MARIA FERNANDA LIMA VILLAÇA
-
CARVALHO
EFEITO NA OSSEOINTEGRAÇÃO DE UM NOVO MÉTODO
DE NANOTEXTURIZAÇÃO DE SUPERFÍCIE DE IMPLANTES
ATRAVÉS DE ANODIZAÇÃO
MARIA FERNANDA LIMA VILLAÇA - CARVALHO
EFEITO NA OSSEOINTEGRAÇÃO DE UM NOVO MÉTODO DE NANOTEXTURIZAÇÃO DE SUPERFÍCIE DE IMPLANTES ATRAVÉS DE
ANODIZAÇÃO
Tese apresentada ao curso de Odontologia do Instituto de Ciência e Tecnologia, UNESP - Univ Estadual Paulista, Campus de São José dos
Campos, como parte dos requisitos para obtenção do título de DOUTOR
pelo Programa de Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área
Patologia.
Orientadora: Profa. Adj. Mari Eli Leonelli de Moraes Coorientadora: Profa. Dra. Luana Marotta Reis de Vasconcellos
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Prof. Achille Bassi e Seção Técnica de Informática, ICMC/USP com adaptações - STATi e STI do ICT/UNESP. Dados fornecidos pelo autor.
AUTORIZAÇÃO
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, desde que citada a fonte.
São José dos Campos, 29 de Janeiro de 2016 E-mail: mfervillaca@hotmail.com
Assinatura: ______________________________
Villaça-Carvalho, Maria Fernanda Lima
Efeito na oseointegração de um novo método de nanotexturização de superfície de implantes através de anodização / Maria Fernanda Lima Villaça-Carvalho. - São José dos Campos : [s.n.], 2016.
106 f. : il.
Tese (Doutorado em Biopatologia Bucal) - Pós-graduação em Biopatologia Bucal - Instituto de Ciência e Tecnologia de São José dos Campos, UNESP - Univ Estadual Paulista, 2016.
Orientadora: Mari Eli Leonelli de Moraes
BANCA EXAMINADORA
Prof. Adj.Mari Eli Leonelli de Moraes (Orientadora)
Instituto de Ciência e Tecnologia UNESP - Univ Estadual Paulista
Campus de São José dos Campos
Prof. Dr. João Paulo Barros Machado
Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais-INPE
Laboratório Associado de Sensores e Materiais, LAS
Prof. Dr.Natal Nerímio Regone
Curso de Engenharia de Telecomunicações
UNESP - Univ Estadual Paulista
Campus Experimental de São João da Boa Vista
Prof. Adj. Maria Aparecida Neves Jardini
Instituto de Ciência e Tecnologia UNESP - Univ Estadual Paulista
Campus de São José dos Campos
Prof. Ass. Dr. Sergio Lucio Pereira de Castro Lopes Instituto de Ciência e Tecnologia
UNESP - Univ Estadual Paulista
Campus de São José dos Campos
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por todos os planos maravilhosos que teve e tem para mim; pela minha família e todas as pessoas que coloca em minha vida. Agradeço por todas as oportunidades, e por me ajudar a manter a mente sã mesmo nos momentos de dificuldade. Agradeço pelo dom da vida, por ser cercada de amor, e por confiar tarefas tão lindas a mim!
Ao meu marido, Rodrigo, que sempre acreditou em mim. Talvez tenha percebido mais do que eu, o quanto esta etapa e conquista seriam importantes para mim. Meu companheiro, incentivador, meu amor! Obrigada por me escolher, obrigada por confiar a mim “o projeto”, sem dúvida, mais lindo e desafiador de todos!!! Palavras não serão suficientes para descrever tudo o que significa para mim... Te amo!
Aos meus pais, Paulo César e Lêda, por todas as batalhas para que nunca faltasse nada a mim e meu irmão; sendo exemplos de retidão, trabalho, dedicação, honestidade.... Mas acima de tudo, muito obrigada pelos valores passados, por todo amor dedicado a nós, por toda torcida, por estarem sempre dispostos a ajudar. Amo vocês!
Ao meu irmão José Rodolfo, meu melhor amigo! Dizem que irmãos brigam, graças a Deus, esta nunca foi nossa realidade. Muito obrigada pela torcida, por sempre saber como me alegrar, por ser esta pessoa tão especial. Amo tanto que queria mais irmãos, aí você fez isso e me trouxe uma irmã, sua esposa Anahi. Agradeço a Deus por tê-la em nossa família,
e por ser essa pessoa tão boa e meiga, que sei que está torcendo por mim nesta nova etapa!
otimismo, confiança em Deus e seguiu em frente; sem dúvida foi uma grande lição para mim. Muito obrigada por aceitar me orientar, por acreditar nesta pesquisa, nesta idéia; sem o seu “sim” não teria chegado até aqui.
À minha co-orientadora, a Professora Luana Marotta Reis de
Vasconcellos, por me aceitar quando fui procurá-la. Obrigada por acreditar
e confiar em mim, por estar sempre disposta a ajudar, por dar todo suporte e incentivo em todos os momentos. Seu entusiasmo e amor pela pesquisa são exemplos para mim.
À Professora Heloisa Andrea Acciari por todo empenho e disposição nesta pesquisa, pela confiança em mim, e por ter me recebido sempre tão disposta.
Ao Professor Natal Nerímio Regone nas etapas de anodização, também sempre disposto a colaborar.
Ao Professor João Paulo Barros Machado por sempre me receber tão bem e por permitir as análises realizadas no Inpe.
A todos os amigos conquistados nestes anos de Pós Graduação. Tivemos momentos de muito estudo, preocupação, porém de muita amizade e divertimento. Levarei estes momentos para eternidade e todos em meu coração. Sei que cada um segue seu rumo, mas espero sempre poder reecontrá-los!
Ao Programa de Pós-Graduação em Biopatologia Bucal, em especial a
Profª Adj. Juliana Campos Junqueira, coordenadora do curso, pela amizade, exemplo profissional e dedicação a todos os discentes.
Aos secretários do Programa de Pós-graduação, pela atenção e auxílio
durante esses anos.
A todos os funcionários do Instituto de Ciência e Tecnologia, Campus São José dos Campos – UNESP, pela ajuda sempre que solicitados.
À Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” Instituto de Ciência e Tecnologia, Campus São José dos Campos, na pessoa do Diretor Profº Titular Estevão Tomomitsu Kimpara e da vice-diretora Profa
Adj. Rebeca Di Nicoló, pela oportunidade de realização do curso de graduação e pós-graduação, por todo conhecimento adquirido, e
principalmente por tantos momentos inesquecíveis.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pela concessão da bolsa de Doutorado.
SUMÁRIO
RESUMO...8
ABSTRACT ... 15
1 INTRODUÇÃO ... 11
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 14
2.1. Osseointegração ... 14
2.1.1 Osteoindução, osteocondução, osteogênese e osseointegração ... 17
2.2 Rugosidade ... 18
2.3 Tipos de Superfície ... 19
2.3.1 Superfície Usinada ... 21
2.3.2 Adição ... 22
2.3.2.3 Superfícies Biomiméticas ... 23
2.3.3 Subtração ... 24
2.3.4. Nanoestruturas ... 26
2.3.4.1 Anodização ... 27
2.3.5 Estudos que compararam diferentes superfícies de implantes ... 30
2.4 Histomorfometria ... 36
2.4.1 Microtomografia Computadorizada (µTC) ... 37
2.4.1.1 Estudos com µTC ... 38
3 DETALHAMENTO METODOLÓGICO ... 41
3.1 Implantes ... 41
3.2 Procedimento de Anodização ... 42
3.3 Caracterização dos Implantes ... 44
3.4 Procedimentos Cirúrgicos ... 46
3.5 Anestesia ... 46
3.6 Instalação dos implantes ... 46
3.8 Análise por Radiografia periapical (RP) ... 49
3.9 Avaliação por Microtomografia Computadorizada (µTC) ... 51
3.10 Teste por remoção de torque ... 55
3.11 Avaliação da citotoxicidade por MTT ... 56
3.11.1 Procedimento de cultura de células ... 56
3.11.2 Isolamento de células da linhagem osteoblástica e desenvolvimento de cultura primária osteogênica ... 57
3.11.3 Determinação da viabilidade celular (ensaio de citotoxicidade) .... 57
3.12 Análise Estatística ... 58
4 ARTIGO ... 59
4.1 Effect on osseointegration of a new method of nano-texturing implant surface by Anodization ... 59
5 REFERÊNCIAS ... 96
Villaça-Carvalho MFL. Efeito na oseointegração de um novo método de
nanotexturização de superfície de implantes através de anodização. [tese] São José dos Campos (SP): Instituto de Ciência e Tecnologia, UNESP
-Univ Estadual Paulista; 2016.
RESUMO
A Implantodontia é uma das áreas da Odontologia que mais tem evoluído nas últimas décadas. Diversos estudos são desenvolvidos na intenção de otimizar o processo de osseointegração utilizando a nanotopografia na superfície dos implantes. Atualmente o processo de anodização da superfície vem se destacando entre estas técnicas. Desta forma, o objetivo nesta pesquisa foi obter nano rugosidades e fase de anatase em implantes odontológicos de Titânio, buscando a otimização da osseointegração. Sessenta implantes foram caracterizados quanto à morfologia, por meio de microscopia de força atômica (AFM) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV); quanto à composição química, por análise por detector de espectrometria por espalhamento de energia (EDS) e Espectroscopia Raman; e por fim, quanto ao potencial de corrosão, pela análise de impedância eletroquímica (EIE). A osteogênese,
in vivo, foi comparada por Radiografia periapical (RP), Microtomografia Computadorizada (µTC) e teste de remoção por torque reverso; e, a análise in vitro, foi realizada por teste de citotoxicidade por MTT [(brometo de 3-4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliol]. Os implantes foram
divididos em: G1 (controle); Grupo 2 (jateado); Grupo 3 (anodizado
necessidade de maior força de remoção dos implantes anodizados. No teste por MTT, os implantes experimentais foram atóxicos células. Conclui-se que a anodização utilizada neste estudo afetou positivamente
a composição química e estrutural do filme de TiO2, melhorando suas características biológicas na osseointegração.
.
Palavras-chave: Anodização. Microtomografia. Nanotecnologia.
Villaça-Carvalho MFL. Effect on osseointegration of a new method of nano
texturing implant surface by anodization [doctorate thesis]. São José dos Campos (SP): Institute of Science and Technology, UNESP - Univ
Estadual Paulista; 2016.
ABSTRACT
The Implantology is one of the areas of dentistry that has most evolved in recent decades. Many studies have been developed with the intention of optimizing the osseointegration process using nanotopography on the surface of the implants. Currently the surface of the anodizing process has stood out among these techniques. Thus, the aim of this research was to obtain nano roughness and anatase phase in dental Titanium implants, seeking for the optimization of the osseointegration. Sixty implants were characterized for morphology by atomic force microscopy (AFM) and Scanning Electron Microscopy (SEM); in chemical composition, by mass spectrometry detector energy scattering (EDS) and Raman spectroscopy; and finally, as the potential for corrosion, the electrochemical impedance analysis (EIS). Osteogenesis in vivo was compared by Periapical Radiography (PR), Computed Microtomography (μTC), removal reverse torque test; and in vitro analysis, it was performed by MTT cytotoxicity assay [(bromide 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-difeniltetrazoliol]. The
implants were divided into G1 (control); Group 2 (sandblasted); Group 3 (anodized-experimental). Each rabbit received an implant of each group in
the right and left tibias and five rabbits were euthanized 2 and 6 weeks after surgery. The implants of the right tibia underwent PR and μTC; and the left tibia, the reverse torque test and MTT cytotoxicity assay. AFM and SEM confirmed the presence of nano roughness on the surface in G3; EDS analysis and Raman spectroscopy showed increased TiO2 film layer and obtainment of anatase G3. In PR, no implant presented radiolucent halo. In μTC, G3 has always been higher than the other groups in the observed parameters: BV, BV / TV, Tb.Th. In the reverse torque test, It was required greater removal force of anodized implants. In the MTT test, the experimental implants were nontoxic to cells. It was conclude that the anodizing process used in this study positively affected the chemical and structural composition of TiO2 film, improving their biological characteristics at osseointegration.
1 INTRODUÇÃO
O uso de implantes como forma de tratamento odontológico tem sido amplamente utilizado nos últimos anos (Chilvarquer et al., 2005), e visando acelerar o processo de osseointegração, atualmente, há uma grande preocupação com a topografia de superfície destes (Zuo et al., 2013; Lai et al., 2009; Lang et al., 2011). Após a implantação de um biomaterial no corpo, inicialmente ocorre a interação das células com a superfície deste; portanto, a avaliação da interface substrato-célula é crucial para a concepção de um implante com sucesso
(Shokuhfar et al., 2014).
Buscando otimizar o processo de osseointegração, diversos estudos têm sido desenvolvidos para avaliar os efeitos de modificações na superfície dos implantes neste microambiente. Diversos autores observaram que estas modificações podem ser capazes de acelerar e melhorar a qualidade da osseointegração, resultando em maior deposição óssea e redução do período de reparo (Shokuhfar et al., 2014; Zuo et al., 2013; Polizzi et al., 2013; Vasconcellos et al., 2012; Lai et al., 2009; Wennerberg et al., 2009; Lang et al., 2011; Stanford, 2010; Buser et al., 2004).
energia de superfície, maior adsorção de proteínas; que resultarão em maior adesão celular (Shokuhfar et al., 2014; Doroudian et al., 2013; Yu et al., 2010; von der Mark et al., 2010). Segundo Yao et al., (2008), as características nanométricas podem simular o ambiente celular. A superfície deve funcionar adequadamente nos momentos iniciais do processo até anos mais tarde suportando as forças da mastigação, isto é, a superfície deve atrair biomoléculas adequadas para a resposta óssea e ao mesmo tempo transmitir satisfatoriamente a tensão na interface osso
-implante por vários anos (Meirelles, 2010).
O interesse pela obtenção da nanotopografia por meio do processo de anodização vem crescendo, uma vez que esta técnica exibe adequada modificação de superfície, resultando em um efeito positivo sobre as atividades celulares (Li et al., 2012; Adamek, Jakubowicz, 2010; Yu et al.,, 2008), além de ser um processo de baixo custo e eficiente reprodutibilidade. De acordo com Williamson et al., (2013), a anodização é um método eletroquímico de modificação de superfície que melhora a bioatividade de implantes ortopédicos e dentários de titânio. Assim, a superfície anodizada exibe uma topografia única com boa capacidade para reter líquidos e tecido ósseo (Al-Nawas et al., 2008).
O processo de anodização pode gerar nano rugosidades e/ou poros na superfície dos implantes, além de permitir a formação de um filme de dióxido de Titânio (TiO2) mais cristalino, favorecendo o crescimento de células osteoblásticas em diferentes orientações, resultando num processo de osseointegração mais eficaz. Estudos demonstram que a anodização é utilizada para aumentar e estabilizar a espessura do filme TiO2 (Habazaki et al., 2003; Al-Nawas et al., 2008) que
Ratner, 2013; Doroudian et al., 2013; Lavenus et al., 2012; Li et al., 2012; Niinomi, 2008; El-wassefy et al., 2014).
O objetivo da maioria das pesquisas na área da Implantodontia é avaliar, comparar ou quantificar a neoformação óssea na interface osso-implante. A análise histomorfométrica da interface osso
-implante pode ser realizada por diferentes técnicas de observação como a microscopia óptica, a microscopia eletrônica de varredura e a µCT (Park et al., 2005).
Neste contexto, propõe-se comparar a neoformação
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Osseointegração
O conceito de Osseointegração fundamentado pelo professor Branemark, consiste em “uma conexão direta, estrutural e funcional entre o osso vital organizado e a superfície de um implante de titânio capaz de receber carga funcional” (Branemark et al., 1969).
O termo osseointegração foi usado inicialmente para descrever o contato direto entre o osso vivo e um implante sem a interposição de camadas de tecido fibroso (Branemark et al., 1977), e em nível de microscopia óptica (Albrektsson et al., 1981) (Figura 1).
Figura 1-Esquema demonstrativo, comparando fixação do dente ao osso alveolar e do
implante ao tecido ósseo alveolar (Instituto do Sorriso, 2010).
Ligamento Periodontal
Dente Implante
Coroa Coroa
Gengiva Gengiva
Osso Osso
O objetivo inicial dos estudos era analisar as reações de injúria e reparação dos tecidos em diversas regiões anatômicas de diferentes animais, com atenção especial para a função e estrutura microvascular do tecido ósseo nesses processos. As pesquisas iniciais foram feitas por meio da observação da regeneração da medula óssea, em fíbula de coelhos, que era exposta para a instalação de uma objetiva, feita em titânio, de um microscópio óptico para análise in situ e in vivo. Por meio de uma técnica cirúrgica delicada, a cicatrização dos vasos sanguíneos da medula foi estudada, após o osso cortical ter sido preparado. Assim, foi possível a realização de diversos estudos in vivo do osso cortical, medular e dos tecidos articulares com ênfase na reação dos tecidos a diversos tipos de trauma e, consequentemente, as diversas possibilidades para minimizar tais danos. Esses estudos sugeriram a possibilidade de ancoragem óssea. O objetivo seguinte era estabelecer um conjunto de procedimentos clínicos para a colocação de próteses que permitissem uma cicatrização completa do tecido ósseo e que permanecessem estáveis ao longo dos anos (Branemark, 1983).
natureza da composição subsequente do filme de proteínas que é adsorvido na superfície do implante e guiam a osteogênese. Após a aposição das células sanguíneas sobre a superfície do implante, uma matriz óssea mineralizada é formada, a partir da qual ocorre o processo de formação óssea. O osso neoformado passa por um processo de remodelação, que cria em sítios específicos, uma interface osso-implante
compreendida entre a matriz mineralizada e um osso mais velho. Na opinião do autor, estes processos são extremamente dependentes da topografia do implante.
Figura 2-Fotomicrografia de secção longitudinal de um implante mostrando um passo de
2.1.1 Osteoindução, osteocondução, osteogênese e osseointegração
O contato inicial da superfície de titânio ocorre assim que o implante é instalado, devido à presença de coágulo sanguíneo. Desta forma, há uma interação inicial caracterizada pela adesão de plaquetas e fibrinogênio na superfície do implante, a qual apresenta camada superficial de TiO2. Em seguida, ocorre a adesão de células osteogênicas, resultando na formação de uma rede de fibrina. Após a aposição de células sobre a superfície do implante, a deposição e posterior mineralização de matriz óssea é iniciada (Davies, 1998).
O processo de cicatrização do tecido ósseo, após a instalação de um implante, pode ser dividido basicamente em três etapas: osteocondução, neoformação e remodelação óssea. Na fase de osteocondução, a reparação da ferida cirúrgica começa logo após a instalação do implante por meio da formação do coágulo (Davies, 1998).
De acordo com Carr et al., (1997), uma vez que a função primária dos implantes orais é a de promover suporte e estabilidade funcional para a substituição de elementos dentários perdidos, torna-se
importante a compreensão da biologia de formação e remodelação do tecido ósseo ao redor dos implantes.
fibrinólise do coágulo, um tecido conjuntivo frouxo é formado, tecido este que serve de guia para a angiogênese. A capacidade de ancoragem dessas células á superfície do implante varia de acordo com as características da mesma. Em torno de uma semana, as células mesenquimais em diferenciação secretam matriz orgânica sem colágeno, que fornecem locais específicos para a deposição de fosfato de cálcio. Nesses locais específicos ocorre o crescimento dos cristais de fosfato de cálcio e, simultaneamente, ocorre aposição de fibras colágenas na interface formada. Finalmente, ocorre a calcificação da porção colágena, tanto das fibras quanto da região entre as fibras. Assim, no processo de neoformação óssea, a porção colágena fica separada da superfície do implante por uma camada de tecido calcificado livre de colágeno (Brunsky et al., 2000)
Osteoindução ocorre quando células mesenquimais indiferenciadas devidamente estimuladas; por exemplo, trauma; transformam-se em pré-osteoblastos e, em seguida, osteoblastos,
iniciando o processo de osteogênese. A osteogênese pode ocorrer sobre uma determinada superfície ou arcabouço, sendo este processo denominado osteocondução. O processo de osseointegração depende previamente de osteoindução e osteocondução, que são fenômenos inter
-relacionados, mas não idênticos (Albrektsson, Johansson, 2001).
2.2 Rugosidade
Albrektsson et al. (1981), afirmaram que alguns fatores como a biocompatibilidade, o desenho do implante, as condições da
da osseointegração.
No que se refere à rugosidade superficial, é bem estabelecido pela literatura que a presença de rugosidade na superfície dos implantes resulta em melhorias no processo de osseointegração. Assim, o aumento da rugosidade superficial tem sido associado a diversas vantagens, tais como: aumento na área de contato entre osso
-implante, aumento na adesão celular na superfície do implante e aumento na interação bioquímica entre o implante e o tecido ósseo (Gupta et al., 2010).
De fato, o processo de crescimento de células sobre a superfície do implante se mostra dependente da rugosidade, uma vez que superfícies lisas apresentam maior proliferação celular ao longo das ranhuras decorrentes do processo de usinagem, caracterizando uma forte direcionalidade. Contudo, culturas de células realizadas na presença de superfícies tratadas (as quais apresentam maior rugosidade) resultam em menor direcionalidade, o que resulta em uma melhor interação das células com a superfície do implante (Elias, Meirelles, 2010).
2.3 Tipos de Superfície
Os trabalhos iniciais sobre osseointegração (Branemark et al., 1969; Albrektsson et al., 1981) utilizaram implantes de titânio comercialmente puro, com superfície usinada. Os implantes eram instalados na região anterior da mandíbula ou maxila, unidos, para uma melhor distribuição da carga mastigatória, com o propósito de reabilitar pacientes edentados totais.
células no que se refere a adesão, proliferação, alterações morfológicas e funcionais.
Obviamente, áreas com maior volume de osso cortical apresentam maior contato do implante com o tecido ao final da instalação. Além disso, superfícies tratadas de implantes resultam em um consequente aumento da área de contato osso-implante em relação a
implantes lisos. Por este motivo, o uso de implantes com superfície tratada foi originalmente mais indicado para situações de leito ósseo pobre, ou seja, com menor contato osso-implante ao final da cirurgia,
como no caso de regiões de enxertia e pacientes com comprometimentos sistêmicos (Wennerberg et al., 1995).
Albrektsson 1988 relatou que os implantes originais de Branemark eram reconhecidos como um padrão ouro, baseado em muitos estudos longitudinais. Tais implantes eram usinados com uma mínima rugosidade na superfície, entre 0,5 µm e 1,0 µm.
A alta taxa de sucesso dessa modalidade de tratamento levou a uma extrapolação da técnica. Assim, implantes orais foram instalados em regiões de pior qualidade óssea. As altas taxas de sucesso obtidas com implantes de superfície usinada já não eram observadas. Além deste fator, a busca por tempos de cicatrização menores contribuíram para o estímulo à pesquisa e ao desenvolvimento de novas superfícies de implantes. (Groisman, Vidigal, 2005).
um procedimento relevante para a produção de alta qualidade destes dispositivos.
Silva (2006) relatou que a rugosidade deve ser controlada, pois as células necessitam de pontos de ancoragem na superfície dos implantes, para iniciar a proliferação e constituir a biofixação dos implantes. Se as rugosidades forem muito menores que o tamanho das células, não existirão sítios de biofixação adequados. Em contrapartida, se a superfície apresentar grandes picos ou vales, mas se estes possuírem superfícies lisas, as células poderão não encontrar sítios de biofixação adequados. Para os autores, a adesão e o espalhamento de células em superfícies de implantes são associados à microestrutura superficial.
Para Palmquist et al., (2010) a deposição de tecido ósseo na superfície dos implantes é fortemente dependente das interações entre as células e a superfície do titânio dos implantes.
2.3.1 Superfície Usinada
Para Sykaras et al., (2000) as ranhuras superficiais são consideradas de extrema importância para o processo de adesão celular e produção de matriz proteica.
De acordo com Teixeira (2001), devido à presença de microrranhuras superficiais resultantes do processo de corte ou usinagem da peça metálica, esta não exibe características de completa lisura superficial.
direcionam o crescimento das células esparramadas e somente naquele sentido.
Elias et al., (2004) relataram que um implante usinado permite o processo de mineralização do osso em direção ao implante, mas não possui uma superfície indutora.
Pinto e Elias (2006) observaram em microscópio que a orientação das estrias e sulcos da superfície usinada seguem o sentido do corte, dificultando o espalhamento das células, tornando-se uma
superfície anisotrópica.
As superfícies lisas ou usinadas são caracterizadas por uma maior lisura superficial em decorrência do processo de usinagem dos implantes. No entanto, ranhuras são observadas após este processo, resultando em superfícies que não são completamente lisas (Wennerberg, Albrektsson, 2009).
2.3.2 Adição
Um dos primeiros métodos de tratamento de superfície foi a adição de HA à superfície dos implantes. Através desse método, buscava-se uma ligação química entre o implante recoberto com HA e o
tecido ósseo. Contudo, esta técnica caiu em desuso por apresentar desvantagens como alto custo de fabricação e pelo fato de alguns estudos in vivo demonstrarem que há destacamento da camada de HA do corpo do implante (Gottlander et al., 1992).
fase mineral do tecido ósseo (Caulieret et al., 1997).
Diferentes processos de recobrimento utilizam como matéria prima a HA, resultando em superfícies com diferentes morfologias e propriedades, até dentro de um mesmo lote de um mesmo fabricante, sendo difícil a obtenção de uma camada fina e uniforme de HA quando da sua aplicação em superfícies geométricas complexas, tais como roscas ou superfícies porosas de metal (Suchanek, Yoshimura, 1998).
Outro método de adição bastante comum é o de aspersão térmica por plasma; onde a chama ionizada de um gás é aquecida a temperaturas muito altas, 10000 e 30000 ºC, e partículas aquecidas do material de recobrimento são lançadas em altas velocidades contra o corpo do implante. Após o contato com o corpo do implante, as partículas resfriam e solidificam-se, e a superfície adquire um aspecto de lava
vulcânica solidificada (Groissman, Vidigal, 2005).
2.3.2.3 Superfícies Biomiméticas
Atualmente, é possível depositar camadas de fosfato de cálcio sob condições fisiológicas de temperatura e pH pelo processo biomimético. Uma vez que as moléculas estão integradas à estrutura do material, elas são liberadas gradualmente, na medida em que as camadas vão se degradando, o que aumenta o potencial de servirem como um sistema de liberação lento de agentes osteogênicos para o sítio de implantação (Liu et al., 2001).
Nesse processo, células mesenquimais foram isoladas de biópsias da medula óssea, expandidas in vitro e então cultivadas na superfície dos implantes, carregando uma camada de fosfato de cálcio e de BMP-233, criando implantes osteoindutores (fatores de crescimento) e
osteocondutores (camada de fosfato de cálcio) (Yeo et al., 2008).
2.3.3 Subtração
Nos métodos de subtração, para obter uma superfície rugosa, são utilizadas técnicas de ataque ácido à superfície, ou as superfícies são jateadas com óxidos ou areia. Muitas vezes faz-se uma
combinação desses métodos (jateamento e ataque ácido) para obter o grau de rugosidade desejado. Os principais ácidos utilizados no tratamento por ataque ácido são o ácido clorídrico (HCl) e ácido sulfúrico (H2SO4) em determinadas concentrações. Os principais métodos de jateamento são por óxidos como, por exemplo, óxido de alumínio (Al2O3). Desta forma, tem-se uma superfície com ranhuras irregulares, que variam
de acordo com o tamanho e a forma das partículas e também as condições do jateamento (pressão, distância do bico do jato à superfície do implante, tempo de jateamento). A rugosidade média pode variar entre 1,20 e 2,20 µm (Ivanoff et al., 2001).
químicas da superfície.
As modificações que alteram as interações da superfície as fazem por meio de íons, biomoléculas e células, influenciando na adesão e proliferação celular. Diferenciação e adesão de células específicas que vão interferir no processo de osseointegração potencializam seus efeitos. Assim, algumas situações da atividade clínica diária podem ser beneficiadas, tais como protocolos de carga imediata, instalação de implantes em alvéolos de extração, instalação de implantes e enxertos simultâneos, áreas estéticas onde a preservação do nível ósseo é fundamental, instalação de implantes em locais de baixa densidade óssea, situações em que seja necessário instalar implantes curtos.
Atualmente, alguns métodos de tratamento de superfície
atuam na escala nanométrica. Um dos métodos utiliza um jateamento com TiO2, seguido por um tratamento com ácido fluorídrico (OsseoSpeed
-Astra Tech AB, Mondal, Suécia). Outro método consiste em um depósito de nanopartículas de cálcio e fosfato sobre uma superfície previamente tratada com duplo ataque ácido (Nanotite-Biomet 3i, Palm Beach
Gardens, Fl, EUA). Ambos os tratamentos vem demonstrando bons resultados, porém são necessários mais estudos em escala nanométrica para avaliar verdadeiros riscos e benefícios (Mendonça et al., 2008).
De acordo com Al-Nawas et al., (2008), o método de
obtenção da superfície de TiO2 porosa é eletroquímico, chamado de oxidação anódina. A média de diâmetro dos poros fica em torno de 1 a 2 µm. Esse tipo de superfície exibe uma tipografia única, sem características agudas e com boa capacidade para reter líquidos e tecido ósseo. A camada de óxido é fortemente aderente ao metal subjacente, com ótima resistência ao desgaste, o que indica risco mínimo de liberação de partículas durante a inserção do implante.
estão contribuindo com informações importantes sobre a interação celular/tecidual e o material implantado (Meirelles, 2010).
2.3.4. Nanoestruturas
Para ser classificada como uma nanoestrutura, uma estrutura deve ter ao menos uma das três dimensões variando entre 1 a 100 nanômetros. O limite máximo de 100 nanômetros é baseado no Sistema Internacional de Unidades (The International System of Units) (Aumailley, Gayraund, 1998).
Elias e Serra (2006) relataram que o tratamento eletroquímico das superfícies dos implantes submetidos ao processo de oxidação anódica aumentaram a espessura da camada de óxido. Na visão dos autores, as modificações por anodização permitem uma melhor adesão e orientação das células e uma osseointegração mais acelerada; uma vez que a superfície possui poros abertos e irregulares semelhantes a vulcões, que crescem na superfície do implante.
Yang (2009) avaliaram que o tratamento eletroquímico por anodização aumentaram a espessura da camada de óxido de Ti da superfície metálica dos implantes. Esta camada de TiO2 melhorou significativamente toda a coagulação do sangue e aderência em células da medula óssea humana.
Para Meirelles (2010), a presença de nanoestruturas, independente da composição química, resulta em aumento do contato osso-implante. Segundo o autor, o próximo passo seria determinar o
tamanho e a distribuição ideal das nanoestruturas na superfície para melhorar a resposta óssea. A resposta óssea na interface osso-implante é
extra para o desenho da superfície ideal para implantes osseointegráveis. A superfície deve funcionar adequadamente nos momentos iniciais do processo inflamatório até anos mais tarde suportando as forças dinâmicas de mastigação, isto é, a superfície deve atrair biomoléculas adequadas para a resposta óssea e ao mesmo tempo permitir a transmissão adequada da tensão na interface osso-implante por vários anos.
2.3.4.1 Anodização
Na anodização a superfície de um metal é transformada numa camada de óxido, através da passagem de corrente elétrica e outros parâmetros, como o tipo de solução eletrolítica. Além de proteger o metal, a camada de óxido formada anodicamente exibr coloração em muitas tonalidades diferentes (Santos Junior, 2005).
O titânio é recoberto espontaneamente por um filme fino de TiO2 devido à sua alta afinidade com o oxigênio, sendo a anodização um
processo eletroquímico utilizado para aumentar a espessura do filme de óxido. A formação da camada interna do filme de TiO2 em elevados
potenciais anódicos ocorre pela migração de íons O2-/OH- em direção à interface metal/filme. Por outro lado, os íons Ti4+ originários do substrato de Ti migram para a interface filme/eletrólito formando a camada mais interna do filme anódico. Em geral, os óxidos cristalinos têm maior resistividade iônica, e por esta razão necessitam de campos elétricos mais altos do que óxidos amorfos. Então, a probabilidade de excitação de elétrons na banda de valência, originada pela sobreposição de orbitais O 2p no filme de TiO2 cristalino, conduz à oxidação de íons O2- para formar
anódicas ocorridas no filme são variadas. As mais relevantes no crescimento do filme são aquelas que formam O2 e TiO2. O filme pode ser
dividido em duas camadas, onde aproximadamente 65% da espessura corresponde à camada interna. Esta camada mais interna do óxido apresenta cristais de anatásio. Contrariamente, a camada mais externa do filme é amorfa. Entre estas duas subdivisões, há uma interface onde ocorre a transição de cristalinidade (Habazaki et al., 2003).
A anodização é uma técnica de modificação de superfície fundamentada na oxidação do metal para formar filmes uniformes e relativamente espessos à temperatura ambiente. Esta técnica também pode ser utilizada para incorporar elementos químicos do eletrólito com o objetivo de melhorar as propriedades protetoras do metal (Narayanan, Seshadri, 2007).
Dentre os vários métodos para melhorar as propriedades interfaciais e aumentar o tempo de vida dos implantes, a anodização têm atraído grande atenção dos pesquisadores, devido à sua simplicidade e facilidade para manipular os parâmetros experimentais na obtenção de filmes microporosos ou nanoporosos (Yu et al., 2008).
O processo eletroquímico de anodização de metais permite a obtenção de uma camada de óxidos relativamente fina e mais densa que aquela formada naturalmente na atmosfera. No caso do titânio, esta camada tem sido utilizada para favorecer a nucleação de apatitas e, por conseguinte, a osteointegração (Adamek, Jakubowicz, 2010).
utilizada em numerosos campos de aplicação, incluindo aplicações médicas. O objetivo dessa pesquisa foi investigar a cristalinidade e óxido durante a formação de poros por anodização de titânio usando uma forma de onda pulsada numa série eletrólitos de ácido sulfúrico. A forma de onda pulsada mostrou produzir poros. Os autores concluíram que as distribuições de tamanho dos poros produzidos podem ser benéficos para o osso a ligação de células e proliferação.
Yamagami et al., (2014) demonstraram que em aplicações dentárias, o contato entre o implante metálico e a loja cirúrgica de tecido vivo é obtido por meio da camada de óxido da superfície do implante, permitindo o processo de osseointegração. Em Odontologia, a camada passiva formada no titânio parece ser mais estável e oferecer maior proteção do que aquele formado nas ligas de Ti, habitualmente utilizadas em outras aplicações médicas.
Shokuhfar et al., (2014) analisaram a interação dos osteoblastos em titânio comercialmente puro e na liga Ti6Al4V exibindo TiO2 amorfo e cristalino. A cristalinidade do filme foi demonstrada pela fase de anatase, obtida pelo processo de anodização. Esta pesquisa mostrou que a composição química do substrato foi mais importante para aumentar a densidade celular do que a morfologia de superfície. Os autores concluíram que a alta molhabilidade da superfície devido à cristalinidade exibiu maior influência no espalhamento celular devido à hidrofilicidade da superfície cristalina em comparação com a amorfa.
El-wassefy et al., (2014), realizaram um estudo visando obter
nanoestruturas na superfície dos implantes de titânio por processo de oxidação anódica com o objetivo de avaliar a bioatividade resultante tanto
colocação cirúrgica dos implantes anodizados em tíbia de coelhos em diferentes períodos de cicatrização. A análise histológica de rotina foi realizada para avaliar as reações do tecido do osso aos implantes anodizados. A anodização de implantes de titânio produziu alterações morfológicas, elevaram o percentual de oxigênio na camada de TiO2, aumentou a rugosidade da superfície dos implantes e notavelmente, modificou a cristalinidade do filme. Os autores concluíram que superfícies nanoestruturadas de implantes de titânio podem ser preparadas por oxidação anódica e promovem osseointegração acelerada, a qual pode ser recomendada para o carregamento inicial.
2.3.5 Estudos que compararam diferentes superfícies de implantes
Johansson e Albretsson (1987) compararam implantes usinados a implantes recobertos por HA, e chegaram à conclusão de que os recobertos por HA apresentaram maior contato entre osso e implante.
Estudos in vivo através de modelos em animais revelaram que há aumento na deposição óssea em torno de implantes com superfície tratada através de jateamento seguido por ataque ácido quando comparados aos implantes lisos (Buser et al., 1991).
Pebé et al., (1997) demonstraram que, implantes com a superfície tratada por duplo ataque ácido (ácidos hidroclorídrico e sulfúrico) apresentaram maior resistência à força de contra-torque do que
Carr et al., (1997) compararam por meio de cortes transversais, o percentual de contato entre osso e implantes recobertos por hidroxiapatita borrifada com plasma (HA-OS), implantes usinados de
Ticp e implantes usinados em liga de Ti6Al4V instalados na mandíbula e maxila de babuínos e que não receberam carga. Os implantes recobertos por HA-PS apresentaram maior percentual de contato entre osso e
implante do que os implantes usinados de Ticp e liga de titânio, após três meses de cicatrização.
Trisi et al., (1999) constataram que implantes com superfície jateada com partículas de Al2O3 instalados em osso tipo III em humanos, apresentaram maior percentual de contato entre osso e implante do que implantes usinados, após períodos de cicatrização de três, seis e doze meses, porém não houve alteração ou melhora da qualidade do tecido ósseo ao redor dos implantes com superfície tratada.
Cordioli et al., (2000), compararam quatro tipos diferentes de superfície de implantes (usinada, jateada com Al2O3, tratadas com plasma de titânio (TPS), e atacada por ácido), verificaram que, dentro de um período de cinco semanas, os implantes com superfície tratada por ácido apresentaram 33% mais contato ósseo e foi necessário um torque 60% maior para sua remoção do que para os implantes com outras superfícies.
Weng et al., (2003) realizaram uma pesquisa, na qual implantes com superfície modificada por TPS, por ataque ácido, e usinados, foram istalados em mandíbulas de cães. Demonstraram que os implantes com superfície tratada (TPS e ataque ácido), apresentaram maior superfície de contato entre osso e implante, em cortes longitudinais, do que os de superfície usinada, principalmente em áreas de baixa densidade óssea.
Ivanoff et al., (2003) constataram que implantes instalados tanto na maxila quanto na mandíbula de pacientes, cuja superfície foi tratada por oxidação anódica, apresentaram um maior contato com o tecido ósseo adjacente do que implantes com superfícies usinadas, após períodos de cicatrização médios de 6,6 meses para a maxila e 3,5 meses para a mandíbula.
Pinto e Elias (2006) demonstraram que a superfície dos implantes orais submetida à oxidação anódica revelou a presença de cálcio e fósforo na superfície, além da presença de titânio e oxigênio. Quando comparada a superfície usinada, houve diminuição da concentração de titânio e um aumento da concentração de oxigênio. Com estes resultados, os autores afirmaram que ocorreu aumento da espessura do óxido com incorporação de cálcio e fósforo na camada superficial. Na oxidação ocorre formação de gases, principalmente H2 e O2, que se condensam em microbolhas; desta forma, originaram poros que se interconectaram, justificando o aumento da rugosidade.
Histologicamente, foi observado que implantes com superfície tratada instalados na tíbia de coelhos apresentaram aumento no contato osso-implante (Celletti et al., 2006).
Alguns trabalhos demonstraram aumento na resposta óssea com a configuração nano+micro estruturas quando comparadas com micro apenas (sem nanoestruturas definidas), em humanos (Orsini et al., 2007; Goene et al., 2007) e ratos (Mendes et al., 2007).
acompanhamento de oito semanas em cachorro, obtiveram valores similares de contato osso-implante entre implantes micro comparados
com micro+nano (Vignoleti et al., 2009).
O comportamento de células em cultura foi avaliado na presença de três superfícies de titânio: polidas, submetidas ao ataque ácido e superfície modificada em escala nanométrica com alumina. Os resultados revelaram mais expressão de genes envolvidos no metabolismo ósseo em superfícies de titânio com modificações nanométricas. E ainda, implantes com tal superfície apresentaram maiores valores de contato osso-implante e de torque de remoção em
experimentos in vivo (Mendonça et al., 2009).
Busquim et al. (2012) realizaram um estudo com o objetivo de caracterizar a camada de TiO2 existente em implantes comerciais Vulcano Actives (anodizado) e Master Porous (tratado com ácido) e comparar com o implante não comercial Porous Nano (deposição de íons). As amostras foram submetidas aos seguintes tratamentos de superfície e divididas em grupos: a) usinado com superfície semelhante ao implante comercial Master Screw; b) ataque com ácido semelhante ao implante comercial Master Porous; c) Anodizado semelhante aos implantes Master Vulcano Actives; d) Tratados com flúor, tratamento não comercial. Nas amostras
sem tratamento observaram-se marcas de usinagem. Com o tratamento
ácido, a superfície torna-se mais homogênea, as características
ácido, tendo a presença de partículas nano e micrométricas depositadas na superfície do implante. Neste trabalho concluiu-se que as superfícies
anodizadas apresentaram maiores valores de rugosidade. O ângulo de contato entre o líquido e a superfície foi, em todas as amostras, menor que 90º o que torna a superfície hidrofílica, permitindo melhor contato do coágulo com o implante. As superfícies anodizadas apresentaram molhabilidade significativamente superior às demais. Quanto ao torque de remoção, as superfícies usinadas foram mais facilmente removidas. A superfície Vulcano Actives foi submetida ao tratamento de oxidação anódina em solução eletrolítica contendo cálcio e fósforo, revelando a presença de cálcio, fósforo, titânio e oxigênio. É possível afirmar que essas mudanças podem ser atribuídas ao aumento da espessura do óxido com incorporação de cálcio e fósforo na camada superficial. O óxido formado na superfície das amostras anodizadas apresenta mistura de TiO2 na forma de rutilo e anatase.
circunferencial criado foi quase totalmente preenchido por osso novo num período de 2 semanas, para ambos os tipos de implantes. Na avaliação da área óssea e o contato osso-implante não foram encontradas
diferenças significativas entre os dois grupos. Neste estudo, a superfície bioativa F- modificada não foi superior à superfície bioinerte anodizada em
termos de resposta óssea inicial. Mais estudos foram solicitados para determinar se os recém - introduzidos implantes com superfícies bioativas
são melhores em termos de osseointegração do que as superfícies modificadas existentes.
Lavenus et al., (2012) verificaram as interações entre células-tronco mesenquimais humanas e a integração óssea de implantes
de titânio nanoestruturado. Nanotexturas foram preparadas por anodização de Ti em uma mistura de ácido fluorídrico e ácido acético. As nanoestruturas 30 e 50 nm promoveram a expressão gênica precoce para a diferenciação dos osteoblastos a partir das células mesenquimais humanas, sem suplementos osteogênicos. A osseointegração de implantes de Ti nanoestruturado e do controle foi comparada pela implantação em tíbias de ratos no período de 1 e 3 semanas. As nanoestruturas aceleraram significativamente aposição óssea e força de ligação óssea in vivo, em correlação com os resultados in vitro. Os achados desta pesquisa demonstraram que as nanoestruturas específicas controlaram a diferenciação de células e, assim, a integração dos implantes. Sendo assim, concluíram que estas superfícies de titânio nanotexturizadas podem ser de grande interesse para implantes dentários e ortopédicos.
Para Zuo et al., (2013), há uma grande demanda por implantes dentários com a capacidade de acelerar a regeneração óssea perimplantar, sendo que as modificações de superfície micro e nanotopográficas revelaram afetar o metabolismo das células ósseas. Neste estudo, utilizou-se a alta tecnologia de barreira dielétrica (DBD)
citotoxicidade da superfície DBD-Ti quando comparadas com superfícies
usinadas (Ti-m) e polido (Ti-p). Estes três tipos de placas de Ti exibiram
diferentes energia superfície topografias nas escalas micro e nano. A superfície tratada com DBD Ti puro aumentou significativamente a adesão celular e proliferação das células MC3T3-E1 pré osteoblásticas,
comparadas com as superfícies de Ti-m e Ti-p, sugerindo sua melhor
biocompatibilidade em comparação às outras duas superfícies. Este estudo demonstrou que a modificação DBD reforça significativamente a adesão celular e a proliferação de pré-osteoblastos sem efeitos negativos
sobre a diferenciação celular.
2.4 Histomorfometria
Histomorfometria (do grego histós-tecido; morphe-forma; métron-medida) é a análise quantitativa de estruturas histológicas, sendo
que os parâmetros de avaliação podem variar; como área, perímetro e contorno (Vidigal Jr, 1996).
Os dois métodos mais empregados para analisar a interface entre osso e implante são os testes biomecânicos e análise histomorfométrica (Sykaras et al., 2000).
dos cortes histológicos (Park et al., 2005).
2.4.1 Microtomografia Computadorizada (µTC)
Em 1989 Feldkamp et al., Desenvolveram um método para examinar a estrutura de osso esponjoso utilizando a microtomografia computadorizada (µTC) com a vantagem de ser uma técnica não destrutiva. A quantificação das estruturas ósseas foi baseada na análise histomorfométrica. Os parâmetros quantificados foram: razão entre volume ósseo e volume total da amostra (BV/TV); a razão entre a superfície óssea e seu volume (BS/BV); a separação média entre as trabéculas (Tb.Sp); a densidade das trabéculas (Tb.N) e a espessura média das trabéculas (Tb.Th). A reconstrução 3D permitiu uma descrição compreensiva da variação estrutural óssea.
De Assis em 1992 apresentou um sistema microtomográfico com características de um tomógrafo de primeira geração, com tubos de raios X convencionais e um sistema mecânico (translação e rotação), com precisão micrométrica. Foi usada uma amostra de dente decíduo para teste do sistema, e este conseguiu distinguir a camada de esmalte que recobre o dente e o diâmetro do canal central. A análise revelou que era possível identificar regiões de interesse com resolução de 20 µm.
A µTC é uma versão miniaturizada da Tomografia Computadorizada (TC) e vem sendo utilizada na área de pesquisas de materiais. Na área biológica, foi adaptada para o estudo de materiais duros como matriz óssea dentária (Davis, Wong, 1996).
o sistema tomográfico possui uma fonte de raios X com um foco bem menor do que os comumente usados em diagnóstico, da ordem de micrômetros. Uma vantagem desta técnica está na alta resolução espacial alcançada, permitindo uma maior magnificação da imagem, sem que haja o efeito indesejável da penumbra geométrica (Lopes et al., 1997).
De acordo com Muller et al. (1998) alterações morfológicas são tradicionalmente estudadas através de medidas feitas em duas dimensões, onde os parâmetros estruturais são inspecionados visualmente ou medidos de secções transversais das amostras. O método convencional de histomorfometria envolve uma cuidadosa preparação da amostra, seguido de secções das amostras em lâminas bem finas. Apesar de o método apresentar alta resolução espacial e alto contraste, consome muito tempo e necessita de um técnico treinado.
Segundo Rodrigues (2008), esta técnica é especialmente útil na visualização externa e interna da mesma parte do osso, sem provocar danos à amostra. Trata-se de uma técnica não destrutiva usada
para criar um mapa tridimensional de pequenos campos com resolução de poucos micrômetros. As imagens obtidas podem ser submetidas ao uso de softwares específicos para análise e melhor compreensão dos dados, bem como para a construção de modelos computacionais 3D e simulações, utilizadas para os mais diversos fins.
2.4.1.1 Estudos com µTC
por aumento na fragilidade óssea, alterações na região trabecular podem ser facilmente detectadas por µTC, tendo em vista que a fragilidade óssea não está somente ligada à densidade mineral óssea, mas depende em grande parte da estrutura trabecular (Goulet et al., 1994).
Mercer e Anderson (1996) sugeriram um estudo piloto para investigar os efeitos do laser de dióxido de carbono no esmalte de dentes, para isto mediram as mudanças da densidade mineral nos dentes através dos níveis de cinza das imagens microtomográficas. Os resultados mostraram a habilidade da µTC para exibir alta resolução das imagens bidimensionais, e quantificar mudanças em densidade mineral dentro das amostras.
Yang et al. (2003) avaliaram a influência da resolução espacial da µTC de ossos de ratos. Os autores mostraram que, com uma resolução de 15µm era possível notar uma mudança estrutural nas amostras de tíbias entre os dois grupos de amostras estudados.
Postnov et al., (2003) desenvolveram um método para medir densidade do cálcio em amostras ósseas, utilizando a técnica de µTC. As µTC foram adquiridas de fêmures de ratos. Os autores empregaram uma correção polinomial para endurecimento do feixe. Os níveis de cinza foram calibrados com os valores da densidade mineral do cálcio. O conteúdo do cálcio foi calculado diretamente do histograma das imagens e expresso como percentual da relação do volume e peso das amostras ósseas.
alterações significativas em BS/BV, Tb.N, Tb.Sp, Th e ConnD. Este trabalho mostrou a possibilidade de realizar medidas histomorfométricas
in vivo através de µTC, com a vantagem de que cada animal possa ser seu próprio controle.
redor da fratura, BV/TV foi diretamente proporcional com a Força máxima e Rigidez do calo. Isto sugeriu que menor quantidade de fendas e lacunas na cortical do calo aumenta a resistência do mesmo.
3 DETALHAMENTO METODOLÓGICO
Este projeto foi submetido e aprovado ao Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Ciência e Tecnologia do Campus de São José dos Campos/UNESP com protocolo 02/2014-PA/CEP e foi realizado de
acordo com os Princípios Éticos para a Experimentação Animal, adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
Para este estudo foram utilizados 10 coelhos albinos da raça Nova Zelândia, pesando cerca de 4,0 kg, com 5 meses de idade. Os animais foram fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”-UNESP-Campus de Botucatu.
3.1 Implantes
Sessenta implantes Ti cp tipo IV, de 8,5mm x 3,75mm de diâmetro, com ápice cônico arredondado com quatro câmaras de corte, rosca auto perfurante, hexágono externo (HE), fornecidos pela empresa TITANIUM FIX (São José dos Campos, SP, Brasil); foram utilizados para o desenvolvimento deste estudo. Inicialmente, estes, foram divididos em três grupos:
• Grupo 1 LISO (Controle) : superfície usinada Ti cp tipo IV;
jateamento com óxido de alumínio seguido de subtração por ácido nítrico;
• Grupo 3 ANODIZADO (Experimental): superfície usinada
submetida ao processo de anodização com aplicação de corrente pulsátil (30 V, 0,6 A e 1000 Hz, durante 4 horas).
3.2 Procedimento de Anodização
Os implantes usinados (sem tratamento de superfície) foram devidamente adaptados em uma placa de titânio (Figura 3A) para posterior limpeza com álcool isopropílico em ultrassom por 10 minutos. Em seguida, foram novamente lavados água deionizada por mais 10 minutos em ultrassom (Figura 3B). Após este procedimento de lavagem, os implantes foram submetidos à secagem com ar frio.
Figura 3 - A) Implantes posicionados em placa de titânio, B) Implantes lavados em
ultrassom.
Após estes procedimentos, iniciou-se o processo de
anodização. Para isso, os implantes adaptados na placa de titânio foram devidamente colocados, juntamente com uma placa de cobre (para permitir passagem de corrente elétrica), tendo-se então um ânodo e um
cátodo, num Becker contendo 1 mol/L de H2SO4 utilizado como meio eletrolítico (Figura 4).
Figura 4- Implantes na placa de titânio e placa de cobre inseridos no Becker com solução
de 1 mol/L de H2SO4.
Os parâmetros utilizados para a anodização foram aplicação de corrente pulsátil (30% de ciclo de trabalho, 30 V, 0,2 A e 1000 Hz, durante 4 horas). Para o monitoramento dos parâmetros elétricos nesta condição, foram utilizados: um osciloscópio digital, modelo MO2061, marca Minipa; um retificador pulsante de onda quadrada, modelo GI21P-10/30, da empresa General Inverter (Figura 5).
Figura 5- monitoramento dos parâmetros elétricos: um osciloscópio digital (MO2061); e
Após a anodização, os implantes apresentaram coloração azulada (Figura 6).
Figura 6- Figura demonstrativa: implante inicialmente usinado (sem tratamento) (A), e
submetido à anodização, exibindo coloração azulada (B).
3.3 Caracterização dos Implantes
Os implantes foram analisados previamente à instalação cirúrgica, e após a remoção por torque reverso, a fim de observar se houve dano na superfície e composição química após a instalação cirúrgica e posterior remoção dos mesmos com o torquímetro digital.
Os implantes de superfície anodizada foram analisados por Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) e Microscopia de Força Atômica (AFM) para caracterização da morfologia da superfície.
A análise de Microscopia Eletrônica de Varredura foi realizada no Laboratório de Caracterização Estrutural DEMa / UFSCar por meio do equipamento Philips XL-30 FEG, com aumento de 100.000 e
200.000 vezes.
A análise de AFM foi realizada no Laboratório Associado de Sensores e Materiais – LAS, Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais
Anodização
– INPE, utilizando um microscópio de força atômica V Nanoscope Veeco. Durante a análise, o microscópio foi operado no modo de contato sendo utilizado um cantilever V shape Si3N4. Em tal modo operacional, o sistema de resposta do microscópio foi regulado para manter a distância entre a ponta do microscópio e às superfícies, constante durante a varredura da amostra, e o movimento z realizado pelo piezoelétrico cerâmico foi registrado durante a digitalização. Esta técnica de microscopia consiste em monitorar a força entre uma ponta de prova e a superfície da amostra. Assim, preserva-se a superfície e a qualidade dos resultados.
Para a caracterização química, foram realizadas as análises de e Espectroscopia Raman, EDS e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) para avaliar potencial de corrosão metálica.
Na Espectroscopia, foi utilizado o Espectrômetro Raman Horiba Scientific T64000, visando encontrar as bandas características da fase de anatase, sendo esta a fase mais cristalina e, portanto, a mais biocompatível, do TiO2.
Na análise por EDS, foi utilizado detector de energia dispersiva de raios X (EDS), juntamente com o programa Espirit 1.9 (Bruker), que realizou a análise dos elementos químicos presentes e sua quantificação. Por meio deste equipamento foi observada a composição química de cada material estudado.
Na técnica deespectroscopia de impedância
eletroquímica (EIE), que consiste na aplicação de um potencial elétricovariável, utilizou-se um potenciostato/galvanostato Autolab (Eco.
3.4 Procedimentos Cirúrgicos
Previamente à cirurgia de instalação dos implantes, os mesmos foram devidamente lavados em ultrassom e esterilizados com 25 kGy na empresa EMBRARAD ( Unidade de Esterilização Cotia LTDA,
Cotia – SP – Brasil. CNPJ: 45.789.724/0002-85 – I.E.: 278.015.211.114).
As cirurgias foram realizadas em sala cuidadosamente limpa, com álcool etílico na concentração de 70%; com instrumentos devidamente esterelizados. O cirurgião e auxiliares utilizaram aventais esterelizados, e materais descartáveis (máscaras, luvas estéreis, gorro).
3.5 Anestesia
Previamente à cirurgia de implantação, os animais foram pesados e anestesiados por via intramuscular, com uma mistura de 13 mg/kg de solução aquosa a 2,3 g de cloridrato de xilazina (Anasedan – Vetbrands), substância sedativa analgésica e relaxante muscular, com 33 mg/Kg de quetamina (Dopalen - Agibrands do Brasil Ltda.) como
anestésico geral; e anestésico local composto por cloridrato de prilocaína 3% associado à felipressina 0,03 UI/mL (Citanest a 3%® – Dentsply).
3.6 Instalação dos implantes
e esquerda foram submetidos à raspagem e à anti-sepsia com solução de
álcool iodado. A incisão foi realizada com lâmina de bisturi número 15 na região correspondente à face medial da tíbia em seu terço proximal. A cortical da tíbia foi exposta e as lojas cirúrgicas então realizadas. Durante todo este procedimento foi mantida irrigação abundante com cloreto de sódio a 0,9%, visando evitar o aquecimento decorrente do atrito da broca com o osso.
Em seguida, a perfuração para instalação dos implantes foi realizada com a sequência padronizada de brocas para implantes de diâmetro 3,75 x altura 8,5 mm. Os implantes foram instalados manualmente até a obtenção da estabilidade primária e então, adaptaram-se os parafusos de cobertura. Os coelhos foram submetidos à
cirurgia de instalação de seis implantes, três em cada tíbia, sendo um de cada grupo em cada tíbia (Figura 7).
Figura 7 - Sequência cirúrgica: A) Incisão com lâmina de bisturi 15; B) Exposição da
Após o procedimento cirúrgico de colocação dos implantes, o tecido muscular foi suturado com fio absorvível nº4 (Monoglyde ® Poliglecarpone 25), a pele suturada com fio de seda nº4 (Ethicon/Johnson & Johnson) e novamente foi realizada anti-sepsia com
álcool iodado. Os animais receberam terapia antibiótica com benzilpenicilina benzatina, benzilpenicilina procaína, benzilpenicilina potássica e diidroestreptomicina base sulfato em ampola de 6.000.000 UI (Pentabiótico – Fort Dodge), por via intramuscular na dose de 1,35 mL/kg, no pós-operatório imediato. Após a cirurgia, os coelhos foram colocados
em gaiolas individuais com ração e água ad libitum, e monitorados até o prazo da eutanásia de 2 e 6 semanas. Cada período de sacrifício foi composto de um grupo de 5 coelhos.
3.7 Eutanásia
Para a eutanásia os animais foram submetidos à anestesia geral profunda (propofol 10 mg/Kg) via intravenosa e em seguida foram submetidos à administração de uma ampola de cloreto de potássio via intravenosa para sacrifício.
As tíbias direitas contendo os implantes foram armazenadas em formol tamponado para serem utilizados para avaliação de RP e µTC.
3.8 Análise por Radiografia periapical (RP)
Ao período de eutanásia (2 e 6 semanas), as tíbias direitas dos coelhos contendo os implantes, foram submetidas à radiografia periapical (RP), visando observar a presença de tecido ósseo neoformado (imagem radiopaca) e a ausência de halo radiolúcido, o qual indicaria a formação de tecido fibroso ao redor dos implantes.
Para obtenção das imagens radiográficas periapicais foi utilizado o aparelho de raios X odontológico convencional da marca Dabi Atlante, modelo Spectro 70 X Seletronic e realizada a técnica do paralelismo com 70 kV e 8 mA com um tempo de exposição de 0,4 segundos. O filme utilizado foi o Ekataspeed Plus (EP-21p) fabricado pela
Eastman Kodak Company mantido pelo posicionador (Posicionador RH para incidências radiográficas– Indusbello® – Ind. de Instrumentos Odontológicos Ltda – Manual).
Para realização da técnica radiográfica, as tíbias foram adequadamente imobilizadas em uma mesa apropriada e posicionadas de forma que o filme ficasse paralelo à região de interesse e que a incidência dos raios X fosse perpendicular aos implantes (Figura 8).
O processamento radiográfico foi pelo método tempo
-temperatura, com soluções novas. Em seguida, as RP foram digitalizadas e avaliadas pelo programa Image J® versão 1.29x: NIH, Bethesda, MD, EUA para quantificação densitométrica. Neste programa as imagens foram convertidas para uma escala de 8 bits com ajustes de brilho e contraste. As imagens de cada implante foram recortadas e transformadas em arquivos separados e armazenadas no formato TIF.
Em cada imagem, a área de interesse selecionada foi a região entre as roscas dos implantes (lados direito e esquerdo da imagem radiográfica), exceto as duas últimas roscas, pois algumas imagens não apresentavam definição adequada (Figura 9). Após a seleção da área de interesse, foi realizado o histograma de cada implante, para cada grupo estudado (liso, jateado e anodizado). Ao clicar, este programa fornece os valores de escala de cinza. Este histograma mostra os dados sobre a quantificação densitométrica com as médias dos valores dos pixels na escala de cinza entre 0-255, atribuindo valor zero para o nível mais escuro
de cinza (preto) e 255 para o mais claro (branco). Deste modo, valores mais próximos do branco indicaram melhor osseointegração.
Figura 9- área de interesse selecionada entre as roscas dos implantes em implante
3.9 Avaliação por Microtomografia Computadorizada (µTC)
As tíbias contendo os implantes foram avaliadas através do microtomógrafo de raios X SkyScan 1176 – Bélgica (Figura 10). A captação dos dados desta análise foi realizada na Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP sob a responsabilidade do Departamento de Diagnóstico e Cirurgia. Os parâmetros para reconstrução da imagem em µCT foi o escaneamento com rotação das peças em 360º, utilizando raios X monocromáticos com 89 kV e 275 µA, filtro de cobre 0.1. A reconstrução das imagens utilizou os softwares NRecon, Dataviewer (fornecidos pelo fabricante do microtomógrafo SkyScan 1176 - Bélgica) e para quantificação da formação óssea foram
utilizados os softwares CT-Analyzer e CT-Vol.
Figura 10 – A) e B) Microtomógrafo de raios X SkyScan 1176 (Bélgica). C)Tíbia devidamente posicionada no isopor azul no interior do microtomógrafo para análise.
A
B
Após o escaneamento das tíbias, as imagens dos cortes foram reconstruídas individualmente pelo programa NRecon da Skycan,
obtendo-se os cortes como ilustrado na Figura 11.
Figura 11 - Imagem reconstruída de microtomografia computadorizada de implante anodizado no período de 6 semanas.
Figura 12-Utilização do programa Data Viewer, centralização as linhas na região cortical nos planos: coronal (A), transversal (B) e sagital (C).
Neste estudo foi escolhido o plano transversal para ser realizada a análise de quantificação da neoformação óssea na interface osso/implante. No programa CT Analizer da Bruker MicroCT (CTAn), na vista transversal, foi feita a seleção da região de interesse (ROI) retangular, na região de osso cortical, delimitada da mesma forma para todos os grupos (Figura 13). Ainda no programa CTAn foi criado um volume de interesse (VOI), a partir do ROI determinado. Foram utilizados 100 cortes (slices) da tíbia para compor o VOI. Foi escolhido este valor, por ser o número de cortes (slices) máximo em que o VOI não ultrapassaria o osso cortical pré-existente, o que poderia alterar os
resultados do estudo. A
