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RESUMO
O conhecimento sobre os procariotos nativos em locais de risco favorece a aplicação
de biotecnologias para biorremediação. Estratégias independentes de cultivo, como
metagenômica, contribuem para aprofundar o conhecimento microbiológico,
possibilitando estudos com organismos não cultiváveis acerca do “status
microbiológico nativo” e seu potencial papel na biodegradação de, por exemplo,
Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAP’s). Considerando o bioma de mangue
uma interface frágil e crítica de fronteira com o oceano, este trabalho caracteriza a
microbiota nativa de mangue com potencial biodegradador de HAP’s utilizando um
biomarcador molecular para detecção e avaliação da diversidade bacteriana em
áreas sob influência de indústrias petrolíferas através da PCR-DGGE na Bacia
Petrolífera Potiguar (BPP). Foi escolhido um biomarcador molecular metabólico,
enzima PcaF, para detecção de procariotos degradadores de HAP’s. Com o
biomarcador, fingerprints foram obtidos de amostras de Paracuru-CE, Fortim-CE e
Areia Branca-RN, revelando a ocorrência de flutuações das comunidades
microbianas de acordo com os períodos de amostragem e em resposta ao impacto
por petróleo. Através da análise das comunidades microbianas frente à interferência
da indústria do petróleo, em Areia Branca-RN e Paracuru-CE foi observado que o
petróleo é determinante para a diversidade microbiana. Fortim-CE provavelmente
não tem influência direta da atividade petrolífera. No intuito de obter dados para o
melhor entendimento do transporte e biodegradação de HAP’s, foram desenvolvidos
estudos in silico de modelagem e simulação computacional a partir da obtenção de
modelos 3-D de proteínas envolvidas na degradação do fenantreno, no transporte de
HAP’s e também a obtenção do modelo 3-D da enzima PcaF. Estudos de dockings
com substratos e produtos forneceram dados para o melhor entendimento sobre o
mecanismo de transporte e catálise de HAP’s.
Palavras-chave: Manguezais, hidrocarboneto aromático policíclico, metagenoma,
Biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos: prospecção metagenômica e modelagem computacional 3-D de proteínas
ABSTRACT
Knowledge of the native prokaryotes in hazardous locations favors the application of
biotechnology for bioremediation. Independent strategies for cultivation and
metagenomics contribute to further microbiological knowledge, enabling studies with
non-cultivable about the "native microbiological status” and its potential role in
bioremediation, for example, of polycyclic aromatic hydrocarbons (HPA's).
Considering the biome mangrove interface fragile and critical bordering the ocean,
this study characterizes the native microbiota mangrove potential biodegradability of
HPA's using a biomarker for molecular detection and assessment of bacterial
diversity by PCR in areas under the influence of oil companies in the Basin
Petroleum Geology Potiguar (BPP). We chose PcaF, a metabolic enzyme, to be the
molecular biomarker in a PCR-DGGE detection of prokaryotes that degrade HPA’s.
The PCR-DGGE fingerprints obtained from Paracuru-CE, Fortim-CE and Areia
Branca-RN samples revealed the occurrence of fluctuations of microbial communities
according to the sampling periods and in response to the impact of oil. In the analysis
of microbial communities interference of the oil industry, in Areia Branca-RN and
Paracuru-CE was observed that oil is a determinant of microbial diversity. Fortim-CE
probably has no direct influence with the oil activity. In order to obtain data for better
understanding the transport and biodegradation of HPA's, there were conducted in
silico studies with modeling and simulation from obtaining 3-D models of proteins
involved in the degradation of phenanthrene in the transport of HPA's and also
getting the 3-D model of the enzyme PcaF used as molecular marker in this study.
Were realized docking studies with substrates and products to a better understanding
about the transport mechanism and catalysis of HPA’s.
Keywords: Mangrove, polycyclic aromatic hydrocarbon, metagenomic, bioinformatics,
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS...V
LISTA DE FIGURAS...VI
LISTA DE TABELAS...VII
LISTA DE ANEXOS...VIII
1. INTRODUÇÃO...9
2. OBJETIVOS E METAS...24
2.1. OBJETIVO GERAL...24
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...24
2.3. METAS...24
3. METODOLOGIA...25
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO...36
5.CONCLUSÃO...79
6.REFERÊNCIAS...81
7. CRONOGRAMA...86
Biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos: prospecção metagenômica e modelagem computacional 3-D de proteínas
LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA – Aminoácido
ABC – Amostra Areia Branca-RN contaminado
ABP – Amostra Areia Branca-RN pura
BPP – Bacia Petrolífera Potiguar
DGGE – Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante
FTC – Amostra Fortim-CE contaminado
FTP – Amostra Fortim-CE pura
HAP – Hidrocarboneto aromático policíclico
mDNA – DNA metagenômico
M – Marcador molecular
NidAm – Biodegradação do Fenantreno (proteína modelada)
NidBm – Biodegradação do Fenantreno (proteína modelada)
OTUs – Organismal Taxonomic Units
PAGE – Gel de Poliacrilamida
PCC – Amostra Paracuru-CE contaminado
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
PcaFm – Enzima de Convergência HAP’s (proteína modelada)
PCP – Amostra Paracuru-CE pura
SHE – DNA genômico de Shewanella sp. usado como controle positivo em reações
da PCR
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribuição dos HAP’s no meio aquático (Fonte: Lima, 1996)...13
Figura 2. Degradação do naftaleno...15
Figura 3. Vias metabólicas de HAP’s construída por Pérez-Pantoja et al., 2008...17
Figura 4. Fluxograma ilustrando as etapas metodológicas do projeto...25
Figura 5. Visão geral dos locais de coleta pertecente a Bacia Petrolífera Potiguar...26
Figura 6. Local de Coleta Fortim/CE...27
Figura 7. Local de Paracuru/CE...27
Figura 8. Local de Areia Branca/RN...28
Figura 9. Metodologia para construção e amostragem dos microcosmos...28
Figura 10. Gráfico da quantificação microbiana das amostras do tempo “0”...36
Figura 11. Gráficos das concentrações de mDNA ...37
Figura 12. Região alvo para os primers PCAF...39
Figura 13. PAGE com amplicons das amostras PC primers 16S DNAr - PCR...40
Figura 14. PAGE com amplicons das amostras PC primers PCAF - PCR...40
Figura 15. PAGE, amostras PC primers PCAF – PCR (teste com DMSO)...41
Figura 16. PAGE, Screen do genepcaF - PCR...43
Figura 17. Screen do genepcaF – PCR – Análise Digital...45
Figura 18. Perfil gerado por PCR-DGGE com primer PCAFe 16SDNAr...49
Figura 19. Perfil DGGE-16S DNAr refinado pelo software LabImage 1D 2006...51
Figura 20. Gráficos dos perfis DGGE 16S DNAr ...52
Figura 21. Gráficos da riqueza de amplicons...54
Figura 22. Dendrogramas de similaridade – UPGMA...56
Figura 23. Ampliação da imagem DGGE, em destaque amplicons PCAF...57
Figura 24. Modelo construído da proteína TbuXm de R. euthropha JMP134...59
Figura 25. Gráficos de Ramachandran do modelo TbuXm...60
Figura 26. Docking avaliativo no template cristalográfico 3bryB...61
Figura 27. Docking no modelo TbuXm com tolueno e fenantreno...63
Figura 28. Cristal hexamérico 2b1x de Rodococcus sp...64
Figura 29. Cristal hexamérico 2bmo de Comamonas sp...65
Figura 30. Modelo construído da proteína NidAm/NidBm de M. vanbaalenii....66
Figura 31. Gráficos de Ramachandran dos modelos NidAm e NidbM...67
Figura 32. Alinhamento múltiplo das sequências protéicas primárias NidA e NidB...68
Figura 33. Aminoácidos catalíticos no modelo NidAm/NidBm de M. vanbaalenii...69
Figura 34. Docking com fenantreno no modelo NidAm/NidBm de M. vanbaalenii...70
Figura 35. Possível posicionamento fenantreno com os aa do modelo NidAm/NidBm...71
Figura 36. Gráfico da energia da posição da molécula fenantreno x a energia total...72
Figura 37. PcaFm de R. euthropha JMP134...74
Figura 38. PcaFm de R. euthropha JMP134 e suas regiões catalíticas inferidas...75
Biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos: prospecção metagenômica e modelagem computacional 3-D de proteínas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. HAP’s relevantes segundo a IUPAC...11
LISTA DE ANEXOS
Anexo 8.1. Dados do cristal PDB:2b1x...87
Anexo 8.2. Dados do cristal PDB:2bmo...88
Anexo 8.3. Dados do cristal PDB:3bry...89
Anexo 8.4. Dados do cristal PDB:1ulq...90
Anexo 8.5. Dados da Matriz de Similaridade...91
Anexo 8.6. Dados sobre a validação dos modelos 3-D proteicos...92
Biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos: prospecção metagenômica e modelagem computacional 3-D de proteínas
1. INTRODUÇÃO
1.1. Atividade Industrial, Meio ambiente e Microbiologia
Entre as atividades industriais urbanas e não urbanas, a indústria de petróleo e
gás, demanda uma grande preocupação ambiental e social. Considerando que o
petróleo é utilizado como matéria-prima não renovável, possuindo uma série de
subprodutos que são gerados após o refino com diversas utilidades: gasolina, óleo
diesel, querosene, nafta, lubrificantes, plásticos, fertilizantes, medicamentos, tintas,
tecidos, etc., também são gerados compostos indesejáveis e a maioria deles
recalcitrantes (van Hamme et al. 2003; Ward et al., 2003).
O impacto ambiental em todo o mundo provocado direta e/ou indiretamente
pela indústria de petróleo e gás, e o elevado custo nas práticas de recuperação do
meio ambiente têm levado a investimentos na geração de conhecimento sobre a
biodegradação dos constituintes do petróleo: hidrocarbonetos saturados e não
saturados, lineares, monoaromático e poliaromáticos assim como também dos
petro-derivados (Magot et al., 2000; Watanabe, 2002; van Hamme et al., 2003; Laubier, 2005).
Devido à crescente preocupação com a degradação ambiental causada por
atividades industriais, surgiu o termo “Ecologia Industrial”, que considera ambientes
industriais e comerciais como análogos de ambientes biológicos. Nesse contexto
pretende-se reduzir os agravos ambientais decorrentes da extração de
matérias-primas, da produção de bens materiais, do uso desses bens e do manejo dos
dejetos resultantes, ocasionando um incremento da sustentabilidade no
aproveitamento dos recursos naturais e das atividades humanas (Galloupolus et al., 2006).
O petróleo é composto basicamente por hidrocarbonetos (97%), e elementos
como nitrogênio, enxofre e oxigênio (Yender et al., 2002; National Research Council, 1985 apud National Research Council, 2003). Os hidrocarbonetos podem ser
classificados em dois grandes grupos: alifáticos e aromáticos. Os hidrocarbonetos
aromáticos são formados por pelo menos um anel aromático e podem ser separados
em dois grupos: os compostos monoaromáticos e os poliaromáticos também
chamados de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP’s). Embora os HAP’s
estáveis, persistentes no meio ambiente e por apresentarem efeitos tóxicos nos
organismos aquáticos e terrestres.
Os HAP’s são compostos constituídos unicamente de átomos de carbono e de
hidrogênio, estruturados para formar dois ou mais anéis aromáticos sendo mais de
100 HAP’s os reconhecidos pela União Internacional de Química Pura e Aplicada
(IUPAC) e dentre estes, somente 16 são considerados relevantes em função das
informações químico-físicas, toxicológicas, industriais e ambientais existentes. São
eles: acenaftaleno, acenaftileno, antraceno, benzo(a)antraceno, benzo(a)pireno,
benzo(b)fluoranteno, benzo(k)fluoranteno, benzo(g,h,i)perileno, criseno,
dibenzo(a,h)antraceno, fenantreno, fluoranteno, fluoreno, indeno(1,2,3-c,d)pireno,
naftaleno e pireno (Tabela 1) (Verschueren, 2001; Potin et al., 2004, Peng et al., 2008).
A contaminação por HAP’s originários de fontes petrogênicas demonstram
dominância de compostos de 2-3 anéis aromáticos, enquanto o predomínio de
compostos de 4-5 anéis geralmente está associado a fontes pirolíticas (Carr e Neff,
1988).
Os HAP’s, como por exemplo: benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno (BTEX)
são compostos orgânicos naturais, gerados continuamente pela combustão
incompleta da matéria orgânica e também pela geração antropogênica, por exemplo,
indústria Petrolífera, resultando na contaminação dos ecossistemas, uma vez que
estes compostos não são degradados pela maioria dos microrganismos, devido à
complexa estrutura química e baixa solubilidade em água (Jonhsen et al., 2005). A ocorrência dos HAP’s no ambiente é perigosa por suas propriedades mutagênicas e
carcinogênicas (Chakradeo et al., 1993; Netto et al., 2000). A diminuição natural dos HAP’s é mediada por microrganismos nativos, tornando relevantes os estudos
visando a identificação, monitoramento e utilização biotecnológica (Bamforth e
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Os HAP’s possuem uma forte tendência em adsorver as partículas orgânicas e
minerais do solo e dos sedimentos, minimizando sua biodisponibilidade aos
potenciais microrganismos degradadores, tornando-se recalcitrantes (Johnsen et al., 2005).
Segundo Silva et al., (2004) para diferenciar os HAP’s originados em
combustão daqueles de origem petrogênica, podem ser usados índices baseados na
razão da concentração de HAP’s selecionados. Assim, pode-se usar a razão entre
HAP’s de baixa massa molecular e HAP’s de alta massa molecular, onde valores
menores que 1 sugerem fonte de contaminação por combustão. Pode-se usar
também as razões entre componentes homólogos como fenantreno e antraceno,
benzo(a)antraceno e criseno (Lima, 2001).
Nos Estados Unidos, a legislação ambiental existente sobre HAP’s está
vinculada à Agência Americana de Proteção Ambiental (USEPA) e na União
Europeia, à Comissão das Comunidades Europeias e à Lista Holandesa de Valores
de Qualidade do Solo e da Água Subterrânea, proposta em 1994 pelo governo
holandês e que é utilizada por alguns órgãos ambientais brasileiros. Ao nosso
conhecimento, somente o Estado de São Paulo possui legislação própria que trata
da contaminação do solo e das águas subterrâneas pelos HAP’s. Na legislação
paulista, o naftaleno apresenta um valor de referência de 0,12 mg.kg-1, o que
significa que, em concentrações iguais ou menores a esta, o solo pode ser
considerado "limpo" e possível de ser utilizado para qualquer finalidade. O valor de
intervenção indica que há riscos para a saúde humana e para o ambiente, sendo
que a ultrapassagem desse valor em um volume de solo de 25 m3 ou em 100 m3 de
água subterrânea indica a necessidade de implementação na área avaliada de
ações voltadas para a sua remediação. Para o naftaleno o valor de intervenção é de
30 mg.kg-1 em solos agrícolas, de 60 mg.kg-1 em solos residenciais e de 90 mg kg-1
em solos industriais. Na água subterrânea o valor de intervenção para este HAP é
de 140 mg.L-1 (CETESB, 2005).
Entre os HAP’s, o antraceno e o fenantreno são os menos reativos e, apesar
de apresentarem o mesmo número de anéis, possuem energia de ressonância de 84
e 91 Kcal/mol, respectivamente (Wade et al., 1995).
O fenantreno é um HAP, cristalino, isômero do antraceno, obtido
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não provoca uma redução significativa dos hidrocarbonetos com mais de quatro
anéis benzênicos (Azevedo et al., 1998).
Na transformação metabólica, os HAP’s são degradados através de reações de
alguns organismos aquáticos, envolvendo a participação de enzimas específicas. De
40 a 80% do óleo cru pode ser degradado por ação microbiana (Hoffman et al.,
2003). Em relação à biota, os HAP’s podem ser bioacumulados. Para que haja a
bioacumulação de um xenobiótico, a taxa de assimilação deve exceder a taxa de
eliminação deste. Muitos compostos lipofílicos, como os HAP’s, podem se acumular
quase que indefinidamente se o organismo não for capaz de transformá-los em
metabólitos hidrofílicos, que são mais facilmente excretados. Os peixes são capazes
de metabolizar hidrocarbonetos e só o acumulam em áreas muito poluídas. Já os
organismos invertebrados têm metabolismo mais lento, acumulando maiores
quantidades de HAP’s (Meador et al., 1995).
1.3. Biodegradação dos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
A degradação dos HAP’s no ambiente pode ocorrer através de processos
químicos e físicos que são lentos e/ou incompletos, sendo que a biodegradação é a
principal via de eliminação dos HAP’s no solo (Prince e Drake, 1999). Os
microrganismos degradadores destes compostos encontram-se em pequeno número
no solo, porém com populações maiores em ambientes contaminados. Têm sido
descritos procariotos dos grupos g- - e -Proteobacteria e Actinobacteria, sendo os
gêneros Pseudomonas, Aeromonas, Beijerinckia, Burkholderia, Nocardia,
Corynebacterium, Sphingomonas, Mycobacterium, Flavobacterium, Paracoccus,
Gordonia os mais frequentes (Mutnuri et al., 2005; Peng et al., 2008).
A biodegradação dos HAP’s na forma aeróbica é realizada pelas bactérias,
pelos fungos lignolíticos e não-lignolíticos (neste trabalho serão somente
considerados os procariotos).
No metabolismo bacteriano dos HAP’s, por exemplo naftaleno, a oxigenação
inicial é realizada por dioxigenases, que têm a função de reconhecer o HAP e
adicionar dois átomos de oxigênio, quebrando a estabilidade devido à ressonância
do anel aromático. Um cis-diidrodiol é o produto da dioxigenase, que por ação de
uma desidrogenase será transformado em um composto diidroxilado. Subsequentes
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conhecidas (Evans, 1977; Bamforth e Singleton, 2005; Meckenstock et al., 2000; Rockne et al., 2000).
A taxa de degradação de um poluente no ambiente pode ser resultado do
reduzido número de microrganismos nativos com habilidade de degradação do
composto. Nestes casos, estratégias de biorremediação por bioestimulação e
bioaumentação microbiana são apropriados para a degradação dos contaminantes e
inclusive nos últimos anos tem sido dada a utilização de consórcios microbianos
para aumentar as taxas de mineralização dos HAP’s (Bamforth e Singleton, 2005;
Peng et al., 2008).
A grande diversidade e complexidade molecular dos HAP’s é uma importante
motivação para os pesquisadores em descobrir quais rotas metabólicas são
responsáveis pela sua degradação. Pérez-Pantoja et al., (2008) propõe a
reconstrução metabólica das diferentes rotas de biodegradação de HAP’s que
ocorrem em diferentes procariotos, destacando que muitas delas confluem em
acetil-CoA, de modo que os HAP’s através de diversas vias metabólicas de degradação
podem ser utilizados como fonte de carbono e/ou energia (Figura 3).
Por várias características já descritas em itens anteriores, é relevante destacar
a problemática do fenantreno, HAP presente no petróleo e prioritário segundo a
USEPA, 2008. De acordo com Ouyang et al., (2004) o fenantreno pode ser
degradado e mineralizado por bactérias presentes no solo através de duas rotas
metabólicas. Numa delas, o ácido 1-hidróxi-2-naftóico é oxidado a
1,2-dihidroxinaftaleno, que é degradado via rota metabólica do naftaleno até salicilato.
Na outra rota, o anel do ácido 1-hidróxi-2-naftóico é clivado e metabolizado via rota
metabólica do ftalato. Sendo demonstrado, portanto, que o naftaleno e o fenantreno
têm rotas metabólicas em comum durante a sua degradação. A biodegradação do
fenantreno gera subprodutos como o catecol. De acordo com Pérez-Pantoja et al.,
(2008) o catecol entra na via de degradação por hidroxilação do benzoato que
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1.4. Prospecção de microrganismos degradadores de HAP’s
O conhecimento sobre a capacidade de degradação de constituintes do
petróleo e de petro-derivados por procariotos foi limitado à capacidade de cultivo em
laboratório. Nos últimos anos estratégias independentes de cultivo – metagenômica
– contribuem para aprofundar o conhecimento microbiológico (Macalady e Banfield,
2003; Handelsman et al., 2004). É importante lembrar que estudos baseados em
cultura de microrganismos fornece acesso apenas a uma comunidade e, muitas
vezes na natureza elas agem em consórcios. Assim, a metagenômica analisada por
PCR-DGGE - Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (Muyzer, 1999) abre
uma importante abordagem metodológica para estudos de microbiologia aplicada,
por exemplo a microbiologia relacionada com biodegradação de petróleo e de
petro-derivados (Magot et al., 2000; Van Hamme et al., 2003).
Até pouco tempo, a detecção e a identificação de bactérias eram feitas de
acordo com os meios de obtenção de carbono e energia, exigências nutricionais,
meio de cultivo para seu crescimento, e observação direta através do microscópio
(Kennedy et al., 1999). No entanto, a utilização dessas metodologias fornecia
informações limitadas com necessidade de maior refinamento (Zak et al., 1994).
Como alternativas para esses métodos, foram desenvolvidas várias técnicas, dentre
as quais destacam-se aquelas baseadas nas sequências de nucleotídeos do DNA.
As limitações das técnicas tradicionais de detecção e de identificação de
microrganismos são ainda maiores quando se quer estudar a diversidade de
microrganismos associada a determinado ambiente. Sabe-se que a diversidade das
bactérias é maior que a de qualquer outro grupo de organismos, no entanto, os
meios de cultivo são seletivos a grupos particulares. Até mesmo quando se quer
utilizar um meio seletivo para determinado organismo–alvo, algumas estirpes não
cultiváveis, provavelmente, serão excluídas das análises (Coutinho et al., 1999).
Amann et al., (1995) sugerem que apenas 1-10% das espécies bacterianas do
planeta tenham sido identificadas, deixando vasta porção dessa biota desconhecida
e não estudada. As limitações dos métodos tradicionais, aliadas ao avanço
tecnológico na área de biologia molecular, fazem com que as técnicas moleculares
sejam muito utilizadas para o estudo da diversidade microbiana (Van Elsas et al., 1998). Nas últimas décadas várias metodologias moleculares têm sido
Biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos: prospecção metagenômica e modelagem computacional 3-D de proteínas
mais utilizadas destacam-se: a) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism);
b) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA); c) AFLP (Amplified Fragment
Lenght Polymorphism); d) sequências de subunidades do RNAr; e) ARDRA (Amplified Ribossomal DNA Restriction Analysis); f) RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis); g) DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) (Mcdonald, 1997; Van Elsas et al, 1998; Pennanen et al, 2001; Taylor et al, 2001; Oliveira e Costa, 2002; Fagbola e Abang, 2004).
Vantagens e limitações podem ser apresentadas pela técnica do DGGE,
segundo (Sanz et al., 2002 e Oliveira et al., 2000). Dentre as vantagens pode-se citar: a técnica permite ter uma ideia geral das espécies predominantes no
ecossistema que se está estudando em pouco tempo; é adequada para analisar um
grande número de amostras, quando comparada com outras técnicas tal como a
clonagem; permite canalizar esforços na busca diferencial de representantes dos
domínios Bacteria e Archaea; pode-se realizar o sequênciamento de bandas
isoladas do gel. Dentre as limitações: dependendo do tipo de amostra, podem
aparecer problemas na extração e amplificação de DNA representativo das
populações presentes; genes excepcionalmente ricos em GC não são facilmente
analisados, pois é muito difícil separar as bandas no gel; o método envolve o uso de
substâncias tóxicas como formamida e, por último, é uma técnica não quantitativa. A
técnica de DGGE, inicialmente introduzida em ecologia microbiana molecular para
determinar a diversidade genética de misturas complexas de comunidades
microbianas (Muyzer et al., 1993), pode ser amplamente utilizada, como no estudo
das mudanças ocorridas nas comunidades microbianas no ambiente natural ou
submetido a condições de estresse, ou no monitoramento de microrganismos
específicos em um ambiente natural, sendo assim uma poderosa ferramenta de
estudo (Rosado e Duarte, 2002). De acordo com Oliveira et al., (2000) e Sanz et al., (2002) o DGGE é uma técnica muito apropriada não somente para caracterizar
comunidades complexas, como monitorar bactérias a partir de amostras ambientais
e acompanhar a dinâmica de populações específicas em função de variações
ambientais ou das condições operacionais de um sistema. Sakamoto et al., (2002)
utilizou a técnica do DGGE para comparar a estrutura de comunidades microbianas
complexas presentes em sistemas de lodos ativados modificados para remoção
microbiana complexa, e que algumas populações eram semelhantes entre os dias
de amostragem.
A extração de DNA de amostras ambientais, com posterior amplificação e
análise do material genético, tem sido uma alternativa ou complemento ao clássico
método de cultivo e análises fisiológicas de microrganismos (Coutinho et al., 1999;
Zilli et al., 2003). Técnicas de análise do DNA podem gerar perfis moleculares
“molecular fingerprinting”, como o DGGE, que possibilita a análise de várias amostras ambientais simultaneamente, sendo bastante útil para o monitoramento e
compreensão de variações temporais e espaciais de comunidades microbianas (Zilli
et al., 2003).
A técnica de eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE)
possibilita a separação dos produtos da PCR (as fitas de DNA) de acordo com suas
sequências de pares de bases, e não de acordo com os tamanhos dos fragmentos
de DNA, como a maioria das técnicas de fingerprint genético. Assim, teoricamente, cada banda no gel representa uma espécie ou um grupo de espécies de bactéria
(OTUs), e a imagem final do gel corresponderá a um padrão de “códigos de barra”
referente à comunidade bacteriana dos solos estudados. Os géis da eletroforese são
confeccionados com poliacrilamida (acrilamida e bis-acrilamida) e o gradiente
desnaturante pode ser químico (agentes desnaturantes como uréia e formamida no
DGGE) ou físico (temperatura no TGGE) (Muyzer et al, 1993).
Diversos autores de vários países têm reportado a utilização de abordagem
dependente de cultivo e metagenômica na prospecção de microrganismos nativos
com potencial para degradar HAP’s, por exemplo em amostras de um bosque na
Coréia (Ji, et al., 2007), em plantas de tratamentos de águas e resíduos industriais
no Japão (Suenaga et al., 2007) e solos dos Estados Unidos contaminados com
HAP’s (Chadhain, et al., 2006).
Embora seja comum a utilização do gene 16S DNAr e RNAr para estudos de
identificação filogenética de procariotos degradadores de HAP’s a partir de amostras
de genoma (Brito, et al., 2006, Jacques et al, 2009, Long et al., 2009) ou de
metagenoma (Chadhain, et al., 2006, Ji, et al., 2007, Suenaga et al., 2007),
recentemente tem sido explorado o potencial de outros genes “housekeeping” assim
como também de diversos genes metabólicos envolvidos em degradação de HAP’s
Biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos: prospecção metagenômica e modelagem computacional 3-D de proteínas
nahH, todC1, todE ,hif, mint-1 e sso1 (Nyyssonen et al., 2008); genes 16S rDNA e rRNA, xylM, C23O e bcr (Higashioka et al., 2009).
A abordagem metagenômica para bioprospecção da diversidade microbiana
nativa relacionada com petróleo é pouco conhecida no Brasil. Entre os poucos
trabalhos sobre ocorrência de diversos tipos de microrganismos nativos com
potencial biodegradador de petro-derivados em biomas, caatinga e mangue, foram
reportados por Blaha et al., (2008). A diversidade microbiana nativa da Bacia
Petrolífera Potiguar, foi avaliada metagenomicamente por Santos, (2006); Pereira, (2007); Carvalho et al., (2007, 2008); Silva et al., (2007).
1.5. Modelagem computacional
Novas técnicas de biologia molecular, metodologias de seleção de
biocatalisadores e novas abordagens de pesquisa foram desenvolvidas a fim de se
obter catalisadores com suas especificidades alteradas, bem como a exploração da
biodiversidade. Os catalisadores biológicos nativos atualmente disponíveis, em sua
maioria, apresentam limitações quanto à utilização em processos industriais, sendo
este o maior desafio do campo. As limitações encontradas na aplicação sintética de
enzimas em sua forma nativa estão sendo contornadas atualmente através da
alteração da estereoespecificidade, termoestabilidade e atividade envolvendo
técnicas de biologia molecular de mutações sítio dirigidas ou aleatórias.
O método de modelagem por homologia fundamenta-se na hipótese de que
uma sequência de aminoácidos similar implica em estrutura e função similar entre
diferentes proteínas, mesmo que estas sejam isoladas de diferentes organismos
(Ginalski, Grishin et al., 2005; Reeves, Thornton et al., 2006). Deste modo, havendo a informação disponível a respeito da estrutura terciária de uma proteína, é possível
predizer a estrutura terciária de outra proteína homóloga, cuja estrutura é
desconhecida. De posse desses modelos estruturais gerados in silico, é possível
inferir sobre diferentes características funcionais da proteína alvo (Ginalski, Grishin
et al., 2005; Reeves, Thornton et al., 2006). A modelagem molecular por homologia utiliza dados cristalográficos conhecidos para determinar a estrutura e predizer
função de proteínas desconhecidas. As etapas para utilização desse método
incluem: a) identificação do molde (template) para modelagem da proteína alvo; b) alinhamento da sequência-alvo com a sequência molde; c) construção do esqueleto
esqueleto carbono da molécula; f) adição de cadeias laterais; g) refinamento do
modelo, que consiste principalmente em ajustar a molécula, para que assuma menor
estado de energia livre (minimização de energia), utilizando programas como
CHARM, AMBER ou CROMOS (Peitsch et al., 1996).
As mutações sítio dirigidas podem ser aplicadas para melhorar a atividade
enzimática e a seletividade de um biocatalisador, mas não de um modo geral, uma
vez que este processo requer o conhecimento detalhado da estrutura tridimensional
da enzima, do mecanismo catalítico e também certo grau intuitivo com respeito à
escolha do aminoácido a ser substituído.
Simulações com modelagem molecular estão provando serem cruciais na
obtenção de dados experimentais, proporcionando análises a uma resolução
atômica em reações enzimáticas. Simulações moleculares podem sondar os
mecanismos enzimáticos, e as origens da catálise, a um nível de detalhe que
apenas no futuro seria possível predizer experimentalmente. A modelagem
enzimática pode identificar prováveis mecanismos químicos, analisar os efeitos das
mutações e
variações genéticas, identificar as causas de especificidade, e derivar
relações estrutura-atividade (Richard Lonsdale et al., 2010).
Segundo Richard Lonsdale et al, (2010), cálculos podem também identificar
grupos funcionais e interações envolvidas na catálise. Vários exemplos foram
publicados das principais interações catalíticas que foram identificados por modelos
(por exemplo, um resíduo de prolina conservado que especificamente estabiliza o
estado de transição da hidroxilação aromática na flavina dependentes de
monooxigenases, para hidroxibenzoato hidroxilase e fenol hidroxilase.
No Brasil, das 29 bacias petrolíferas, oito são produtoras de petróleo e gás
natural, sendo as atividades exploratórias na Bacia Petrolífera Potiguar, on-shore, uma das maiores produtoras, com um volume recuperável estimado em 171 milhões
de barris e produzindo aproximadamente 100 mil barris diários. No estado do RN
são mais de 5000 km de dutos de óleo e gás que inevitavelmente proporcionam
riscos de impacto ambiental com vazamentos de compostos altamente tóxicos e
muitas vezes de difícil assimilação ambiental e, entre estes, compostos poluentes
Biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos: prospecção metagenômica e modelagem computacional 3-D de proteínas
O estudo da biodiversidade microbiana nativa é de grande relevância para o
conhecimento dos ciclos biogeoquímicos de solos de ambientes marinhos, por
exemplo, manguezal. Esses microrganismos utilizam compostos presentes no
petróleo, como aceptores finais de elétrons e, sendo assim, podem participar da sua
decomposição (Tanaka et al., 2002). A prospecção metagenômica de
biocatalisadores microbianos em diversos ambientes naturais vem sendo uma
abordagem que demonstra um grande interesse pela indústria petroquímica, assim
como também pelos órgãos governamentais de controle ambiental. Portanto, os
estudos metagenômicos dos microrganismos associados às atividades da indústria
petrolífera fornecerão dados e informações que visam contribuir para o
conhecimento acerca do “status microbiológico nativo” e seu potencial papel na
biodegradação de HAP’s em ambientes de risco de contaminação, como o semiárido
e os manguezais localizados em áreas de influência da indústria de Petróleo e Gás
no RN.
A posse do conhecimento sobre os mecanismos biomoleculares de transporte
e biocatálise de HAP’s e da estrutura 3-D das proteínas envolvidas diretamente no
uptake e na degradação de HAP’s é de grande valor, principalmente para o desenvolvimento de métodos moleculares que visam a potencialização da
degradação e/ou bioconversão de compostos de alta toxicidade. São poucos os
dados na literatura sobre o uptake e degradação do fenantreno, um importante HAP
presente em locais de atividade petrolífera. Utilizando-se como subsídio a
modelagem computacional por homologia, metodologia de baixo custo, modelos 3-D
de proteínas chaves na degradação HAP’s foram estudados. Estes dados ampliarão
2. OBJETIVOS E METAS
2.1. OBJETIVO GERAL
Prospectar a diversidade microbiana nativa com potencial para degradação de
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP’s) em amostras de sedimentos de
manguezal da Bacia Petrolífera Potiguar – RN (BPP-RN), através da metagenômica
e realizar estudos computacionais de proteínas chaves envolvidas em transporte e
na degradação de HAP’s.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.2.1. Avaliar a microbiota nativa com potencial biodegradador de HAP’s
utilizando biomarcadores moleculares para detecção e análise da
diversidade bacteriana de procariotos em áreas de mangue sob influência
de indústrias petrolíferas através da PCR-DGGE e ensaios de
microcosmos;
2.2.3. Caracterizar através da modelagem computacional por homologia
proteínas chaves na biodegradação de fenantreno em Mycobacterium
vanbaalenii e Ralstonia euthropha JMP134.
2.3. METAS
2.3.1. Amostrar solos, construir microcosmos e isolar DNA metagenômico
(mDNA);
2.3.2. Construir uma base de dados sobre o processo de biodegradação de
compostos aromáticos;
2.3.3. Realizar estudos in silico de vias metabólicas, DNA e proteínas visando a escolha de biomarcadores moleculares para a avaliação e detecção de
microrganismos degradadores de HAP;
2.3.4. Obter fingerprints por PCR-DGGE de microrganismos degradadores de
HAP baseados no biomarcador escolhido na meta “2.3.3.” e 16S DNAr
degradadoras de petróleo;
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Biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos: prospecção metagenômica e modelagem computacional 3-D de proteínas
3.2. Isolamento de DNA metagenômico (mDNA) dos microcosmos
O DNA metagenômico das amostras foi extraído utilizando um procedimento
otimizado seguindo as recomendações do fabricante, através do kit FastDNA SPIN
(BIO101, Carlsbad, CA, USA). O DNA extraído com o kit foi quantificado por
espectrofotometria observando-se a OD260nm (Nanodrop) e posteriormente
padronizado para as reações da PCR. Todos os DNAs metagenômicos foram
diluídos para uma concentração final de ~30ng/ l.
3.3. Contagem dos microrganismos
As comunidades microbianas presentes nas amostras puras e contaminadas
do tempo “0” foram quantificadas através do procedimento de diluições seriadas e
posteriormente inoculadas em placas de petri contendo meio de cultivo sólido LB
(Luria Bertani ou também referido como Lenox Broth composto de 10g de Bacto
Triptona, 5g de Extrato de Levedura, 10g NaCl e 1ml de NaOH 1N, para solidificação
utilizou-se 15g de Ágar Bacteriológico para 1L), onde 500mg de solo foram
adicionados a 1ml de água estéril e levados ao vórtex por 5 minutos para
homogeneização. Posteriormente 100 l dessa solução foi diluída novamente em
900 l de água estéril gerando uma diluição de 10x e assim sucessivamente.
Finalmente, os cálculos necessários foram realizados para obter o valor final das
unidades formadoras de colônias (UFCs/g de solo). Foi realizado o controle negativo
para cada plaqueamento. Os meios de cultivo foram autoclavados a 120°C por 20
minutos.
3.4. Construção de uma base de dados sobre o processo de degradação dos compostos aromáticos utilizando dados do NCBI, KEGG e UM-BBD
Foram verificados nos bancos de dados online todos os principais gêneros
envolvidos na degradação de HAP’s utilizando como ferramenta o BLAST/NCBI. Os
genes em questão, (query) envolvidos na rota metabólica de degradação de HAP’s foram escolhidos partindo da análise dos estudos de Pérez-Pantoja et al., (2008).
3.5. Realização de estudos in silico de sequências primárias
Após a construção e análise do banco de dados, genes envolvidos na
degradação de HAP’s foram avaliados por similaridade entre os procariotos. Foi
Tiolase – (PcaF) para detecção molecular de bactérias degradadoras de HAP’s com
auxílio da ferramenta BLAST/NCBI. A maioria das rotas metabólicas envolvidas na
degradação de HAP’s, direta ou indiretamente, convergem para esta tiolase. O gene
pcaF foi a região alvo para a construção do biomarcador molecular.
3.6. Desenhos de primers para PCR
Primers para a detecção de procariotos degradadores de HAP’s foram
desenhados e avaliados computacionalmente com auxílio dos softwares: Primer
BLAST/NCBI e Vector NTI Advance ™ 11.0. Os Primers PCAF foram desenvolvidos.
3.7. Obtenção dos perfis da PCR/PCR-DGGE
Para os primers 16S DNAr, as reações da PCR foram realizadas no
termociclador contendo as seguintes concentrações finais: 2,5mM de MgCl2, 0,5mM
de DNTP’s, 1,5ng/ l de DNA molde, 2pmol/ l de cada Primer, 2,5U de Taq DNA
Polimerase (TaqGen Biosystems) e Tampão de Enzima 1x, para um volume final de
20 l. O programa utilizado para as amplificações do DNA metagenômico consiste
em: 94°C por 3min, 56° por 30s, 94°C por 3min, 10 ciclos a 94°C por 1min, com a
temperatura de anelamento diminuindo um grau a cada ciclo entre 56°C e 47°C por
1min, 72°C por 1min, 25 ciclos a 94°C por 1min, 46°C por 1min, 72°C por 1min e
uma extensão final de 72°C por 10min.
Para os primers PCAF sem grampo, as reações da PCR foram realizadas no
termociclador contendo as seguintes concentrações finais: 1,5mM de MgCl2, 45mM
KCl, 5% de DMSO, 0,2mM de DNTP’s, 1,5ng/ l de DNA molde, 2pmol/ l de cada
Primer, 1,0U de Taq DNA Polimerase (TaqGen Biosystems) e Tampão de Enzima 1x, para um volume final de 20 l. O programa utilizado para as amplificações do
DNA metagenômico consiste em: 94°C por 3min, 35 ciclos a 94°C por 1min, 64°C
por 1min, 72°C por 1min e uma extensão final de 72°C por 10min.
Para os primers PCAF com grampo, as reações da PCR foram realizadas no
termociclador contendo as seguintes concentrações finais: 2,5mM de MgCl2, 5% de
DMSO, 0,5mM de DNTP’s, 1,5ng/ l de DNA molde, 2pmol/ l de cada Primer, 2,5U
de Taq DNA Polimerase (TaqGen Biosystems) e Tampão de Enzima 1x, para um
volume final de 20 l. O programa utilizado para as amplificações do DNA
Biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos: prospecção metagenômica e modelagem computacional 3-D de proteínas
40seg., 72°C por 30seg., 30 ciclos a 94°C por 1min, 63°C por 40seg., 72°C por
30seg. e uma extensão final de 72°C por 10min.
Os amplicons gerados nas reações da PCR com os oligonucleotídeos
desenvolvidos para detecção do gene metabólico e também com primers 16S DNAr
obtidos por Santos et al., (2006) foram analisados através de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) a 10% durante 2 horas a 100V e 100mA corado com prata
para verificação da especificidade e tamanho molecular dos amplicons.
Para otimização da PCR, foram realizadas incisões das bandas esperadas do
PAGE, purificadas, e condicionadas em microtubos novos e autoclavados para um
volume final de 50 l. A eluição do amplicon extraído foi utilizada para PCR,
metodologia necessária para aumentar a eficiência de detecção da PCR-DGGE.
Nas reações da PCR além dos primers desenvolvidos utilizamos um par de
primers 16S DNAr específico para degradadores de petróleo descrito por Santos et al., (2006). Utilizando como referência Shewanella sp., esses primers amplificam um segmento de DNA de ~585pb.
Para as análises por DGGE foi sintetizado um oligonucleotídeo com 40
nucleotídeos 5’ CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG
GGG G 3’ “grampo” como descrito por Nakatsu et al., (2000) e inseridos na
extremidade 5’ tanto na sequência nucleotídica forward quanto no reverse dos
primers PCAF.
Os produtos da PCR foram analisados pela técnica da PCR-DGGE utilizando
o aparelho DGGE-1001, C.B.S., Scientific Company. A PCR-DGGE foi realizado em
poliacrilamida a 6% durante 16 horas a 75V e 75mA, com gradiente de desnaturação
Uréia-Formamida de 40% a 70%, considerando uma solução 100% desnaturante
aquela possuindo 40% vol/vol de formamida e 7M de Uréia, com a temperatura do
tampão de corrida TAE 1x (40mM Tris, 20mM Ácido Acético, 1mM EDTA e pH 8,0) a
60ºC. Foram carregados em cada canaleta do DGGE 10 l das amostras de reações
da PCR. Posteriormente o gel foi corado com nitrato de prata a 0,2% e
fotodocumentado (Sanguinetti et. al., 1994).
As fotografias foram analisadas com o programa LabImage 1D 2006. As
bandas identificadas com esse recurso foram posteriormente utilizadas na
construção das matrizes binárias baseando-se na presença ou ausência,
Dice e em seguida agrupadas com o UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Averages) através do site: http://genomes.urv.cat/UPGMA/ para
construção do dendrograma de similaridade genética. A UPGMA é um algoritmo
fenético, baseado em distâncias genéticas, que considera a similaridade geral no
agrupamento das OTUs.
3.8. Modelagem computacional
Através do servidor online Swiss-Model foram gerados modelos 3-D por
homologia das proteínas críticas na biodegradação de HAP’s e subsequentemente
docking com substrato/produto. Esta abordagem utiliza dados da sequência primária referente à proteína-chave escolhida para a busca de um template cristalográfico a
fim de predizer a sua estrutura terciária. Com auxílio do docking com softwares
específicos (Molegro Virtual Docker, 2010) foram construídos modelos proteicos
para avaliar entrada e a conversão de substratos.
3.8.1. Dados para construção dos modelos proteicos 3-D
Proteína Transportadora de HAP’s
Sequência primária da provável proteína TbuX pertencente ao organismo Ralstonia
euthropha JMP134 foi selecionada do GenBank/NCBI. Esta proteína apresenta 78% de identidade (sequência primária) com a proteína cristalografada PDB:3bry –
(Transportadora de tolueno) de Ralstonia pickettii, descrita por Elizabeth et al.,
(2008). Essa estrutura proteica foi utilizada como molde para construção e análise
do modelo TbuX em R. euthropha JMP134 (Tabela 2).
Biodegradação do Fenantreno
Sequência primária das proteínas – [EC:1.13.11.-] – NidA (dioxigenase
subunidade maior) e NidB (dioxigenase subunidade menor) pertencentes ao
organismo Mycobacterium vanbaalenii foram selecionadas do Keeg Pathway (Rota
Metabólica – Degradação de Naftaleno e Antraceno). Estas enzimas iniciam a
catálise do fenantreno anexando dois átomos de oxigênio (dioxigenase)
convertendo-o em cis-3,4-Di-hidroxi-3,4-di-hidrofenantreno. As sequências foram
selecionadas conforme os seguintes critérios: sequência primária proteica completa
(NidA/NidB), não hipotética e substrato conhecido (fenantreno). Cristais proteicos
Biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos: prospecção metagenômica e modelagem computacional 3-D de proteínas
Enzima de Convergência – PcaF
Sequência primária da provável proteína PcaF (Beta-Cetoadipil-CoA Tiolase)
pertencente ao organismo Ralstonia euthropha JMP134 foi selecionada do GenBank
- NCBI. Esta proteína possui 55,5% de identidade (sequência primária) com a
proteína cristalografada PDB:1ulq – (Tiolase) de Ralstonia pickettii. Essa estrutura
proteica foi utilizada como molde para construção e análise do modelo PcaF em R.
euthropha H16 (Tabela 2).
Tabela 2. Bactérias selecionadas referente às proteínas NidA/NidB, TbuX e PcaF. As
células em cinza representam os procariotos e seus respectivos cristais protéicos
utilizados como molde.
Bactérias selecionadas Identificação
Mycobacterium vanbaalenii NidA/NidB gi|119953846|
Mycobacterium gilvum NidA/NidB gi|145213092|
Mycobacterium sp. MCS NidA/NidB gi|108767400|
Mycobacterium sp. KMS NidA/NidB gi|11969214|
Ralstonia euthropha JMP134 TbuX e PcaF gi|73539494| gi|73539409|
Rodococus sp. PDB:2B1X
Comamonas sp. PDB:2BMO
Ralstonia pickettii PDB:3BRY
Thermus thermophilus PDB:1ULQ
3.8.2. Análise das estruturas primárias e secundárias
As sequências foram analisadas em alinhamento múltiplo pelo programa
Clustal-W (Higgins e Sharp, 1988) e visualizados pelo BioEdit (Hall, 1999) e T-Coffe
EMBL-EBI. O programa PREDATOR (Argos et al., 1996) foi utilizado para a predição
das estruturas secundárias.
3.8.3. Domínios conservados e assinaturas proteicas
Todas as informações de domínios e assinaturas proteicas foram obtidas
através da ferramenta Sequence Feature Scan presente no servidor online
dados: InterPro, Pfam, TIGRFAMs, PROSITE, SUPERFAMILY, ProDom, PRINTS, SMART, PSIPRED, DISOPRED.
3.8.4. Molde cristalográfico
Transportador de HAP’s – Cristal utilizado: PDB:3bryB (Transportador de
tolueno) de R. pickettii., resolução de 3,2 Angstroms obtido por difração de Raio-X, R-fator: 0,268% (http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/entry/3bry/summary.html) com
70,67% de identidade em relação à sequência primária proteica TbuX R. euthropha.
Dados de similaridade obtidos pelo servidor onlineSwiss-Model usando a ferramenta de identificação de moldes (Template Identification). O cristal identificado (fragmento 26-458) é uma proteína de membrana organizado em duas cadeias A e B idênticas.
Ligante associado: C8H(Hidroxietiloxi)tri(etiloxi)octano).
Biodegradação Fenantreno – Cristais utilizados: PDB: 2b1xE (Naftaleno
1,2-dioxigenase) de Rodococcus sp., resolução de 2,0 Angstroms obtido por difração de Raio-X, R-fator: 19,127%
(http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/entry/2b1x/summary.html) com 53,333% de identidade em relação à
sequência primária proteica NidA M. vanbaalenii e PDB:2bmoB (Nitrobenzeno
dioxigenase) de Comamonas sp., resolução de 1,2 Angstroms obtido por difração de
Raio-X, R-fator: 0,156%
(http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/entry/2bmo/summary.html) com 30,233% de identidade em relação à
sequência primária proteica NidB M. vanbaalenii, dados de similaridade obtidos pelo
servidor online Swiss-Model usando a ferramenta de identificação de moldes
(Template Identification). Os cristais identificados são monômeros estruturais que
compõem um complexo multimérico. O cristal PDB: 2b1xE de Rodococus sp.
corresponde à cadeia E do complexo enzimático PDB:2b1x – oxidorredutase,
composto pelas cadeias A, C, E – sequências proteicas primárias idênticas
(subunidade maior) e B, D, F – sequências proteicas primárias idênticas (subunidade
menor) caracterizando uma estrutura quaternária hexamérica (forma nativa). O
cristal 2bmoB de Comamonas sp. corresponde à cadeia B do complexo enzimático
2bmo – oxidorredutase, composto pelas cadeia A (subunidade maior) e B
(subunidade menor). Estas cadeias formam uma unidade assimétrica que são
estruturalmente organizadas em três unidades assimétricas, caracterizando uma
Biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos: prospecção metagenômica e modelagem computacional 3-D de proteínas
Enzima de Convergência PcaF – Cristal utilizado: PDB: 1ulqE (Acetil-CoA
Transferase) de Thermus thermophilus., resolução de 3,0 Angstroms obtido por
difração de Raio-X, R-fator: 0,218%
(http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/entry/1ulq/summary.html) com 55,5% de identidade em relação à sequência
primária proteica TbuX de R. euthropha JMP134, dados de similaridade obtidos pelo
servidor online Swiss-Model usando a ferramenta de identificação de moldes
(Template Identification). Os cristais identificados são monômeros estruturais que
compõem um complexo multimérico. O cristal PDB:1ulqE de Thermus thermophilus
corresponde à cadeia E do complexo enzimático PDB:1ulq, composto pelas cadeias
A, B, C, D, E, F, G e H – sequências proteicas primárias idênticas caracterizando
uma estrutura quaternária tetramérica (forma nativa) (dados detalhados dos cristais
em anexo).
3.8.5. Construção dos modelos 3-D
Foram construídos os modelos proteicos NidA/NidB para M. vanbaalenii,
TodX e PcaF de R. euthropha JMP134. As sequências foram modeladas pelo
servidor Swiss-Model e analisadas pelos programas DeepView v3.7 (SP5), PyMOL
v0.99 e Molegro Virtual Docker 2010.
3.8.6. Validação
Os modelos gerados foram validados com auxílio da ferramenta Structure
Assessment do servidor Swiss-Model que avalia com base nos seguintes bancos de dados: ProQRes, Anolea, Gromos, QMEAN, DFire, Whatcheck, Procheck, DSSP e
Promotif.
3.8.7. Docking
Foram realizados docking nos modelos proteicos: NidA/NidB de M.
vanbaalenii com fenantreno; TodX de R. euthropha JMP134, com tolueno e
fenantreno, através do programa Molegro Virtual Docker, 2010. Os parâmetros de
configuração permaneceram no padrão do software, mudando-se apenas a
resolução para 0,35 Angstroms. Inicialmente foi realizado docking incluindo toda a
área (grid) proteica. Posteriormente, com base nos resultados, foram realizados
