A
LMIR
A
SSIS
B
RAGA
P
URIFICAÇÃO E
C
ARACTERIZAÇÃO DE
P
ROTEINASE
E
XTRACELULAR PRODUZIDA POR
Candida krusei AP176.
Tese apresentada ao Departamento de
Microbiologia do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de
Minas Gerias, como requisito parcial à
obtenção do título de Doutor em
Ciências Biológicas.
Área de concentração: Microbiologia.
Orientador: Valter Roberto Linardi
Lista de figuras
Figura 1 - Porcentagem de diferentes enzimas vendidas no mundo
Figura 2. (A) Efeito do pH do meio de cultivo na produção de proteinases
extracelulares (A) e no crescimento (B) de Candida krusei AP176. O meio
de cultivo foi tamponado em valores de pH 3,0, 5,0 e 7,0 e as atividades
proteolíticas determinadas em pH 5,0. O crescimento foi determinado pela
leitura espectrofotométrica DO
480. Uma unidade proteolítica (UP) é a
quantidade de proteinase necessária para gerar uma DO
280de 0,01/hora, nas
condições do experimento.
Figura 3 - Perfil cromatográfico em coluna de gel filtração Sephacryl-S100.
Figura 4 - Eletroforese SDS-PAGE (10%), copolimerizado com substrato
protéico. A atividade proteolítica foi detectada em gel, contendo 0,023% de
gelatina, sendo visualizadas como bandas claras contra o fundo corado em
azul escuro.
Figura 5 - Perfil de cromatografia em coluna Mono–Q HR 5/5, equilibrada
com tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,5. A eluição foi realizada em
gradiente linear de 0 a 1,0 M de NaCl no mesmo tampão a uma fluxo de 0,5
mL/minuto. A proteinase foi eluída em gradiente de NaCl de 0,2 M.
Proteínas e atividade proteolítica.
Figura 6 - Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE (12,5%).
Figura 7 - Efeito da temperatura na atividade proteolítica da proteinase PI
de Candida krusei AP176. Uma unidade de atividade proteolítica é definida
como a quantidade de enzima necessária para gerar uma DO
280de 0,01 por
hora, nas condições do experimento como descrito em materiais e métodos.
Figura 8 - Efeito do pH na atividade proteolítica da proteinase PI de
Candida krusei AP176. Uma unidade de atividade proteolítica é
definida
como a quantidade de enzima necessária para gerar uma DO
280de 0,01 por
hora, nas condições do experimento como descrito em materiais e métodos.
Figura 9 - Temperatura de estabilidade da proteinase PI de C. krusei AP176.
A proteinase foi incubada por 1 ou 2 horas nas temperaturas de 15, a 50
oC
antes da medida da atividade proteolítica. Atividade relativa é expressa em
porcentagem da atividade proteolítica máxima obtida no tempo zero de
incubação da enzima, dada como valor de 100%.
Figura 10 - pH de estabilidade da proteinase PI de C. krusei
AP176. A
proteinase foi mantida em valores de pH de 2,0 a 9,0 por 12 horas antes da
medida da atividade proteolítica. Atividade relativa é expressa em
porcentagem da atividade proteolítica máxima obtida no tempo zero de
incubação da enzima, dada como valor de 100%.
43
45
47
Lista de tabelas
Sumário
1 - INTRODUÇÃO...
1
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 3
2.1 – As proteinases... 3
2.2 – Importância industrial das proteinases... 4
2.3 – Proteinases de leveduras... 8
3 –OBJETIVOS... 16
3.1 – Objetivos geral... 16
3.2 - Objetivos específicos...
16
4 – MATERIAIS E MÉTODOS... 17
4.1 - Amostra de levedura... 17
4.2 – Manutenção da levedura... 17
4.2.1 – Manutenção e repique... 17
4.3.2 – Meio de produção... 19
4.4 – Determinação da atividade proteolítica... 20
4.5 – Dosagem de proteína... 21
4.6 – Purificação da proteinase... 21
4.6.1 – Cromatografia de filtração... 21
4.6.2 – Cromatografia de troca iônica... 22
4.6.3 – Eletroforese em gel de poliacrilamida copolimerizado com substrato
protéico...23
4.7 – Caracterização da proteinase... 24
4.7.1 – Determinação da massa molecular... 24
4.7.2 – Efeito da temperatura e do pH na atividade proteolítica... 24
4.7.3 – Efeito da temperatura e pH de estabilidade da proteinase PI... 25
5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO... 26
5.1 – Produção de proteinases... 26
5.2 – Purificação da proteinase PI... 28
5.3– Cromatografia de filtração... 31
5.4– Cromatografia de troca iônica... 34
5.5– Eletroforese em gel de poliacrilamida, copolimerizado com gelatina... 36
5.6- Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS – PAGE)... 38
5.8– Efeito da temperatura na atividade proteolítica... 42
5.9- Efeito do pH na atividade proteolítica... 44
5.10 - Efeito da temperatura e do pH na estabilidade da proteinase PI... 46
6 – CONCLUSÕES... 7 – SUMMARY...
49
50
9 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 52
LISTA DE FIGURAS... i
LISTA DE TABELAS... iii
SUMÁRIO... iv
Resumo
As enzimas proteolíticas são de grande valor comercial, sendo amplamente
utilizadas nas indústrias, representando 59% de todas as enzimas comercializadas
no mundo. Elas têm uma grande variedade de aplicações industriais, sendo utilizado
na fabricação de alimentos, bebidas, papel, detergentes, nos produtos farmacêuticos
e no processamento de couros, além de ter um importante papel em pesquisas
básicas. Para as várias aplicações industriais, tem-se utilizado proteinases de
microrganismos. Neste trabalho foi estudada a produção, purificação e
caracterização da proteinase extracelular PI da levedura Candida
krusei AP176
isolada de frutos do amapá (Parahancornia amapa) uma árvore da floresta
amazônica. C. krusei AP176 produziu quatro proteinases extracelulares em meio
líquido YCB (Yeast Carbon Base) suplementado com caseína 0,01%. As
proteinases foram denominadas de PI, PII, PIII e PIV. A proteinase PI foi
selecionada para este estudo, a qual foi purificada do sobrenadante do meio de
cultivo em dois passos, utilizando-se de cromatografia em coluna de gel filtração e
coluna de troca iônica. A enzima apresentou massa molecular de aproximadamente
36 KDa, estimada em eletroforese de gel de poliacrilamida na presença de SDS
(SDS-PAGE). A proteinase PI apresentou atividade proteolítica na faixa de
temperatura e pH que variaram de 10 a 50 e 2,0 a 9,0 respectivamente. A enzima
apresentou boa estabilidade térmica mantendo 98,5% de atividade entre 15 e 30o
Aproximadamente 98,6% da sua atividade foi mantida quando incubada em pH 4,0
(tampão citrato de sódio 50 mM) por um período de 12 horas em temperatura
ambiente (24o
C 2o
C). O valor ótimo de pH e temperatura de atividade proteolítica
da proteinase produzida por C. krusei AP176 foi de 4,0 e 25
oC, respectivamente. Os
maiores valores de atividade foram em valores de pH ácido (pH 3,0 a 5,0) em uma
faixa de temperatura de 20 a 30o
C. As propriedades físico-químicas apresentadas
pela proteinase PI podem, favorecer possíveis aplicações desta enzima nos diversos
