a s a s e sp é c ie s ve g e ta is. Em e rvilha , p o r e xe mp lo , o c re sc ime nto d o e p ic ó tilo no e sc uro fo i inib id o p o r a p lic a ç ã o d e c ito c inina . Este e ve nto nã o p ro mo ve o d e se nvo lvime nto d a s fo lha s na a usê nc ia d a luz (Se ye d i e t a l., 2001). As c ito c inina s tê m um e fe ito surp re e nd e nte no s muta nte s lip 1 d e e rvilha . No e sc uro , o s muta nte s
lip 1 a c umula m b a ixo s níve is d e p hyA c o mp a ra d o s a o s d o tip o se lva g e m, e ntre ta nto , tra ta me nto s c o m c ito c inina s sup re m e sta d e fic iê nc ia (Se ye d i e t a l., 2001). De sta fo rma , e ste s re sulta d o s ind ic a m q ue a inte ra ç ã o e ntre luz e c ito c inina s p o d e se r e sp e c ífic a p a ra c a d a e sp é c ie (Ha llid a y & Fra nc kha use r, 2003).
2.6.3 Fitoc romo e g ibe re lina s
O s me lho re s p ro c e sso s e nvo lve nd o a re g ula ç ã o p e la luz e g ib e re lina s
ind ic a nd o q ue G A e luz a g e m p o r via s ind e p e nd e nte s (Be hring e r e t a l., 1990). Lup e z-Jue z e t a l. (1995), utiliza nd o muta nte s d e p e p ino Ih d e fic ie nte s no a c úmulo d e p hyB, Re e d e t a l. (1996), usa nd o muta nte s Ara b id o p sis ta mb é m d e fic ie nte s e m p hyB, e We lle r e t a l. (1994), usa nd o muta nte s fo to mo rfo g e né tic o s e d e fic ie nte s e m GA, mo stra ra m q ue o a c úmulo d e G A nã o é re g ula d a p e la luz, ma s a se nsib ilid a d e a o G A p a re c e se r re d uzid a p e la luz, sug e rind o q ue a inte ra ç ã o e ntre o s d o is sina is se ja na via d e sina liza ç ã o .
C o nsid e ra nd o o e nvo lvime nto d e G As na re g ula ç ã o d o d e se nvo lvime nto p e la luz, to d o s o s d a d o s sug e re m uma inte ra ç ã o e ntre e ste s d o is fa to re s, e mb o ra
se ja ne c e ssá rio ma io re s inve stig a ç õ e s (Kra e p ie l & Mig inia c , 1997).
2.6.4 Fitoc romo e a uxina
Vá rio s a uto re s tê m ve rific a d o o tra nsp o rte d a a uxina no hip o c ó tilo d e p lâ ntula s e o e nvo lvime nto d e ste ho rmô nio na re g ula ç ã o d o a lo ng a me nto c e lula r c o mo uma re sp o sta à luz (Kra e p ie l & Mig inia c , 1997). O e fe ito inib itó rio d o V so b re a b io ssínte se d e a uxina e m c o le o p tile s d e milho fo i d e mo nstra d o p o r Lino (1982), sug e rind o o fito c ro mo c o mo um p o ssíve l me d ia d o r d e ste p ro c e sso (Ha llid a y & Fra nc kha use r, 2003). Ante rio rme nte , She rwin & Furuya (1973) re la ta ra m o e fe ito re ve rsíve l d e V/ VE no tra nsp o rte d e a uxina e m c o le o p tile s d e a rro z. Alé m d isso , Ste ind le r e t a l. (1999) re la ta ra m q ue a d isp o nib ilid a d e d e VE so b uma ve g e ta ç ã o p ro mo ve o e stio la me nto d a p la nta d e vid o à ind uç ã o p o r e ste c o mp rime nto d e o nd a no a c úmulo d e a uxina . Po ré m, e m p la nta s tra nsg ê nic a s d e Ara b id o p sis sup e re xp re ssa nd o a uxina , Ro ma no e t a l. (1995) d e mo nstra ra m q ue a re g ula ç ã o d o a lo ng a me nto d o hip o c ó tilo p o r a uxina e luz o c o rre d e mo d o ind e p e nd e nte .
a so ma tó ria d a s e vid ê nc ia s sug e re q ue a luz ind uz um d e c ré sc imo no s níve is d e a uxina (Kra e p ie l & Mig inia c , 1997).
2.6.5 Fitoc romo e á c ido a bsc ísic o
Luz e á c id o a b sc ísic o (ABA) p o d e m a g ir sine rg istic a me nte e m a lg uns c a so s (Mc Elwa in e t a l., 1992) e anta g o nistic a me nte e m o utro s (C ha ng e Wa ling , 1991; To yo ma su e t a l., 1994). O e fe ito ne g a tivo d a luz no a c úmulo d e ABA fo i o b se rva d o p o r Kra e p ie l e t a l. (1994). Este s a uto re s ve rific a ra m um a c ré c imo d e ABA e m
muta nte s d e ta b a c o d e fic ie nte s na sínte se d o c ro mó fo ro (p e w1) c o mp a ra d o a o d o tip o se lva g e m, sug e rind o q ue a d e g ra d a ç ã o d e ABA se ja me d ia d a p e la luz. No c a so d a g e rmina ç ã o d e se me nte s d e a lfa c e , To yo ma su e t a l. (1994) re la ta ra m c o rre la ç õ e s e ntre tra ta me nto c o m luz, d e c ré sc imo no s níve is d e ABA e g e rminaç ã o d e se me nte s. Ne ste p ro c e sso , a ina tiva ç ã o d e ABA p o d e ria se r um p a sso imp o rta nte . Este s re sulta d o s sup o rta m a hip ó te se d e q ue o s p ro c e sso s fisio ló g ic o s e nvo lve nd o ABA d e p e nd e m d o s sina is tra zid o s p e la luz. Entre ta nto , a re la ç ã o e ntre o s d o is sina is a ind a nã o fo i e sta b e le c id a , e a imp o rtâ nc ia fisio ló g ic a na re g ula ç ã o no s níve is d e ABA p e la luz p e rma ne c e nã o e sc la re c id a (Mig inia c & Kra e p ie l, 1997).
2.6.6 Fitoc romo e bra ssinoe ste róide
A id e ntific a ç ã o d o muta nte d e t2 e m Ara b id o p sis fo i a p rime ira ind ic a ç ã o d e uma p o ssíve l inte ra ç ã o e ntre luz e b ra ssino e ste ró id e (BR). O muta nte d e t2 fo i id e ntific a d o p o r a p re se nta r inib iç ã o no a lo ng a me nto d o hip o c ó tilo , c o tilé d o ne s
e xp a nd id o s e a c úmulo d e a nto c ia nina no hip o c ó tilo me smo q ua nd o c re sc id o s na a usê nc ia d e luz (Li e t a l., 1996).
p ro d uç ã o d e b ra ssino e ste ró id e , p ro mo ve nd o a inib iç ã o d o a lo ng a me nto d o hip o c ó tilo (Ha llid a y & Fra nc kha use r, 2003). Po ré m, Symo ns e t a l. (2002) re la ta ra m q ue a luz p ro mo ve a p ro d uç ã o d e BR e m p la nta s d e e rvilha , c o ntra sta nd o c o m o s re sulta d o s a p re se nta d o s.
O muta nte b a s1 d e Ara b id o p sis a nula o e fe ito d o a lo ng a me nto d o hip o c ó tilo no muta nte d e fic ie nte e m phyB, no s d up lo s muta nte s fo rma d o s. O muta nte b a s1 sup e re xp re ssa o c ito c ro mo P450, o q ua l re sulta na ina tiva ç ã o d e b ra ssino lid e (Ne ff e t a l., 1999), sug e rind o uma p o ssíve l lig a ç ã o e ntre BR e fito c ro mo (Ha llid a y & Fa nc kha use r, 2003) .
3 O BJETIVO
O o b je tivo d o p re se nte tra b a lho fo i inc o rp o ra r a s muta ç õ e s fo to mo rfo g e né tic a s a u, fri, tri, hp , a tv, e Ip b e m c o mo o lo c us d e re g e ne ra ç ã o Rg 1 na c ultiva r Mic ro-To m. As linha g e ns g e ra d a s fo ra m utiliza d a s p a ra :
I) Ava lia r o e fe ito d a s muta ç õ e s fo to mo rfo g e né tic a e d o lo c us Rg 1 na c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o in vitro d e ra iz, c a ule e fo lha so b luz b ra nc a .
II) Ava lia r o e fe ito d o s c o mp rime nto s d e o nd a d o ve rme lho e ve rme lho-e xtre mo na c a p a c id a d e d e re g e ne ra ç ã o in vitro d e ra iz, c a ule e fo lha c a rre g a nd o o lo c us
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Ma te ria l ve g e ta l
Fo ra m utiliza d a s p la nta s d e to ma te iro (Lyc o p e rsic o n e sc ule ntum):
Ta b e la 1 - C a ra c te riza ç ã o d o s muta nte s fo to mo rfo g e né tic o s
Mutante s Ca ra c te rístic a s mo rfo ló g ic a s e funç õ e s
dos g e ne s c orre sponde nte s Re fe rê nc ia
a ure a (a u) Pla nta c lo ró tic a e e stio la d a me smo na
p re se nç a d e luz. Le sã o no g e ne q ue c o d ific a o c ro mó fo ro d o fito c ro mo .
Te rry & Ke nd ric k, (1996)
fa r re d inse nsitive (fri) Inse nsib ilid a d e a o ve rme lho-e xtre mo
(VE). De fic iê nc ia no a c úmulo d e fito c ro mo e m p lâ ntula s e stio la d a s. Le sã o no g e ne q ue c o d ific a p a ra fito c ro mo A.
Van Tuine n e t a l., (1995a )
te mp o ra ry re d inse nsitive (tri)
Inse nsib ilid a d e a o ve rme lho (V). Hip o c ó tilo a lo ng a d o . Le sã o no g e ne q ue
c o d ific a p a ra fito c ro mo B1.
Va n Tuine n e t a l., (1995b )
Hig ht p ig me nt (hp ) Pig me nta ç ã o ve rd e -e c ura d a fo lha g e m
e d o s fruto s. Alte ra ç ã o na via d e tra nsd uç ã o d o fito c ro mo .
a tro vio la c e a e (a tv) Pig me nta ç ã o ve rd e -e sc ura da fo lha g e m
e d o s fruto s. Alte ra ç ã o na via d e tra nsd uç ã o d o fito c ro mo .
Inte nse p ig me nt (Ip ) Pig me nta ç ã o ve rd e -e sc ura da fo lha g em
e d o s fruto s. Alte ra ç ã o na via d e tra nsd uç ã o d o fito c ro mo .
Ke nd ric k & Kro ne nb e rg , (1994)
