Miriam Pires de Castro Oliveira
Trypanosoma dionisii: determinação do padrão de expressão
de epítopos definidos por anticorpos monoclonais
anti-Trypanosoma cruzi e estudos da invasão em linhagens
celulares
São Paulo
2008
Miriam Pires de Castro Oliveira
Trypanosoma dionisii: determinação do padrão de expressão
de epítopos definidos por anticorpos monoclonais
anti-Trypanosoma cruzi e estudos da invasão em linhagens
celulares
Orientador: Prof. Dr. Renato Arruda Mortara
Co-orientador Dr. Mauro Javier Cortez Véliz
São Paulo
2008
Trabalho realizado sob a orientação do Prof. Dr.
Renato Arruda Mortara e co-orientação do Dr.
Mauro Javier Cortez Véliz, na Disciplina de
Parasitologia do Departamento de Microbiologia,
Imunologia e Parasitologia da Universidade
Federal de São Paulo, com apoios financeiros
concedidos pela Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),
Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação
de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Você não depende dos outros, depende da sua mente. Mantenha a mente arejada, abra as suas janelas ao mundo, respire com segurança e ande com firmeza.
Agradecimentos
Ao meu cunhado Alex, pela amizade e imediata disposição em me auxiliar sempre que solicitado.
Ao meu orientador Dr. Renato Arruda Mortara, pela paciência, conselhos e ensinamentos. Muito obrigada por ter me aceitado em sua equipe.
Ao meu co-orientador Dr. Mauro Javier Cortez Véliz, pela ajuda, amizade e conselhos. Muito obrigada.
À amiga Solange, pelos ensinamentos, conselhos e carinho.
A Dra. Diana Bahia pela revisão desta tese e pela amizade sincera em tão pouco tempo de convivência.
A Dra. Edna Haapalainen pela pronta disposição em esclarecer minhas dúvidas e por sempre me receber com carinho em seu laboratório.
À equipe do laboratório: Cecília, Cláudio, Manu, Juliana, Mario, Fernando e à recém chegada Érica pela ajuda e amizade neste período de convivência.
Aos amigos Simone, Henrique, Natália e Carol pela empatia e carinho.
Aos amigos do Centro de Microscopia Eletrônica: Márcia, André, Patrícia e Isabel por toda a ajuda e carinho.
Aos amigos Sandra, Cidinha, Adilson, Fátima e Adauto sempre dispostos a me auxiliar.
Às secretárias Regiane e Mércia pela amizade e por toda a atenção dedicada.
A todos os docentes da Disciplina de Parasitologia e do Departamento de Micro, Imuno e Parasito, pela cordialidade nestes anos de convivência.
Sumário
Lista de figuras...xi
Resumo...xiii
Abstract...xv
1.0 Introdução...1
1.1 Ciclo de vida...3
1.2 Invasão celular...5
1.3 Processo de invasão celular: compostos que interferem com a célula alvo ou com o parasita...9
2.0 Objetivos...13
2.1 Objetivo geral...13
2.2 Objetivos específicos...13
3.0 Material e Métodos...14
3.1 Cultura celular...14
3.2 Parasitas...14
3.2.1 Epimastigotas...14
3.2.2 Tripomastigotas de cultura de tecido (TCT)...15
3.2.3 Tripomastigotas metacíclicas (TM)...15
3.2.4 Amastigotas extracelulares (AM)...15
3.3 Anticorpos...16
3.4 Imunofluorescência indireta (IFI)...16
3.4.1 Anticorpos monoclonais anti-T. cruzi cepa G e anti-T. cruzi cepa CL...16
3.4.2 Duplas marcações com anticorpos monoclonais anti-T. cruzi cepas G e CL...17
3.4.3 Ensaio de invasão utilizando anticorpo monoclonal anti-LAMP-1...18
3.4.4 Ensaio para a visualização de parasitas no interior da célula hospedeira utilizando anticorpo policlonal anti-T. dionisii...19
3.6 Ensaio para a detecção do efeito de diferentes compostos na invasão
celular de T. dionisii...21
3.7 Análise da atividade trans-sialidásica (TS) dos parasitas...22
3.8 Análise estatística...23
4.0 Resultados...24
4.1 Distribuição de epítopos reconhecidos por anticorpos monoclonais anti-amastigotas de T. cruzi das cepas G e CL durante o ciclo intracelular de T. dionisii e em formas isoladas do parasita...24
4.2 Duplas marcações com anticorpos monoclonais anti-T. cruzi cepas G e CL...32
4.3 Processo de invasão celular do T. dionisii em células COS-7...39
4.4 Visualização do parasita no interior da célula hospedeira...43
4.5 Ultra-estrutura de parasitas isolados e células LLCMK2 infectadas...46
4.6 Influência na infectividade de T. dionisii de compostos que interferem no processo de invasão de T. cruzi...49
4.7 Análise da atividade trans-sialidásica (TS) dos parasitas...51
5.0 Discussão...53
5.1 A reatividade de epítopos reconhecidos por anticorpos monoclonais anti-amastigotas de T. cruzi cepa G e anti-amastigotas de T. cruzi cepa CL, durante o ciclo intracelular de T. dionisii e em formas isoladas do parasita, evidencia o compartilhamento de epítopos, a existência de características estruturais próprias e a existência de subpopulações na espécie...53
5.2 Duplas marcações com anticorpos monoclonais anti-T. cruzi cepas G e CL reafirmam a existência de subpopulações na espécie T. dionisii ...56
5.3 Trypanosoma dionisii recruta lisossomos para invadir células COS-7 in vitro...57
5.4 A imunofluorescência com anticorpo policlonal anti-T.dionisii detecta parasita dentro do núcleo de células hospedeiras in vitro.....59
5.6 O composto wortmanina interfere na invasão celular por formas
tripomastigotas metacíclicas de T. dionisii...62
5.7 T. dionisii possui menor atividade trans-sialidásica do que T. cruzi...64
6.0 Conclusões...66
7.0Perspectivas...66
xi
Lista de figuras
Figura 1: Distribuição de epítopos definidos pelos anticorpos monoclonais 1D9,
4B5 e 4B9 em formas intracelulares de T. dionisii...27
Figura 2: Distribuição de epítopos definidos pelos anticorpos monoclonais 3B9, 4D9 e 3B2 em formas intracelulares de T. dionisii...28
Figura 3: Distribuição de epítopos definidos pelos anticorpos monoclonais 4B5, 4D9 e 3B9 em amastigotas extracelulares de T. dionisii...29
Figura 4: Distribuição de epítopos definidos pelos anticorpos monoclonais 4B5, 4D9 e 3B9 em epimastigotas de T. dionisii...30
Figura 5: Distribuição de epítopos definidos pelos anticorpos monoclonais 3B9 e 4D9 em tripomastigotas metacíclicos de T. dionisii...31
Figura 6: Dupla marcação com os anticorpos monoclonais 4B5 e 4B9...34
Figura 7: Dupla marcação com os anticorpos monoclonais 4B5 e 3B9...35
Figura 8: Dupla marcação com os anticorpos monoclonais 4B9 e 3B9...36
Figura 9: Dupla marcação com os anticorpos monoclonais 2B6 e 3B9...37
Figura 10: Formas tripomastigotas metacíclicas de T. dionisii recrutando LAMP-1 e no interior de vacúolos LAMP-1 positivos após infecção de células COS-7...40
xii
Figura 12: Cinética de formação de vacúolos parasitóforos LAMP-1 positivos
durante a invasão de T. dionisii em células COS-7...42
Figura 13: Parasitas no núcleo de células COS-7 96 horas após a infecção...43
Figura 14: Parasitas dentro do núcleo de uma célula COS-7 96 horas após a
infecção...44
Figura 15: Renderização de diferentes planos de células COS-7 infectadas
com T. dionisii evidencia parasitas dentro do núcleo das células...45
Figura 16: Ultra-estrutura de cortes longitudinais das diferentes formas
evolutivas de T. dionisii...47
Figura 17: Presença de formas tripomastigotas de T. dionisii dentro do núcleo
de células LLCMK2...48
Figura 18: Efeito de diferentes compostos na invasão de T. dionisii e T. cruzi
cepa CL em células COS-7...50
Figura 19: Comparação da atividade trans-sialidásica das formas TCT (barras
pretas) e metacíclicas (barras brancas) de T. dionisii (T. dio) e T. cruzi cepas
xiii
Resumo
Trypanosoma dionisii é um tripanosomatídeo de morcegos
filogeneticamente muito próximo ao Trypanosoma cruzi, agente etiológico da
Doença de Chagas que, segundo a Organização Mundial de Saúde, afeta 18 milhões de pessoas na América Latina além de ocorrer aproximadamente 300.000 novas infecções anualmente.
Durante seu ciclo de vida, T. dionisii passa por diferentes formas
evolutivas alternando entre hospedeiro vertebrado e invertebrado. As formas são: epimastigotas e tripomastigotas metacíclicas no hospedeiro invertebrado e tripomastigotas sanguíneas e amastigotas no hospedeiro vertebrado. As formas tripomastigotas metacíclicas são capazes de invadir e se multiplicar in vitro em diversos tipos de células de mamíferos.
O presente trabalho teve como objetivo observar características da ultraestrutura da espécie, alguns aspectos de seu mecanismo de invasão e identificar possível compartilhamento de epítopos entre as espécies T. dionisii e T. cruzi através de ensaios utilizando anticorpos monoclonais anti-T. cruzi.
Assim como ocorre com T. cruzi, as formas tripomastigotas metacíclicas
de T. dionisii recrutam lisossomos durante a invasão da célula hospedeira e
permanecem em vacúolos LAMP-1 positivos por várias horas.
Nossos resultados mostraram que aproximadamente 10% das formas tripomastigotas metacíclicas LAMP-1 positivas de T. dionisii, transformam-se
em amastigotas em compartimentos LAMP-1 positivos, permanecendo nestes vacúolos por até 96 horas. Além disto, o pré-tratamento da célula hospedeira com nocodazol (composto que despolimeriza microtúbulos, impedindo o recrutamento lisossomal) não alterou a invasão do parasita, enquanto o pré-tratamento com wortmanina (composto que inibe a invasão via PI3-quinase e invaginação de membrana) inibiu significativamente a invasão. Estes dados sugerem que a fusão lisossomal talvez não seja um evento crítico para o estabelecimento de uma infecção bem sucedida de T. dionisii.
xiv
T. dionisii e T. cruzi da cepa G, pois T. dionisii reagiu com apenas um dos
anticorpos anti-T.cruzi da cepa CL testados.
Quanto à ultraestrutura T. dionisii é bastante semelhante a T. cruzi, com
exceção do núcleo, que em T. dionisii apresenta um característico padrão de
xv
Abstract
Trypanosoma dionisii is a bat trypanosomatid phylogenetically related to Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas’ disease that according to the World
Health Organization affects 18 million people in Latin America that also report approximately 300.000 new infections annually.
During its life cycle T. dionisii alternates through different developmental
forms between vertebrate and invertebrate hosts: epimastigotes and metacyclic trypomastigotes in the invertebrate host, and bloodstream trypomastigotes and amastigotes in the vertebrate host. In vitro the trypomastigote metacyclic forms
are able to invade and replicate within a large number of mammalian cells. In the present we examined ultrastructural aspects of the species, described some morphological aspects of host cell invasion and identified some epitopes shared between T. cruzi and T. dionisii using anti-T. cruzi monoclonal
antibodies.
As well as it occurs with T. cruzi, T. dionisii trypomastigote forms also
recruit host cell lysosomes during invasion and reside inside LAMP-1 positive parasitophorous vacuoles for many hours.
Our results showed 10% of T. dionisii trypomastigotes metacyclic LAMP-1
positives transformed into amastigotes within LAMP-1 positive compartments, remaining in these vacuoles for up to 96 hours. Moreover, host cell treatment with nocodazol (a drug that disrupts cell microtubules, blocking lysosomal recruitment) did not affect parasite invasion, while wortmannin (a compound that inhibits PI3 kinase-dependent invasion) host cell treatment significantly inhibited parasite invasion. These data suggest that lysosomal fusion may no be a critical event for successful T. dionisii cell infection.
Analysis of epitope expression during the intracellular host cell cycle using anti-T. cruzi amastigote monoclonal antibodies showed higher relatedness of T. dionisii to the G strain of T. cruzi, since T. dionisii reacted with only one of the
monoclonal antibodies raised against the CL strain of T. cruzi.
About ultrastructure, T. dionisii is very similar with T. cruzi, except in the
nucleus, that in T. dionisii showed a characteristic chromatin condensation
1
1.0 Introdução
Trypanosoma dionisii é um tripanosomatídeo de morcegos, pertencente ao
gênero Schizotrypanum. Filogeneticamente é um protozoário muito próximo ao parasita Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas que,
segundo a Organização Mundial de Saúde (WHO, 2002) afeta 18 milhões de pessoas na América Latina e promove aproximadamente 300.000 novas infecções anualmente.
Pela primeira vez, em 1905 na Europa, Bettencourt e França descreveram a espécie T. dionisii isolada do morcego Pipistrellus pipistrellus. Já, em 1978,
Baker et al. relataram a proximidade filogenética entre T. dionisii e T. cruzi e,
em 1987, Petry et al. sugeriram que T. dionisii e T. cruzi compartilham
componentes antigênicos e epítopos definidos por anticorpos monoclonais contra formas epimastigotas.
Segundo Hoare (1972) o gênero Schizotrypanum é composto por pequenos tripanosomos de difícil identificação morfológica. A presença de um cinetoplasto volumoso e formas sanguíneas tipicamente curvilíneas com 14 a 24 µm de comprimento são características típicas deste gênero bastante homogêneo. Ainda de acordo com Hoare (1972), a estrutura e o ciclo de vida das diversas espécies do gênero Schizotrypanum, assemelham-se à espécie T. cruzi. Entretanto, sob vários aspectos, o ciclo de vida das espécies
encontradas nos morcegos, assim como, o papel destes animais na epidemiologia de T. cruzi ainda não é bem conhecido (Molyneux, 1991).
2 utilizam áreas domiciliares como abrigo, representando um potencial trófico para a manutenção de populações de triatomíneos. Além disso, as colônias de morcegos eventualmente trocam de abrigo, constituindo-se, assim, em potenciais elementos de dispersão da tripanosomíase (Fabián, 1991). Outro fato importante com relação a este reservatório vertebrado, é que em sua circulação podem coexistir diversas espécies destes hemoparasitas (Baker et al., 1973; Soria & Dusanic, 1975). Além de T. dionisii, já foi descrito o
isolamento em morcegos dos seguintes tripanosomatídeos: T. cruzi, T. cruzi marinkelle, T. vespertilionis, T. desterrensis, T. hedricki, T. myoti, T. pteropi, T. hipposideri, T. rangeli, T. conorhini, T. leeuwenhoeki, T. minasense, T. cyclops, T. lewisi, T. theileri, T. saimiri, T. equiperdum e T. evansi (Barnabé et al., 2003;
Grisard et al., 2003).
De acordo com Marinkelle (1976), ao contrário de T. cruzi, as espécies
conhecidas de tripanosomos de morcego (gênero Schizotrypanum) são incapazes de infectar animais de laboratório sob condições experimentais. Entretanto, infectam natural e experimentalmente triatomíneos (conhecidos vetores de T. cruzi), mas estas infecções são transitórias (Dias et al., 1942;
Pinto & Bento, 1986).
Triatomíneos do gênero Cavernícola foram descritos como possíveis vetores de algumas espécies do gênero Schizotrypanum, como T. cruzi e T. cruzi marinkellei entre morcegos neotropicais. Cimex spp também foi
3 Perfis enzimáticos obtidos de T. cruzi isolado de morcego (Molossus molossus) foram similares aos perfis enzimáticos de T. cruzi isolados de Rhodnius prolixus e Didelphis marsupialis, capturados na mesma região,
sugerindo que infecções naturais de tripanosomos Schizotrypanum podem ocorrer em regiões endêmicas onde estas espécies de hospedeiros coexistam (Saravia et al., 1987).
A transmissão vetorial de T. dionisii para o morcego pode ocorrer através de
invertebrados que o parasitam pertencentes às seguintes famílias: Reduvidae, Argasidae (Rodhain, 1942), Hirudínea (Ewers, 1974), Psychodidae (Williams, 1976) e Cimicidae (Gardner & Molyneux, 1988), além de vertebrados dos quais os morcegos se alimentam como primatas, marsupiais, edentados, lagomorfos, rodentia, carnívoros e artiodactylos (Molyneux, 1991).
1.1 Ciclo de vida
Na natureza, através do repasto sanguíneo no morcego, o inseto (Cimex
4 infecção é semelhante ao de T. cruzi, envolvendo os vetores triatomíneos
(Molyneux, 1991).
Segundo Wilkins & Baker (1975), o período de multiplicação e diferenciação de T. dionisii no inseto é de seis a dezesseis dias e culmina com a liberação
das formas tripomastigotas metacíclicas na luz intestinal do mesmo, dando início a um novo ciclo.
Molyneux (1991) afirma que pode ocorrer também diferenciação de epimastigotas em tripomastigotas metacíclicas na região anterior do intestino do inseto que migrariam para a glândula salivar e seriam inoculadas no hospedeiro vertebrado durante a hematofagia.
No sangue de P. pipistrellus (quiróptero), T. dionisii tem grande semelhança
com T. cruzi com formas curtas que tendem a ficar com o típico formato
curvado (‘C’) de T. cruzi. Após 24 hs de infecção com tripomastigotas em
células HeLa in vitro, alguns amastigotas (solitários ou em pares) podem ser
observados. Os amastigotas multiplicam-se por fissão binária e aproximadamente uma semana após a infecção as células estão repletas destas formas. Com sete a nove dias de infecção, algumas células HeLa apresentam parasitas transformados em tripomastigotas. Formas epimastigotas e tripomastigotas metacíclicas são mantidas in vitro em meio monofásico ou
difásico a 28 ºC (Baker et al., 1972).
Ainda segundo Baker et al. (1972), T. dionisii invade (ou é fagocitado) por
acrófagos peritoniais in vitro e sua multiplicação ocorre por fissão binária de
5 ºC. O desenvolvimento em macrófagos é menos sincronizado do que em células HeLa.
1.2 Invasão celular
T. cruzi:
O processo de interação de T. cruzi com células de mamíferos pode ser
descrito em: adesão, internalização ou invasão, e destino intracelular (Araújo-Jorge, 1989). Tanto em células fagocíticas como em células não fagocíticas, os tripomastigotas são interiorizados por um complexo mecanismo de endocitose envolvendo moléculas da membrana plasmática do parasita e também das células hospedeiras (Colli, 1984; Zingales & Colli, 1985; Mortara, 1991; Schenkman & Mortara, 1992; Procópio et al., 1998). A seguir os
parasitas podem ser encontrados em vacúolos nos estágios precoces da infecção (Nogueira & Conh, 1976; Tardieux et al., 1992).
Vários estudos in vitro citam glicoconjugados, presentes no parasita e na
célula hospedeira, como participantes do processo de invasão celular sugerindo, portanto, que carboidratos podem desempenhar papel importante na interação ligante-receptor (Alves et al., 1986; Yoshida et al., 1989; Ramirez et al., 1993; Ming et al., 1993; Schenkman et al., 1993b; Herrera et al., 1994;
Barros et al., 1997; Mortara et al., 1999; Silva et al., 2006).
A adesão in vitro, tanto das formas metacíclicas quanto das formas
6 No curso natural da infecção por T. cruzi, as formas tripomastigotas
metacíclicas, transmitidas pelo inseto infectado, invadem as células de mamíferos, escapam de vacúolos endocíticos e transformam-se em amastigotas que se replicam no citoplasma e diferenciam-se em tripomastigotas que são liberadas após lise celular (Behbehani, 1973; Nogueira & Cohn, 1976; Carvalho et al., 1981, Umezawa et al., 1985, Ulisses de
Carvalho & De Souza, 1986; Mortara et al., 1999).
De acordo com Tardieux et al. (1992; 1994), o mecanismo de entrada de T. cruzi em células não-fagocíticas envolve o recrutamento de lisossomos para o
local de adesão do parasita na célula hospedeira, resultando na formação de vacúolo parasitóforo. A adesão do parasita à membrana da célula hospedeira sinaliza o recrutamento dos lisossomos que percorrem ao longo dos microtúbulos de maneira dependente de cinesinas (Rodriguez et al., 1996),
sofrem fusão Ca2+ dependente (Rodriguez et al., 1997), disponibilizando a
membrana para a formação do vacúolo parasitóforo nascente (Tardieux et al.,
1992).
Recentemente foi proposto um novo mecanismo de entrada do parasita em células não fagocíticas, dependente de PI3 quinase (fosfatidilinositol 3 quinase) e independente de fusão lisossomal. Envolve invaginação da membrana plasmática da célula hospedeira no local de adesão do parasita, seguida da formação de vacúolo enriquecido dos produtos lipídicos da PI3 quinase classe I, fosfatidil-inositol bi- e tri- fosfato (PtdInsP3/PtdIns(3,4)P2) e inicialmente livre
7 adquire marcadores lisossomais (LAMP-1, lysosomal-associated membrane protein 1) (Woolsey et al; 2003).
Segundo Ley et al. (1990) e Andrade et al. (2004), a residência do parasita T. cruzi dentro de compartimentos ácidos lisossomais é necessária para o
estabelecimento de uma infecção intracelular bem sucedida. Além disto, a sobrevivência dos parasitas que invadem células pelo mecanismo independente de lisossomos, depende de sua habilidade de se fundir com lisossomos da célula hospedeira (Woolsey et al., 2003).
As formas tripomastigotas possuem a capacidade de escapar de seus vacúolos parasitóforos devido à exposição ao ambiente ácido do vacúolo lisossomal que dispara a secreção de Tc-Tox (hemolisina, análoga ao fator C9 do sistema complemento dos mamíferos) do parasita e que, por sua vez, promove o rompimento do vacúolo e o escape para o citoplasma (Andrews & Whitlow, 1989; Andrews et al., 1990).
A trans-sialidase do parasita, enzima cuja atividade neuraminidásica remove o ácido siálico de proteínas lisosomais, facilita a ação da Tc-Tox e, portanto favorece o escape do parasita do vacúolo parasitóforo (Hall et al.,
1992) e consequentemente o alcance do citoplasma da célula hospedeira, onde diferencia-se em amastigota e multiplica-se.
A importância da trans-sialidase na invasão e conseqüente infecção pelo T. cruzi ainda não está totalmente esclarecida. Cavallesco & Pereira (1988) citam
8 trans-sialidásica são altamente infectivos enquanto que parasitas desprovidos desta atividade enzimática têm baixa capacidade infectiva em células epiteliais e fibroblastos, e que a adição de pequena quantidade de trans-sialidase na suspensão de parasitas pouco infectivos converte-os ao fenótipo altamente infectivo (Cavallesco & Pereira, 1996).
De acordo com Schenkman et al. (1993), a trans-sialidase de formas
tripomastigotas metacíclicas incorpora o ácido siálico das células de mamíferos em mucinas do parasita. As mucinas e os resíduos de ácido siálico aparentemente não são requisitos na invasão celular por TCT, embora anticorpos monoclonais contra epítopos contendo ácido siálico inibam a adesão do parasita à célula hospedeira (Schenkman et al., 1991b). Em 2006,
Rubin-de-Celis et al., demonstraram que a expressão da trans-sialidase de TCTs em
formas tripomastigotas metacíclicas favorece o escape do parasita do vacúolo parasitóforo.
T. dionisii:
As formas tripomastigotas metacíclicas de T. dionisii são capazes de invadir
e se replicar em uma variedade de células de hospedeiros vertebrados (in vitro). Estas formas permanecem no citoplasma, onde se diferenciam em
amastigotas (formas replicativas). Após uma intensa fase de multiplicação, os amastigotas diferenciam-se em tripomastigotas sanguíneas e são liberados no interstício após lise celular (Molyneux, 1991).
A infectividade de T. dionisii, tanto das formas tripomastigotas metacíclicas
9 células pode variar, como já estudado em culturas de macrófagos peritoniais de camundongo, células CLA 4 (Baker et al., 1972), células fagocíticas humanas
(Thorne et al., 1979), células L de camundongos (Baker & Selden, 1981),
células HeLa, células pulmonares de búfalo (Glauret et al., 1982) e neurônios
de camundongo (Petry et al., 1987).
1.3 Processo de invasão celular: compostos que interferem com a célula
alvo ou com o parasita
Em células fagocíticas profissionais, como macrófagos, foi observado que o tratamento com citocalasina B ou D (compostos que induzem a despolimerização de actina) bloqueia a internalização de epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas de T. cruzi (Alexander, 1975; Nogueira & Cohn,
1976; Meirelles et al., 1982; McCabe et al., 1984; Mortara, 1991; Procópio et al., 1998). Entretanto, em 1979, Kipnis et al. não observaram alteração na
invasão de tripomastigotas em macrófagos tratados com citocalasina B.
Em células não fagocíticas, os efeitos também são diversos. Segundo Henriquez et al. (1981) e Barbosa & Meirelles (1992), a citocalasina B inibe a
invasão de tripomastigotas de T. cruzi em células musculares (MA-103) e
fibroblastos (Vero) já, de acordo com Mortara (1991) e Schenkman et al.
(1991c), a citocalasina D não afeta a invasão de tripomastigotas em células HeLa e MDCK esparsas. Entretanto, aumenta a invasão em células MDCK polarizadas e NRK (Tardieux et al., 1992).
Em 1992, Tardieux et al. afirmam que a despolimerização de actina
10 pela remoção da barreira física, constituída pela actina, permitindo, assim, o acesso de lisossomos ao longo dos microtúbulos, para os sítios de adesão. Compostos que induzem despolimerização dos microtúbulos como colchicina e nocodazol, inibem a invasão de tripomastigotas em células musculares, Vero e NRK (Henriquez et al., 1981; Tardieux et al., 1992). Porém, em células MDCK
polarizadas a invasão por tripomastigotas não foi afetada com nocodazol (Tardieux et al., 1992).
Segundo Procópio et al. (1998), o rompimento dos microfilamentos
(induzido por citocalasina D) e o rompimento dos micotúbulos (induzido por nocodazol) inibem a internalização de formas amastigotas extracelulares de T. cruzi, mas não de tripomastigotas metacíclicas. Além disso, amastigotas
extracelulares e tripomastigotas metacíclicas de T. cruzi utilizam diferentes
mecanismos na invasão de células, sendo dependentes de características particulares de cada uma destas formas e também de cada tipo de célula alvo.
Ainda de acordo com Procópio et al. (1998) após a internalização, tanto
11 Em 2003, Woolsey et al. investigando o mecanismo de entrada de T. cruzi
mediado pelo recrutamento lisossomal, pré trataram células com wortmanina (composto inibidor da PI3 quinase) impedindo a imediata associação do parasita com marcadores de membrana plasmática. O resultado deste tratamento foi o bloqueio da associação primária de LAMP-1 com parasitas invadindo ou parasitas intracelulares, sugerindo que a atividade PI3 quinase da célula hospedeira é requisito para a entrada mediada por lisossomos. Além disso, em outro experimento, imagens de imunofluorescência em seqüência de tempo (time-lapse), mostraram tripomastigotas penetrando ativamente em regiões da membrana plasmática ricas em produtos lipídicos da PI3 quinase. A fração de parasitas que se associaram imediatamente com lisossomos foi mínima (20%) e aproximadamente 50% dos parasitas recém internalizados encontraram-se dentro de vacúolos derivados da membrana plasmática. Os demais estavam em vacúolos ricos em marcadores endossomais (EEA1, early endosome antigen 1).
Segundo Fernandes et al. (2007), a caracterização de vacúolos
parasitóforos (utilizando imunofluorescência) com marcação para LAMP-1 e EEA-1 em células Vero infectadas com T. cruzi revelou, com apenas 30 min de
infecção, 20% das formas tripomastigotas metacíclicas positivas para LAMP-1 e EEA-1. Com 60 min de infecção mais de 60% destas formas são LAMP-1 e EEA-1 positivas e esta porcentagem se mantem até 90 min de infecção. Estes resultados mostram que formas tripomastigotas metacíclicas de T. cruzi
12 lisossomais, reforçando observações feitas anteriormente (Stecconi-Silva et al.,
13
2.0 Objetivos
2.1 Objetivo geral
Obter informações sobre mecanismos de invasão, crescimento intracelular e ultraestrutura de T. dionisii.
2.2 Objetivos específicos
Estudar os mecanismos de invasão utilizados pelo parasita, in vitro, em
culturas celulares;
Descrever a ultra-estrutura das formas evolutivas do parasita utilizando microscopia eletrônica de transmissão;
Identificar atividade trans-sialidásica nas formas infectantes de T. dionisii;
Identificar componentes de superfície das diferentes formas evolutivas do parasita, utilizando dois painéis de anticorpos monoclonais já disponíveis contra T. cruzi, e verificar a existência de possíveis epítopos
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3.0 Material e Métodos
3.1 Cultura celular
Foram utilizadas células COS-7 (fibroblastos de rim de macaco Verde africano) e células LLCMK2 (células epiteliais de rim de macaco Rhesus),
linhagens obtidas no ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, USA), assim como células HeLa (células epiteliais de carcinoma cervical humano) e Vero (células epiteliais de rim de macaco Verde africano), linhagens obtidas no Instituto Adolfo Lutz (São Paulo, SP, Brasil), para manutenção do ciclo de vida do T. dionisii in vitro, avaliação da infectividade das formas deste
parasita e ensaios de imunofluorescência de células infectadas. Estas células foram cultivadas em meio DMEM (Sigma) com 10% de soro fetal bovino (Cultilab) (DMEM-SFB 10%), penicilina (10 U/ml), estreptomicina (25 µg/ml) e gentamicina (40 µg/ml). Foram mantidas em estufa a 37 ºC com atmosfera úmida e 5% de CO2.
3.2 Parasitas
3.2.1 Epimastigotas
A cepa Try cc: 495 de T. dionisii, isolada de morcego da espécie Carollia perspecillata na região de Porto Velho Rondônia, foi gentilmente cedida pela
Dra. Marta M. G. Teixeira e Marta Campaner (Departamento de Parasitologia, ICB - Universidade de São Paulo).
15 de sangue de coelho, acrescido de LIT (Liver Infusion Tryptose) (Cultilab), 2% de glicose e 10% de SFB, mantendo-se em estufa a 28°C.
3.2.2 Tripomastigotas de Cultura de Tecido (TCT)
Foram obtidas através da infecção de células COS-7 e LLCMK2 com
formas tripomastigotas metacíclicas (TM). Com sete a dez dias da infecção, os parasitas (TCT) encontram-se no sobrenadante.
3.2.3 Tripomastigotas metacíclicas (TM)
Foram obtidas através das formas epimastigotas mantidas em meio axênico TC 100 (meio de cultura para células de insetos, da CULTILAB) distribuído em garrafas plásticas de cultura celular. As formas epimastigotas aderem ao fundo da garrafa, dividem-se por fissão binária e formam rosetas. A partir do 7° dia ocorre a diferenciação para TM que soltam-se do fundo e movem-se para o sobrenadante. Os parasitas são purificados das culturas de epimastigotas envelhecidas, através da passagem em coluna de DEAE-celulose, de acordo com o protocolo estabelecido por Teixeira & Yoshida (1986).
3.2.4 Amastigotas Extracelulares (AE)
Foram obtidas através de formas TCT do sobrenadante de células COS-7 e LLCMK2 , infectadas com tripomastigotas metacíclicas. Com sete a dez dias de
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3.3 Anticorpos
Para a identificação de possíveis epítopos compartilhados entre T. dionisii
e T. cruzi, utilizou-se anticorpos monoclonais já disponíveis em nosso
laboratório (1D9, 3B9, 3B2, 4B5, 4B9), produzidos contra formas amastigotas de T. cruzi da cepa G (Barros et al., 1997). Outros anticorpos utilizados foram
produzidos por Solange da Silva Hernandes (biomédica do laboratório do Dr. Renato A. Mortara) contra formas amastigotas de T. cruzi da cepa CL (1A4,
2B6, 3D11, 7C6, 1A2, 4A7, 4D12, 2G5 e 2B2) e contra citoesqueleto de formas TM de T. cruzi cepa G (4D9) (Cotrim et al, 1995, Rocha et al., 2006). Utilizou-se
também o anticorpo monoclonal anti-LAMP-1 (anti-LAMP-1 humano, sobrenadante do clone H4A4, desenvolvido em camundongo pelo DSHB-Development Studies Hybridoma Bank, Iowa, EUA), que reconhece uma glicoproteína de membrana lisossomal da célula hospedeira (Chen et al, 1985)
e o anticorpo policlonal anti-T. dionisii (desenvolvido em camundongos, contra
formas metacíclicas do parasita, no Laboratório de Parasitologia da UNIFESP pela Dra. Nobuko Yoshida e seu aluno de iniciação científica Fernando Maeda).
3.4 Imunofluorescência indireta (IFI)
3.4.1 Anticorpos monoclonais anti-T. cruzi cepa G e anti- T. cruzi cepa CL
Lamínulas contendo células COS-7 infectadas, apresentando ninhos de amastigotas e TCT, assim como lâminas de imunofluorescência contendo parasitas isolados, foram lavadas com solução salina (PBS, phosphate buffered saline solution) e fixadas com formaldeído 3,5% em PBS por 1h; lavou-se três
17 em PGN (PBS com 0,2% gelatina, 0,1% NaN3 em PBS). As lamínulas foram
então incubadas com anticorpos monoclonais (fluídos ascíticos diluídos 1:50 em PGN) por 1h a temperatura ambiente; lavou-se três vezes com PBS e a reação foi revelada com anti-IgG de camundongo conjugado com FITC (Sigma), diluído 1:100 em PGN acrescido de 0,4 µg/ml de faloidina-TRITC para marcação de filamentos de actina e 10µM de DAPI (cloridrato de 4’,6-diamindino-2-fenilindol, Molecular Probes, Eugene, Oregon, EUA) para marcação de DNA. Após três lavagens com PBS, as lamínulas foram montadas em lâminas de vidro com glicerol tamponado com 0,1M de Tris pH 8.6 e 0,1% de p-fenilenodiamina (Sigma). As lamínulas foram examinadas em microscópio
confocal (BioRad 1024-UV) acoplado a um microscópio Zeiss Axiovert 100, usando objetivas de 63x ou 100x, PlanApocromáticas N.A. 1.4 de imersão em óleo, com contraste de fase ou contraste interferencial de Nomarski (DIC). As imagens foram processadas utilizando o programa NIH-ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/).
3.4.2 Duplas marcações com anticorpos monoclonais anti-T. cruzi cepas
G e CL
Em lamínulas contendo células COS-7 infectadas apresentando ninhos de amastigotas, foram realizados ensaios de dupla marcação com os anticorpos monoclonais citados anteriormente (item 3.3).
18 com anti-IgG de camundongo-Alexa Fluor 568 (vermelho). Estes conjugados isotipo-específicos foram adquiridos da Molecular Probes. As duplas foram: 4B5 (IgG1) + 4B9 (IgG3); 4B5 (IgG1) + 3B9 (IgM); 4B9 (IgG3) + 3B9 (IgM); 4B9 (IgG3) + 2G5 (IgG1); 3B9 (IgM) + 2G5 (IgG1); 2B6 (IgG2a) + 4B9 (IgG3) e 2B6 + 3B9 (IgM).
As reações de imunofluorescência foram realizadas como descrito anteriormente (item 3.4.1), com a diferença que neste ensaio utilizou-se dois anticorpos e, portanto, dois conjugados. As lamínulas foram examinadas em microscópio confocal (como citado no item 3.4.1).
3.4.3 Ensaio de invasão utilizando anticorpo monoclonal anti-LAMP-1
Células COS-7 foram plaqueadas sobre lamínulas de vidro estéreis em placas de 24 poços (500 µl contendo 5 X 104 células em cada poço) e deixadas
overnight a 37°C em estufa contendo 5% de CO2. Foram, então, infectadas
19 com glicerol tamponado com 0,1M de Tris pH 8.6 e 0,1% de p-fenilenodiamina
(Sigma). Em seguida foram examinadas em microscópio confocal (como citado no item 3.4.1).
Para a realização gráfica da cinética de formação de vacúolos parasitóforos LAMP-1 positivos por tempo de infecção, o número de parasitas LAMP-1 positivos foi contado em 100 células (em duplicata) em microscópio convencional de fluorescência. Foram realizados quatro experimentos independentes.
3.4.4 Ensaio para visualização de parasitas no interior da célula
hospedeira utilizando anticorpo policlonal anti-T. dionisii
Garrafas de cultura de células LLCMK2 não confluentes foram infectadas
com formas tripomastigotas metacíclicas, mantidas por 96 horas a 37 °C em estufa contendo 5% de CO2. Após este período, foram lavadas, tripsinizadas,
plaqueadas sobre lamínulas de vidro estéreis em placas de 24 poços (500 µl contendo 1,5 X 105 células em cada poço) e deixadas overnight para total
adesão. Foram, então, lavadas para a retirada do meio de manutenção e fixadas com formaldeído 3,5% em PBS por 1h. Em seguida permeabilizou-se com saponina 0,1% (Sigma) em PGN. Incubou-se as lamínulas com anti-T. dionisii diluído 1:40 em PGN por 1h à temperatura ambiente. Lavou-se três
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3.5 Ultra-estrutura
Informações sobre a ultra-estrutura das formas evolutivas do parasita foram obtidas por microscopia de transmissão convencional no Centro de Microscopia Eletrônica da UNIFESP-EPM, com a colaboração da Dra. Edna F. Haapalainen.
Os parasitas (epimastigotas, tripomastigotas metacíclicos e tripomastigotas de cultura de tecido), em seus respectivos meios de manutenção e células LLCMK2 infectadas foram centrifugados a 2500 x g por 5
21 ultramicrótomo e os cortes ultrafinos depositados em grades de níquel cobertas com formvar e carbono, corados com acetato de uracila 1% e citrato de chumbo 2%, para observação ao microscópio de transmissão JEM 1200EX II (Jeol), operado a 80kV.
3.6 Ensaio para a detecção do efeito de diferentes compostos na invasão
celular por formas tripomastigotas metacíclicas de T. dionisii
Células COS-7 foram plaqueadas sobre lamínulas de vidro estéreis em placas de 24 poços (500 µl contendo 0,5 X 105 células em cada poço) e
deixadas overnight a 37°C em estufa contendo 5% de CO2. Os compostos
utilizados foram Citocalasina D (Sigma), Wortmanina (Sigma), e Nocodazol (Sigma), preparadas na concentração final de 2 µM em DMEM. As lamínulas contendo células (em duplicata) foram incubadas com os respectivos compostos por 1h.
22 1000x. Os parasitas intracelulares presentes no citoplasma das células, que neste procedimento de fixação e coloração ficam evidenciados com um halo ao seu redor (vacúolo parasitóforo), foram contados em 200 células em duplicata. Foram realizados três experimentos independentes.
3.7 Análise da atividade trans-sialidásica (TS) dos parasitas
A atividade trans-sialidásica das amostras foi determinada como descrito por Schenkman et al. (1992). O ensaio foi realizado com extratos de parasitas
congelados (-70°C) a seco em uma concentração de 108 parasitas por alíquota.
As alíquotas foram descongeladas no dia do ensaio e adicionou-se solução de lise (NP-40 2% diluído em PBS, EGTA-0,5 mM, MgCl2 e inibidores de protease:
PMSF 1mM, iodoacetamida 1mM, leupeptina 25 µg/ml, antipaína 25 µg/ml e aprotinina 25 µg/ml) aos parasitas por 10 minutos. Para separar as proteínas de membrana dos restos celulares, os tubos de microcentrífuga contendo os parasitas em solução de lise, foram centrifugados por 15 minutos a 10.700 x g. O sobrenadante foi, então, recolhido e dividido em duas alíquotas de 10 µl, para a realização da metodologia em duplicata. Foram adicionados, às alíquotas da enzima (trans-sialidase) 5 µl de HEPES (0,2M, pH 7), 5 µl de sialil-lactose (10mM), 5 µl de D-glicose-1-[14C]-lactose-1/50 (60mCi/mmol-1; 0,36
23 colunas foram, então, lavadas com 8 ml de água para a remoção da [14
C]-lactose livre. O produto [14C]-sialil-lactose foi eluído com 1 ml de formato de amônio 1M e a radioatividade quantificada por cintilador (1600 TR, Packard, EUA). Foram realizados três experimentos, cada um deles em duplicata.
3.8 Análise estatística
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4.0 Resultados
Infecções in vitro de células COS-7 ou LLCMK2 semiconfluentes com
formas tripomastigotas metacíclicas (na proporção de 50 parasitas/célula) geraram após 3 a 4 dias vários ninhos com alguns amastigotas que se dividiram por fissão binária, e de um dia para o outro deram origem a células repletas destas formas. Aproximadamente 7 dias após a infecção, os amastigotas transformaram-se em tripomastigotas (TCT) e romperam a membrana celular sendo liberados no sobrenadante da cultura (1x107 parasitas). Estes TCT por sua vez reinfectaram as células e a cada 3 dias foram liberados mais TCT no sobrenadante desta cultura (1x 107 parasitas a cada 3 dias).
Neste trabalho células HeLa, Vero e Hep2 semiconfluentes, foram
infectadas in vitro (na proporção de 50 parasitas/ célula) (resultados não
mostrados). Porém, surgiram poucos ninhos sendo o rendimento da infecção insatisfatório para a obtenção de parasitas em quantidade suficiente para a realização dos experimentos subsequentes.
4.1 Distribuição de epítopos reconhecidos por anticorpos monoclonais
anti-amastigotas de T. cruzi das cepas G e CL durante o ciclo intracelular
de T. dionisii e em formas isoladas do parasita
25 O anticorpo monoclonal 1D9 (Tabela 1) não marcou amastigotas ou tripomastigotas de T. dionisii tanto em parasitas intracelulares (figuras 1A e B)
como em parasitas isolados (amastigotas extracelulares e tripomastigotas de cultura de tecido presentes em sobrenadante de culturas celulares infectadas) (resultado não mostrado).
A distribuição da fluorescência obtida com o anticorpo monoclonal 3B9 (Tabela 1) apresentou um padrão de marcação de superfície, em alguns casos evidenciando apenas o contorno das formas amastigotas intracelulares (figuras 2A e B) e amastigotas extracelulares (figuras 3E e F). No caso das formas amastigotas intracelulares ocorreu diferença de intensidade entre ninhos de parasitas (figuras 2A e B). Nos tripomastigotas metacíclicos isolados, a marcação foi difusa pelo parasita (figuras 5A e B). Alguns parasitas isolados não são marcados (figuras 3E e F; 5C e D). Em epimastigotas a marcação foi superficial evidenciando o contorno dos parasitas (como em amastigotas extra e intracelulares), sendo que em alguns casos aparece também uma marcação na região do cinetoplasto, além de parasitas não marcados (figuras 4E e F).
O anticorpo monoclonal 4B5 (Tabela 1), além de um padrão de fluorescência difuso na superfície de amastigotas em processo de divisão, apresentou uma marcação bastante característica pontual nos pólos de amastigotas intracelulares (figuras 1C e D) assim como de amastigotas extracelulares (figuras 3A e B). Em epimastigotas a marcação mostra-se pontual próxima ao cinetoplasto (figuras 4A e B).
26 contorno dos parasitas) (tabela 1) (figuras 1E e F), também com diferenças de intensidade entre ninhos.
O anticorpo monoclonal 4D9 (tabela 1) reagiu com tripomastigotas de cultura de tecido (TCT), tripomastigotas metacíclicos isolados, amastigotas intracelulares (resultado não mostrado) e amastigotas extracelulares, evidenciando um padrão de marcação na região de contato do flagelo com o corpo celular de TCT (figuras 2C e D), metacíclicos (figuras 5E e F) e epimastigotas (figuras 4C e D).
O anticorpo monoclonal 3B2 (tabela 1) reagiu muito fracamente apenas com a superfície de TCT de T. dionisii e alguns parasitas não foram marcados
(figuras 2E e F).
As análises da distribuição de epítopos definidos por anticorpos monoclonais anti-T.cruzi cepa CL revelaram forte reação positiva de
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Figura 1: Distribuição de epítopos definidos pelos monoclonais 1D9, 4B5 e 4B9 em formas
intracelulares de T. dionisii. Células COS-7 96hs após infecção com formas tripomastigotas
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Figura 2: Distribuição de epítopos definidos pelos monoclonais 3B9, 4D9 e 3B2 em formas
intracelulares de T. dionisii. Células COS-7 96hs após infecção com formas tripomastigotas
