ENRAIZAMENTO DE
Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla
PELA AÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO, QUERCETINA E
ÁCIDO INDOLBUTÍRICO
DÉBORA ZANONI DO PRADO
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Botânica), Área de concentração Fisiologia e Bioquímica Vegetal.
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“Júlio de Mesquita Filho”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU
ENRAIZAMENTO DE
Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla
PELA AÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO, QUERCETINA E
ÁCIDO INDOLBUTÍRICO
DÉBORA ZANONI DO PRADO
ORIENTADORA: GIUSEPPINA PACE PEREIRA LIMA
CO-ORIENTADORA: ELIZABETH ORIKA ONO
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Botânica), Área de concentração Fisiologia e Bioquímica Vegetal.
AGRADECIMENTOS
A Deus por sempre guiar meus caminhos.
À minha orientadora, amiga e segunda mãe, Profª Drª Giuseppina Pace Pereira Lima, pelo aprendizado, crescimento pessoal e profissional e momentos incrivelmente divertidos
durante esses anos.
Aos meus pais Messias e Marta por me apoiarem em todas as minhas decisões.
Ao meu namorado e melhor amigo, Allan, por me aguentar e sempre me ajudar como pode em todos os momentos.
Ao professor Dr. Fabio Vianello e sua equipe, Davide, Max, Vitorino e Ângela, pelo carinho ao me receberem na Università degli studi di Padova e me auxiliarem sempre que
necessário.
À empresa Duratex S.A. e sua equipe, Raul, Henrique e Tiago, por me cederem todo material e estrutura necessários para a execução de minha pesquisa
Aos colegas de laboratório, em especial, Sérgio, Maira, Ju, Roberta, Rene e William pelo auxílio nas análises bioquímicas e estatísticas e na redação da dissertação.
Ao professor Danilo Muniz da Silva que não apenas me ensinou estatística como me auxiliou em todas as dúvidas após a disciplina.
Aos funcionários da seção de Pós-graduação do IBB/UNESP pelo auxílio sempre que necessário.
À FAPESP, pela concessão de bolsa de estudos no Brasil e no exterior.
Sumário
Lista de Tabelas ... ...1
Lista de Figuras ... 4
RESUMO ... 6
ABSTRACT ... 8
1. INTRODUÇÃO ... 10
2. OBJETIVO ... 12
3. REVISÃO DE LITERATURA ... 12
3.1. EUCALYPTUS ... 12
3.2. PROPAGAÇÃO VEGETATIVA ... 13
3.3. AUXINAS ... 14
3.4. COMPOSTOS FENÓLICOS ... 14
3.5. PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ... 15
3.5. ENZIMAS ... 16
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 17
CAPÍTULO 1 ... 25
O USO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO E QUERCETINA PODE MELHORAR A PRODUÇÃO DE MUDAS DE Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla? ... 26
RESUMO ... 26
ABSTRACT ... 27
1. INTRODUÇÃO ... 28
2. MATERIAL E MÉTODOS ... 29
2.1.COLETA DAS ESTACAS ... 30
2.3. IMPLANTAÇÃO DOS EXPERIMENTOS ... 34
2.4. PLANTIO DAS ESTACAS ... 34
2.5. AVALIAÇÕES EM VIVEIRO ... 35
2.6. ANÁLISES BIOQUÍMICAS ... 36
2.6.1. Determinação do teor de poliaminas ... 37
2.6.2. Determinação da atividade da poliamina oxidase ... 37
3. ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 38
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 38
4.1.QUERCETINA E ÁCIDO INDOLBUTÍRICO ... 38
4.2.PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO E ÁCIDO INDOLBUTÍRICO ... 42
4.3.QUERCETINA, PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO E ÁCIDO INDOLBUTÍRICO ... 45
4.3.1. Avaliações em viveiro ... 45
4.3.2. Avaliações bioquímicas ... 47
5. CONCLUSÃO ... 51
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 51
ENZIMAS OXIDATIVAS EM Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla SOB EFEITO DE QUERCETINA, PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO E ÁCIDO INDOLBUTÍRICO ... 57
RESUMO ... 57
ABSTRACT ... 58
1. INTRODUÇÃO ... 59
2. OBJETIVO ... 60
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 60
3.1. ANÁLISE ENZIMÁTICA... 62
3.1.1. IAA-oxidase ... 62
3.1.2. Peroxidase ... 63
3.1.3. Polifenoloxidase ... 63
3.1.4. Fenilalanina amônio-liase ... 64
4. RESULTADOS ... 65
4.1. PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO E ÁCIDO INDOLBUTÍRICO ... 65
4.2. QUERCETINA E ÁCIDO INDOLBUTÍRICO ... 69
4.3. QUERCETINA, ÁCIDO INDOLBUTÍRICO E PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ... 73
5. DISCUSSÃO ... 76
5.1.PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO E ÁCIDO INDOLBUTÍRICO ... 76
5.2.QUERCETINA E ÁCIDO INDOLBUTÍRICO ... 78
5.3.PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO, QUERCETINA E ÁCIDO INDOLBUTÍRICO ... 80
6. CONCLUSÕES ... 82
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 82
COMPOSTOS FENÓLICOS E ÁCIDO INDOLACÉTICO EM Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla SOB EFEITO DE QUERCETINA, PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO E ÁCIDO INDOLBUTÍRICO ... 89
RESUMO ... 89
ABSTRACT ... 90
1. INTRODUÇÃO ... 91
2. MATERIAIS E MÉTODOS ... 92
2.1. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE COMPOSTOS FENÓLICOS ... 93
2.2. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE FLAVONÓIDES ... 93
2.3. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ANTOCIANINAS ... 94
2.4. QUANTIFICAÇÃO DE QUERCETINA E ÁCIDO INDOLACÉTICO EM LC/MS ... 94
2.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 95
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 95
3.1. PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO E ÁCIDO INDOLBUTÍRICO ... 95
3.2. QUERCETINA E ÁCIDO INDOLBUTÍRICO ... 97
1 Lista de Tabelas
CAPÍTULO 1
Tabela 1. Enraizamento (%), comprimento de raiz (cm) e número de raízes, medidos aos 90 dias após o plantio de estacas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla, sob diferentes
doses de quercetina (0; 250; 500; 1.000 mg kg-1) e ácido indolbutírico (0; 1 000 mg.kg-1)...40 Tabela 2. Altura (cm), diâmetro (cm) e porcentagem de sobrevivência, medidos aos 30, 60 e 90 dias após o plantio de estacas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla sob diferentes
doses de quercetina (0; 250; 500; 1.000 mg kg-1) e ácido indolbutírico (0;1.000 mg kg-1)...41 Tabela 3. Enraizamento (%), Comprimento de raiz (cm) e número de raízes, medidos aos 90 dias após o plantio de estacas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla, sob diferentes
porcentagens de peróxido de hidrogênio (0; 1,75; 3,5; 7,0) e doses de ácido indolbutírico (0;1.000 mg kg-1)...43 Tabela 4. Altura (cm), diâmetro (cm) e porcentagem de sobrevivência, medidos aos 30, 60 e 90 dias após o plantio de estacas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla sob diferentes
porcentagens de peróxido de hidrogênio (0; 1,75; 3,5; 7,0 %) e doses de ácido indolbutírico (0;1.000 mg kg-1)...44 Tabela 5. Enraizamento (%), Comprimento de raiz (cm) e número de raízes, medidos aos 90 dias após o plantio de estacas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla, sob diferentes
doses de quercetina associada ao de peróxido de hidrogênio (0;0 e 500 mg.kg-1;3,5 %) e ácido indolbutírico (0;1.000 mg kg-1)...46 Tabela 6. Altura (cm), diâmetro (cm) e porcentagem de sobrevivência, medidos aos 30, 60 e 90 dias após o plantio de estacas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla sob diferentes
doses de quercetina associada ao de peróxido de hidrogênio (0;0 e 500 mg kg-1;3,5 %) e ácido indolbutírico (0;1.000 mg kg-1)...46 Tabela 7. Teor das poliaminas putrescina, espermidina e espermina (µg g-1 de matéria fresca) em folhas e raízes de mudas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla sob diferentes
2 peróxido de hidrogênio e quercetina (0;0 e 3,5%; 750 mg kg-1) e doses de ácido indol butírico (0;1.000 mg kg-1)...50
CAPÍTULO 2
Tabela 1. Atividade das enzimas peroxidase (POD), ácido indolacético oxidase, polifenoloxidase (PPO) e fenilalanina amônio liase (PAL) (Abs.min-1.g-1 de proteína), em folhas de mudas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla sob diferentes porcentagens
de peróxido de hidrogênio (0; 1,75; 3,5; 7,0 %) e doses de ácido indol butírico (0;1.000 mg kg-1)...66 Tabela 2. Atividade das enzimas peroxidase (POD), ácido indolacético oxidase (IAA-oxidase), polifenoloxidase (PPO) e fenilalanina amônio liase (PAL) (Abs.min-1.g-1 de proteína) e em raízes de mudas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla sob diferentes
porcentagens de peróxido de hidrogênio (0; 1,75; 3,5; 7,0 %) e doses de ácido indol butírico (0;1.000 mg kg-1)...67 Tabela 3. Atividade das enzimas peroxidase (POD), ácido indolacético oxidase (IAA-oxidase), polifenoloxidase (PPO) e fenilalanina amônio liase (PAL) (Abs.min-1.g-1 de proteína), em folhas de mudas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla sob diferentes
doses de quercetina (0; 250; 500; 1.000 mg kg-1) e ácido indol butírico (0;1.000 mg kg-1)...70 Tabela 4. Atividade das enzimas peroxidase (POD), ácido indolacético oxidase (IAA-oxidase), polifenoloxidase (PPO), fenilalanina amônio liase (PAL) (Abs.min-1.g-1 de proteína), e em raízes de mudas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla sob diferentes
doses de quercetina (0; 250; 500; 1.000 mg kg-1) e ácido indol butírico (0;1.000 mg kg-1)...71 Tabela 5. Atividade das enzimas peroxidase (POD), ácido indolacético oxidase (IAA-oxidase), polifenoloxidase (PPO) e fenilalanina amônio liase (PAL) (Abs.min-1.g-1 de proteína), em folhas de mudas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla sob diferentes
combinações de quercetina e peróxido de hidrogênio (0;0 e 3,5%;500 mg kg-1) e doses de ácido indol butírico (0;1.000 mg kg-1)...74 Tabela 6. Atividade das enzimas ácido indolacético oxidase (IAA-oxidase), polifenoloxidase (PPO), fenilalanina amônio liase (PAL) (Abs.min-1 g-1 de proteína), em raízes de mudas de
Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla sob diferentes combinações de quercetina e
3 CAPÍTULO 3
Tabela 1. Teor de ácido indolacético e quercetina (mg kg-1 de matéria fresca) em folhas e raízes de mudas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla sob diferentes combinações de
4 Lista de Figuras
CAPÍTULO 1
Figura 1. Temperaturas médias e pluviosidade ao longo de 30 anos no município de Lençóis Paulista-SP, INMET (2013)...30 Figura 2. Jardim clonal da empresa Duratex S.A., localizado em Lençóis Paulista-SP, no ano de 2012, canaletas com plantio de Eucalyptus grandis x Eucalyptus uroplylla, Clone CL1,
utilizado no experimento...31 Figura 3. Padrão das cepas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus uroplylla, Clone CL1, das
quais foram retiradas as estacas caulinares. Lençóis Paulista, SP, 2012...32 Figura 4. Coleta de estacas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus uroplylla com auxílio de
tesoura esterilizada e borrifador para manutenção da turgescência...32 Figura 5. Aplicação dos tratamentos nas bases das estacas clonais de Eucalyptus grandis x
Eucalyptus urophylla, seguida do plantio em substrato...35
Figura 6. Determinação da altura e diâmetro de mudas de Eucalyptus, 30 dias após o
plantio...36 Figura 7. Média do comprimento médio da maior raiz formada em estacas caulinares de
Eucalyptus, ao final do ciclo de produção...36
Figura 8. Atividade da enzima poliamina oxidase em folhas de Eucalyptus grandis x
Eucalyptus urophylla......38
Figura 9. Teores de putrescina em folhas em folhas, espermidina e espermina em raízes de mudas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla sob diferentes combinações de peróxido
de hidrogênio e quercetina (0;0 e 3,5%; 750 mg kg-1) e doses de ácido indol butírico (0;1.000 mg kg-1)...50
CAPÍTULO 2
Figura 1. Folhas e raízes de E. grandis x E. urophylla separadas para o início das análises
bioquímicas...62 Figura 2. Folhas de E. grandis x E. urophylla maceradas em nitrogênio líquido para início das
5 Figura 3. Atividade da enzima fenilalanina amônio liase acompanhada em espectofotômetro com auxílio do software Kinetics®...65 Figura 4. Atividade da enzima peroxidase (POD) (Abs.min-1g-1 de proteína) em raízes de mudas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla, sob o efeito de IBA (0; 1.000 mg kg-1)
e da combinação de peróxido de hidrogênio e quercetina (0;0 e 3,5%;500 mg kg-1)...74
CAPÍTULO 3
Figura 1. Teor de compostos fenólicos (mg 100g-1) em folhas e raízes, flavonóides (mg g-1) em folhas e raízes e antocianinas (mg g-1) em folhas e raízes de mudas de Eucalyptus grandis
x Eucalyptus urophylla, sob o efeito de IBA (0; 1.000 mg kg-1) e de peróxido de hidrogênio
(0, 1,75, 3,5 e 7,0%)...96 Figura 2. Teor de compostos fenólicos (mg 100 g-1 de matéria fresca) em folhas e raízes, flavonóides (mg g-1 de matéria fresca) em folhas e raízes e antocianinas (µg.g-1 de matéria fresca) em folhas e raízes de mudas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla, sob o
efeito de IBA (0; 1.000 mg kg-1) e quercetina (0, 250, 500 e 1.000 mg kg -1)...98 Figura 3. Teor de compostos fenólicos (mg 100g-1 de matéria fresca) em folhas e raízes e, flavonóides (mg g-1 de matéria fresca) em folhas e raízes e antocianinas (µg g-1 de matéria fresca) em folhas e raízes de mudas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla, sob o
efeito de IBA (0; 1.000 mg kg-1) e combinação de peróxido de hidrogênio e quercetina (0%;0 mg kg-1, 3,5%;500 mg kg-1)...102 Figura 4. Cromatogramas de ácido indolacético (IAA) em folhas e raízes sob tratamento com IBA (1.000 mg kg-1) em mudas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla.
Figura 5. Cromatogramas do flavonóide quercetina em folhas, controle, e raízes sob efeito de peróxido de hidrogênio (3,5%), quercetina (500 mg kg-1) e IBA (1.000 mg kg-1) em mudas de
6 PRADO, D.Z. ENRAIZAMENTO DE Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla PELA AÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO, QUERCETINA E ÁCIDO INDOLBUTÍRICO. 2014. 106P. DISSERTAÇÃO (MESTRADO) - INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS, UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA, BOTUCATU.
RESUMO
A propagação vegetativa é a principal forma de produção de mudas de Eucalyptus, porém
alguns materiais clonais ainda apresentam dificuldades de propagação, inclusive no enraizamento. Indiretamente, os flavonóides e o peróxido de hidrogênio podem favorecer este processo, assim como alterar os níveis de substâncias antioxidantes, como enzimas e compostos fenólicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação do flavonóide quercetina, peróxido de hidrogênio e ácido indol butírico (IBA) no enraizamento e desenvolvimento de
Eucalyptus grandis x urophylla, bem como nos mecanismos de produção de antioxidantes e
7 redução do teor de putrescina e da atividade da poliamina oxidase nos tratamentos com a combinação de IBA, quercetina e peróxido em raízes. As associações de peróxido de hidrogênio e IBA não elevaram às atividades de peroxidae, IAA-oxidase, polifenoloxidase e fenilalanina amônio liase, demonstrando que a aplicação exógena de peróxido de hidrogênio não gerou danos às plantas. Os tratamentos com quercetina isolada e a combinação de peróxido de hidrogênio, quercetina e IBA, colaboram mais evidentemente para a redução das atividades de POD, IAAO, PPO e PAL, demonstrando o papel protetor da quercetina sob os danos celulares. Nos tratamentos com IBA, houve aumento no teor de fenóis totais, quercetina e IAA, indicando o papel da auxina sintética sob a regulação de compostos fenólicos e da auxina endógena.
8 ROOTING OF Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla THROUGH THE ACTION OF HYDROGEN PEROXIDE AND QUERCETIN
ABSTRACT
Vegetative propagation is the main form to produce cuttings of Eucalyptus, but some clones
still have difficulties in propagation, including on rooting process. Indirectly, flavonoids and hydrogen peroxide can enhance this process, as well as modify the levels of antioxidants such as phenolic compounds and enzymes. This work was aimed to evaluate flavonoid quercetin, hydrogen peroxide and indolbutyric acid (IBA) action on rooting of cuttings of Eucalyptus
grandis x urophylla, as well as in mechanisms of antioxidants production and cells protection
9 peroxide, quercetin and IBA combination collaborated more clearly to reduction of POD, IAAO, PPO and PAL activities, demonstrating the protective role of quercetin in cell damage. In IBA treatments, there was an increase in total phenol, quercetin and IAA, indicating the role of the synthetic auxin in the regulation of phenolic compounds and endogenous auxin.
10 1. INTRODUÇÃO
O Eucalyptus é o gênero florestal mais plantado no Brasil por apresentar rápido
crescimento e uma madeira que pode ser utilizada para diversas finalidades. Em 2012, a área de plantios de Eucalyptus totalizou 5.102.030 ha, apresentando crescimento de 4,5% (228.078
ha) frente ao indicador de 2011 (ABRAF, 2013).
Atualmente, o consumo mundial de madeira é estimado em aproximadamente 1,5 bilhões m3/ano, porém, previsões estimam que em 2040 esse consumo aumente para 2,5 bilhões m3/ano, tornando insustentável a exploração de florestas naturais. Assim, vem sendo sugerido que entre 50 e 75% do suprimento mundial de madeira será originado de florestas plantadas (SEDJO, 2004), o que demonstra a importância econômica crescente dessa espécie para o mercado mundial.
A propagação vegetativa é a forma mais eficiente e flexível de se produzir materiais geneticamente melhorados para atingir às futuras demandas de madeira (LELU-WALTER et al., 2013). É a principal técnica de produção de mudas de Eucalyptus por proporcionar
homogeneidade dos materiais clonais, controle de doenças (XAVIER et al., 2009), melhor produtividade e qualidade da madeira (BORGES et al., 2011) e a minimização de algumas dificuldades no processo de produção de mudas de certos clones e espécies, principalmente as relacionadas ao enraizamento (XAVIER & SILVA, 2010).
Apesar dos avanços obtidos pelas técnicas de propagação vegetativa, alguns materiais clonais ainda apresentam dificuldades em sua propagação, muitas vezes pela baixa taxa de enraizamento, dificultando o aproveitamento das estacas e gerando prejuízos a produção. Assim, substâncias que influenciem o enraizamento vêm sendo pesquisadas com o intuito de melhorar esse processo.
11 Na literatura, é descrito que quando esses reguladores vegetais são associados a outras substâncias como fenóis (BARTOLINI & TATTINI, 1986; DE KLERK et al., 1999), flavonóides (CURIR et al., 1990) e peróxido de hidrogênio (RUGINI et al.,1997; SEBASTIANI & TOGNETTI, 2004), a taxa de enraizamento parece aumentar.
Diante da revisão apresentada, é possível notar a necessidade de tratamentos com auxina e de possíveis coadjuvantes, como o peróxido de hidrogênio e compostos fenólicos no enraizamento de espécies vegetais.
A aplicação de tais compostos pode alterar os mecanismos oxidativos das plantas. Os radicais livres também conhecidos como espécies reativas de oxigênio (ROS) como o H2O2, são continuamente gerados nos tecidos vegetais como subprodutos de diversos processos metabólicos. A presença desses radicais induz a ativação de um sistema composto por antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos, como os compostos fenólicos (flavonóides e antocianinas), capazes de eliminar as espécies reativas de oxigênio das células vegetais (GAJEWSKA; SKŁODOWSKA, 2007).
Inicialmente, as espécies reativas de oxigênio eram consideradas subprodutos tóxicos do metabolismo aeróbico, mas atualmente, vem sendo reconhecidos como protagonistas na sinalização celular (MITTLER et al., 2011). Em estudo foi demonstrado que o estresse oxidativo pode contribuir para regular as concentrações de auxinas atuando, indiretamente, na ativação mitótica e contribuindo para o ciclo de crescimento celular (PASTERNARK et al., 2005).
O peróxido de hidrogênio (H2O2) é também um importante produto da oxidação das poliaminas, catalizada pelas poliamina oxidases (PAO) e diamina oxidases (DAO) (BOUCHEREAU et al., 1999). As poliaminas estão relacionadas a diversos aspectos do crescimento e desenvolvimento, tais como aumento da atividade meristemática (COUEÈ et al., 2004).
Assim, devido às dificuldades de enraizamento encontradas em alguns materiais clonais
de Eucalyptus e ao incremento no enraizamento de estacas submetidas à ação de auxina,
12 2. OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito do flavonóide quercetina, do peróxido de hidrogênio e da auxina, ácido indolbutírico, no enraizamento de estacas de Eucalyptus
grandis x Eucalyptus urophylla (clone CL1) e as alterações provocadas por tais tratamentos
nas atividades da peroxidase, IAA-oxidase polifenoloxidase, fenilalanina amônio liase, poliamina oxidase, na concentração de compostos fenólicos, flavonóides, antocianinas e poliaminas em folhas e raízes de mudas de Eucalyptus.
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Eucalyptus
O gênero Eucalyptus pertence à família Myrtaceae e é composto por mais de 700
espécies (SHARMA, 2006). As espécies do gênero são originadas da Austrália e regiões próximas como Timor, Indonésia, Papua, Nova Guiné, Molucas, Irian Jaya e sul das Filipinas, sua faixa de ocorrência é compreendida entre as latitudes 9ºN e 44ºS (ELDRIDGE et al., 1994).
A madeira de eucalipto pode ser utilizada para diversas finalidades, desde os usos mais tradicionais, como lenha, estacas, mourões, dormentes, carvão vegetal, celulose e papel, chapas de fibras e de partículas, até usos mais nobres, como fabricação de casas, móveis e estruturas (PEREIRA et al., 2000).
Relatos apontam que as plantações clonais de Eucalyptus foram disseminadas no Brasil
a partir da década de 70, quando dificuldades relacionadas à heterogeneidade dos plantios e à incidência de cancro impulsionaram o desenvolvimento da técnica de estaquia em escala operacional, considerada hoje como referência mundial no controle de doenças desta espécie (AHUJA & LIBBY, 1993a; AHUJA & LIBBY, 1993b; ALFENAS et al., 2004; ASSIS & MAFIA, 2007; XAVIER et al., 2009). Desde então, a área de plantios clonais de Eucalyptus
13 diversas regiõese propósitos comerciais, aliado a um custo competitivo (XAVIER & SILVA, 2010).
Figura 1. Área e distribuição de plantios florestais de Eucalyptus nos estados do Brasil, 2012.
ABRAF (2013) e Pöyry Silviconsult (2013).
3.2.Propagação vegetativa
A propagação vegetativa é a maneira mais eficiente de capturar e aproveitar as características de plantas geneticamente superiores em populações selvagens. A técnica envolve a criação e multiplicação de novas plantas dispensando a reprodução sexual, como por exemplo, estaquia, enxertia e mergulhia. Essas técnicas possibilitam a criação de um indivíduo geneticamente idêntico à planta-mãe, este novo indivíduo é conhecido como clone (LEAKEY, 2012).
14 combinado das duas são considerados métodos práticos para a produção comercial em larga escala (LELU-WALTER et al., 2013).
3.3.Auxinas
A caracterização inicial das auxinas como "hormônios vegetais formadores de raízes em plantas” estabeleceu ligação de longa data entre esta classe de pequenas moléculas e o desenvolvimento radicular (WENT, 1929; THIMANN & WENT, 1934). A raiz é estabelecida durante a embriogênese e dá origem a novas raízes laterais em um processo contínuo de forma indeterminada. Evidências em muitos estudos destacam o papel central das auxinas na formação da arquitetura final da raiz, definindo o papel de auxinas como um componente de desenvolvimento endógeno que pode ser influenciado por estímulos ambientais (OVERVOORDE et al., 2010).
A auxina endógena melhor caracterizada em plantas é o ácido indol-3-acético (IAA). No entanto, as moléculas sintéticas, tais como o ácido 1-naftaleno-acético (ANA), ácido 2,4-diclorofenoxi-acético (2,4-D) e o ácido indol-3-butírico (IBA) podem provocar respostas bioquímicas, moleculares e fisiológicos semelhantes às do IAA (RYBEL et al., 2012).
Entre os compostos sintéticos, o mais utilizado é o IBA (ácido indolbutírico), devido a sua menor mobilidade e maior estabilidade química na estaca (SARZI & PIVETTA, 2005), estabilidade à fotodegradação, menor fitotoxidez e capacidade de promover a formação de primórdios radiculares (ASSIS & TEIXEIRA, 1998; HARTMANN et al., 2002).
Em Eucalyptus, o IBA tem sido utilizado em concentrações variáveis de 1.000 a 4.000
mg kg-1 (TITON et al., 2003). Outros autores recomendam doses entre 1.000 e 3.000 mg kg-1 de IBA para incrementar as taxas de sobrevivência e de enraizamento em estacas de
Eucalyptus (WENDLING et al., 2000).
3.4. Compostos fenólicos
15 (SCHNEIDER & WIGHTMAN, 1974; FAUST, 1989; BANDURSKI et al., 1995). No entanto, alguns fenólicos (monofenóis e m-difenóis) podem inibir o processo de enraizamento, estimulando a oxidação e promovendo a descarboxilação de IAA, enquanto outros, não apresentam nenhum efeito regulador no conteúdo de IAA das plantas (TROBEC et al., 2005).
Pesquisas mostram que a suplementação apenas com ácido clorogênico (composto fenólico) não influenciou a indução de raízes laterais e pelos radiculares de Hyperricum
perforatum, porém a aplicação em associação com ANA (ácido naftalenoacético) foi
fundamental para a formação de raízes e pelos radiculares (FRANKLIN & DIAS, 2011). Estacas de erva-mate (Ilex paraguariensis) apresentaram bons resultados em relação ao
enraizamento quando mergulhadas em solução aquosa de naringenina, quercetina e rutina a 30µM por 12 horas. Dentre os compostos testados, os melhores resultados foram obtidos pela aplicação de quercetina, que aumentou a taxa de enraizamento adventício, de 17 para 55% (TARRAGÓ et al., 2005).
Em estacas de Eucalyptus gunni, com e sem raízes, foram determinados os teores de
isoquercetrina (quercetina 3-0-glucosideo) e quercetrina (quercetina 3-0-rhamnosídeo). Os dois flavonóides identificados estavam presentes em quantidades muito baixas (0,2-0,5 mg 100 g-1 de matéria fresca) nas estacas incapazes de enraizar e em quantidade maior (8 mg 100 g-1 de matéria fresca) em estacas com a capacidade de enraizar (CURIR et al., 1990), o que evidencia o possível sucesso da aplicação de compostos fenólicos no enraizamento de
Eucalyptus.
Assim, a aplicação de compostos fenólicos poderia colaborar para o enraizamento de diversas espécies, em contrapartida, a presença de elevadas concentrações de compostos fenólicos capazes de inibir a oxidação de IAA, podem causar acúmulo de auxina e a inibição do desenvolvimento radicular (TROBEC et al., 2005). Este mecanismo já foi verificado em experimento com plantas herbáceas (FRAIVE-RAMPANT et al., 2002).
3.5. Peróxido de hidrogênio
16 Alguns estudos recentes têm apontado que o peróxido de hidrogênio (H2O2) pode estar relacionado na indução de auxina para o enraizamento, como encontrado nos estudos de LI et al. (2007, 2009), em que altas concentrações de H2O2 foram requeridas durante a formação e desenvolvimento de raízes adventícias em pepino e feijão-mungo (LI et al., 2007, 2009). Em contrapartida, em batata doce os níveis de H2O2 foram benéficos para esse fim apenas em baixas concentrações, sendo que a partir de certa concentração ocorreu o efeito contrário, inibindo o desenvolvimento de raízes adventícias e as prejudicando consideravelmente (DENG et al., 2012).
Estacas semi-lenhosas também mostram resultados satisfatórios no enraizamento, como estacas de dois cultivares de oliveira (Olea europaea L.), com alta e baixa capacidade de
enraizamento, submetidas a dois diferentes tratamentos, com imersão da base das estacas por 10 segundos em IBA (4.000 ppm) e por 30 segundos em 3.5% (p/v) H2O2 + 10 segundos IBA 4.000 ppm. Os tratamentos com H2O2 favoreceram a formação de raízes, bem como aumentaram o número de raízes por estaca para ambos os cultivares (SEBASTIANI & TOGNETTI, 2004).
3.5.Enzimas
As peroxidases (POD) são responsáveis por catalisar a oxidação de muitos compostos fenólicos na presença de H2O2 e é considerada uma enzima chave na biossíntese de lignina (GASPAR et al.,1999). Estão envolvidas em uma ampla quantidade de processos fisiológicos durante o ciclo de vida da planta, provavelmente devido ao grande número de isoformas e a versatilidade das reações de sua enzima catalisada (PASSARDI et al., 2004).
As PODs participam do catabolismo do IAA e podem modificar o balanço hormonal nas plantas, o que leva a modificação da morfogênese (ROS et al., 1992). Em contrapartida foi proposto que a atividade da IAA oxidase é similar a POD e pode ajudar na regulação do conteúdo de IAA (MOHAMED-YASSEEN & SPLITTSTOESSER, 1990).
17 A fenilalanina amônio liase (PAL, EC 4.3.1.5) foi descrita pela primeira vez em 1961 por Koukol e Conn (MACDONALD & D´CUNHA, 2007). Essa enzima catalisa as deaminações não oxidativas de fenilalanina para o ácido trans cinâmico e amônia, que é a primeira fase na biossíntese de compostos fenólicos (HAHLBROCK & SHELL, 1989).
As poliaminas estão relacionadas a diversos aspectos do crescimento e desenvolvimento, tais como aumento da atividade meristemática, alongamento, formação de raízes laterais e adventícias (COUEÈ et al., 2004). A atividade de poliaminas oxidases (PAO, EC 4.3.1.5), está inversamente relacionada com o teor endógeno de poliaminas (NAG et al., 2001), sugerindo que a enzima participa de sua degradação.
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26 O USO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO E QUERCETINA PODE MELHORAR A PRODUÇÃO DE MUDAS DE Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla?
RESUMO
A propagação vegetativa é considerada ideal na rápida multiplicação de espécies, porém, o enraizamento de estacas ainda apresenta algumas dificuldades. Substâncias como auxinas, compostos fenólicos e peróxido de hidrogênio são caracterizadas como capazes de auxiliar esse processo. O objetivo deste trabalho foi verificar se o uso de peróxido de hidrogênio e/ou quercetina, combinados ou não com ácido indolbutírico, pode alterar algumas características relacionadas ao enraizamento e desenvolvimento de mudas de Eucalyptus grandis x
Eucalyptus urophylla. As mudas foram avaliadas periodicamente, aos 30, 60 e 90 dias
segundo os seguintes critérios: altura, diâmetro e porcentagem de sobrevivência. Após 90 dias, uma avaliação destrutiva foi realizada a fim de determinar a porcentagem de enraizamento, tamanho médio da maior raiz e quantidade de raízes. O teor de poliaminas e a atividade de poliamina oxidase, marcadores bioquímicos do desenvolvimento vegetal, foram determinados. Não foram encontradas diferenças estatísticas significativas em relação à altura, diâmetro, porcentagem de sobrevivência e enraizamento, comprimento de raiz e número de raízes por estacas. Os tratamentos induziram diminuição nos teores de putrescina e diminuíção da atividade da PAO em raízes. Pela ausência de respostas positivas, o uso destas substâncias como tratamento para melhorar a produção de mudas é economicamente inviável.
27 HYDROGEN PEROXIDE AND QUERCETIN CAN IMPROVE PRODUCTION OF
Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla CUTTINGS?
ABSTRACT
Vegetative propagation is considered ideal in rapid multiplication of species, however, rooting still have some difficulties. Substances such as auxins, phenolic compounds and hydrogen peroxide are characterized as able improve this process. This work aim was determine if hydrogen peroxide and/or quercetin, combined or not with IBA, can modify some characteristics related to rooting and development in Eucalyptus grandis x Eucalyptus
urophylla´s cuttings. Cuttings were periodically evaluated at 30, 60 and 90 days according to
the following criteria: height, diameter and survival percentage. 90 days after planting, a destructive evaluation was performed to determine rooting percentage, average size of roots and number of roots. Polyamines content and polyamine oxidase activity, biochemical markers of plant development, were determined. No statistically significant differences in height, diameter, survival and rooting percentage, root length and number of roots per cuttings were found. Treatments induced decrease in putrescine levels and PAO activity in roots. For absence of positive responses, the use of these substances as a treatment to improve cuttings production is economically unviable.
28 1. INTRODUÇÃO
A produção de mudas florestais, em quantidade e qualidade, é uma das fases mais importantes para o estabelecimento de povoamentos florestais, com grande repercussão sobre a produtividade (WENDLING; GUASTALA; DEDECEK, 2007). A muda de Eucalyptus
ideal para plantio deve possuir características tais como, sistema radicular e parte aérea bem formada, com bom estado nutricional, estar livres de pragas e doenças, altas taxas de sobrevivência e desenvolvimento após o plantio (WENDLING et al., 2002). Para tanto, muitos trabalhos têm sido desenvolvidos no sentido de melhorar a qualidade e reduzir os custos de produção de mudas (SIMÕES & SILVA, 2010).
A propagação vegetativa é considerada ideal na rápida multiplicação de espécies, mantendo certas características desejáveis (HARTMANN et al., 2002.; TCHOUNDJEU et al., 2004). No entanto, o enraizamento de espécies arbóreas por meio de estacas pode ser modificado por diversos fatores, como a posição da estaca coletada na cepa, a idade da planta doadora e o tratamento com ácido indolbutírico (IBA) (HARTMANN et al., 2002;. HUSEN & PAL, 2006).
Os hormônios e reguladores vegetais, tais como a auxina sintética IBA, desempenham funções complexas no enraizamento, podendo exercer efeitos diretos (divisão ou crescimento celular) ou indiretos (interagindo com outras moléculas ou hormônios vegetais) (CORRÊA & FETT-NETO, 2004).
Algumas substâncias, tais como compostos fenólicos e peróxido de hidrogênio vem sendo apontadas como importantes reguladores de auxina nas plantas. Alguns grupos de fenólicos como p-difenóis, o-difenóis, cumarinas e polifenóis, tal como o flavonóide quercetina, são descritos como inibidores da oxidação de IAA (BANDURSKI et al., 1995) pela inibição do sistema IAA-oxidase (PADNEY & PATHAK, 1981).
O acúmulo de H2O2 durante a formação de raízes e seus efeitos benéficos em baixas concentrações vem sendo apontado em diversos estudos (DUNAND et al., 2007; LI et al., 2007, 2009). Em estudos também foi demonstrado que houve melhorias no enraizamento quando essas substâncias foram associadas às auxinas (SEBASTIANI & TOGNETTI, 2004; FRANKLIN & DIAS, 2011).
29 plantas, as PAs desempenham papéis críticos em uma variedade de processos de desenvolvimento e fisiológicos, como a regulação da proliferação celular, embriogênese somática, a diferenciação e a morfogênese (KUSANO et al., 2007, 2008). As PAs são conhecidas por apresentarem uma função contra danos oxidativos. Esse efeito antioxidante é devido à combinação de suas propriedades iônicas na eliminação de radicais livres, inibindo a peroxidação lipídica, reações catalisadas por metais e pela produção de peróxido de hidrogênio através da ação de aminas oxidases (GROPPA & BENAVIDES, 2008). As poliaminas oxidases (PAOs) (EC 1.5.3.11) são responsáveis por catalisar a oxidação das poliaminas espermina (Spm) e espermidina (Spd) e/ou de seus derivados acetilados do grupo amino secundário (CONA et al., 2006; ANGELINI et al., 2010). Essas enzimas apresentam uma relação direta com o nível de auxinas nas plantas. Aplicação exógena de auxina pode induzir aumento na expressão de PAOs durante o crescimento de mesocótilos de milhos (CONA et al., 2003). Outras substâncias também podem alterar a atividade dessas enzimas, incluindo compostos com ação oxidante, como o peróxido de hidrogênio (NAG et al., 2001).
Assim, devido às necessidades de melhoria na qualidade das mudas e aos bons resultados obtidos para o enraizamento de estacas em estudos anteriores, este trabalho teve com objetivo avaliar a ação do peróxido de hidrogênio, do flavonóide quercetina e do ácido indolbutírico no enraizamento de estacas e no desenvolvimento de mudas de Eucalyptus
grandis x Eucalyptus urophylla com auxílio das poliaminas, marcadores bioquímicos do
desenvolvimento vegetal.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Para o experimento foram utilizadas estacas caulinares do clone (CL1) Eucalyptus
grandis x Eucalyptus urophylla provenientes da empresa Duratex S.A. O experimento foi
30 Figura 1. Temperaturas médias e pluviosidade ao longo de 30 anos no município de Lençóis Paulista-SP, INMET (2013).
2.1. Coleta das estacas
A coleta das estacas caulinares, de 3 a 6 cm de comprimento, foi realizada no jardim clonal da empresa Duratex S.A (Figura 2). O jardim clonal da empresa é composto de canaletas de fibro-cimento, com largura útil na parte superior de 90 cm. Em seu interior, há a seguinte ordem de camadas: forro de filme plástico, camada de 4 a 5 cm de seixo rolado para a drenagem da água, tela de sombreamento (sombrite) para evitar a mistura com a areia grossa, areia grossa, para nivelar a superfície para o plantio.
O jardim clonal contém todos os nutrientes essenciais ao desenvolvimento das plantas, pH entre 5,5 e 6,2 e condutividade elétrica entre 1,3 e 2,3 ms.cm-1. A adubação do jardim foi realizada diariamente através de 3 a 5 fertirrigações, constituídas de N-P-K mais micronutrientes, com duração de 4 a 5 minutos cada. O manejo hídrico do jardim foi realizado conforme a necessidade. A incidência de oídio foi controla pelo manejo hídrico.
0 50 100 150 200 250 300
0 5 10 15 20 25 30
Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Temperatura média (ºC)
31 Figura 2. Jardim clonal da empresa Duratex S.A., localizado em Lençóis Paulista-SP, no ano de 2012, canaletas com plantio de Eucalyptus grandis x Eucalyptus uroplylla, Clone CL1,
utilizado no experimento.
As estacas caulinares foram retiradas de cepas de no máximo 20 cm de altura (Figura 3). Para a coleta (Figura 4) foram utilizadas tesoura esterilizada com álcool 70%, para evitar a contaminação por patógenos e uma caixa térmica, onde foram acondicionadas as estacas. As estacas foram pulverizadas com solução composta de água a 15 ± 5ºC + Ca + B a cada 10 minutos para a manutenção das condições de turgescência e a redução da oxidação. As estacas obtidas do clone de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla (CL1) possuíam tamanhos de
3 a 6 cm de comprimento, 1,5 a 2,5 mm de diâmetro. Esse padrão foi adotado, pois, segundo o protocolo da empresa, dimensões inferiores indicam material vegetativo tenro e dimensões superiores indicam a lignificação do broto.
32 Figura 3. Padrão das cepas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus uroplylla, Clone CL1, das
quais foram retiradas as estacas caulinares. Lençóis Paulista, SP, 2012.
Figura 4. Coleta de estacas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus uroplylla com auxílio de
tesoura esterilizada e borrifador para manutenção da turgescência.
2.2. Preparo dos tratamentos
As soluções dos tratamentos em que as estacas caulinares foram mergulhadas foram preparadas no Laboratório de Bioquímica, Departamento de Química e Bioquímica, Instituto de Biociências de Botucatu no dia anterior à aplicação e a partir delas três experimentos foram implantados.
33 seguida misturados ao talco em mg kg-1, em diferentes combinações, sendo resultantes os seguintes tratamentos:
T1 - Controle
T2 - Quercetina (250 mg kg-1) T3 - Quercetina (500 mg kg-1) T4 - Quercetina (1.000 mg kg-1) T5 - IBA (1.000 mg kg-1)
T6 - IBA (1.000 mg kg-1) + Quercetina (250 mg kg-1) T7 - IBA (1.000 mg kg-1) + Quercetina (500 mg kg-1) T8 - IBA (1.000 mg kg-1) + Quercetina (1.000 mg kg-1)
Para o segundo experimento, foi utilizado peróxido de hidrogênio 30% (m/m) (Vetec®) (%) e ácido indolbutírico (mg kg-1), misturados ao talco nas seguintes combinações:
T1 - Controle
T2 - Peróxido de hidrogênio (1,75%) T3 - Peróxido de hidrogênio (3,5%) T4 - Peróxido de hidrogênio (7,0%) T5 - IBA (1.000 mg kg-1)
T6 - IBA (1.000 mg kg-1) + Peróxido de hidrogênio (1,75%) T7 - IBA (1.000 mg kg-1) + Peróxido de hidrogênio (3,5%) T8 - IBA (1.000 mg kg-1) + Peróxido de hidrogênio (7,0%)
O terceiro experimento foi composto pela combinação do tratamento mais adequado de peróxido hidrogênio e quercetina dos experimentos anteriores e de sua associação com IBA, assim, as seguintes combinações foram preparadas:
T1 - Controle
T2 – Quercetina (500 mg kg-1) + Peróxido de hidrogênio (3,5%) T3 - IBA (1.000 mg kg-1)
34 Após o preparo, todos os tratamentos permaneceram em estufa a 60ºC para a evaporação da fase líquida.
2.3. Implantação dos experimentos
Para a implantação dos dois primeiros experimentos foi utilizado delineamento experimental inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 2x4, sendo dois tratamentos com auxina, quatro com peróxido de hidrogênio e quercetina e 5 repetições de 48 estacas por unidade experimental, totalizando 1.920 estacas caulinares por teste.
Para o terceiro experimento foi utilizado delineamento experimental inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2x2, sendo duas doses de auxina e duas de peróxido de hidrogênio combinado com quercetina e cinco repetições de 48 estacas por unidade experimental, totalizando 480 estacas.
2.4. Plantio das estacas
As estacas foram plantadas em substrato composto por turfa canadense, casca de arroz carbonizada e vermiculita, acrescido de 4 kg m3 do fertilizante Superfosfato Simples (SSF) (P2O5) e do fertilizante de liberação lenta, Basacote Plus NPK (15-08-12) mais micronutrientes, 1 kg m3 no verão e 3 kg m3 no inverno. O substrato possuía relação C/N na faixa de 20 a 45. Os componentes foram levados ao misturador e permaneceram por 20 minutos. Após este tempo, 20 a 30 litros de água foram acrescentados.
O substrato foi acondicionado em tubetes plásticos de 55 m3. As bases das estacas (1 cm) foram mergulhadas nas soluções com talco de forma que ficassem aderidas ao local e, em seguida plantadas nos tubetes com substrato (Figura 5).
35 Após este período, as estacas permaneceram 20 dias em casa de sombra para aclimatação. A adubação, composta de macro e micronutrientes, foi aplicada diariamente ou a cada dois dias, de acordo com o crescimento das estacas e épocas do ano.
Após este período, as mudas foram levadas à área a pleno sol por mais 50 dias. Nesta fase, uma randomização das bandejas foi realizada, a fim de garantir que as mudas centrais escolhidas para a análise fossem independentes. Dois tipos de adubação foram realizadas, nos primeiros 15 a 30 dias foi utilizada a adubação de crescimento e após esse período, uma adubação de rustificação foi realizada. Para a rustificação, a frequência e volume de irrigação foram diminuídos.
Figura 5. Aplicação dos tratamentos nas bases das estacas clonais de Eucalyptus grandis x
Eucalyptus urophylla (A), seguida do plantio em substrato (B).
2.5. Avaliações em viveiro
Das 48 mudas de cada unidade experimental, 28 mudas centrais foram avaliadas, devido ao descarte da bordadura. Periodicamente, aos 30, 60 e 90 dias, os diâmetros e altura das mudas foram medidos com auxílio de paquímetro e de fita métrica (Figura 6) e porcentagem de sobrevivência foi verificada.
36 Figura 6. Determinação da altura (A) e diâmetro (B) de mudas de Eucalyptus, 30 dias após o
plantio.
Figura 7. Média do comprimento médio da maior raiz formada em estacas caulinares de
Eucalyptus, ao final do ciclo de produção.
2.6. Análises bioquímicas
37 2.6.1. Determinação do teor de poliaminas
Os teores de poliaminas foram determinados de acordo com o método proposto por Flores & Galston (1982), modificado por Lima et al. (1999). Foram pesados 0,2 g de folhas e raízes e homogeinizadas em 3 mL de HClO4 (5%). Em tubos de ensaio, foram adicionados 200 µL do sobrenadante, 200 µL de carbonato de cálcio saturado e a 400 µL de cloreto de dansil e deixados por 16 horas no escuro, a temperatura ambiente. Após esse período, foram adicionados 100 µL de prolina. Foram utilizados 500 µL de tolueno para retirar as poliaminas livres, obtendo então, o extrato dansilado. O extrato dansilado foi aplicado em placas de vidro recobertas por sílica gel 60-G com o auxílio de microseringa. Para a separação das poliaminas foi utilizado o solvente clorofórmio-trietilamina (20:1 v/v). A separação das poliaminas foi acompanhada mediante luz UV. Após aproximadamente uma hora, as placas foram retiradas da solução de solvente e mantidas dentro da capela, com circulação de ar, para secagem. Posteriormente, foram levadas ao densitômetro para quantificação. Os resultados foram expressos em µg de poliaminas (espermidina, espermina e putrescina) g-1 de massa fresca.
2.6.2.Determinação da atividade da poliamina oxidase
A atividade de poliamina oxidase foi determinada de acordo com o método de Stevanato et al. (1990). Foram pesados aproximadamente 0,05 g de amostra de folhas e raízes
de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla em eppendorf e adicionado tampão Hepes, 20
38 Figura 8. Atividade da enzima poliamina oxidase em folhas de Eucalyptus grandis x
Eucalyptus urophylla acompanhada durante 7 minutos em espectofotômetro com auxílio do
software Kinetics®. Indicação da medida da inclinação da reta no ponto mais estável da reação, valor obtido (Slope) expresso em Abs min-1 de matéria fresca.
3. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos periodicamente foram submetidos à análise de variância de medidas repetidas e os demais dados à análise de variância (ANOVA) e ao teste Tukey (p<0,05).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Quercetina e ácido indolbutírico
Para as variáveis obtidas a partir da avaliação destrutiva, porcentagens de enraizamento, número de raízes e comprimento da maior raiz, não foram encontradas diferenças estatísticas significativas entre os tratamentos (Tabela 1). Para as variáveis medidas aos 30, 60 e 90 dias após o plantio (altura, diâmetro e porcentagem de sobrevivência), nos tratamentos com auxina e quercetina, o F de interação (tempo x auxina x quercetina) não foi significativo entre os tratamentos, assim, o teste de médias não foi aplicado (Tabela 2).
39 o ambiente, genética do material e as condições nutricionais e hídricas da planta doadora, exerceram maior influência sob as mudas do que a aplicação de auxina e quercetina para o enraizamento e desenvolvimento das mudas via estaquia.
Em outros estudos foi verificado que o enraizamento de estacas pode ser influenciado por injúrias, pelo balanço hormonal, pela constituição genética, pela presença de inibidores e pelas condições nutricionais e hídricas da planta doadora de propágulos (ALFENAS et al., 2004), além de ser fortemente influenciado pela maturação/ juvenilidade dos propágulos e pelas condições ambientais (WENDLING et al., 2000; XAVIER et al., 2009).
Por outro lado, resultados positivos em relação aos flavonóides e IBA foram encontrados em outros estudos. Em clones de Eucalyptus benthamii Maiden & Cambage
x Eucalyptus dunnii Maiden a aplicação de IBA influenciou positivamente nos processos
rizogênicos das estacas, em índices de enraizamento, velocidade de formação de raízes e incrementos no enraizamento adventício (BRONDANI et al., 2010, 2012).
Flavonóides como quercetina, kaempferol, apigenina e outras moléculas de aglicona, sintetizadas nos primeiros processos da via de biossíntese dos flavonóides, demonstraram capacidade de inibir o transporte polar de auxina e, consequentemente, aumentar o acúmulo de auxina na planta (PEER; MURPHY, 2007). Em erva-mate (Ilex paraguariensis), a
40 Tabela 1. Enraizamento (%), comprimento de raiz (cm) e número de raízes, medidos aos 90 dias após o plantio de estacas
de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla, sob diferentes doses de quercetina (0; 250; 500; 1.000 mg kg-1) e ácido
indolbutírico (0; 1.000 mg kg-1).
Enraizamento (%) Comprimento de raiz (cm) Número de raízes
IBA (mg kg-1)
Quercetina (mg kg-1) 0 1.000 0 1.000 0 1.000
0 87,86 ± 8,22 89,29 ± 8,38 10,59 ± 0,32 10,65 ± 0,25 2,06 ± 0,36 2,14 ± 0,38
250 89,29 ± 5,65 88,57 ± 10,53 10,30 ± 0,38 10,69 ± 0,68 2,30 ± 0,41 2,08 ± 0,40
500 90,71 ± 5,42 83,57 ± 8,49 10,38 ± 0,35 10,36 ± 0,67 2,26 ± 0,40 1,78 ± 0,39
1.000 90,00 ± 4,66 92,86 ± 6,68 10,50 ± 0,35 10,25 ± 0,43 2,28 ± 0,49 2,30 ± 0,26
CV(%) 7,77 4,34 1,19
41 Tabela 2. Altura (cm), diâmetro (cm) e porcentagem de sobrevivência, medidos aos 30, 60 e 90 dias após o plantio de estacas
de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla sob diferentes doses de quercetina (0; 250; 500; 1.000 mg kg-1) e ácido
indolbutírico (0;1.000 mg kg-1).
Altura (cm) Diâmetro (cm) Sobrevivência (%)
IBA (mg kg-1)
0 1.000 0 1.000 0 1.000
Quercetina (mg kg-1) 30 dias
0 7,78 ± 0,34 7,61 ± 0,56 1,10 ± 0,06 1,23 ± 0,17 89,29 ± 7,58 90,00 ± 8,89
250 7,81 ± 0,59 7,89 ± 0,19 1,23 ± 0,17 1,17 ± 0,08 91,43 ± 6,96 88,57 ± 10,53
500 7,83 ± 0,30 6,99 ± 0,80 1,21 ± 0,18 1,15 ± 0,08 92,86 ± 6,19 83,57 ± 8,49
1.000 7,57 ± 0,29 7,41 ± 0,19 1,27 ± 0,16 1,21 ± 0,14 93,57 ± 6,39 95,00 ± 4,07
Quercetina (mg kg-1) 60 dias
0 12,89 ± 1,04 13,11 ± 0,95 1,67 ± 0,16 1,79 ± 0,06 88,57 ± 8,89 90,00 ± 8,89
250 12,34 ± 1,73 15,15 ± 1,40 1,69 ± 0,19 1,82 ± 0,11 90,71 ± 5,98 88,57 ± 10,53
500 13,62 ± 1,49 13,51 ± 1,22 1,75 ± 0,15 1,83 ± 0,15 92,14 ± 5,87 83,57 ± 8,49
1.000 12,28 ± 1,43 13,10 ± 1,75 1,73 ± 0,15 1,74 ± 0,11 92,04 ± 6,02 93,57 ± 6,87
Quercetina (mg kg-1) 90 dias
0 21,87 ± 1,03 22,55 ± 0,56 2,14 ± 0,09 2,25 ± 0,08 88,57 ± 8,89 89,29 ± 8,38
250 21,48 ± 2,33 24,05 ± 1,27 2,12 ± 0,14 2,35 ± 0,15 90,71 ± 5,98 88,57 ± 10,53
500 23,65 ± 2,18 22,70 ± 0,43 2,23 ± 0,09 2,26 ± 0,08 92,14 ± 5,87 83,57 ± 8,49
1.000 21,60 ± 2,32 22,50 ± 2,97 2,15 ± 0,15 2,26 ± 0,14 91,43 ± 5,42 93,57 ± 6,87
42 4.2. Peróxido de hidrogênio e ácido indolbutírico
Para as variáveis obtidas a partir da avaliação destrutiva, porcentagens de enraizamento, número de raízes e comprimento da maior raiz, não foram encontradas diferenças estatísticas significativas entre os tratamentos (Tabela 3). Nos tratamentos com IBA e H2O2 para as variáveis medidas periodicamente, altura, diâmetro e porcentagem de sobrevivência (Tabela 4), o F de interação (tempo x auxina x peróxido de hidrogênio) não foi significativo entre os tratamentos, assim, o teste de médias não foi aplicado.
Para Eucalyptus grandis x urophylla, em todos os tratamentos, inclusive no controle,
todas as variáveis apresentaram resultados satisfatórios, podendo inferir que outros fatores, tais como as condições ambientais, as características genéticas do clone e os cuidados no manuseio das estacas foram decisivos no estabelecimento das mudas.
Alguns autores afirmam que a presença de peróxido de hidrogênio pode afetar o crescimento e a diferenciação de raízes (DUNAND et al., 2007; SEBASTIANI & TOGNETTI, 2004). Em tomate foi descrito que o H2O2 se encontrava em baixa concentração na planta, porém, essa concentração aumentou, após a aplicação de auxina, tendo como consequência a diminuição do alongamento radicular, sugerindo que a auxina regula os níveis de H2O2 no meristema da raiz, para controlar seu crescimento (IVANCHENKO et al., 2013). Em estacas de oliveira, os tratamentos com H2O2, no início do processo de enraizamento, promoveram enraizamento mais precoce e aumentaram as porcentagens de enraizamento. Os efeitos positivos de H2O2 no enraizamento foram gradativamente suavizados após 88 dias, quando a quando o tratamento com IBA 4.000 + H2O2 em comparação com o tratamento apenas com IBA 4.000 mg kg-1 não diferiu mais (RUGINI et al.,1997).
43 Tabela 3. Enraizamento (%), Comprimento de raiz (cm) e número de raízes, medidos aos 90 dias após o plantio de
estacas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla, sob diferentes porcentagens de peróxido de hidrogênio (0; 1,75;
3,5; 7,0) e doses de ácido indolbutírico (0;1.000 mg kg-1).
Enraizamento (%) Comprimento de raiz (cm) Número de raízes
IBA (mg kg-1)
H2O2 (%) 0 1.000 0 1.000 0 1.000
0 91,43 ± 7,41 95,00 ± 4,07 10,36 ± 0,32 10,13 ± 0,52 2,46 ± 0,43 2,14 ± 0,61
1,75 92,86 ± 10,41 93,57 ± 6,87 10,42 ± 0,21 10,23 ± 0,25 2,38 ± 0,36 2,54 ± 0,47
3,5 95,00 ± 3,19 87,14 ± 8,60 9,98 ± 0,37 10,40 ± 1,19 2,12 ± 0,08 2,14 ± 0,51
7 92,14 ± 6,87 92,14 ± 7,74 10,01 ± 0,65 9,76 ± 0,52 2,45 ± 0,53 2,00 ± 0,25
CV(%) 7,83 5,56 19,00
44 Tabela 4. Altura (cm), diâmetro (cm) e porcentagem de sobrevivência, medidos aos 30, 60 e 90 dias após o plantio de estacas de
Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla sob diferentes porcentagens de peróxido de hidrogênio (0; 1,75; 3,5; 7,0 %) e doses de
ácido indolbutírico (0;1.000 mg kg-1).
Altura (cm) Diâmetro (cm) Sobrevivência (%)
IBA (mg kg-1)
0 1.000 0 1.000 0 1.000
H2O2 (%) 30 dias
0 7,18 ± 0,37 7,71 ± 0,40 1,16 ± 0,04 1,22 ± 0,07 92,86 ± 8,38 93,57 ± 7,74
1,75 8,03 ± 0,55 8,06 ± 0,77 1,28 ± 0,20 1,33 ± 0,22 95,00 ± 7,41 95,00 ± 5,42
3,5 7,61 ± 0,39 7,84 ± 0,81 1,24 ± 0,14 1,23 ± 0,10 97,14 ± 2,99 94,29 ± 4,07
7 7,61 ± 0,53 7,45 ± 0,30 1,22 ± 0,07 1,20 ± 0,13 95,00 ± 5,98 95,71 ± 3,91
H2O2 (%) 60 dias
0 13,93 ± 1,58 14,73 ± 1,14 1,76 ± 0,14 1,84 ± 0,07 92,86 ± 8,38 93,57 ± 7,74
1,75 15,19 ± 2,03 14,60 ± 0,94 1,86 ± 0,10 1,84 ± 0,11 95,00 ± 7,41 95,00 ± 5,42
3,5 14,09 ± 1,48 14,88 ± 1,63 1,81 ± 0,09 1,89 ± 0,10 95,71 ± 2,99 93,57 ± 3,91
7 13,98 ± 1,63 14,13 ± 1,52 1,77 ± 0,12 1,81 ± 0,09 93,57 ± 6,39 94,29 ± 6,96
H2O2 (%) 90 dias
0 24,22 ± 2,20 26,64 ± 1,47 2,25 ± 0,14 2,22 ± 0,08 92,86 ± 8,38 92,86 ± 7,14
1,75 25,52 ± 3,04 25,38 ± 1,08 2,33 ± 0,17 2,25 ± 0,13 95,00 ± 7,41 93,57 ± 6,87
3,5 23,72 ± 1,78 25,95 ± 1,60 2,17 ± 0,13 2,29 ± 0,13 95,71 ± 2,99 90,71 ± 6,96
7 24,89 ± 1,54 26,22 ± 1,04 2,22 ± 0,15 2,25 ± 0,06 93,57 ± 6,39 92,86 ± 6,96
