Efeito combinado do ácido zoledrônico e do alfacalcidol no tratamento da osteoporose por desuso em ratos.

(1)

w w w . r e u m a t o l o g i a . c o m . b r

REVISTA

BRASILEIRA

DE

REUMATOLOGIA

Artigo

original

Efeito

combinado

do

ácido

zoledrônico

e

do

alfacalcidol

no

tratamento

da

osteoporose

por

desuso

em

ratos

Deepak

Kumar

Khajuria

a,b,∗

,

Choudhary

Disha

a

,

Rema

Razdan

a

e

D. Roy

Mahapatra

b a_Departamento_de_{Farmacologia,}_Al-Ameen_College_of_Pharmacy,_Bangalore,_Índia

b_Departamento_de_Engenharia_{Aeroespacial,}_Laboratório_de_Materiais_e_Sistemas_de_Engenharia_Multiescala_Integrada,_Indian_Institute

ofScience,Bangalore,Índia

informações

sobre

o

artigo

Históricodoartigo:

Recebidoem1demaiode2014 Aceitoem17deagostode2014 On-lineem22deoutubrode2014

Palavras-chave:

Osteoporosepordesuso Estudocomratos Ácidozoledrônico Alfacalcidol

r

e

s

u

m

o

Objetivos:Odesusopelorepousonoleito,pelaimobilizac¸ãodemembrosoupormissões espaciaisprovocaaperdaóssearápida.Fez-seesteestudoparainvestigarosefeitos tera-pêuticosdoácidozoledrônico(ZOL),isoladamenteeemcombinac¸ãoaoalfacalcidol(ALF), emummodeloderatocomosteoporosepordesuso.

Métodos:RatosWistarmachosdetrêsmesesforamsubmetidosàimobilizac¸ãodapata tra-seiradireita(IPTD)por10semanasparainduziraosteopenia;emseguida,foramdivididos emquatrogrupos:1–IPTDparacontrolepositivo;2–IPTDmaisZOL(50␮g/kg,doseúnica intravenosa);3–IPTDmaisALF(0,5␮g/kg,viaoraldiariamente);4–IPTDmaisALF(0,5␮g/kg, viaoraldiariamente)maisZOL(50␮g/kg,doseúnicaintravenosa)poroutras10semanas. Umgrupoderatosnãoimobilizadosfoiusadocomocontrolenegativo.Nofimdo trata-mento,osfêmuresforamremovidosetestaram-seaporosidadedoossoesuaspropriedades mecânicas,alémdopesosecoedascinzasdoosso.

Resultados:AterapiacombinadacomZOLmaisALFfoimaiseficazemreduziraporosidade doossodoqueamonoterapiacomumdosfármacosadministradoisoladamenteemratos submetidosàIPTD.Noquedizrespeitoàmelhoriadaresistênciamecânicadadiáfisefemoral média,otratamentocombinadocomZOLmaisALFfoimaiseficazdoqueamonoterapiacom umdosfármacosadministradoisoladamente.Alémdisso,aterapiacombinadacomZOL maisALFfoimaiseficaznamelhoriadopesosecoedascinzasdoossodoqueamonoterapia comZOLouALFemratossubmetidosàIPTD.

Conclusões:EssesdadossugeremqueaterapiacombinadacomZOLmaisALFrepresenta umaopc¸ãoterapêuticapotencialmenteútilparaotratamentodaosteoporosepordesuso.

∗ _Autor_para_{correspondência.}

E-mail:deepakkumarkhajuria@yahoo.co.in(D.K.Khajuria).

http://dx.doi.org/10.1016/j.rbr.2014.08.007

(2)

Additive

effect

of

zoledronic

acid

and

alfacalcidol

in

the

treatment

of

disuse

osteoporosis

in

rats

Keywords:

Disuseosteoporosis Ratmodel

Zoledronicacid Alfacalcidol

a

b

s

t

r

a

c

t

Objectives:Disusebybedrest,limbimmobilizationorspaceflightcausesrapidboneloss.We conductedthepresentstudytoinvestigatethetherapeuticeffectsofzoledronicacid(ZOL), aloneandincombinationwithalfacalcidol(ALF)inaratmodelofdisuseosteoporosis. Methods:Inthepresentstudy,3-month-oldmaleWistarratshadtheirrighthind-limb immo-bilized(RHLI)for10weekstoinduceosteopenia,thenweredividedintofourgroups:1–RHLI positivecontrol;2–RHLIplusZOL(50␮g/kg,i.v.singledose);3–RHLIplusALF(0.5␮g/kg,oral gaugedaily); 4–RHLIplusALF(0.5␮g/kg,oralgaugedaily)plusZOL(50␮g/kg,i.v.single dose)foranother10weeks.Onegroupofnon-immobilizedratswasusedasnegative con-trol.Attheendofthetreatment,thefemurswereremovedandtestedforboneporosity, bonemechanicalproperties,andbonedryandashweight.

Results: CombinationtherapywithZOLplusALFwasmoreeffectiveindecreasingbone porositythaneachdrugadministeredasmonotherapyinRHLIrats.Withrespectto impro-vementinthemechanicalstrengthofthefemoralmid-shaft,thecombinationtreatmentof ZOLplusALFwasmoreeffectivethaneachdrugadministeredasamonotherapy.Moreover, combinationtherapyusingZOLplusALFwasmoreeffectiveinimprovingdryboneandash weight,thansingle-drugtherapyusingZOLorALFinRHLIrats.

Conclusions: ThesedatasuggestthatcombinationtherapywithZOLplusALFrepresentsa potentiallyusefultherapeuticoptionforthetreatmentofdisuseosteoporosis.

Introduc¸ão

Acargamecânicaéessencialparaofuncionamentonormal dotecidoósseo.1_A_{manutenc¸ão}_da_integridade_do_esqueleto,

amassaósseaeaformac¸ãodeossonosmembrosquerecebem descargadepesosãodependentesdagravidade.2_A_ausência

dedescargadepesonoesqueletoinduzidapelaimobilização prolongadaporaparelhogessadooutala,proteçãocontrao estressedecorrentedafixaçãodefraturascomplacas, incapa-cidadeocasionadaporumadoençacrônicaoulesãomedular ouausênciadepeso associadaamissões espaciaisprovoca umadiminuiçãodamassaósseatantoemmodeloshumanos quantoanimais.2,3 _A_osteoporose_por_{imobilização}_(desuso)

provocaperdalíquidadeosso,comoresultadodeum dese-quilíbrioentre areabsorc¸ão ea formac¸ão óssea.3 _Por _isso,

é necessário considerar que a perda óssea decorrente da imobilizac¸ãoprolongada aumentaasuscetibilidadea fratu-rasempacientescomlesõesnamedulaespinal,idososque necessitamde repousonoleitoeastronautasdurante mis-sõesespaciaisprolongadas.Portanto,éessencialselecionar otratamentoidealparaomanejoeficazdaosteoporosepor desuso.

Osdifosfonatosinibemareabsorçãoósseaconformesão seletivamente incorporados aos osteoclastos e interferem em sua ação de reabsorção.4 _O _ácido _zoledrônico _(ZOL) _é

umdifosfonatode terceiragerac¸ão quecontémnitrogênio. Éamplamenteusadoparaaosteoporoseinduzidapela pós--menopausa e por glicocorticoides em seres humanos.5-8

Estudoscomanimaismostraramosefeitosdotratamento iso-ladocomZOLnaosteoporoseinduzidapelaimobilizac¸ão.9,10

Embora agentes antirreabsortivos, como os difosfonatos,

sejameficazesnareduc¸ãodaperdaóssea,nãosãocapazes deinduziraformac¸ãodeossonovo.7,10

O alfacalcidol (1-alfa-hidroxivitamina D3 – ALF) é um análogo sintético da vitamina D,um hormônio que regula o cálcio e é frequentemente usado emdiversos países no tratamento da osteoporose.9,11 _O _ALF _reduz _os _níveis _de

hormôniodaparatireoide,comoresultadotantodoaumento naabsorçãodecálcioquantodainibiçãodaproliferaçãoda glândulaparatireoide.Tambémdiminuialiberaçãode citoci-naspró-inflamatórias,asquaiscontribuemparaaativaçãode osteoclastos.Alémdisso,oALFestimulaaformaçãoeaçãodos osteoblastos,oquelevaaumaumentodaformaçãoóssea.12–15

Outrostrabalhosdemonstraramqueaadministrac¸ãodeALF diminuioefeitodaimobilizac¸ãosobreodesenvolvimentode osteoporose.9,16

OZOLeoALFestãodisponíveiscomercialmentenaÍndia. OZOLéconhecidoporinibirareabsorc¸ãoósseamediadapelos osteoclastos,9,12,17_enquanto_o_ALF_exerce_tanto_efeitos

ana-bolizantes quantoantirreabsorc¸ão sobreo esqueleto.13,18,19

Acredita-se que a combinac¸ão de dois medicamentos seja umtratamento maiseficazdoque umaterapiaúnicapara a osteoporose; acombinac¸ão de difosfonatos ede um fár-macoanabolizanteósseotemsidousadaclinicamentepara aosteoporosepós-menopáusica.20,21_Dado_que_a_perda_óssea

induzida pela imobilização envolve tanto o aumento da reabsorçãoósseaquantoareduçãodaformaçãoóssea,3_parece

óbviotrataraperdademassaósseainduzidapelaimobilizac¸ão comumregimedetratamentoantirreabsorc¸ãoeanabolizante ósseocombinado,comocomoZOLeoALF.Osefeitosda tera-piacombinadacomZOLeALFforampreviamenteestudados emratasovariectomizadas,17_mas_esse_regime_de_tratamento

(3)

desuso.Porconseguinte,oobjetivodesteestudoéinvestigara eficáciadoagenteanabolizantedotecidoósseoALF,doagente antirreabsorçãoósseaZOLedacombinaçãodessesdois agen-tesnotratamentodaosteopeniainduzidapelaimobilização emratos.Emrazão dosdiferentes mecanismosde açãodo ZOL e do ALF, a hipótese do estudo é que a combinação deZOL com ALFfacilitaria maioresmelhorias nas proprie-dadesdosossosdoqueumadasduasintervençõesisolada. Foram avaliados os seguintesparâmetros; (1) propriedades mecânicasdadiáfisemédiadefêmuresimobilizados(direito) enãoimobilizados(esquerdo);(2)medidada porosidadede fêmuresimobilizados(direito)enãoimobilizados(esquerdo), (3)mediçãodopesosecoedascinzasdefêmuresimobilizados (direito)enãoimobilizados(esquerdo).

Materiais

e

métodos

Fármacos,produtosquímicoseoutrosmateriais

O ZOL eo ALFforam obtidos doslaboratórios Naprod Life Sciences (Maharashtra, India) e GlaxoSmithKline Pharma-ceuticals (Mumbai, India), respectivamente. A cetamina, a xilazina e o xileno foram obtidos dos laboratórios Neon Pharma(Mumbai,India),IndianImmunologicals(Hyderabad, India)eS.D.Finechemicals(Mumbai,India),respectivamente.

Animaisexperimentais

ForamincluídosnoestudoratosWistarmachosde12 sema-nasdeidade,comde170a180g.Osanimaisforammantidos sobtemperaturacontroladaa25◦_±₂◦_C_e_ciclo_claro/escuro_de

12horas,comcomidaeáguafornecidasàvontade.Os experi-mentosforamfeitosdeacordocomasdiretrizesdoCPCSEA (Committee for the Purpose ofControl and Supervision of ExperimentsonAnimals),depoisdeobtidaumaautorizac¸ão éticadoInstitutionalAnimalEthicalCommittee.

Metodologiadoestudopré-clínico

Aostrêsmeses,apataposteriordireitadosratosfoi imobili-zadacontraoabdomesobanestesiacomcetamina(80mg/kg) exilazina(10mg/kg)porvia intraperitoneal,deacordocom umnovométododeimobilizac¸ãodemembrosposteriores des-critoporKhajuriaetal.9

Osratos foramdivididosemcincogrupos(seisratospor grupo).1–gruponãoimobilizado(controlenegativo);2–IPTD (controlepositivo)por20semanas;3–IPTDpor10semanas e,emseguida,IPTDmaisZOL(50␮g/kg,emdoseúnica intra-venosa)pormais10semanas;4–IPTDpor10semanase,em seguida,IPTDmaisALF(0,5␮g/kg,porviaoraldiariamente)por mais10semanas;5–IPTDdurante10semanas,emseguida, IPTDmaisALF(0,5␮g/kg,porviaoraldiariamente)maisZOL (50␮g/kg,emdoseúnicaintravenosa)durantemais10 sema-nas.AdoseoraldiáriaemcasodegruposcomIPTDtratados comALFeZOLmaisALFexigiualgummanejodosanimaise crioualgumestresseparaeles.Portanto,ogruponão imobi-lizado(controlenegativo)eosgruposIPTD(controlepositivo) eIPTDmaisZOL receberamadministrac¸ãode veículo(soro fisiológicocomum)porviaoraldurante 10semanas.Todos

os ratossubmetidos àIPTDforam alojadosemgaiola indi-vidualde polipropileno (tamanho: 421×290×190mm, com intervalode7mmentreasgrades)duranteoperíododo expe-rimento. Asdoses demedicac¸ãousadasnesteexperimento foramselecionadasapartirdeumestudoanteriorfeitopelos autores,conduzidoemmodelosderatoscomosteoporose pós--menopáusica.17_No_fim_do_tratamento_{experimental,}_todos_os

gruposforameutanasiadosporumaoverdosedeanestesia. Emtodososratos,aspatasimobilizadas(direita)enão imobi-lizadas(esquerda)foramexcisadasesubmetidasàremoc¸ãode gorduraetecidosconjuntivos.Osfêmuresforamembebidos emgazecomsorofisiológicoecongeladosa–20◦ _C_até

aná-liseposterior.Tantoosfêmuresimobilizados(direito)quanto nãoimobilizados(esquerdo)foramusadosparaamedic¸ãoda porosidadedoosso,daspropriedadesbiomecânicas,do com-primentodofêmur,dopesosecoedascinzasdosfêmures.

Pesocorporalecomprimentofemoralfinal

Opesocorporal(expressoemgramas)foimonitoradonoinício enofimdoexperimento.Ocomprimentodofêmurfoimedido comumpaquímetro.

Medic¸ãodaporosidadedoossoporradiografia

Osfêmuresdireitosdetodososanimaisforamradiografados com oaparelhoFox-Rayzor,queéumsistemadeinspec¸ão porraios-Xportátilequipadocomaferramentadesoftware CalculateHistogram,deacordocomummétodopreviamente descritonaliteratura.22_Em_resumo,_para_a_análise_das

radi-ografiasdofêmurdosratos,ofêmurfoidivididoemquatro áreasiguais,queincluíramaepífisefemoraldistal(R1),a diá-fisefemoral(R2eR3)eaepífisefemoralproximal(R4).

Testesbiomecânicosderesistênciaóssea

Aspropriedadesmecânicasdadiáfisemédiadofêmurforam medidaspormeiodotestedeflexãodetrêspontos,comum aparelhodeensaiouniversal(BISSMakron,Bangalore,Índia). A resistência dofêmurfoi avaliadapelotestede flexão de três pontos,conformedescritoanteriormente22_.

Resumida-mente, os fêmures foram removidos docongelador a –20◦

Cere-hidratadosemsorofisiológicodurantequatrohorasà temperaturaambiente.Opesohidratadodosossosfoi deter-minadocomumabalançadigitaldequatrocasasdecimais.O comprimentodosossosfoimedidocomumpaquímetro.As amostrasforamcolocadasemdoissuportes,queforam sepa-radosporumadistânciade12mmedobradosatéafratura, abaixandoacruzetaposicionadanomeio dadiáfiseauma velocidadeconstantede0,033mm/s.Apartirdacurva carga--deslocamento, foramobtidosopicodecarga (N),arigidez máxima(N/mm)eadureza(mJ).Aresistênciamáxima (ten-são)eomódulodeelasticidadeforamobtidosdascurvasde carga-deformaçãolevantadaspormeiodeequaçõesdescritas previamentenaliteratura.22

Medic¸ãodopesosecoedascinzasdofêmur

(4)

gordurafoiremovida cométerdietílico.Aseguir,deixou-se queosossossecassemaoarlivreeopesosecofoimensurado comumabalanc¸adigital.Emseguida,osfêmuressecosforam queimadosereduzidosacinzasa900◦_C,_durante_cinco_horas,

eopesodecinzasfoiquantificado.

Análiseestatística

Todos os dados foram expressos como a média ± desvio padrão(DP).Para todosos dados,ascomparações entreos diferentestratamentosforamanalisadaspeloAnovaone-way, seguido pelo testede comparações múltiplas de Tukey. As diferençasentreoladoimobilizadoeonãoimobilizadoforam comparadascom oWilcoxonsigned-ranktest.Emtodosos casos,umaprobabilidadedeerroinferiora0,05foi selecio-nadacomocritérioparaasignificânciaestatística.Osgráficos foramelaboradoscomoprogramaGraphPadPrism(versão5.0 paraWindows).

Resultados

Efeitodosdiferentestratamentossobreopesocorporal

ecomprimentodofêmur

DezsemanasdepoisdaIPTD,ospesoscorporaisforam signifi-cativamentemaisbaixosnosanimaisdogrupoIPTD(controle positivo) e dos grupos de tratamento submetidos à IPTD, emcomparaçãocomogruponormalnãoimobilizado.Essa diferençatornou-semaiornofimdoexperimento(IPTDpor outras10semanas).Noentanto,nãohouvediferenças estatis-ticamentesignificativasnospesosobservadosentrequalquer umdosgruposdetratamentoativoeogrupoIPTD(controle positivo)(tabela1).

Não houve diferenc¸as significativas no comprimento dos fêmures imobilizados (direito) entre o grupo de con-trole positivo (39,89±1,3mm), grupo ZOL (40,23±4,7mm), grupo ALF (39,78±8,4mm), grupo ZOL + ALF (40,69±10,4) e grupo controle normal (41,09±2,2mm). Além disso, não houvediferenc¸asestatisticamentesignificativasentreolado

Tabela1–Efeitosdosdiferentestratamentossobreo

pesocorporal

Pesocorporal

Grupo Pré-tratamento(g) Pós-tratamento(g)

Controlenormal 253,2±10,65a _320,1_±_13,39a

IPTD(controlepositivo) 230,1±18,22 216,6±9,01 IPTD+ZOL 229,4±11,22 218,0±10,19 IPTD+ALF 232,8±17,15 223,4±12,18 IPTD+ZOL+ALF 225,8±13,34 212,6±11,13

Opré-tratamentomostraosdadosrelativosaodiaanteriorao iní-ciodotratamento.Opós-tratamentomostradadosdoúltimodia detratamento.Osdadossãoexpressoscomoamédia±DP(n=6), avaliadospeloAnovaone-way,seguidopelotestedecomparac¸ões múltiplasdeTukey.

a _p_<_0,001,_comparado_com_o_grupo_IPTD_(controle_positivo)._Todos

osgrupos,comexcec¸ãodogrupocontrolenormal,foram subme-tidosàimobilizac¸ãodapatatraseiradireita(IPTD).

imobilizado(direito)eonãoimobilizado(esquerdo)(dadosnão mostrados).

Efeitodosdiferentestratamentossobreaporosidade

doosso

Aimagemderaios-X mostraadiferençanaintensidadede transmissãoderaios-Xdeacordocomaporosidadedo espé-cime.Aintensidadedatransmissãoderaios-Xédiretamente proporcionalàporosidade.OsefeitosdaIPTDedotratamento subsequentecomtodasasintervençõesterapêuticassobrea porosidadedofêmurdireitoforammedidosporimagemde raios-X,comomostradonafigura1.Aintensidadedos raios--XnogrupoIPTD(controlepositivo)emR1(epífisedistal),R2 (diáfisedistal),R3(diáfiseproximal)eR4(epífiseproximal)foi significativamentemaiordoquenogruponormalnão imobi-lizado,oqueindicaqueaimobilizaçãoprovocouumaumento naporosidadeósseanessasáreas.

Depoisde10semanasdetratamento,todosos tratamen-tosativos(individuaisecombinados)conseguiramdiminuir aporosidadeósseaemratos submetidosàIPTD.Osvalores daintensidadedatransmissãoderaios-XemR1(epífise dis-taldofêmur)nosgruposZOL,ALFeZOL+ALFfoimenordo quenogrupoIPTD(controlepositivo)(p<0,001).Domesmo modo,osvaloresda intensidadeda transmissãoderaios-X

emR2 (diáfisedofêmurdistal) nosgruposZOL,ALF eZOL + ALF foi menordo que no grupo IPTD (controle positivo) (p<0,01,p<0,05ep<0,001,respectivamente).Similarmente, osvaloresda intensidadedatransmissãoderaios-XemR3 (diáfisefemoralproximal)nosgruposZOL,ALFeZOL+ALF foimenordoquenogrupoIPTD(controlepositivo)(p<0,01, p<0,001ep<0,001,respectivamente).Alémdisso,osvalores daintensidadedatransmissãoderaios-XemR4(epífise femo-ralproximal)nosgruposZOL,ALFeZOL+ALFfoimenordoque nogrupoIPTD(controlepositivo)(p<0,01,p<0,01ep<0,001, respectivamente).Emcontraste,aintensidadede transmis-sãoderaios-XnogrupoZOL+ALFfoisignificativamentemais baixadoquenosgruposZOLeALFnasregiõesR1,R2,R3eR4 (p<0,05).

Efeitodosdiferentestratamentossobreaspropriedades

mecânicasdadiáfisefemoralmédia

A figura 2 mostra o pico de carga, a rigidez máxima, a dureza, a resistência máxima e o módulo de elasticidade nadiáfise femoral,respectivamente.Os testesdeflexão de três pontos dofêmurdireito indicaramque aIPTDcausou reduc¸õessignificativasnopicodecarga,narigidezmáxima,na dureza,naresistênciamáximaenomódulodeelasticidadeem comparac¸ãocomogruponormalnãoimobilizado(p<0,001).

(5)

Epífise femoral distal (R1)

Controle normalIPTD controle IPTD + ZOL IPTD + ALF IPTD + ZOL + ALF

Controle normalIPTD controle IPTD + ZOL IPTD + ALF IPTD + ZOL + ALF Controle normalIPTD controle IPTD + ZOL IPTD + ALF

IPTD + ZOL + ALF

0 10 20 30

***

b

***

a

***

a

Intensidade dos pixels (%)

Diáfise femoral distal (R2)

0 5 10 15 20 25

***

**

a

*

b

*

a

Diáfise femoral proximal (R3)

0 5 10 15 20 25

***

*** ***a *b **a

Epífise femoral proximal (R4)

0 10 20 30

***

**a ** a

Figura1–Efeitodoácidozoledrônicoedoalfacalcidol,isoladosouemcombinac¸ão,sobreaporosidadefemoral.Porosidade ósseaemR1:epífisefemoraldistal,R2:diáfisefemoraldistal,R3:diáfisefemoralproximal,R4:epífisefemoralproximal.Os dadossãoexpressoscomoamédia±DP(n=6),avaliadospelotestedecomparac¸õesmúltiplasdeTukey.*p<0,05;

**p<0,01;***p<0,001,comparadocomogrupoIPTD(controlepositivo);a_p_<_0,05,_comparado_com_o_grupo_ZOL₊_ALF._Todos

osgrupos,comexcec¸ãodogrupocontrolenormal,foramsubmetidosàimobilizac¸ãodapatatraseiradireita(IPTD).

foisignificativamentemaisbaixadoquenogrupoALF+ZOL (p<0,05).Alémdisso,nosgruposZOL,ALFeZOL+ALF,a resis-tênciamáximadofêmurfoisignificativamentemaiordoque nogrupoIPTD(controlepositivo)(p<0,001).NosgruposZOL eALF,aresistênciamáximaerasignificativamentemenordo quenogrupoZOL+ALF(p<0,01ep<0,001,respectivamente). Alémdisso,omódulodeelasticidadedosgruposZOL,ALFe ZOL +ALFfoi significativamentemaiorquandocomparado comogrupoIPTD(controlepositivo)(p<0,05,p<0,01,p<0,01 ep<0,001,respectivamente).Emtodosostratamentos indi-viduais,omódulodeelasticidadefoisignificativamentemais baixodoquenogrupoZOL+ALF(p<0,05).

Comparac¸ãodoefeitodosdiferentestratamentossobreo pesosecoedascinzasdosfêmuresimobilizadosenão imobi-lizadosemratos

AIPTD induziu aumadiminuic¸ão estatisticamente sig-nificativa(p<0,001)nopesoseco edas cinzasdosfêmures imobilizadosdosratoscontrole(grupoIPTD)emcomparac¸ão

com os ratos controlenormaisnão imobilizados(tabela2). Nofêmur da patatraseiradireita imobilizadade ratos tra-tados com terapias individuais e combinadas, o peso da biomassasecaedas cinzasfoisignificativamente maiordo que no grupo IPTD (controle positivo). No fêmur da pata traseira direita imobilizada de ratos tratados com ZOL + ALF, o peso seco foi significativamente maior do que nos grupos ZOL ou ALF (p<0,05 no grupo ALF). Além disso, no fêmur da pata traseira direita imobilizada de ratos tratados com ZOL + ALF, o peso das cinzas era signifi-cativamente maior do que nos grupos tratados com ZOL ou ALF (p<0,05 no grupo ALF). Nos fêmures esquerdos não imobilizados não foi observada diferenc¸a estatistica-mentesignificativaentreosgrupossubmetidosatratamentos isolados ou combinados e o grupo normal não imobili-zado.

(6)

Controle normalIPTD controleIPTD + ZOL IPTD + ALF

ALF = IPTD + ZOL + ALF

Controle normalIPTD controleIPTD + ZOL IPTD + ALF

ALF = IPTD + ZOL + ALF 0

50 100 150 ***

***

* **

Pico de carga (N)

0 100 200 300

**

*** ** ***

Rigidez máxima (

N

/m

m

)

Controle normalIPTD controle IPTD + ZOL IPTD + ALF

IPTD + ZOL + ALF Controle normal

IPTD controle IPTD + ZOL IPTD + ALF

IPTD + ZOL + ALF

Controle normalIPTD controle IPTD + ZOL IPTD + ALF IPTD + ZOL + ALF

0 10 20 30 40 50

*

a

***

**

a

Dureza (mJ)

0 100 200 300

***

***b _***c ***

Resistência máxima

(MPa)

0 2 4 6

**

a

***

**

a

Módulo de

elasticidade (GPa)

Figura2–Efeitosdoácidozoledrônico,alfacalcidolouácidozoledrônicomaisalfacalcidolsobrearesistênciamecânicada diáfisemédiadofêmur.Adiáfisefoisubmetidaaotestedeflexãodetrêspontosatéafalha,queforneceudadossobreo picodecarga,arigidezmáxima,adureza,aresistênciamáximaeomódulodeelasticidade.Osdadossãoexpressoscomo amédia±DP(n=6),avaliadospelotestedecomparac¸õesmúltiplasdeTukey.*p<0,05;**p<0,01;***p<0,001,comparado comogrupoIPTD(controlepositivo);a_p_<_0,05;b_p_<_0,01;c_p_<_0,001,_comparado_com_o_grupo_ZOL₊_ALF._Todos_os_grupos,

comexcec¸ãodogrupocontrolenormal,foramsubmetidosàimobilizac¸ãodapatatraseiradireita(IPTD).

Aporosidade do osso eas propriedades mecânicas das patasesquerdaedireitaestãorepresentadascomodiagramas debarrasnasfiguras3e4,respectivamente.Oasteriscoindica quehouve diferenc¸a estatisticamentesignificativaentre as patasesquerda edireita dentro de um mesmogrupo. Nas

(7)

Tabela2–Efeitosdaimobilizac¸ãoedosdiferentestratamentossobreopesosecoedascinzasdofêmur

Fêmuresquerdonãoimobilizado Fêmurdireitoimobilizado

Grupo Pesodoossoseco (mg/osso)

Pesodascinzas doosso (mg/osso)

Pesodoossoseco (mg/osso)a

Pesodascinzas doosso (mg/osso)a

Controlenormal 630,7±8,1 381,4±7,7 639,8±12,2b _385,7_±_9,4b

IPTD(controlepositivo) 620,5±10,9 368,9±4,3 543,9±15,5 321,5±11,5 IPTD+ZOL 622,1±18,1 379,1±7,2 593,7±13,7b,c _351,7_±_9,8

IPTD+ALF 627,5±12,1 382,4±9,6 583,5±9,4b,c _349,5_±_7,6b,c

IPTD+ZOL+ALF 640,7±14,8 392,2±13,6 619,1±12,1b _369,9_±_9,4b

Osdadossãoexpressoscomoamédia±DP(n=6),avaliadospeloAnovaone-way,seguidopelotestedecomparac¸õesmúltiplasdeTukey.

a _Indica,_para_o_parâmetro,_uma_diferenc¸a_{significativa}_dos_tratamentos_ativos_entre_os_dois_casos. b _p_<_0,001,_comparado_com_o_grupo_IPTD_(controle_positivo);_patas.

c _p_<_0,05,_comparado_com_o_grupo_ZOL₊_ALF.

noladoimobilizado(direito)pareceusignificativamentemais elevadadoquenoladonãoimobilizado(esquerdo)nosgrupos submetidosàIPTDtratadoscomZOLouALF(p<0,05).Em con-traste,ogrupoIPTDtratadocomZOL+ALFmostrouprotec¸ão completacontraaosteoporosepordesusonasregiõesR1,R2,

R3eR4,conformeindicadopelosvaloresdeintensidadede transmissãoderaios-X(fig.3).

Nadiáfisefemoralmédia(testedeflexãodetrêspontos),o efeitodaimobilizac¸ãofoimuitopronunciadonosgrupos sub-metidosàIPTD(controlepositivo);ouseja,oladoimobilizado

Epífise femoral distal (R1)

0 10 20 30

IPTD + ZOL + ALF

IPTD + ZOL + ALF Controle normalIPTD controle IPTD + ZOL

IPTD + ALF

IPTD + ZOL + ALF

***

*

Diáfise femoral distal (R2)

0 5 10 15 20 25

***

*

Diáfise femoral proximal (R3)

0 5 10 15 20

25

_***

*

_*

Epífise femoral proximal (R4)

0 10 20 30

***

* *

(8)

0 50 100 150 200

Controle normal

RHLI control RHLI + ZOL RHLI + ALF

RHLI + ZOL + ALF

Controle normal

RHLI + ZOL + ALF

Controle normal

RHLI + ZOL + ALF

Controle normal

RHLI + ZOL + ALF Controle normal

RHLI + ZOL + ALF

***

*

Pico de carga (N)

0 100 200 300 400

*** * *

Rigidez máxima (N/mm)

0 10 20 30 40

50

***

**

Dureza (mJ)

0 100 200 300

*** ** _**

Resistência máxima (MPa)

0 2 4 6

***

**

Módulo de elasticidade (GPa)

Figura4–Propriedadesmecânicasdoladonãoimobilizado(barradaesquerda)edoladoimobilizado(barradadireita) dentrodeummesmogrupo.Adiáfisefemoralfoisubmetidaaotestedeflexãodetrêspontosatéafalha,oqueforneceu dadossobreopicodecarga,arigidezmáxima,adureza,aresistênciamáximaeomódulodeelasticidade.Oasteriscoindica aexistênciadeumadiferençaestatisticamentesignificativaentreoladonãoimobilizadoeoladoimobilizado(média±DP). Todososgrupos,comexceçãodogrupocontrolenormal,foramsubmetidosàimobilizaçãodapatatraseiradireita(IPTD).

(direito)apresentouvaloressignificativamentemenoresnos parâmetrosderesistência,incluindoopicodecarga,arigidez máxima,adureza,aresistênciamáximaeomódulode elas-ticidade,doqueoladonãoimobilizado(esquerdo)(p<0,001). Domesmomodo,nosgrupossubmetidosàIPTDtratadoscom ZOLouALF,o ladoimobilizado(direito)apresentouvalores

(9)

Discussão

Quesetemconhecimento,osefeitoscombinadosdos agen-tesantirreabsorçãoeanabolizantessobreoesqueletoainda nãoforamespecialmenteavaliadosemmodelosderatocom osteoporosepordesuso.Opresenteestudofoifeitopara escla-receraeficáciadaadministraçãocombinadadeZOLeALFna qualidadegeraldoossoemratossubmetidosàIPTD.Os resul-tadosdesteestudomostraramqueamonoterapiacomZOLe ALFécapazdeneutralizaraperdaósseaemummodelode ratocomosteoporosepordesuso.Apropriedade antiosteopo-róticadoZOLmaisacombinaçãocomoALFparecesermais eficazquandocomparadacomamonoterapiacomZOLouALF. Assim,confirmaram-seosefeitosbenéficosdaadministração combinadadeZOLeALFparaotratamentodaosteoporose pordesusoemratos.

Opesocorporaldogruponormalfoimaiordoqueodo grupoIPTD(controlepositivo).Issopodetersidodecorrenteda anestesiaadministradaduranteoprocessodeimobilizac¸ão. A alimentac¸ão diminuída e a mobilidade geral reduzida sãooutros possíveis fatoresque podemter contribuídode

modo secundário para o desenvolvimento de um menor

pesocorporaledaperdademassaóssea.Estudosanteriores demonstraramumadiminuic¸ão semelhantenopeso corpo-raldepoisdaIPTD.9,23 _O_comprimento_do_fêmur_no_membro

imobilizadonãofoisignificativamentediferentedaqueledo fêmurnãoimobilizadointactodomesmorato,oquesugere queocrescimentolongitudinaldoossonãoéretardadonesses animais.Portanto,émaisprovávelquenestecasoestejamos lidandocomaosteoporosepelaimobilizac¸ão,emvezdo sim-plesatrasonocrescimento.

Observou-seumaumentoproeminentenaporosidadedo ossoemR1,R2,R3eR4depoisdaimobilizac¸ãodapata tra-seiradireita.Oaumentodaporosidadedoossonasregiões R1,R2,R3,R4dofêmurdoratoemrazãodafaltadedescarga depesonapatatraseiradireitafoisuprimidopelotratamento comZOL,ALFeZOL+ALF.Naanálisedaporosidadeósseado fêmurderatocomaimagemporraios-X,verificou-sequea terapiacombinadacomZOL+ALFfoiestatisticamente supe-rioràmonoterapiacomZOLouALFnasupressãodoaumento daporosidadeósseadecorrentedaIPTD.Issoindicaquea tera-piacombinada com ZOL+ ALF engrossaefortalece oosso cortical.

Deve-seobservarquenosratostratadoscomZOL,ALFe ZOL +ALF,o pesosecoedas cinzasdofêmurdireito imo-bilizadofoisignificativamente maiordoquenogrupo IPTD (controlepositivo).Alémdisso,nosanimaistratadoscom tera-piacombinada(ZOL+ALF),opesosecoedascinzasdofêmur direitoimobilizadofoi significativamentemaiordoquenos gruposZOL ouALF. Esses resultadosmostram queo trata-mentocombinadocomZOL+ALFébenéficoemaumentar amassaósseadofêmurdorato,queestava diminuídaem decorrênciadaIPTD.

As propriedades mecânicas do osso estão relacionadas comadensidade,arquitetura,conectividadeemineralização óssea.23 _A _{imobilização}_resulta_em _redução_das

proprieda-desmecânicas,9,24 _o _que_foi _observado_neste_estudo._Neste

experimento,aspropriedadesmecânicasdoossofemoralde ratosdiminuíramnogrupoIPTD(controle positivo)quando

comparadoscom ogrupocontrolenormalnãoimobilizado, oquesugereumaumentodafragilidadedoossocorticalde ratos submetidos à IPTD. Os resultados do testede flexão detrêspontosderatostratadoscomZOL,ALFeZOL+ALF indicam um maior picode carga máxima,rigidez, energia (dureza), resistência àflexão emódulo de elasticidade em comparac¸ãocomosratosdogrupoIPTD(controlepositivo). AterapiacombinadacomZOL50+ALFfoiestatisticamente

superior à monoterapia com ZOL ou ALF no aumento da

durezadadiáfise médiadofêmur,daresistênciamáximae domódulodeelasticidade.

A comparaçãoentre a pata não imobilizada (esquerda) e aimobilizada(direita) dentrode ummesmogrupo mos-trouqueaspropriedadesósseasforammelhoradasportodas as intervenções terapêuticas, mas a osteopenia marcada induzidapelaIPTDnãofoicompletamentecorrigidacoma monoterapia com ZOL ouALF. Emcontraste, o tratamento combinadocomZOL+ALFmostrouproteçãocompletacontra aosteoporosepordesuso,oquesugerequeaterapia combi-nadatemumavantagemterapêuticasobreambososfármacos

em monoterapia para o tratamento da osteoporose por

desuso.

O tratamento para a osteoporose tem sido dominado poragentesantirreabsorc¸ão,principalmenteosdifosfonatos (risedronato, alendronato, ibandronato, pamidronato, ácido zoledrônicoetc.), queimpedemumaperda ósseaadicional na osteoporose já estabelecida, mas não alteram a massa óssea nemrepõem o osso jáperdido.7,10,25 _Nesta _pesquisa

experimental, preferiu-se oZOL em detrimentodosoutros difosfonatos disponíveis na Índia. O ZOL tem várias van-tagens sobre os outros difosfonatos: (1) a vantagem óbvia do ZOL sobre os outros difosfonatos é seu elevado nível de adesão, que é possível em razão de sua aplicac¸ão em ambientecontroladocominfusãoumavezporano adminis-tradasobsupervisãomédica.Considerandoasbaixastaxas deadesãodosdifosfonatosorais,issoéumavanc¸omédico significativo;26 ₍₂₎ _os _difosfonatos_orais _não_são _facilmente

absorvidos pelo intestino e apresentam biodisponibilidade variável.Portanto,énecessáriaaadministrac¸ãodealtasdoses porviaoral,quecausamefeitosadversoscomoaesofagite;7

(3) verificou-sequeemcondições susceptíveisde estimular a ligaçãododifosfonato aoosso, oZOL tem amaior afini-dade deligação com ahidroxiapatita óssea entretodos os outros difosfonatos;27 ₍₄₎ _o _custo _do_ZOL _é_comparável _ao

custo anualdos difosfonatosoraiseé maisbarato doque o outrodifosfonatointravenoso (ibandronato),queé admi-nistradoacadatrêsmeses.27_No_entanto,_as_{administrac¸ões}

parenteraisdedifosfonatostêmmostradoumafaseagudade resposta, hipocalcemia e hiperparatireoidismo secundário, dor musculoesquelética, complicac¸ões renais, osteonecrose da mandíbulaeeventos ocularesemalgunscasos.7,27,28 _Os

resultados do nosso estudo anterior mostraram que uma dose maisbaixa de ZOL (50␮g/kg, emdose única intrave-nosa)apresentaefeitosbenéficosepromissoressemelhantes no tratamentoda osteoporoseemcomparac¸ãocom adose terapêuticadeZOL(100␮g/kg,emdoseúnicaintravenosa)em ratoscomdeficiênciadeestrogênio.29 _Por_conseguinte,_para

(10)

OALF é usadopara tratar a osteoporoseporqueexerce tanto efeitosanabolizantes quantoantirreabsorc¸ão sobreo esqueleto.13,18,19 _Entretanto, _as_doses_mais_elevadas_de_ALF

podem aumentaro risco de hipercalcemia ou hipercalciú-ria. Por outro lado, o tratamento com ZOL pode causar hipocalcemiapelasupressãodareabsorc¸ãodeosso.17_Os

dife-rentesmecanismosdoZOLedoALFsugeremqueaterapia combinadacomambosos medicamentospodeeliminarou minimizaroriscodeapresentarasreaçõesadversas conheci-dasdescritaspreviamentequandoessesdoisfármacosforam administradosisoladamente.Combasenosachadosde estu-dosprévioseatuais,propõe-sequeaterapiacombinadacom ZOL+ALFatuaaoaumentaraformaçãoóssea(pormeioda estimulaçãodaformaçãoeaçãodososteoblastos)ediminuira reabsorçãoóssea(pormeiodainduçãodaapoptosedos oste-oclastos)ereequilibra,assim,o turnoverósseoemfavorda formaçãode osso, um efeito que resultaem umaumento damassaeresistênciaóssea.Issopossivelmentepode expli-carcomoaterapiacombinadacomZOL+ALFfoimaiseficaz doqueamonoterapiacomALFouZOLnoaumentodamassa ósseaeresistênciaemratossubmetidosàIPTD.

Esteestudotemváriaslimitações:(1)osratossãoanimais quadrúpedese,porconseguinte, experimentamumpadrão decargadiferentedaqueledossereshumanos;(2)opadrãode remodelação óssea no rato é diferente daquele dos seres humanos;(3)nesteestudo,foiusadoummodeloderatoem crescimento.Assim,osganhosrelacionadoscomamaturação damassaósseanãopodemserignoradosemratos submeti-dosàIPTD;(4)Alémdisso,oefeitodoZOLedoALFsobrea porosidadecortical,oquepodeserobservadoemratos enve-lhecidossubmetidosàIPTD,nãofoiavaliado.Porconseguinte, osresultadosdesteestudonãopodemserextrapoladospara sereshumanoscomosteoporosepordesusoprimária.Assim, sãonecessáriosmaisestudosparaconfirmarosefeitos bené-ficosdaadministraçãocombinadadeZOLeALFsobreamassa ósseaemratossubmetidosàIPTD.

Conclusões

Esteestudoinvivoinicialmentemostrouqueaterapia com-binadacomZOL +ALF éaltamenteeficaznamelhoriadas propriedadesdoossoemummodeloderatoscom osteopo-rosepordesuso.Issosugerequeaterapiacombinadatemuma vantagemterapêuticasobreamonoterapiacomZOLouALF notratamentodaosteoporosepordesusoinduzidapela inati-vidademecânica.Assim,esseregimecombinadopodeserde interesseparaavaliac¸ãoadicionalporensaiosclínicos.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

Agradecimentos

OsautoresagradecemaoSr.B.KJain,daNaprodLife Scien-ces,Maharashtra,Índia,porforneceramostrasgrátisdoácido zoledrônico.Os autores tambémagradecem a contribuic¸ão do Sr. Vijay Kumar e do Sr. Manish Kumar Priydarshi, do

DepartamentodeEngenhariaAeroespacial,InstitutoIndiano deCiência,pelafeituradasimagensderaios-Xedostestesde flexãodetrêspontos.

r

e

f

e

r

ê

n

c

i

a

s

1.LiCR,ZhangGW,NiuYB,PanYL,ZhaiYK,MeiQB. AntiosteoporosiseffectofRadixScutellariaeextracton densityandmicrostructureoflongbonesintail-suspended sprague-dawleyrats.Evidence-BasedComplementaryand AlternativeMedicine.2013,2013:753703.

2.BarouO,Lafage-ProustMH,MartelC,ThomasT,TirodeF, LarocheN,etal.Bisphosphonateeffectsinratunloaded hindlimbbonelossmodel:three-dimensional

microcomputedtomographic,histomorphometric,and densitometricanalyses.JPharmacolExpTher.1999;291:321–8.

3.WatersDJ,CaywoodDD,TurnerRT.Effectoftamoxifencitrate oncanineimmobilization(disuse)osteoporosis.VetSurg. 1991;20:392–6.

4.RussellRG,WattsNB,EbetinoFH,RogersMJ.Mechanismsof actionofbisphosphonates:similaritiesanddifferencesand theirpotentialinfluenceonclinicalefficacy.OsteoporosInt. 2008;19:733–59.

5.BlackDM,DelmasPD,EastellR,ReidIR,BoonenS,CauleyJA. Once-yearlyzoledronicacidfortreatmentofpostmenopausal osteoporosis.NEnglJMed.2007;356:1809–22.

6.LambrinoudakiI,VlachouS,GalapiF,PapadimitriouD, PapadiasK.Once-yearlyzoledronicacidinthepreventionof osteoporoticbonefracturesinpostmenopausalwomen.Clin IntervAging.2008;3:445–51.

7.KhajuriaDK,RazdanR,MahapatraDR.Drugsforthe managementofosteoporosis:areview.RevBrasReumatol. 2011;51:365–82.

8.ReidDM,DevogelaerJP,SaagK,RouxC,LauCS,ReginsterJY, PapanastasiouP,etal.Zoledronicacidandrisedronateinthe preventionandtreatmentofglucocorticoid-induced osteoporosis(Horizon):amulticentre,double-blind, double-dummy,randomisedcontrolledtrial.Lancet. 2009;373:1253–63.

9.KhajuriaDK,DishaC,RazdanR,MahapatraDR,VasireddiR. Prophylacticeffectsofpropranololversusstandardtherapy onanewmodelofdisuseosteoporosisinrats.SciPharm. 2014;82:357–74.

10.VeggerJB,NielsenES,BrüelA,ThomsenJS.Additiveeffectof PTH(1-34)andzoledronateinthepreventionofdisuse osteopeniainrats.Bone.2014[Epubaheadofprint].

11.ShiraishiA,MiyabeS,NakanoT,UmakoshiY,ItoM,MiharaM. Thecombinationtherapywithalfacalcidolandrisedronate improvesthemechanicalpropertyinlumbarspineby affectingmaterialpropertiesinanovariectomizedratmodel ofosteoporosis.BMCMusculoskeletDisord.2009;10:66.

12.KhajuriaDK,DishaC,RazdanR,MahapatraDR.Comparative evaluationofzoledronicacid,alfacalcidol,andpropranololin pharmacologicalcorrectionofexperimentalosteoporosis.Lat AmJPharm.2013;32:968–76.

13.ErbenRG.VitaminDanalogsandbone.JMusculoskelet NeuronalInteract.2001;2:59–69.

14.SchachtE,DukasL,RichyF.Combinedtherapiesin osteoporosis:bisphosphonatesandvitaminD-hormone analogs.JMusculoskeletNeuronalInteract.2007;7:174–84.

15.deNijsRN,JacobsJW,LemsWF,LaanRF,AlgraA,Huisman AM,etal.Alendronateoralfacalcidolin

glucocorticoid-inducedosteoporosis.NEnglJMed. 2006;355:675–84.

(11)

effectofactivevitaminDanalogsonthedevelopment ofimmobilizationosteoporosisinrats.CalcifTissueInt. 1981;33:623–30.

17.KhajuriaDK,RazdanR,MahapatraDR.Zoledronicacidin combinationwithalfacalcidolhasadditiveeffectson trabecularmicroarchitectureandmechanicalpropertiesin osteopenicovariectomizedrats.JOrthopSci.2014[Epub aheadofprint].

18.IwamotoJ,MatsumotoH,TakedaT,SatoY,XuE,YehJK. Effectsofalendronateandalfacalcidolonthefemoralbone massandbonestrengthinorchidectomizedrats.ChinJ Physiol.2008Dec31;51:331–7.

19.IwamotoJ,SekiA,TakedaT,SatoY,YamadaH,YehJK.Effect ofrisedronateonthecorticalandcancellousbonemassand mechanicalpropertiesinovariectomizedrats:acomparison withtheeffectsofalfacalcidol.JNutrSciVitaminol. 2006;52:393–401.

20.FredianiB,AllegriA,BisognoS,MarcolongoR.Effectsof combinedtreatmentwithcalcitriolplusalendronateonbone massandboneturnoverinpostmenopausalosteoporosis: twoyearsofcontinuoustreatment.ClinDrugInvest. 1998;15:235–44.

21.MalavoltaN,ZanardiM,VeronesiM,RipamontiC,GnudiS. Calcitriolandalendronatecombinationtreatmentin menopausalwomenwithlowbonemass.IntJTissueReact. 1999;21:51–9.

22.KhajuriaDK,RazdanR,MahapatraDR,BhatMR.

Osteoprotectiveeffectofpropranololinovariectomizedrats: acomparisonwithzoledronicacidandalfacalcidol. JOrthopSci.2013;18:832–42.

23.FaibishD,OttSM,BoskeyAL.Mineralchangesin

osteoporosis:areview.ClinOrthopRelatRes.2006;443:28–38.

24.MosekildeL,ThomsenJS,MackeyMS,PhippsRJ.Treatment withrisedronateoralendronatepreventshind-limb immobilization-inducedlossofbonedensityandstrengthin adultfemalerats.Bone.2000;27:639–45.

25.ShirkeSS,JadhavSR,JagtapAG.Methanolicextractof Cuminumcyminuminhibitsovariectomy-inducedboneloss inrats.ExpBiolMed(Maywood).2008;233(11):1403–10.

26.SchumannSA,HicknerJ.Annualzoledronicacidinfusion lowersriskoffracture,death.JFamPract.2007;56:1013–6.

27.PapapoulosSE.Bisphosphonates:howdotheywork?Best PractResClinEndocrinolMetab.2008;22:831–47.

28.SuK,ShiX,VarshneyRR,WangD.Transplantabledelivery systemsforinsitucontrolledreleaseofbisphosphonatein orthopedictherapy.ExpertOpinDrugDeliv.2011;8: 113–26.