DIGITOXINA AUMENTA A SOBREVIDA DE RATAS PORTADORAS DE INSUFICIÊNCIA CARDÍACA CONSEQUENTE AO INFARTO DO MIOCÁRDIO DE GRANDES DIMENSÕES
Tese de Doutorado Apresentada à disciplina de Cardiologia da Universidade Federal de São Paulo/ Escola Paulista de Medicina para Obtenção do Título de Doutor em Medicina.
Orientador: Paulo J. F. Tucci
Helber, Izo
Digitoxina aumenta a sobrevida de ratas portadoras de insuficiência cardíaca conseqüente ao infarto do miocárdio de grandes dimensões. / Izo Helber -- São Paulo, 2008.
vi, 43f.
Tese (Doutorado) Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Ciências..
Título em inglês: Digitoxin prolongs survival of female rats with heart failure due to large myocardial infarction.
1.Ratos 2. Digitoxina 3. Sobrevida 4. Insuficiência Cardíaca 5. Infarto do Miocárdio
Ao meu orientador Prof. Dr. Paulo José Ferreira Tucci, cuja clareza de idéias, espírito investigativo e busca constante de novos conhecimentos, que tanto me impressionaram inicialmente, acabaram não sendo tão relevantes frente a sua grandeza de caráter.
Aos Prof. Dr. Antonio Carlos Carvalho e Angelo de Paola, por me receberem de forma tão calorosa na disciplina de cardiologia da UNIFESP.
Aos meus colegas Alexandra Alberta, Ronald Flumignan, Danilo Bocalini e Ednei Luiz Antonio, os quais tiveram participação fundamental nesta tese.
Aos Dr. Neif Murad e Leonardo dos Santos pelas suas excelentes sugestões.
A todos os colegas do laboratório de Fisiologia Cardiovascular pela agradável convivência e troca de idéias durante todos estes anos.
Aos docentes, pós graduandos e demais membros da disciplina de cardiologia da UNIFESP, pela excelente convivência neste período.
Aos meus colegas José O. Moreira e José R. Feitosa pelo estimulo e agradável convivência durante vinte anos na disciplina de cardiologia da Universidade de Mogi das Cruzes.
Por fim, agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para que este trabalho se realizasse.
ÍNDICE
RESUMO... 1
SUMMARY ... 3
1. INTRODUÇÃO ... 4
2. MATERIAL E MÉTODOS ... 8
2.1. ANIMAIS ESTUDADOS ... 8
2.2. PRODUÇÃO DO INFARTO DO MIOCÁRDIO ... 8
2.3. ELETROCARDIOGRAMA ... 9
2.4. DOPPLER ECOCARDIOGRAMA ... 10
2.5. COMPOSIÇÃO DOS GRUPOS ESTUDADOS ... 11
2.6. PERÍODO DE OBSERVAÇÃO ... 12
2.7. DIETA COM DIGITOXINA ... 12
2.8. ESTUDO DA FUNÇÃO MECÂNICA DE MÚSCULOS PAPILARES E TEOR DE ÁGUA DOS PULMÕES ... 13
2.9. ESTUDO NECROSCÓPICO ... 17
2.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 17
3. RESULTADOS ... 18
3.3. ANIMAIS ESTUDADOS- DISTRIBUIÇÃO PELOS GRUPOS SEGUNDO O TAMANHO DO INFARTO DO MIOCÁRDIO E TRATAMENTO ... 18
3.2. ELETROCARDIOGRAMA ... 20
3.3. DADOS DOS ESTUDOS DE DOPPLER ECOCARDIOGRAMA ... 20
3.4. SOBREVIDA ... 22
3.5. DADOS DE NECROPSIA ... 24
3.6. DADOS DE MECÂNICA MIOCÁRDICA E TEOR DE ÁGUA DO PULMÃO ... 25
4. DISCUSSÃO ... 30
5. CONCLUSÕES ... 36
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 37
Resumo
Objetivo Insuficiência cardíaca congestiva (ICC) é o maior preditor de mortalidade entre as doenças cardíacas. Este trabalho foi conduzido para analisar, pela primeira vez, se a digitoxina afeta a sobrevida de ratos com ICC que se segue ao Infarto do Miocárdio.
SUMMARY
Congestive heart failure (CHF) is a major predictor of death. We design this protocol aiming to analyze, for the first time, whether digitoxin affect survival of rats with CHF due to Myocardial Infarction. Methods and Results – The influence of digitoxin administration (0.1 mg/100 g/day, orally) on the survival of decompensate infarcted female rats (n=170) randomized as Control (C: n=85) or Digitoxin (D: n=85) was evaluated during a 280-day observational period. Mean survival was 235±7 days (95%CI: 220; 249) for C and 255±5 days (95%CI: 244; 265) for D; the logrank test revealed a borderline significant difference (p=0.06). Digitoxin did not affect
(p=0.5595) survival in rats presenting CHF due to myocardial infarction (MI) <40% of the left ventricle; however, prolonged survival in rats presenting MI ≥40%. Indeed, death was reported for 56% in C≥40% and 34% rats in D≥40%; the logrank test defined significantly (p=0.0161) higher mortality in C, with a hazard ratio of 2.03 (95%CI: 1.13; 3.55). CHF was present in all deceased rats. Pulmonary water content (PWC) and papillary muscle mechanics were analyzed in C (n=7) and D (n=14) survivors. Significant differences were observed (x±epm) regarding PWC (C: 82±0.4; D: 80±0.3%; p=0.0014), developed tension (C: 2.7±0.3; D: 3.8±0.3 g/mm2; p=0.0286) and +dT/dt (C: 24±3; D: 39±4 mg/mm2/s; p=0.0109). Post-rest
1.INTRODUÇÃO
Dados recentes (HUNT et al,2002,LEVY et al,2006) demonstram que, nos EUA, mais de 5 milhões de indivíduos são acometidos de Insuficiência Cardíaca (IC) e, à cada ano, 550.000 novos casos são diagnosticados, gerando aproximadamente 1.000.000 de hospitalizações, com custos diretos e indiretos estimados em 29 bilhões de dólares/ano, com taxa de mortalidade variando de 5 a 75% ao ano. Estes dados conferem relevante importância na busca de um medicamento para Insuficiência Cardíaca que possua como principais características a melhora da qualidade de vida, ser economicamente viável, ser de fácil administração, não apresentar efeitos adversos importantes, ser de fácil combinação com outros medicamentos e, principalmente, de aumentar a sobrevida dos pacientes.
Em 1997 foi publicado o estudo DIG, (DIGITALIS INVESTIGATION GROUP,1997). Este estudo foi concebido para responder se o uso do digital reduziria a mortalidade e hospitalização por ICC, procurando definir mais precisamente o papel da digoxina nesta patologia. Este estudo randomizou 7.788 pacientes que mantinham ritmo sinusal, em utilização de diuréticos e inibidores de enzima de conversão, que foram acompanhados por três anos. No braço principal do estudo foram acompanhados 6.800 pacientes com fração de ejeção inferior a 45%. Embora a digoxina tenha reduzido o número de hospitalizações e mortes relacionadas com a Insuficiência Cardíaca, não reduziu a mortalidade geral.
agente inotrópico de utilização oral que não aumenta a mortalidade ao longo do tempo na Insuficiência Cardíaca crônica; 2) uma classe de medicamentos que, ao serem utilizados em doses apropriadas, tem baixo índice de efeitos colaterais como ausência de hipotensão, alterações eletrolíticas e efeitos adversos a nível renal. Além destas particularidades, os digitálicos combinam-se adequadamente com outras drogas utilizadas no tratamento da Insuficiência Cardíaca, é de baixo custo e melhora a qualidade de vida (PACKER et al,1993). O declínio acentuado na utilização de digitálicos no tratamento da Insuficiência Cardíaca após a divulgação dos resultados do DIG foi assinalado no registro OPTMIZE – HF (Organized Program to Initiate Lifesaving Treatment in Hospitalized Patients With Heart Failure) (GHEORGHIADE et al,2006). Foi relatado que somente 30% dos pacientes com disfunção ventricular sistólica estavam em tratamento com digoxina antes da admissão, e em apenas 8% dos pacientes a digoxina foi adicionada ou mantida após a alta, a pacientes com sintomas de Insuficiência Cardíaca.
pacientes não tratados (AHMED et al, 2006; AHMED, 2007; SHAHBUDIN, 2004; RATHORE et al, 2003).
trabalho experimental que tenha avaliado a influência de digitálicos na sobrevida de animais portadores de Insuficiência Cardíaca.
2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Animais estudados
Foram analisados os dados de 172 ratas jovens (Rattus norvegicus albinus, Rodentia, Mammalia) da linhagem Wistar-EPM, pesando entre 180 e 220 g (x+epm: 202 ± 1,1 g) quando introduzidas no estudo, livres de patologia, provenientes do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais (CEDEME) da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Os animais foram mantidos em caixas com água e ração “ad libitum” no biotério do CEDEME, em ambiente com temperatura controlada em torno de 22ºC, 54% de umidade relativa do ar ambiente e ciclo claro/escuro de 12 horas. Em cada caixa foram mantidos, no máximo, quatro animais.
2.2. Produção do Infarto do Miocárdio
anterior era identificada e ligada à cerca de 1mm abaixo do bordo inferior do átrio esquerdo, com fio de sutura mononylon 6.0. O coração era reintroduzido no tórax e era promovida hiperinsuflação pulmonar. A toracotomia era fechada por sutura em bolsa previamente preparada na parede do tórax. A ventilação artificial era retirada quando os movimentos ventilatórios espontâneos se mostrassem estáveis, e o animal era extubado. Os ratos foram colocados em caixas sob o calor de lâmpada de tungstênio para permanecerem aquecidos durante o período pós-operatório, até que voltassem completamente da anestesia.
2.3 Eletrocardiograma
eletrocardiogramas se enquadravam dentro deste critério foram considerados como portadores de IM e foram imediatamente encaminhados para realização de Doppler ecocardiograma.
2.4. Doppler Ecocardiograma
O Doppler ecocardiograma foi realizado com aparelho HP SONOS 5500 (Hewlett Packard, Andover, MA, USA) utilizando transdutor de freqüência fundamental de 12 MHz, que permitia obtenção de imagens cardíacas em tempo real nos modos mono e bidimensional, além da velocidade de fluxo por efeito Doppler espectral. As imagens eram obtidas com profundidade de 2 cm. Os animais foram posicionados em decúbito lateral esquerdo e três eletrodos foram colocados nas patas para obtenção do traçado eletrocardiográfico simultâneo à imagem ecocardiográfica.
das bordas das cúspides da valva mitral, dos músculos papilares e da região apical. Este método foi previamente validado em nosso laboratório (CURY et al, 2005), utilizando a fórmula:
% IM = (RAH / PE) x 100
A função sistólica foi avaliada pela determinação da fração de encurtamento da área transversa (FEAT), calculada pela fórmula:
FEAT = (ADF – ASF / ADF) x 100
A função diastólica foi analisada utilizando-se os índices derivados da curva de velocidade do fluxo diastólico mitral obtidos pela técnica de Doppler pulsátil. A curva de velocidade do fluxo diastólico foi obtida a partir da imagem apical quatro câmaras, posicionando-se a amostragem de volume próximo à face ventricular da válvula mitral. Foram determinadas: a) onda E: maior valor da velocidade de fluxo inicial do enchimento ventricular, b) onda A: maior valor da velocidade de fluxo telediastólico mitral, c) relação E/A: relação entre a velocidade máxima da onda E e a velocidade máxima da onda A.
2.5.Composição dos grupos estudados
perímetro endocárdico do VE. A seguir, era colocado na região posterior do pescoço um chip que possibilitava a identificação eletrônica dos animais que eram, em seguida, encaminhados ao biotério central (CEDEME) da Unifesp. As caixas eram inspecionadas toda manhã e os corpos dos animais que morriam eram colocados em freezer para posterior estudo necroscópico. Considerando esta sistemática, foram compostos quatro subgrupos:
1) CONTROLE com IM menor do que 40% do VE (C < 40)
2) CONTROLE com IM igual ou maior do que 40% do VE (C ≥ 40) 3) DIGITAL com IM menor do que 40% do VE (D < 40)
4) DIGITAL com IM igual ou maior do que 40% do VE (D ≥ 40) O número de animais incluídos em cada subgrupo é apresentado em resultados.
2.6. Período de observação
Foi estabelecido o período máximo de observação de 40 semanas (280 dias) como período de acompanhamento para definição da sobrevida dos animais. 2.7. Dieta com digitoxina
A dieta enriquecida com digitoxina (FLUKA), utilizada no presente trabalho, foi padronizada anteriormente, conforme descrito em publicação anterior (HELBER et al, 2004 ).
Os cálculos necessários para se definir a quantidade de digitoxina a ser acrescida à dieta levaram em conta diversos fatores. Em trabalho anterior (PERON et al, 2005 ), que analisou o efeito da desnutrição nas características mecânicas do miocárdio, definimos que, independentemente do peso corpóreo, ratos adultos ingerem, em media, 30 gramas de ração Nuvilar por dia. Este valor foi tomado como ponto de referência para calcular a quantidade de digitoxina a ser acrescida à ração. Tomando como outro ponto de referência o peso médio das ratas, considerado como sendo em torno de 300 g, definiu-se que seriam colocados 0,3 mg de digitoxina para cada 30 g de ração. Esta sistemática permitiu que cada rato, com supostos 300 g, ingerisse aproximadamente 0,3 mg, correspondendo, portanto, à dosagem de 1 mg/kg/dia.
Para preparo da ração, a ração Nuvilar, sob a forma de pellets era tornada em pó e misturando-se o pó resultante com água, formou-se uma massa de ração. A digitoxina foi diluída em álcool absoluto, na concentração de 1 mg para cada 3 ml de álcool, e espargiu-se a solução alcoólica sobre a massa de ração. A mistura ração\solução alcoólica de digitoxina foi deixada a 50° durante 24 horas para evaporar todo o álcool e água, refazendo a forma física original da ração, para ser oferecida aos ratos.
2.8. Estudo da função mecânica de músculos papilares e teor de água dos pulmões
toracotomia ampla. O coração foi retirado rapidamente do tórax e colocado em solução de Krebs-Henseleit previamente oxigenada com 100% de oxigênio e aquecida a 30°C. A parede livre do ventrículo direito foi extirpada para expor o septo interventricular, que foi dividido ao meio para que os dois músculos papilares do VE (anterior e posterior) fossem adequadamente expostos. O músculo papilar que melhor morfologia apresentava foi cuidadosamente dissecado numa plataforma de plástico e suas extremidades tendínea e parietal foram presas por anéis de aço inoxidável. Todo o procedimento, desde a retirada do coração até a colocação do músculo papilar na cuba experimental, não durou mais do que 5 minutos.
O músculo papilar foi suspenso verticalmente em câmara de vidro contendo solução de Krebs-Henseleit borbulhada com oxigênio 100%, sendo a extremidade tendinosa superior conectada a transdutor de forca isométrica, via anel e fio de aço inoxidável de 0,38 mm de diâmetro. O anel da extremidade inferior do músculo foi conectado a gancho fixo na cuba de vidro. O transdutor de força estava conectado a micromanipulador que permitia deslocamento vertical – e conseqüente alongamento do músculo – a cada 10 micrômetros/volta. A composição da solução de Krebs-Henseleit, em milimoles por litro (mM), foi de: 132 NaCl; 4,69 KCl; 1,5 CaCl; 1,16 MgSO4; 1,18 KH2PO4; 5,50 glicose e 20 de HEPES como tampão. O pH foi ajustado para 7,4 adicionando-se NaOH em concentração de 20%. Para um litro de solução, em média, foram adicionados cerca de 2 ml de NaOH, elevando assim a concentração de NaCl para 146 ± 17 mM.
que permitiu determinar os valores das variáveis fisiológicas a serem analisadas. Paralelamente ao músculo papilar estavam dois eletrodos de platina, acoplados a estimulador elétrico, que liberava estímulos em onda quadrada de 5 ms de duração, com voltagem aproximadamente 10% maior que o mínimo necessário para provocar resposta mecânica máxima do músculo. Os músculos foram estimulados em freqüência de 0,2 Hz.
repouso. Com esta providência, ocorre linearização dos pontos e a análise se simplifica.
Os parâmetros de função mecânica analisados foram: a) tensão isométrica desenvolvida máxima: TDmáx;
b) taxa de variação da tensão desenvolvida (dT/dt): variação da tensão desenvolvida na unidade de tempo. São obtidos os valores máximos das derivadas positiva (+dT/dt) e negativa (-dT/dt), que informam a variação temporal da força na contração (sístole) e no relaxamento (diástole), respectivamente;
c) tensão de repouso (TR): tensão registrada ao final do relaxamento. Seguindo-se às manobras que possibilitaram definir a curva de Frank-Starling, estando o músculo em Lmáx, foi determinada a resposta miocárdica a uma pausa no regime de estimulação, para se analisar a contração pós-pausa. Para tanto, foram promovidas suspensões do estímulo elétrico determinante da contração por períodos de 15, 30 e 60 segundos. A resposta do miocárdio (RM) à manobra de interferência da pausa sobre a capacidade contrátil foi avaliada referindo-se o valor da contração imediatamente seguinte à pausa (CSP) como valor relativo à magnitude da última contração que ocorreu sob o regime de estimulação normal (CEN):
RM = CSP/CEN
temperatura de 80oC. O teor de água do pulmão (% H
20) foi obtido pela aplicação da fórmula:
% H20 = (PU – PS / PU) x 100 onde:
PU é o peso úmido do pulmão e PS o peso seco da mesma amostra. 2.9. Estudo necroscópico
Os animais que faleceram durante o transcurso do protocolo foram colocados em freezer mantido em temperatura de 4º C e foram submetidos à necropsia para avaliar a presença de outra possível causa de óbito além da cardíaca. Para tanto, os ratos foram submetidos à necropsia completa, com exceção do exame do Sistema Nervoso Central. Foi procedida análise macroscópica de todas as vísceras abdominais e torácicas, procurando anormalidades, que eram examinadas quando presentes. Na ausência de suspeitas macroscópicas de outras lesões, o coração, os pulmões e o fígado eram colocados em formol 10%. Amostras de pulmão e fígado foram preparadas para exame histopatológico de rotina, sob coloração com hematoxilina-eosina.
2.10. Análise estatística
3. RESULTADOS
3.1. Animais estudados; distribuição pelos grupos segundo o tamanho do Infarto do Miocárdio e tratamento
O peso dos animais, quando foram introduzidos no protocolo, de acordo com o grupo a que pertenceram, foi: DIGITAL: 202 ± 1,1 g e CONTROLE: 203 ± 1,1 g.
Entre os 172 animais que foram inicialmente introduzidos no protocolo, dois foram excluídos do estudo. Um deles por ter sido acometido de Hamartoma anexial cutâneo benigno de dimensão excepcionalmente grande, a ponto de limitar a movimentação do animal e restringir seu acesso à ração. Esta rata era do grupo DIGITAL, portadora de IM menor do que 40% e sobreviveu 206 dias. A sua exclusão se deveu ao fato de ter sido considerado que sua morte se deveu a conseqüências relacionadas com o tamanho do tumor, que impedia a sua livre movimentação e alimentação. O estudo anátomo-patológico deste animal excluiu a existência de congestão pulmonar. Outro animal, também integrante do grupo DIGITAL, sobreviveu 269 dias e foi excluído porque a avaliação final do tamanho do IM foi impossibilitada, em razão de a fita em que estava gravado o estudo Doppler ecocardiográfico ter se danificado. Este animal permanecia vivo quando foi excluído.
distribuição do tamanho dos IM (p = 0,430). Os dados referentes ao teste Qui-quadrado são apresentados na tabela 1.
Tabela 1: Distribuição das 170 ratas segundo extensão do infarto e do tratamento. DIGITAL
(n=85) CONTROLE (n=85) Total (n=170) Extensão <40% 35 (41,2%) 30 (35,3%) 65 (38,2%) Extensão ≥40% 50 (58,8%) 55 (64,7%) 105 (61,8%)
A aplicação do teste t de Student para comparar o tamanho dos IM nos grupos CONTROLE e DIGITAL permitiu caracterizar que também não houve diferença (p = 0,212) entre os grupos em relação a esta variável. No grupo CONTROLE o tamanho dos IM variou entre 23% e 62% com valores médios ± erro padrão de 40 ± 1,1% e nos animais do grupo DIGITAL os IM variaram entre 20% e 64%, com valores médios de 42 ± 1,0%.
Conclusão semelhante resultou da aplicação do teste t para amostras independentes, quando se compararam os tamanhos de IM equivalentes nos subgrupos. As médias e os limites superiores e inferiores dos tamanhos dos IM nos subgrupos são apresentados na tabela 2.
Tabela 2: Valores (x ± epm) do tamanho dos infartos do miocárdio nos diversos subgrupos.
média ± epm Limites
C < 40 33 ± 0,9 23 – 39
D < 40 31 ± 1,0 20 – 39
C ≥ 40 47 ± 0,7 40 – 62
Não foram identificadas diferenças nas comparações dos tamanhos dos IM de C e de D.
3.2. Eletrocardiograma
O eletrocardiograma foi o método utilizado para proceder à triagem dos animais na identificação da presença de IM, para realização posterior de ECO. As características eletrocardiográficas anteriormente descritas (BONILHA et al, 2005) para ratos portadores de IM – presença de onda Q em D1 e desvio do ÂQRS para além de 90º no plano frontal – foram utilizados como critério de inclusão no protocolo. Em todos os ratos em que foram identificados estes sinais o ECO concretizado a seguir confirmou a presença do IM. Não houve outras particularidades eletrocardiográficas que justifiquem citação neste texto, dado que os resultados verificados reproduziram informações de trabalho conduzido anteriormente no laboratório e já publicado (BONILHA et al, 2005). Confirmando conclusão do trabalho anteriormente publicado, o eletrocardiograma não possibilitou caracterizar o tamanho do IM.
3.3. Dados dos estudos de Doppler ecocardiograma
Tabela 3: Valores (média ± epm) das variáveis Doppler ecocardiográficas dos animais dos diversos grupos.
Normais
(n = 16) C<40% (n = 30) D<40% (n = 31) C(n = 56) ≥40% D(n = 50) ≥40% p
Dd (cm) 0,64±0,01 0,79±0,01 0,78±0,01 0,81±0,01 0,79±0,01 p > 0,05
Ds (cm) 0,35±0,01 0,59±0,02a 0,58±0,02a 0,63±0,016ª 0,64±0,01a p=0,0457
Ad (cm2) 0.35±0.01 0,39±0,01a 0,39±0,01a 0,42±0,01ab 0,44±0,01b p=0,0074
As (cm2) 0.13±0.01 0,23±0,01a 0,24±0,01a 0,28±0,01b 0,30±0,01b p<0,0001
FEAT (%) 64±1,3 42±1,2a 40±1,5a 32±0,95b 31±1,1b p<0,0001
E (cm/s) 58±1,9 64±2,3a 64±2,6a 72±1,9ab 76±2,1b p<0,0002
A (cm/s) 28±1,3 26±1,5a 24±2,4ab 16±1,3c 19±2,1bc p=0,0007
E/A 2,1±0,12 2,8±0,28a 3,6±0,48a 5,9±0,43b 5,5±0,41b p<0,0001 Normais: Dados históricos do laboratório obtidos em ratas normais previamente analisadas. Dd: diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo (VE); Ds: diâmetro sistólico do VE; Ad: área diastólica transversa do VE; As: área sistólica transversa do VE; FEAT: fração de encurtamento da área transversa do VE; E: velocidade de fluxo protodiastólico mitral; A: velocidade de fluxo telediastólico mitral; E/A: razão entre as ondas E e A. As letras minúsculas colocadas após os números representam a significância estatística da ANOVA seguida de testes de Newman-Keuls: letras iguais identificam valores que não foram diferentes no teste pós-hoc, e letras diferentes indicam valores que são estatisticamente diferentes.
diâmetros sistólicos, a ANOVA caracterizou existir diferença entre os valores comparados, todavia, o teste post-hoc não identificou entre quais grupos esta significância se estabeleceu. Já em relação às áreas transversas do VE, o tamanho do IM condicionou expansões que guardaram proporcionalidade com o tamanho do IM e os grandes infartos resultaram em áreas diastólicas e sistólicas maiores do que os infartos moderados.
Já nas comparações das variáveis funcionais, as alterações encontradas guardaram relação com o tamanho do IM. As anormalidades verificadas ao quinto dia de IM foram todas mais destacadas nas ratas portadoras de grandes IM, quando comparadas àquelas verificadas nos IM moderados, na fração de encurtamento da área transversa, nas ondas E e A e na razão E/A.
3.4. Sobrevida
A resposta de interesse foi o tempo de sobrevida, avaliado em dias, após a oclusão coronária. De acordo com o planejamento, o estudo teve duração de 280 dias e ao final destes 280 dias os ratos que ainda continuavam vivos foram sacrificados.
Durante o período de observação morreram 39% (61/170) dos animais. Entre as ratas tratadas morreram 29% (25/85) e entre os não tratados morreram 42% (36/85). Na figura 1A estão representadas as curvas de Kaplan-Meier para os grupos C e D.
as probabilidades das ratas sobreviverem aos 280 dias foram iguais a 71% e 58% para DIGITOXINA e CONTROLE, respectivamente.
Figura 1: Curvas de Kaplan-Meier projetando a probabilidade de sobrevida em função do tempo de acompanhamento dos animais dos grupos Controle e Digital (Painel A) e dos subgrupos que tiveram Infartos do Miocárdio maiores e menores do que 40% (Painel B). São apresentados também os valores de p para cada uma das análises que foram concretizadas.
O tempo médio de vida dos ratos submetidos ao tratamento DIGITOXINA foi de 255 ± 5 dias (IC a 95%: 244; 265) e de 235 ± 7 dias (IC a 95%: 220; 249) entre as ratas CONTROLE. A análise pelo teste Log-Rank não identificou diferença estatisticamente significante do tempo de sobrevida das ratas (p = 0,060), ou seja, os dados mostraram que a droga DIGITOXINA resultou em tempo de sobrevida maior do que o CONTROLE, contudo, os dados não chegaram a caracterizar significância estatística, embora o resultado da análise estatística tenha se aproximado bastante da significância.
D<40 fica ligeiramente abaixo da das ratas CONTROLE. A probabilidade estimada dos animais sobreviverem aos 280 dias foi 77% para os animais tratados com digitoxina e de 83% para os animais controle. O teste Log-Rank não evidenciou diferença estatisticamente significante (p = 0,5595) do tempo de sobrevida das ratas dos dois subgrupos com extensão do IM menor do que 40%.
Entre os 55 animais do subgrupo C≥40, 31 (56%) foram a óbito e entre os 50 animais do subgrupo D≥40 17 (34%) faleceram. A média de sobrevida de C≥40 foi de 220 dias (IC a 95%: 200; 239) e de D≥40 foi de 251 dias (IC a 95%: 235; 266). A curva (Figura 1B) correspondente aos animais D≥40 manteve-se acima da dos animais C≥40 durante todo o período de avaliação. A análise dos dados permite definir que a probabilidade de sobrevida aos 280 dias foi de 66% para os animais do grupo D≥40 e de 44% para os animais C≥40. A análise pelo teste Log-Rank caracterizou diferença significante (p = 0,0161) entre os tempos de sobrevida das ratas com extensão do IM maior ou igual a 40% e a análise pela regressão de Cox permitiu estimar que o risco de óbito entre ratas C≥40 foi 2,03 vezes (IC a 95% 1,13; 3,68) o risco de D≥40 (p = 0,019). Interessantemente, a comparação dos grupos tratados com digitoxina (D<40 x D≥40) mostrou que não houve diferença significante entre eles (p = 0,2995), enquanto a diferença entre os grupos não tratados (C<40 x C≥40) foi claramente significante (p = 0.0008).
3.5. Dados de necropsia
colocado em congelador durante período que prejudicava as análises. Em outros casos – não raros – a necrofagia por animais sobreviventes dificultou, até mesmo, a identificação dos animais, e impossibilitou a colheita de outras informações. Em razão destas limitações, foram concluídas 112 necropsias, sendo 61 dos animais que faleceram espontaneamente durante o transcurso do protocolo e 51 de animais sacrificados ao final do período estabelecido.
Todos os 61 animais necropsiados que morreram durante o transcorrer do protocolo tinham sinais histopatológicos de congestão pulmonar e hepática. Adicionalmente, os sinais de congestão pulmonar e hepática foram avaliados em 51 animais sobreviventes. Em seis deles não foram identificados sinais de ICC. Em todos os outros animais foram encontrados dados que caracterizaram congestão pulmonar e hepática. Quatro das ratas em que a ICC não foi identificada pertenciam ao grupo C<40 (IM = 27%, 35%, 35%, 39%), uma era integrante do grupo D<40 (IM = 32%) e a outra era do grupo D≥40 (IM = 41%). Um dos animais sobreviventes, do grupo D<40 (IM = 25%), ao lado de sinais de ICC, era portador também de Pneumonia lobar. Dado que este animal sobreviveu ao período de análise ele não foi excluído do estudo.
3.6. Dados da mecânica miocárdica e teor de água do pulmão
sobreviventes que não foram tratados, o tamanho do IM foi maior do que 40% em 4 (57%) e menor em 3 (43%). Nas ratas submetidas a estas análises, o tamanho médio do IM foi de 37% ± 7% nas ratas D e de 39 ± 7% em C (p > 0,05).
Em todos os animais que compuseram este estudo o teor de água do pulmão foi superior aos valores (x ± epm) de 77,5 ± 0,7 % descrito anteriormente para ratos normais no laboratório (FLUMIGNAN et al, 2006). A figura 2 ilustra as médias e os erros padrão da média verificados nas ratas integrantes do presente trabalho. A análise destes dados por teste t de Student bi-caudal identificou diferença significante (p = 0,0014) entre os valores dos animais dos grupos D (80,0 ± 0,31%) e C (81,8 ± 0,36%).
C D
0.0
p = 0,0014
78 79 80 81 82 83 T eo r d e ág u a d o p u lm ão ( %)
Os resultados obtidos no estudo da mecânica miocárdica estão expostos na figura 3.
Figura 3: Valores (média ± epm) dos valores da tensão desenvolvida (TD), tensão de repouso (TR), derivada positiva (+dT/dt) e negativa (-dT/dt) dos animais dos grupos Controle (colunas cheias) e Digitoxina (colunas vazias) *: p < 0,05 nas comparações de D e C (teste t para dados independentes).
É possível verificar que, excetuando-se os resultados relativos à tensão de repouso (TR: C: 1,33 ± 0,13; D: 1,37 ± 0,11 g/mm2), músculos papilares de ratas tratadas com digitoxina tiveram as depressões da contração e do relaxamento atenuadas em relação às ratas não tratadas. Assim, foram identificadas diferenças em relação a: TD (C: 2,71 ± 0,32; D: 3,80 ± 0,27 g/mm2; p = 0,0286, teste t de Student para amostras independentes), +dT/dt (C: 23 ± 3; D: 39 ± 3 g/mm2/s, p = 0,0109) e -dT/dt (C: -14 ± 2, D: -22 ± 2 mg/mm2/s; p = 0,0139).
prolongadas são seguidas de estimulações mais acentuadas. Nos registros
Figura 4: Registros representativos das respostas obtidas em miocárdio normal, miocárdio de animais Controle e tratados com Digitoxina quando se promoveu interrupção dos estímulos por 15, 30 e 60 segundos.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
15" 30" 60"
*
*
*
C
SP
/
C
EN
Figura 5: Valores (x ± epm) verificados nos grupos Controle (colunas cheias) e Digitoxina (colunas vazias) para as relações entre os valores das tensões desenvolvidas nas contrações seguintes à pausa (CSP) e os batimentos sob estimulação normal (CEN). *: p < 0,05 entre Controle e Digitoxina pelo teste t de Student para amostras independentes.
teste t para amostras independentes), 30 (C: 0,56 ± 0,11, D: 0,89 ± 0,08; p = 0,0272) e 60 segundos (C: 0,51 ± 0,10, D: 0,86 ± 0,10; p = 0,0489) de intervalos de pausa.
Os resultados verificados quando da análise das variáveis em diferentes comprimentos musculares (mecanismo de Frank-Starling) estão ilustrados na figura 6. Os coeficientes de correlações lineares alcançaram valores extremamente convincentes para TD (C: 0,9978, D: 0,9973), +dT/dt (C: 0,9954, D: 0,9933) e – dT/dt (C: 0,9993, D: 0,9937). Os coeficientes de correlações obtidos para a TR (C: 0,9921, D: 0,9998) também foram convincentes da validade da análise. Os dados relativos à TD, à +dT/dt e à –dT/dt confirmaram os resultados verificados em Lmáx, desde que as retas dos animais digitalizados estiveram sempre acima das retas dos animais que não receberam tratamento. É de se destacar que não foram identificadas diferenças entre as inclinações das diversas retas de C e D, indicando que o miocárdio das ratas tratadas e não tratadas têm igual sensibilidade ao estiramento.
4. Discussão
Depois de mais de 200 anos de aplicação em pacientes portadores de ICC, a recomendação de uso de digitálicos reduziu-se marcadamente nos últimos anos. Um conjunto de fatores contribuiu para desacreditar os méritos dos digitálicos como terapêutica útil no tratamento da ICC (SHAHBUDIN et al,2004) e é inegável que os resultados do estudo DIG exerceram influência decisiva no descrédito que resultou para os digitálicos. No braço principal do estudo DIG, a digoxina não interferiu na mortalidade geral dos pacientes portadores de Insuficiência Cardíaca crônica em ritmo sinusal. Mais recentemente, novas avaliações (AHMED et al, 2006; AHMED et al, 2007; SHAHBUDIN et al, 2004; RATHORE et al, 2003; RICH et al, 2001; RUELAZ et al, 2005; ADAMS et al, 2005) dos resultados do DIG vêm apresentando interpretações alternativas aos dados do braço principal que conduzem a conclusões que diferem daquelas divulgadas na publicação original. Estas abordagens mais recentes dão destaque à importância decisiva que as concentrações plasmáticas da digoxina podem representar como determinante de possível melhora da sobrevida (AHMED et al, 2006; AHMED et al, 2007; RATHORE et al, 2003; RUELAZ et al, 2005; ADAMS et al, 2005) Concentração sérica de 0,9 ng/ml foi identificada como limite superior capaz de prolongar sobrevidas. A ausência de prolongamento da sobrevida ocorreu com concentrações plasmáticas superiores a 1,0 ng/ml (AHMED et al, 2006, AHMED et al, 2007; SHAHBUDIN et al, 2004; RATHORE et al, 2003).
Algumas particularidades de nosso estudo devem ser destacadas. O modelo de ICC utilizado neste trabalho já teve a validade em simular a ICC humana evidenciada em inúmeras publicações, que propiciaram relevantes informações ao estudo da fisiopatologia e tratamento da síndrome congestiva de humanos (PFEFFER et al, 1985; MILAVETZ et al, 1996; LAPOINTE et al, 2002; MARIE et al, 1999; MULDER et al, 1997; SAKAI et al, 1996; LEVIJOKI et al, 2001). Embora o desencadeante da disfunção ventricular seja a oclusão coronária, o modelo não reproduz a Insuficiência Coronariana de humanos. Nestas últimas, a lesão vascular nem sempre é única e é comum vir associada a outras co-morbidades que também trazem repercussões para o coração. É inegável, entretanto, que o modelo é gerador de Insuficiência Cardíaca. Assim, entre os 112 animais em que foram completados o exame necroscópico, apenas em 6 (5%) não foram encontrados sinais conclusivos de congestão pulmonar.
É possível que nossa opção por ratas fêmeas confira características de gênero aos nossos resultados. Deve ser destacado, porém, que trabalho anterior, que foi pioneiro em apontar a capacidade dos inibidores da enzima de conversão da angiotensina em prolongar a sobrevida de ratos infartados (PFEFFER et al 1985) também foi desenvolvido em fêmeas, fato que não reduziu o mérito dos resultados.
recomendaram (DOHERTY et al,1971 ) a escolha da digitoxina (absorção completa ) ao invés da digoxina (absorção variável).
Uma particularidade que distingue marcadamente nossos dados de estudos populacionais conduzidos em humanos – além do comportamento próprio de espécies e gênero – é a grande homogeneidade da amostragem que compõe nosso estudo: animais adultos jovens, desprovidos de outras patologias, portadores de Infarto do Miocárdio sem outras lesões coronárias adicionais, que iniciaram o tratamento bastante precocemente, independentemente da intensidade da repercussão funcional do IM, submetidos à mesma dieta e condições de vida. Estas particularidades permitem superar dificuldades apontadas como inevitáveis nos grandes ensaios clínicos em humanos (PFEFFER et al, 1985).
Estudos que analisaram a farmacologia dos digitálicos em ratos provêem informações que devem ser consideradas. O aspecto mais destacado é a menor sensibilidade da Na/K ATPase destes animais à ação inibidora dos digitálicos(ALLEN et al, 1969). Realmente, foi demonstrado que a Na/K ATPase do miocárdio de ratos tem a sensibilidade duas a três vezes menor do que o miocárdio canino e o bovino(ALLEN et al, 1969). Esta particularidade permite entender as elevadas doses ministradas aos roedores e os níveis plasmáticos de digitoxina por nós encontrados (HELBER et al, 2004) anteriormente (116 ± 14 ng/ml) muito superiores àqueles recomendados para humanos: menor que 34 ng/ml (BELLER et al, 1971). Gera, também, a cogitação de que os ratos possam ser menos sensíveis a arritmias provocadas pelos digitálicos, que vem sendo insistentemente apontada como possível fator de comprometimento da sobrevida nos pacientes do estudo DIG (DIGITALIS INVESTIGATION GROUP, 1997).
mostraram que o teor de água dos pulmões dos animais de ambos os grupos foram superiores aos valores históricos do nosso laboratório, indicando que a síndrome congestiva esteve presente nos dois grupos, coincidindo com as informações dos estudos necroscópicos. Contudo, a congestão pulmonar foi mais acentuada nos animais não tratados, sugerindo que a intensidade da ICC foi menor nos animais submetidos a tratamento. Este achado está coerente com os dados dos ensaios clínicos que reportam melhora da IC e dos índices de qualidade de vida nos doentes digitalizados (PACKER et al, 1993; ADAMS et al, 1997; URETSKY et al, 1993)e piora naqueles em que o digital foi retirado (PACKER et al, 1993; ADAMS et al, 1997; URETSKY et al, 1993). Concilia-se, também, com relatos de que o uso crônico da droga é importante para sustentar o desempenho cardíaco (ARNOLD et al, 1980). Foi descrito, ainda, que a suspensão de digitálicos em doentes cronicamente digitalizados é acompanhada de aumento da pressão capilar pulmonar e que a readministração aguda da droga restaura o padrão hemodinâmico inicial (ARNOLD et al, 1980).
1965). A resposta contrátil promovida pela pausa na estimulação – que é uma manobra dependente da funcionalidade do retículo sarcoplasmático (RS) – indicou que a função desta organela nos animais digitalizados estava menos comprometida do que nos animais não tratados. A acentuação da –dT/dt nos ratos digitalizados, indicando relaxamento mais eficiente nos animais digitalizados. Desde que a ação inotrópica mais importante dos digitálicos não envolve o RS (LITTLE et al, 1987) e que há indicações de que os digitálicos não afetam o relaxamento (LITTLE et al, 1987), estes achados sugerem que o RS foi menos comprometido nos animais tratados, favorecendo a idéia de atenuação do remodelamento. Estes efeitos, possíveis de serem destacados em nossos experimentos, não excluem que outras ações farmacológicas dos digitálicos tenham contribuído para prolongar a vida dos animais. Neste aspecto, destaquem-se as já reconhecidas ações sobre a hiperatividade do sistema renina-angiotensina-aldosterona e do sistema nervoso simpático.
tratamento com digitálico e o efeito mais favorável em portadores de disfunções ventriculares mais acentuadas.
5. Conclusões
5.1. Concordantemente com o estudo DIG os digitálicos não aumentaram a sobrevida geral, porém chamou a atenção para o grupo no qual a insuficiência cardíaca deveu-se a grande acometimento do ventrículo esquerdo, havendo aumento significativo da sobrevida, necessitando-se reavaliar o uso do medicamento neste grupo.
5.2. No grupo de animais digitalizados houve melhora significante nos padrões de contratilidade do músculo cardíaco, bem como diminuição do teor de água nos pulmões, ou seja, melhora da síndrome congestiva, concordantemente com os estudos PROVE e RADIANCE.
5.3. O mecanismo que determinou melhora nos parâmetros de contratilidade e menor comprometimento do retículo sarcoplasmático, não pôde ser elucidado por esse trabalho.
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Caixa de Entrada: JPET/2008/143859 Submission (22 de 82) Data: Thu, 24 Jul 2008 10:53:43 -0700 [24-07-2008 14:53:43 BRT] De: jpet@aspet.org
Para: "Paulo J.F. Tucci" <tucci@fcr.epm.br>
Cc: Izo Helber <helber@terra.com.br> , "Ednei L. Antonio" <ednei@fcr.epm.br> , "Alexandra A. dos Santos" <alexandraalberta@ig.com.br> ,
"Danilo S. Bocalini" <bocalini@fcr.epm.br> ,
Mihai Gheorghiade <m-gheorghiade@northwestern.edu> Assunto: JPET/2008/143859 Submission
MS ID#: JPET/2008/143859
MS TITLE: Digitoxin prolongs survival of female rats with heart failure due to large myocardial infarction
Dear Dr. Tucci:
This is to acknowledge your on-line submission to JPET. Once we have received the manuscript handling fee of $50 you will receive the name of the Associate Editor assigned to your work.
Thank you for giving us this opportunity. Sincerely,
http://fcr.epm.br/horde/index.php?url=http%3A%2F%2Ffcr.epm.br%2Fhorde%2F (1 de 2)26/8/2008 11:53:02
Correio :: Caixa de Entrada: JPET/2008/143859 Submission Rick G. Schnellmann, Ph.D.
Editor in Chief
---
Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics
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Bethesda, MD. 20814-3995
Phone:301-634-7064 (David Williams) 301-634-7978 (Jill Filler) Fax:301-634-7158
DIGITOXIN PROLONGS SURVIVAL OF FEMALE RATS WITH HEART
FAILURE DUE TO LARGE MYOCARDIAL INFARCTION *
1
Izo Helber, MD; 1Ednei L. Antonio, MS; 1Alexandra A. dos Santos, MD;
1
Ronald L. G. Flumignan, MD; 1Danilo Bocalini, MS; 2Mihai Gheorghiade,
MD, FACC; 1Paulo J. F. Tucci, MD, PhD
Cardiac Physiology and Physiopathology Laboratory , Federal University
of São Paulo, São Paulo, Brazil
1 Federal University of São Paulo (UNIFESP), Brazil
Running title: Digitoxin prolongs survival in heart failure
Corresponding author:
Dr Paulo JF Tucci
Rua Estado de Israel, 181/94 CEP: 04022-000, São Paulo, Brazil TEL (FAX) number: (5511) 5572-1452 Email: paulotucci@terra.com.br
Text pages: 15
Number of tables: 2
Number of figures: 3
Number of references: 39
Number of words of:
Abstract: 231
Introduction: 457
Digitoxin prolongs survival of female rats with heart failure due to large
myocardial infarction
Abstract
Congestive heart failure (CHF) is a major predictor of death. We analyzed, for
the first time, whether digitoxin affects survival of rats with CHF. The influence
of digitoxin (0.1 mg/100 g/day, orally) on the survival of infarcted female rats (n
= 170) randomized as Control (C: n = 85) or Digitoxin (D: n = 85) was evaluated
during 280 days. Mean survival was 235 ± 7 days for C and 255 ± 5 days for D
(logrank test: p = 0.0602). Digitoxin did not affect survival in rats with CHF due
to myocardial infarction <40% of the left ventricle but did prolonged survival in
rats with infarction ≥40%. The logrank test defined higher mortality (p =
0.0161) in C>40% (56%) than in D>40% (34%), with a hazard ratio of 2.03.
Pulmonary water content and papillary muscle mechanics were analyzed in C
(n = 7) and D (n = 14) survivors. Significant differences were observed
regarding pulmonary water content (C: 82 ± 0.4; D: 80 ± 0.3%; p = 0.0014),
developed tension (C: 2.7 ± 0.3; D: 3.8 ± 0.3 g/mm2; p = 0.0286) and +dT/dt (C:
24 ± 3; D: 39 ± 4 mg/mm2/s; p = 0.0109). In conclusion, long-term digitoxin
administration reduced cardiac impairment after myocardium infarction,
attenuated myocardial dysfunction, reduced pulmonary congestion, and
provided the first evidence regarding the efficiency of digitalis in prolonging
Currently, the importance of a treatment is based on its influence on
patient survival. The survival effect of several heart failure therapies has been
assessed (Pfeffer et al, 1992; The SOLVD investigators, 1992; Members of the
AIRE Study, 1993; Kober et al, 1995; The Digitalis Investigation Group, 1997).
The Digitalis Investigation Group (DIG) trial (The Digitalis Investigation Group,
1997) was an attempt to answer the question whether digoxin had any effect on
survival of patients presenting congestive heart failure (CHF) and sinus rhythm
who were receiving diuretics and an angiotensin-converting enzyme inhibitor.
In the main trial, although digoxin reduced heart failure-related death and
hospitalization it did not reduce overall mortality.
After the main DIG report, the use of digitalis glycosides to treat heart
failure declined. Later works from analyses of this trial’s data uncovered new
findings (Adams et al, 2005; Ahmed et al, 2006; Ahmed et al, 2007;
Gheorghiade et al, 2006; Rathore et al, 2003; Rich et al, 2001). Analyses of
subgroups suggested that digitoxin did reduce overall mortality of CHF patients
in certain situations. Particular emphasis was given to digitoxin serum
concentration as a modifying factor for the results. In patients with plasma
concentrations below 0.9 ng/ml, overall mortality was lower in treated than in
untreated patients (Adams et al, 2005; Ahmed et al, 2006; Rathore et al, 2003).
Analysis of the influence of treatments on human survival includes
aspects that can complicate the correct conclusion (Pfeffer et al, 1985). Special
difficulties are created by the diversities of the casuistic peculiarities in relation
to patient age group, the type, intensity, and duration of the cardiac pathology,
more control of intervening factors in the study design. Accordingly, diverse
works analyzed the influence of therapies on the survival of animals with heart
failure secondary to myocardial infarction (MI). Antagonists of angiotensin
converting enzyme (Pfeffer et al, 1985; Milavetz at al, 1996; Lapointe et al,
2002), AT1 receptors (Milavetz at al, 1996), neutral endopeptidase (Lapointe et
al, 2002; Marie et at, 1999), endothelin (Mulder et al, 1997; Sakai et al, 1996)
and calcium sensitizer (Levijoki et al, 2001) have already been tested in
animals. Of major importance is the pioneering evaluation of captopril on the
survival of rats with CHF secondary to MI (Pfeffer et al, 1985), the first
consistent and substantial success in the natural history of CHF. Curiously, no
published works to our knowledge have reported the effect of long-term
administration of digitalis glycosides on the survival of animals with CHF.
In this work, we studied the influence of early digitoxin administration
over a prolonged period in decompensate infarcted female rats, verifying that
METHODS
Protocol
The study was conducted in accordance with the Guide for the Care
and Use of Laboratory Animals published by the United States National
Institutes of Health (National Institutes of Health publication no. 96-23, revised,
1996).
Virgin female Wistar rats, aged from 70 to 90 days (body weight 180
to 220 g), underwent coronary artery ligation according to a previously
described method (Kanashiro, 2002; Cury et al, 2005; Peron et al, 2005) and
were housed in our animal facilities. Five days after coronary occlusion the rats
were anesthetized (ketamine, 90 mg/kg and xylazine, 10 mg/kg;
intraperitoneally), and a nine-lead electrocardiogram with six limb leads and
three chest leads was recorded. When the previous described criteria (Bonilha
et al, 2005) for MI were achieved, the rats were examined with Doppler
echocardiography. Those rats with a MI smaller than 20% of the left ventricle
(LV) perimeter were discharged. Rats with MI of at least 20% of the LV (n =
172) were immediately identified by an ID 100 implantable Trovan transponder
(Trovan Electronic Identification System, Ulm, Germany) affixed to the nape of
the neck and randomized into two groups: (a) a control group (Control: n = 85)
that received standard rat chow containing 0.6% of sodium (Nuvilab CR1,
manufactured by Nuvital, Curitiba, Brazil) and (b) a treated group (Digitoxin: n =
87) that received standard rat chow with added digitoxin, as previously
described (Helber et al, 2004). The digitoxin was mixed with the rat chow
as recommended by other authors (Aldinger, 1970, Turto et al, 1975, Williams
and Braunwald, 1965). The positive inotropic effect of digitoxin given via rat
chow and this method’s achievement of a serum concentration that is similar to
that achieved when the drug is administered subcutaneously were documented
previously (Helber et al, 2004).
The rats were observed for 280 days in four subgroups by
intervention and MI size: 1) Control with MI of 20% to 39% of the LV (C<40); 2)
Control with MI of at least 40% of the LV (C≥40); 3) Digitoxin with MI of 20% to
39% of the LV (D<40); and 4) Digitoxin with MI of at least 40% of the LV (D≥40).
The rats lived in clear polyethylene cages with up to four rats each in a single
room of our animal facility, on a 12 h light-dark cycle with independent
ventilation, temperature, and humidity controls. The cages were inspected daily,
and the date of any death was noted. Postmortem examination was
performed, and the lungs, heart, and abdominal viscera were placed in formalin
for subsequent necropsy studies with hematoxylin-eosin.
Doppler echocardiogram studies
The Doppler echocardiographic examination was performed using a
HP Sonos 5500 (Philips Medical System, Andover, USA) with a 12 MHz
transducer at 2 cm depth by the same examiner (A.A.), in accordance with a
previous report (Cury et al, 2005). Briefly, two-dimensional and M-mode images
from the parasternal longitudinal, transverse, and apical views were obtained
and recorded on a 0.5-inch videotape, and imaging analysis and measurements
were performed offline. MI size was estimated on the basis of subjective
myocardial infarction (AMI) and the total perimeter of the endocardial border
(PE) were measured 3 times at end-diastole. Myocardial infarction size (MIS)
was calculated as:
MIS (%) = AMI/PE x 100
The final MIS of each rat was calculated as the mean of the 3
estimates of MIS. The end-diastolic (LVAd) and end-systolic (LVAs) LV areas,
as well as the fractional area change (FAC), peak E and A velocities, and the
E/A ratio, were determined according to the American Society of
Echocardiography.
Papillary muscle mechanics and pulmonary water content
At the end of the observation period, 30 surviving rats were
randomized by a group-blinded researcher (D.S.B.) for a study of myocardial
mechanics and lung water content. After anesthesia, the heart was quickly
removed and placed in oxygenated Krebs-Henseleit solution. The papillary
muscle was dissected free, mounted between 2 spring clips, and placed
vertically in a chamber containing Krebs-Henseleit solution; myocardial
mechanics were determined according to a previous report (Peron et al, 2005).
Using AcqKnowledge 3.5.7 (Biopac Systems Inc, Santa Barbara, Calif)
software, we determined peak developed tension (DT), maximum rate of
tension increase (+dT/dt) and decrease (-dT/dt), and resting tension (RT).
Measurements were made at muscle length where contraction force was peak
(Lmax). Post-rest contraction behavior was analyzed following rests of 15, 30
Pulmonary water content was obtained based on wet and dry
weights, and the water content (%H2O) was determined using the following
equation:
%H2O = (wet weight – dry weight) / wet weight x 100
Statistical analysis
The data are presented as mean ± the standard error of mean.
Differences in distribution of infarct size were investigated by the Chi-square
test. For comparison of continuous data, the Student’s t test or ANOVA one way
were used. Survival analysis was done with the Kaplan-Meier estimator, and
group survival was compared with the logrank test. The Cox regression model
was applied to estimate the risk of mortality in Control and Digitoxin group rats.
RESULTS
Two rats from the Digitoxin group were excluded from the study. One
of these was eliminated because a damaged videotape precluded the correct
determination of MIS. Given that the allocation of the rats into one subgroup or
the other was based on MIS at the onset of the protocol, this rat was eliminated,
while alive, as soon as the problem was identified. The other rat had an
exceptionally large abnexial benign cutaneous hamartoma that prevented it
from moving in order to eat. No other pathologies that demanded exclusion
were found.
The study sample consisted of the 170 remaining female rats.
The distribution of MI sizes was not significantly different (Chi-square
test: P = 0.430) between the untreated and treated groups (Table 1), and the
mean size in untreated rats (42 ± 0.9 %) and treated rats (40 ± 1.0%) was
similar (unpaired t test). Moreover, comparisons (unpaired t test) between the
moderate (C<40: 32.9 ± 4.86% vs D<40: 30.8 ± 5.78%; p = 0.1277) and severe
MI subgroups (C>40: 47.5 ± 5.02% vs D>40: 47.0 ± 6.09%; p = 0.6742)
revealed no statistically significant difference in MIS.
During the observation period, 36% (61/170) of the rats died. Among
the treated rats, 29% (25/85) died, and among the untreated rats, 42% (36/85)
died. Figure 1A presents the Kaplan-Meier curves for groups C and D. The
survival curve of rats on Digitoxin treatment remained above the curve of
Control rats throughout the experiment. The probability of surviving 280 days
was 71% for treated rats and 58% for untreated rats. Mean survival time was
220 to 249) for untreated rats, a borderline statistically significant difference
(logrank test, p = 0.0602).
In rats with MI below 40% of the LV, mortality was 17% (5/30) in the
control group and 23% (8/35) in the treated group (Figure 1B). Probability of
survival after 280 days was 83% for untreated rats and 77% for treated rats, a
non-statistically significant difference (logrank test, p = 0.5595).
In rats with MI of at least 40% of the LV, mortality was 56% (31/55) in
the control group and 34% (17/50) in the treated group. Mean survival for
control rats was 220 days (95%CI: 200 to 239) and for treated rats was 251
days (95%CI: 235 to 266). Throughout the observation period, the survival
curve was higher for treated rats than for untreated rats (Figure 1B). Probability
of rat survival after 280 days was 66% for the treated group and 44% for the
control group. The difference in survival times was statistically significant
(logrank test, p = 0.0161), and the risk of mortality in control rats was 2.03-fold
greater (95%CI: 1.13 to 3.68) than the risk in treated rats (Cox regression, p =
0.019). Interestingly, mortality comparison of the digitoxin-treated groups (D<40
vs D≥40) showed no statistically significant difference (p = 0.2995), while the
difference between the untreated groups (C<40 vs C≥40) was clearly significant
(p = 0.0008)
Doppler echocardiogram
Doppler echocardiogram data obtained before randomization of the
rats were similar between the Digitoxin and Control groups, with no statistically
significant differences between the group values (Table 2). Values from
functional modifications in the results from rats with large infarcts compared to
those with moderate infarcts.
Myocardial mechanics and pulmonary water content
Among the 30 rats that were randomized for myocardial mechanics
and pulmonary water content analyses, 9 died during anesthesia: 2 of 16
treated rats and 7 of 14 control rats (Fisher’s exact test, p = 0.045). Of the 14
surviving treated rats, MIS was at least 40% of the LV in 9 (64%) and below
40% in 5 (36%). Among the 7 surviving untreated rats, MIS was at least 40% of
the LV in 4 (57%) and below 40% in 3 (43%). Mean MIS in treated rats (37 ±
7%) and untreated rats (39 ± 7%) did not statistically significantly differ.
In the rats in this study, the pulmonary water content was higher than
the values (x ± SD: of 78 ± 0.7 %) previously reported by our group for normal
rats (Flumignan et al, 2006). Figure 2 illustrates the means and standard error
of mean verified in the rats studied in this work. Analysis of these data by
two-tailed Student’s t test for independent samples identified a significant difference
(p = 0.0014) between the values of treated (80 ± 0.3%) and untreated rats (82 ±
0.3%).
The results from the myocardial mechanics study are shown in
Figures 2 and 3. With exception of the results related to RT (C: 1.33 ± 0.13; D:
1.37 ± 0.11 g/mm2), papillary muscles of treated rats had attenuated contraction
and relaxation depression as compared to those of untreated rats. We found
group, differences for DT (C: 2.71 ± 0.32; D: 3.80 ± 0.27 g/mm2; p = 0.0286,
Student’s t test for independent samples), +dT/dt (C: 23 ± 3; D: 39 ± 3 g/mm2/s,
