LUIZA HELENA GREMSKI
ANÁLISE DO TRANSCRIPTOMA DA GLÂNDULA
PRODUTORA DE VENENO DE
Loxosceles intermedia
(ARANHA-MARROM): PERFIL DE EXPRESSÃO E
IDENTIFICAÇÃO DE NOVAS TOXINAS
LUIZA HELENA GREMSKI
ANÁLISE DO TRANSCRIPTOMA DA GLÂNDULA
PRODUTORA DE VENENO DE
Loxosceles intermedia
(ARANHA-MARROM): PERFIL DE EXPRESSÃO E
IDENTIFICAÇÃO DE NOVAS TOXINAS
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Gremski, Luiza Helena
Análise do transcriptoma da glândula produtora de veneno de Loxosceles intermedia
(aranha-marrom): perfil de expressão e identificação de novas toxinas.
São Paulo, 2010. 120p.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina
Tese preparada no Departamento de Bioquímica durante o Curso de Pós-Graduação em Biologia Molecular e apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga
AGRADECIMENTOS
Ao meu marido Guilherme pelo incondicional apoio em todos os momentos e decisões da minha vida profissional, e por tornar minha vida mais doce todos os dias.
A Profª Olga Meiri Chaim, colega de laboratório e amiga, pelo apoio, conselhos, idéias e exemplo de conduta. Obrigada por confiar em mim.
Aos inesquecíveis amigos Dilza, Youssef, Andrea, Katia, Márcia, Rafael, Valéria e Daniele por todos esses anos de ótima convivência, aprendizado e auxílio na elaboração deste trabalho. Pelo exemplo de conduta profissional que vocês me deram. A vocês, todo o meu afeto e respeito.
Aos professores Silvio Zanata, Lia Nakao, Adriana Mercadante e Oldemir Mangili da UFPR pela amizade de tantos anos e exemplo de conduta profissional e amor pela ciência.
Aos amigos do Laboratório de Matriz Extracelular, Fernando, Gabriel, Thiago, Adriana, Marianna, Fernanda, Jenifer, Reginaldo, Paulo Henrique, Larissa, Daniela, Ana Carolina, Soraya e Marta. Agradeço a doce convivência no dia-a-dia e por todo o auxílio na elaboração deste trabalho.
Aos funcionários Patrícia, Elsa e Marlene, pela paciência e disposição em ajudar; aos professores, estudantes e funcionários do INFAR, em especial à Profa. Leny Toma e aos colegas Juliana Dreyfuss e Tarsis Ferreira, pela atenção e disposição indispensável em vários momentos da execução desta tese.
Ao Prof. Christian M. Probst, pela disposição em me auxiliar nas análises de dados. Ao Prof. Humberto Madeira e suas orientadas Hellen e Daniele pelo auxílio fundamental e disposição incondicional essenciais para a elaboração deste trabalho.
A CAPES, CNPq, FAPESP e Fundação Araucária-PR e Secretaria de Estado de Ciência, Tecnologia e Ensino Superior do Paraná, pelos recursos financeiros essenciais à realização deste trabalho de tese.
ESTE TRABALHO DE TESE FOI DESENVOLVIDO DENTRO DAS NORMAS IMPOSTAS PELA LEGISLAÇÃO ATUAL, NO QUE DIZ RESPEITO AO USO DE ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS, COM O CERTIFICADO DE QUALIDADE EM BIOSSEGURANÇA N° 0028/97, PUBLICADO NO D.O.U. EM 31/03/1998.
ÍNDICE GERAL
I – INTRODUÇÃO ... 1
1. Aranhas ... 1
2. Aranhas do gênero Loxosceles ... 2
3. Epidemiologia do loxoscelismo no Brasil ... 4
4. Loxoscelismo ... 5
4.1. Loxoscelismo cutâneo ... 6
4.2. Loxoscelismo cutâneo-visceral ... 7
4.3. Terapia aplicada no loxoscelismo ... 8
5. Veneno das aranhas do gênero Loxosceles ... 11
6. Inibidores de serino proteases ... 15
7. Toxinas recombinantes de L. intermedia ... 16
8. Aplicações biotecnológicas das toxinas loxoscélicas ... 18
9. Transcriptoma e venenos ... 19
II – OBJETIVOS ... 21
III – JUSTIFICATIVA ... 22
IV – RESULTADOS ... 23
A - Item 1: Um novo perfil de expressão da glândula de veneno da aranha Loxosceles intermedia demonstrado por análise transcriptômica .. 24
B - Item 2: Identificação, clonagem e expressão de um inibidor de serino protease do veneno de Loxosceles intermedia (aranha marrom).... 41
B.1. Material e métodos ... 42
B.2. Resultados ... 50
V – DISCUSSÃO ... 63
VI – CONCLUSÕES ... 79
VII – ABSTRACT ... 80
IX – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 82
X – ANEXOS ... 97
Curriculum vitae resumido ... 97
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1: Aranha-marrom do gênero Loxosceles ... 2 FIGURA 2: Sequência da EST identificada pela análise do
transcriptoma da glândula de L. intermedia semelhante a um
inibidor de serino-protease ... 51 FIGURA 3: Obtenção do fragmento correspondente à sequência
completa do inibidor de serino-protease e clonagem ... 51 FIGURA 4: Sequências nucleotídicas e aminoacídicas do inibidor de
serino-proteases do veneno de L. intermedia ... 53 FIGURA 5: Alinhamento de sequências de inibidores de
serino-proteases pertencentes à família das serpinas de diferentes
organismos... 55 FIGURA 6: Porcentagem de positividade obtida a partir do
alinhamento das sequências dos diferentes membros da família
das Serpinas em relação à Serpina de L. intermedia ... 57 FIGURA 7: PCR de alta fidelidade para obtenção da sequência
codificante da Serpina ... 58 FIGURA 8: SDS-PAGE representativo do teste de expressão do
inibidor de serino proteinase recombinante em BL21(DE3) pLysS ... 59 FIGURA 9: Reação de Western Blot com anticorpo anti-HisTag
sobre amostra do teste de expressão da Serpina ... 60 FIGURA 10: Teste de solubilidade do inibidor de serino-protease
1
I – INTRODUÇÃO
1. Aranhas
O filo Arthropoda inclui os subfilos Trilobitomorpha, Crustacea, Hexapoda, Myriapoda e Chelicerata. Os artrópodes estão entre as espécies mais bem sucedidas na terra e são encontrados em todos os tipos de ambientes (BRUSCA e BRUSCA, 2002; BARNES, 1990). Uma de suas características é a presença de um exoesqueleto composto de quitina, que fornece sustentação e proteção física (VARKI, 2008).
Os organismos pertencentes ao subfilo Trilobitomorpha estão extintos. O subfilo Hexapoda é o mais numeroso, contendo cerca de 85% dos artrópodes hoje conhecidos. O subfilo Chelicerata inclui organismos como aranhas, escorpiões e ácaros (BARNES, 1990). O subfilo Chelicerata inclui entre outras classes, a classe Arachnida. Dentro desta classe, é a ordem Araneae que descreve as aranhas. Estão descritas até hoje 109 famílias de aranhas (PLATNICK, 2010).
As aranhas são animais predadores e, para isso, possuem um par de glândulas produtoras de veneno que lançam seu conteúdo por um canal que atravessa as quelíceras. As quelíceras têm um formato pontiagudo e são responsáveis pela inoculação do veneno nas vítimas. Além disso, estas estruturas também são utilizadas para macerar a presa e facilitar sua ingestão (BARNES, 1990).
2 localização geográfica mais restrita também causam envenenamento mais severo em humanos; estas pertencem aos gêneros Atrax e Hadronyche spp. (“funnel web spiders”) localizadas na Austrália, e Phoneutria spp. (armadeiras), localizadas no Brasil (ISBISTER et al, 2004).
2. Aranhas do gênero Loxosceles
A família SICARIIDAE (Keyserling, 1880) abrange o gênero Sicarius
(Walckenaer, 1847) e o gênero Loxosceles (Heineken & Lowe, 1832).
As aranhas que pertencem ao gênero Loxosceles são popularmente denominadas aranhas-marrons. Este título se justifica pelo fato de que a coloração desses animais varia de marrom claro (como a espécie Loxosceles laeta) a marrom escuro (Loxosceles gaucho). As aranhas desse gênero também são conhecidas como aranhas violino já que possuem um desenho na parte posterior do cefalotórax que lembra o instrumento (Figura 1) (FUTRELL, 1992; DA SILVA et al, 2004).
3 As aranhas-marrons têm um porte pequeno e o comprimento do seu corpo varia entre 4 e 15 mm. Suas pernas são longas, medindo entre 8 e 30 mm. Possuem seis olhos organizados em pares, com uma díade anterior e as outras díades localizadas em cada lado (DA SILVA et al, 2004); a disposição dos olhos em pares tem sido descrita como o melhor meio para distinção entre as espécies do gênero (VETTER AND VISSCHER, 1998). Uma descrição detalhada da glândula de veneno de Loxosceles intermedia mostrou que a organização deste órgão no gênero segue a arquitetura das aranhas em geral (DOS SANTOS et al, 2000). Além disso, DOS SANTOS (2000) descreveu que o epitélio secretor é revestido por uma membrana basal e rodeado por uma espessa camada de músculo estriado. As células do epitélio secretório são ricas em vesículas contendo veneno. Apesar de alguns autores destacarem que o veneno é produzido por células apócrinas, a morfologia das glândulas e das células indica que o tipo de secreção é holócrina (DOS SANTOS, et al, 2000).
As espécies do gênero Loxosceles podem resistir a temperaturas que variam entre 8 a 43°C e podem sobreviver por vários dias e até por alguns meses sem alimento ou água (DA SILVA et al, 2004). São aranhas retraídas, que não possuem comportamento agressivo e preferem viver em áreas escuras (MÁLAQUE et al, 2002). Com a diminuição do seu habitat natural, as aranhas-marrons adaptaram-se muito bem ao ambiente intra e peridomiciliar. O veneno das aranhas do gênero Loxosceles é usado para paralisar a presa (inseto) e também como mecanismo de defesa. Os acidentes com humanos geralmente acontecem quando a pessoa comprime inadvertidamente o animal contra a pele ao vestir-se, calçar-se ou até mesmo enquanto estão dormindo. Em todos os casos a picada ocorre somente como forma de defesa (FUTRELL, 1992; FISCHER, 1996). Como a picada é indolor, a vítima geralmente só percebe que foi picada horas depois, o que dificulta o tratamento.
Estas aranhas também possuem dimorfismo de gênero, sendo que as fêmeas possuem um corpo maior e pernas mais curtas que os machos (APPEL
et al , 2005). Estudos mostram que o veneno produzido pelas fêmeas deste gênero é mais tóxico e produzido em maior quantidade (DE OLIVEIRA et al,
4
Loxosceles spp. são aranhas cosmopolitas encontradas tanto em regiões de clima tropical, quanto temperado. Cerca de 100 espécies foram descritas em todo o mundo, a maioria delas nas Américas, Índias Ocidentais e na África (BINFORD et al, 2009). O continente americano abriga a maior parte das espécies, sendo que cerca de 50 delas foram descritas somente na América do Norte (GOMEZ et al, 2001). Os acidentes provocados por aranhas deste gênero são considerados problema de saúde pública em determinadas regiões do Brasil, Chile e Peru (DA SILVA et al, 2004; SOUZA et al, 2008).
Segundo PLATNICK (2010), 10 espécies do gênero Loxosceles já foram descritas no Brasil. São elas: L. adelaida, L. amazonica, L. anomala, L. gaucho, L. hirsuta, L. immodesta, L. intermedia, L. laeta, L. puortoi e L. similis. No estado Paraná quatro espécies são comuns: L. intermedia; L. gaucho; L. laeta
e L. hirsuta (MARQUES DA SILVA e FISCHER, 2000). No município de Curitiba (PR) a espécie predominante é a Loxosceles intermedia.
3. Epidemiologia do loxoscelismo no Brasil
O termo loxoscelismo descreve os acidentes envolvendo aranhas pertencentes ao gênero Loxosceles (DA SILVA et al, 2004). Em 1954, no Hospital Vital Brasil no Instituto Butantan (São Paulo – SP) foi descrito o primeiro caso de loxoscelismo no Brasil (CARDOSO et al, 1990). As regiões sul e sudeste são as que mais registram casos de acidentes com aranhas-marrons. Na maior parte das vezes as espécies envolvidas são L. intermedia, L. gaucho e L. laeta (DA SILVA et al, 2004).
Dados do sistema de notificação de agravos do Ministério da Saúde revelam que quase 43% dos acidentes araneídeos (acidentes causados por aranhas) ocorridos no Brasil em 2008 são atribuídos a aranhas do gênero
Loxosceles (MS, 2008).
5 do estado do Paraná: em 2008 ocorreram 3.890 casos nestas localidades (SMS/CE/CVE-SINAM, 2009). Portanto, pode-se afirmar que Curitiba e Região Metropolitana são áreas endêmicas para os acidentes com aranhas-marrons e isso é, provavelmente, consequência de mudanças ambientais e desequilíbrios ecológicos que impedem a manutenção da densidade populacional das espécies em níveis estáveis (BARBARO; JARED; MOTA, 1995).
Sendo assim, vários autores salientam uma necessidade crescente de estudos envolvendo aranhas deste gênero, assim como o veneno produzido por elas. Além disso, esta predominância do loxoscelismo no Brasil exige também a avaliação de fatores ambientais que favorecem essa condição estatística como, por exemplo, desequilíbrio ambiental e ausência de predadores (RIBEIRO et al., 1993; MARQUES DA SILVA, 2002; MARQUES-DA-SILVA e FISCHER, 2005).
4. Loxoscelismo
6 espécie de aranha-marrom envolvida, o estágio de desenvolvimento do animal e o tempo que a vítima leva para procurar auxílio médico também influenciam na gravidade do acidente (DE OLIVEIRA et al., 1999, DE OLIVEIRA et al., 2005, BARBARO et al., 1994).
4.1. Loxoscelismo cutâneo
A picada em si é geralmente indolor e o ferimento que ela causa é mínimo. Dentro das primeiras 12 a 24 horas o local da picada torna-se eritematoso, levemente edemaciado, dolorido e pode desenvolver uma hemorragia que torna o local sarapintado, o que corresponde à área de necrose iminente (ISBISTER et al, 2004). Denomina-se esta área de placa marmórea: uma área isquêmica, circundada por um halo vermelho e zonas pálidas ao centro.
Com o decorrer do tempo a lesão necrótica adquire uma coloração escura e um nítido espalhamento gravitacional, o que aumenta ainda mais a área de necrose tecidual. Esta lesão dermonecrótica que se espalha gravitacionalmente é a marca registrada do chamado quadro cutâneo ou dermonecrótico (FUTRELL, 1992 e DA SILVA et al, 2004).
Quando sem tratamento a lesão evolui em três a sete dias para uma ferida rígida que pode expor uma escara de difícil cicatrização ao longo do tempo (3 a 8 semanas) (APPEL et al, 2005). A úlcera resultante é geralmente dolorosa e lenta para cicatrizar, com ciclos de cicatrização parcial seguido de colapso, às vezes se estendendo por alguns meses (ISBISTER et al, 2004). Dependendo da evolução deste quadro, uma cirurgia plástica reparadora pode ser necessária para remoção do tecido necrosado e substituição por enxerto (FUTRELL, 1992 e DA SILVA et al, 2004). Muitas vezes a lesão dermonecrótica pode ser agravada por uma infecção secundária. A presença de bacilos anaeróbios, tais como o Clostridium perfringens, já foi descrita nas quelíceras e no veneno da aranha-marrom. Estes agentes podem complicar o efeito dermonecrótico do veneno (MONTEIRO et al, 2002).
7 revelam que já após quatro horas de exposição, uma rede intravascular de fibrina se forma. Observam-se também trombose em vasos da derme, vasos sangüíneos degenerados, intenso infiltrado inflamatório na derme e mesmo na musculatura esquelética da hipoderme. Um quadro de edema também pode ser observado na derme, caracterizado pela desorganização das fibras de colágeno. Além disso, quadros como hemorragia e necrose são também descritos. Este conjunto de características pode ser classificado como uma necrose coagulativa asséptica que se instala entre 24 horas e cinco dias após a exposição ao veneno (OSPEDAL et al, 2002). ELSTON e colegas (2000) demonstraram infiltrado inflamatório misto na derme, vasculite e necrose coagulativa da pele em biópsias de pele de coelhos expostos ao veneno de L. reclusa, após 14 dias da inoculação.
Um aspecto bastante interessante do quadro cutâneo do loxoscelismo é que ele não se desenvolve macroscopicamente em camundongos. No entanto, entre 4 a 6 horas após a inoculação, biópsias da pele desses animais revelam alterações histológicas como infiltrado de células inflamatórias, edema na derme e alterações visíveis nos vasos sanguíneos que afetam sua integridade (SUNDERKOTTER et al., 2001).
4.2. Loxoscelismo cutâneo-visceral
A forma sistêmica do loxoscelismo é bem menos comum do que a cutânea, ocorrendo em menos de 1% dos acidentes com aranhas do gênero (VETTER e ISBISTER, 2008; TAMBOURGI et al, 2010). No entanto é um quadro muito mais grave do que as injúrias cutâneas e os sintomas incluem hemólise intravascular, agregação plaquetária, coagulação intravascular e falência renal aguda a qual é a maior responsável pelos casos de óbito no loxoscelismo. Os sinais e sintomas sistêmicos relacionados ao sistema nervoso central tais como astenia, episódios eméticos, cefaléia, convulsão e coma, são sugestivos de alteração sistêmica (FUTRELL, 1992).
8 hemoglobinúria, proteinúria e choque (FRANÇA et al, 2002; CHAVES-MOREIRA et al, 2009). Estes efeitos em conjunto com a agregação plaquetária podem gerar anemia hemolítica, trombocitopenia e coagulação intravascular disseminada (FUTRELL, 1992; DA SILVA et al, 2004).
O efeito nefrotóxico do veneno de Loxosceles intermedia é demonstrado em camundongos expostos experimentalmente ao veneno total. A caracterização histopatológica mostra hialinização e eritrócitos no espaço de Bowman, colapso glomerular, citotoxicidade de células epiteliais tubulares e deposição de material proteináceo no lúmen tubular (LUCIANO et al, 2004). Os mecanismos pelos quais o veneno exerce essa atividade nefrotóxica ainda não foram completamente elucidados. No entanto, já é sabido que a família de fosfolipases-D presentes no veneno, induz nefrotoxicidade pela interação com a membrana das células e atividade fosfolipásica direta e pela geração de mediadores inflamatórios específicos que tornam as células do tecido renal mais vulneráveis ao estresse fisiológico, culminando em uma injúria renal (KUSMA et al, 2008).
Muitas condições clínicas são erroneamente diagnosticadas como acidente loxoscélico, portanto deve ser realizado diagnóstico diferencial para uma série de doenças como vasculite, infecções bacterianas e herpes, entre outras. O diagnóstico precoce da picada abre caminho para evitar o desenvolvimento da lesão, porém, após certa evolução da dermonecrose, o tratamento é apenas sintomático (APPEL et al., 2005; SWANSON e VETTER, 2006).
4.3. Terapia aplicada no loxoscelismo
Para a maioria dos acidentes com aranhas do gênero Loxosceles, a terapia que envolve descanso, gelo, compressão e elevação do membro afetado é considerada apropriada, pois a maioria dos acidentes desenvolve um quadro mínimo. No entanto, um tratamento conservador é aplicado na maioria dos casos.
9 Recentemente um caso clínico que descreve o quadro de um paciente que desenvolveu loxoscelismo cutâneo e sistêmico foi publicado (DE SOUZA et al., 2008). Segundo os autores, o paciente desenvolveu lesão dermonecrótica com espalhamento gravitacional no local da picada, bem como, hemólise intravascular, rabdomiólise, coagulopatia e insuficiência renal aguda. O acompanhamento do quadro clínico assim como os resultados dos exames laboratoriais comprovou a severidade do envenenamento. O próprio paciente quando admitido no hospital, trouxe consigo o espécime, identificado como pertencente ao gênero Loxosceles. Neste caso a administração de soro antiloxoscélico foi realizada, como indicado. No entanto, além dessa, diferentes terapias têm sido propostas, como utilização de dapsona, esteróides, tratamento com câmara hiberbárica de oxigênio e terapia com soro antiveneno (HOGAN; BARBARO; WINKEL, 2004).
A eficácia da terapia com soro antiloxoscélico depende que ele seja administrado nas primeiras horas após a picada. Sendo assim, a maior barreira para a administração do soro antiveneno é o fato de que a maioria dos pacientes demoram a procurar auxílio médico, uma vez que a picada geralmente não é percebida de imediato. Muitas vezes o paciente procura atendimento médico entre 24 e 72 horas após a picada, quando os sintomas locais já estão instalados e, muitas vezes, em estado avançado (PAULI et al., 2006). Apesar de não existirem estudos que permitam correlacionar o tipo de tratamento com a evolução dos casos de loxoscelismo, estudos em modelos animais mostram que a aplicação do soro antiveneno possui potencial terapêutico. A administração do soro minimiza os efeitos cutâneos e sistêmicos do envenenamento, quando empregada até 12 horas após a picada. A utilização de soro até 48 horas após a picada mostrou redução da área da lesão dermonecrótica (PAULI et al., 2006; PAULI et al., 2009). Os estudos foram realizados somente em modelos animais; mais estudos são, portanto, necessários para avaliar a real eficiência dos soros tanto nos quadros de loxoscelismo cutâneo, quanto sistêmico. No entanto, países que já incluíram a soroterapia no protocolo de tratamento, a mortalidade de crianças e jovens diminuiu significativamente (PAULI et al., 2009; ISBISTER et al., 2003).
10 efetiva (VETTER e ISBISTER, 2008). A utilização de corticóides é muito discutida, porém, no Brasil, eles são preferencialmente administrados em pacientes que desenvolvem o quadro sistêmico. Entretanto, quando a aranha é identificada como L. intermedia ou L. laeta deve-se iniciar o tratamento com Prednisona, mesmo sem a existência de uma lesão aparente. O papel imunossupressor dos corticóides teria importância fundamental na redução da resposta inflamatória exacerbada gerada pelo envenenamento (DA SILVA et al., 2004; HOGAN; BARBARO; WINKEL, 2004).
Estudos demonstraram que tetraciclinas inibem ou, até mesmo, previnem a lesão dermonecrótica induzida pelo veneno de Loxosceles em modelos in vivo e in vitro (PAIXÃO-CAVALCANTE et al, 2007). Além disso, o mesmo estudo mostra uma redução na expressão da metaloprotease de matriz MMP-2 exercida pela tetraciclina. Os autores sugerem que a tetraciclina pode ser um agente terapêutico eficiente no tratamento do loxoscelismo cutâneo (PAIXÃO-CAVALCANTE et al, 2007).
MONTEIRO e colaboradores (2002) mostraram a possibilidade de infecção secundária das lesões causadas pelas aranhas da espécie
Loxosceles intermedia com a bactéria Clostridium perfringens. No mesmo trabalho, os autores identificaram e isolaram esta bactéria anaeróbia, potencialmente patogênica no veneno e nas quelíceras das aranhas. Isso indica que C. perfringens é um fator importante na exacerbação das lesões dermonecróticas causadas pelo veneno. Sendo assim, uma terapia eficiente para o tratamento do loxoscelismo, que poderia incluir a administração de antibióticos, deve levar em conta essa possibilidade de infecção.
O aumento da eficiência dos tratamentos depende de uma melhor compreensão da composição do veneno e dos mecanismos de ação das toxinas presentes no veneno produzido pelas aranhas do gênero Loxosceles
11 5. Veneno das aranhas do gênero Loxosceles
Aranhas adultas do gênero Loxosceles inoculam um volume de apenas alguns microlitros na vítima, contendo cerca de 30 µg de proteína (TAMBOURGI et al, 2010). O veneno loxoscélico é um líquido cristalino, composto basicamente por proteínas enzimáticas e não enzimáticas e é produzido por um par de glândulas situadas no cefalotórax das aranhas-marrons (da SILVA et al., 2004). O veneno é rico em muitas enzimas como hidrolases, hialuronidases, lipases, peptidases, colagenases, fosfatase alcalina, proteases, entre outras.
As moléculas que compõem o veneno dessas aranhas são predominantemente proteínas de baixa massa molecular (5 – 40 kDa) com ação tóxica e/ou enzimática (MOTA; BARBARO, 1995; da SILVEIRA et al., 2002; da SILVA et al., 2004; APPEL et al., 2005). Muitos autores sugerem que a toxicidade do veneno de aranhas é decorrente de efeitos danosos sinérgicos e/ou somatórios de todos os seus componentes (GEREN et al., 1976; da SILVA
et al., 2004; APPEL et al., 2005).
Muitos estudos focam na identificação dos constituintes dos venenos loxoscélicos e, portanto, algumas das toxinas presentes no veneno já estão bem caracterizadas bioquímica e biologicamente (da SILVA et al., 2004, APPEL et al., 2005). Já foram descritas enzimas como fosfatase alcalina, 5’ ribonucleotídeo fosfohidrolase, peptídeos com atividade inseticida, hialuronidases, fosfolipases-D, serino-proteases e metalo-proteases em venenos de diferentes espécies de Loxosceles (FUTRELL, 1992; FEITOSA et al., 1998; VEIGA et al., 2000a, 2000b; YOUNG; PINCUS, 2001; VEIGA et al., 2001a; da SILVA et al., 2004; DE CASTRO et al, 2004; BARBARO et al., 2005; DA SILVEIRA et al., 2007a e 2007b).
12 As toxinas dermonecróticas são muito conservadas entre as diferentes espécies do gênero Loxosceles. Atualmente, mais de dez sequências completas de toxinas dermonecróticas desse gênero foram depositadas em bases de dados de sequências nucleotídicas. Essas toxinas foram bioquimicamente caracterizadas como membros da família das esfingomielinases-D devido à sua habilidade de catalizar a hidrólise da esfingomielina (CHAVES-MOREIRA et al, 2009). Em um trabalho de 2005, LEE e LYNCH sugerem que uma denominação mais acurada para a família das toxinas dermonecróticas seria o termo fosfolipases-D, devido à sua habilidade adicional de catalisar a hidrólise de glicerofosfolipídeos.
MURAKAMI e colaboradores (2006) demonstraram que as fosfolipases-D se dobram para formar um barril ( / )8 com a inserção de fitas- , -hélices e vários loops conectores adicionais. O loop catalítico, em conjunto com outros
loops forma a face interfacial (i-face) da enzima onde o sítio ativo está localizado. O sítio ligante de Mg2+ junto com Trp230, Ly93 e os dois resíduos de histidina catalíticos (His12 e His47) formam o sítio ativo que é altamente conservado nas fosfolipases-D de aranhas e bactérias.
O mecanismo catalítico proposto para as fosfolipases-D baseia-se numa reação ácido-base combinada com uma estabilização pelo íon metálico e envolve dois resíduos de histidina, His12 e His47. Nos passos intermediários do mecanismo, o resíduo His12 é desprotonado para o ataque nucleofílico subseqüente de uma molécula de água. Segue-se a liberação final de ceramida-1-fosfato (C1P) do substrato esfingomielina ou ácido lisofosfatídico (LPA) de um lisofosfolipídeo (MURAKAMI et al, 2005).
Recentemente, KUSMA e colaboradores (2008) descreveram a produção de uma isoforma mutada de fosfolipase-D recombinante de
13 isoforma mutada não produziu os mesmos efeitos tóxicos que a LiRecDT1 original, concluindo portanto, que a atividade das fosfolipases-D das aranhas
Loxosceles spp. é dependente da sua atividade catalítica (KUSMA et al, 2008; CHAVES-MOREIRA et al, 2009). Estudos também demonstram que a atividade hemolítica das fosfolipases-D também pode ser desencadeada por mecanismos dependentes do sistema complemento. Em um estudo, TAMBOURGI e colaboradores (2007) demonstram que o tratamento de eritrócitos com esfingomielinases-D de Corynebacterium pseudotuberculosis e do veneno de L. intermedia levam à ativação da via clássica do sistema complemento, por intermédio da ligação direta da proteína C1q (uma das três proteínas do complexo C1 do sistema complemento), o que culmina no processo de hemólise.
Acreditamos que as fosfolipases-D, presentes nos venenos das aranhas do gênero Loxosceles, possam atuar sobre os fosfolipídios das membranas celulares, liberando compostos como a ceramida-1-fosfato (C1P) e/ou ácido lisofosfatídico, como já descrito anteriormente. Perfis de expressão gênica de fibroblastos humanos tratados com a isoforma I da toxina recombinante de L. reclusa (SMD) mostraram uma expressão mais alta de genes relacionados à citocinas e genes envolvidos na via de metabolismo de glicoesfingolipídeos. Além disso, os autores sugeriram que a atividade esfingomielinásica sobre membranas celulares, que resulta na produção de ceramida-1-fosfato, induz a expressão de moléculas pró-inflamatórias como NF- B e interleucina-8 e que esse processo pode estar ligado à histopatologia típica do loxoscelismo, mostrando massivo infiltrado de neutrófilos, necrose, edema e proliferação de fibroblastos (DRAGULEV et al, 2007). Sendo assim, esclarecimentos do ponto de vista do envolvimento das fosfolipases-D na liberação de mediadores inflamatórios e sua relação com os sintomas do loxoscelismo ainda se fazem necessários para complementar o entendimento da ação do veneno e identificar novas possibilidades de intervenção terapêutica.
14 fibronectinolítica e atividade fibrinogenolítica parcial e a Loxolisina B (32-35kDa) com atividade gelatinolítica. O trabalho foi bastante criticado na época já que se cogitava a possibilidade de que essas metaloproteases identificadas fossem oriundas do conteúdo gástrico das aranhas, considerando que a obtenção do veneno era feita utilizando-se o método do eletrochoque. Neste procedimento, um choque de 12V é aplicado na região do cefalotórax do animal, fazendo com que suas glândulas se contraiam e o veneno seja expelido. Porém, DA SILVEIRA e colaboradores (2002) comprovaram que metaloproteases são realmente constituintes do veneno de L. intermedia
através de estudo comparativo do perfil protéico e da atividade metaloproteásica realizada entre veneno obtido por eletrochoque e o extrato de glândulas de veneno de espécimes de L. intermedia. Com esse estudo, mostrou-se que a atividade metaloproteásica está presente no extrato de glândulas de veneno e que é totalmente livre de contaminantes gástricos. Posteriormente, outros trabalhos também descreveram metaloproteases nos venenos de L. reclusa, L. deserta, L. rufescens e L. laeta. (YOUNG; PINCUS, 2001; BARBARO et al., 2005; FERNANDES-PEDROSA et al., 2008).
As hialuronidases também estão possivelmente relacionadas com os efeitos nocivos do veneno de aranha-marrom. Foram descritas hialuronidases de diferentes massas moleculares, em diferentes espécies do gênero
Loxosceles (no caso da L. intermedia foram descritas duas hialuronidases, com massas de 41 e 43 kDa). A enzima possui atividade de hidrolase e é capaz de degradar ácido hialurônico e condroitin sulfato, presentes na matriz extracelular, funcionando como um fator de espalhamento do veneno. Da mesma maneira, proteases que degradam componentes da matriz extracelular ou de membranas basais podem estar envolvidas com distúrbios hemorrágicos, agravamento da lesão dermonecrótica e aumento da permeabilidade vascular. (DA SILVA et al., 2004; DA SILVEIRA et al, 2007; CHAIM et al., 2007).
15 atividade inseticida, causando a paralisação de insetos mediante bloqueio da transmissão neuromuscular. Polipeptídios, com massa entre 3 e 8 kDa têm como alvo canais iônicos de membrana (ESCOUBAS; DIOCHOT; CORZO, 2000; RASH; HODGSON, 2002).
As fosfolipases-D são os componentes do veneno loxoscélico mais bem estudados. Mas outras toxinas isoladas e caracterizadas nos levam a concluir que os mecanismos pelos quais o veneno loxoscélico induz a lesão dermonecrótica e demais distúrbios sistêmicos são bastante complexos e precisam ser investigados com maior profundidade.
6. Inibidores de serino-proteases
Inibidores de serino-proteases são classificados em pelo menos 23 famílias baseadas na sua sequência primária, motivos estruturais e mecanismos de ligação. Essas famílias são agrupadas em três superfamílias de acordo com seu mecanismo de ação: os inibidores canônicos, os inibidores não-canônicos e as serpinas (OTLEWSKI et al., 1999; KROWARSCH et al.,
2003).
Os inibidores canônicos são o maior grupo em quantidade de famílias representadas, sendo proteínas pequenas, de 3 a 21 kDa, encontradas em diferentes organismos. Interagem com a protease alvo por meio de um loop
catalítico altamente conservado entre as diferentes famílias sem sofrer nenhuma alteração conformacional (KROWARSCH et al., 2003). Venenos de diferentes animais contêm inibidores de serinoproteases e geralmente membros da superfamília dos inibidores canônicos, são descritos. No veneno de diversas espécies de serpentes da família Viperidae e Elapidae foram isolados e sequenciados inibidores de serino-protease, principalmente da família Kunitz (SHAFQAT et al., 1990; CHEN et al., 2001; HE et al., 2008; LU
16 serpentes, o grupo mais bem estudado, tem sido demonstrado sua participação nos processos de coagulação, fibrinólise e inflamação por interações ainda não completamente definidas com diversas moléculas (HE et al., 2008).
Os inibidores de serino-protease da superfamília das serpinas são proteínas maiores, tipicamente entre 350-500 aminoácidos, distribuídas desde vírus até mamíferos. A peculiaridade que define essa superfamília são as mudanças conformacionais que ocorrem no processo de inibição das enzimas alvos (LAW et al., 2006). Estas moléculas são consideradas de grande interesse porque atuam como moduladoras em uma variedade de funções fisiológicas, como na coagulação sanguínea, fibrinólise, apoptose, desenvolvimento, inflamação e ativação do sistema complemento (IRVING et al., 2004). Em secreções venenosas animais, foram descritas no veneno da lagarta Lonomia obliqua e na pele do sapo Bufo andrewsi, mas sem a caracterização da sua função especifica (VEIGA et al., 2005; ZHAO et al.,
2005).
7. Toxinas recombinantes de L. intermedia
Nos últimos anos, uma biblioteca de cDNA foi construída a partir de RNAm extraído de glândulas produtoras de veneno de L. intermedia, espécie predominante na cidade de Curitiba e região metropolitana. Inicialmente, a varredura desta biblioteca de cDNA foi feita por sequenciamento aleatório dos clones obtidos. O resultado desta varredura foi o isolamento de cDNAs codificantes para 6 isoformas de toxinas dermonecróticas (bioquimicamente caracterizadas como fosfolipases-D) e 3 isoformas de metaloproteases (CHAIM
et al, 2006; DA SILVEIRA et al, 2006; DA SILVEIRA et al, 2007b; DA SILVEIRA
et al, 2007c; RIBEIRO et al, 2007; APPEL et al, 2008; TREVISAN-SILVA et al,
2010).
17 (dermonecrose, reação inflamatória, agregação plaquetária e permeabilidade capilar) semelhantes, para as toxinas recombinantes obtidas, porém em diferentes intensidades, de acordo com a atividade enzimática exibida, apesar das 3 isoformas apresentarem os aminoácidos do sítio catalítico conservados. Este estudo também mostrou uma reatividade imunológica cruzada diferencial destas três isoformas, além de uma relação estrutural inter e intra-espécie. Outro estudo (CHAIM et al., 2006) mostrou que a isoforma recombinante 1 (LiRecDT1) foi capaz de causar nefrotoxicidade direta (sem a presença de infiltrado inflamatório nos rins), em camundongos, tanto in vivo, quanto in vitro,
em cultura de células epiteliais tubulares. Em relação às isoformas 4, 5 e 6, as proteínas recombinantes expressas em bactérias foram utilizadas em experimentos comparativos, com relação ao veneno total, no que se refere às suas atividades bioquímicas (atividade fosfolipásica) e biológicas (dermonecrose, resposta inflamatória, agregação plaquetária, permeabilidade vascular e mortalidade em camundongos). A semelhança estrutural destas, com as demais isoformas de toxinas dermonecróticas previamente estudadas, também foi analisada (DA SILVEIRA et al., 2007b; APPEL et al., 2008).
18 8. Aplicações biotecnológicas das toxinas loxoscélicas
Pesquisas envolvendo toxinas loxoscélicas vêm ganhando especial atenção nos últimos anos. Diante da diversidade de toxinas presentes nos venenos loxoscélicos, com as mais variadas atividades bioquímicas e farmacológicas, fica cada vez mais evidente o potencial destas moléculas no seu emprego como insumos biotecnológicos, como ferramentas de estudo ou diagnóstico e como modelos para a descoberta e desenvolvimento de novos fármacos (SOUTAR e GINSBERG, 1993, MARKLAND, 1998; KEMPARAJU e GIRISH, 2006).
Já na década de 60, o interesse em componentes bioativos isolados de venenos era notável. No final dessa década, pesquisadores brasileiros descreveram e isolaram um peptídeo com atividade anti-hipertensiva (fator potencializador da bradicinina) do veneno da serpente Bothrops jararaca, que foi utilizado, posteriormente, como modelo para a síntese do Captopril (FERREIRA e VANE, 1967).
Um produto biotecnológico desenvolvido a partir de um veneno loxoscélico, denominado ARACHnase® (Hemostasis Diagnostics International Co., Denver, CO) foi desenvolvido e é atualmente bastante utilizado em laboratórios de diagnóstico. O produto é um plasma normal que contém o extrato de veneno da aranha marrom Loxosceles reclusa, que mimetiza o anticoagulante lúpico, advindo daí um controle positivo para o teste da presença desse composto (MCGLASSON et al, 1993).
Testes pré-clínicos foram realizados, utilizando um soro anti-loxoscélico com fosfolipases-D recombinantes de aranhas do gênero Loxosceles (DE ALMEIDA et al, 2008). Os testes de neutralização mostram que o soro feito com fosfolipases-D recombinantes têm uma maior atividade contra os efeitos tóxicos dos venenos das aranhas do gênero. Este é um exemplo de produto biotecnológico que possui um alto potencial de aplicabilidade na terapia contra o loxoscelismo.
19 sua utilização como drogas ou modelos moleculares, vai depender de uma classificação bioquímica das toxinas, da determinação de estruturas tridimen-sionais, da elucidação de atividades biológicas das toxinas baseada na sua organização molecular e, finalmente, do seu modo de ação sobre diferentes modelos celulares e seus receptores (SENFF-RIBEIRO, et al, 2008).
No Brasil, os venenos de diferentes espécies de aranhas-marrons são utilizados na produção de imunobiológicos para a soroterapia em casos graves de loxoscelismo, levando em consideração a reatividade imunológica cruzada dos diferentes venenos de Loxosceles (GOMEZ et al., 2001, BARBARO et al., 1994a, BARBARO et al., 1996, ARAUJO et al., 2003). O Instituto Butantan, na cidade de São Paulo, é responsável pela produção de um soro polivalente anti-aracnídico, utilizando os venenos brutos de L. gaucho, Phoneutria nigriventer
(aranha “armadeira”), Tityus serrulatus e Tityusbahiensis (escorpiões). No Paraná, dada a ocorrência dos acidentes com aranhas-marrons, um soro anti-loxoscélico é produzido pelo Centro de Produção e Pesquisa de Imunobiológicos (CPPI), utilizando-se como antígenos os venenos de L. gaucho, L. intermedia e L. laeta. Além da produção de imunoterápicos e do próprio uso de anticorpos para o diagnóstico diferencial e correto do loxoscelismo (CHAVEZ-OLORTEGUI et al., 1998, MILLER et al., 2000, KRYWKO e GOMEZ, 2002), a expressão recombinante de toxinas dermonecróticas favorece também um amplo aprendizado dos mecanismos moleculares do loxoscelismo, bem como evidencia o enorme potencial destas toxinas como ferramentas moleculares, possivelmente úteis no estudo de processos de resposta inflamatória, distúrbios da hemostase e agregação plaquetária (SENFF-RIBEIRO, et al, 2008).
9. Transcriptoma e venenos
20 As ESTs e as sequências do DNA complementar (cDNA) fornecem uma evidência direta de todos os transcritos amostrados e eles são atualmente as mais importantes fontes de exploração dos transcriptomas. O cDNA resultante é clonado para formar bibliotecas que representam um conjunto de genes transcritos da célula, tecido ou organismo original. Subsequentemente, estes clones de cDNA são sequenciados randomicamente em uma direção, numa corrida “single-pass” gerando, na maioria das vezes, sequências incompletas (não “full-lenght”) (NAGARAJ et al, 2006).
Só recentemente, o grande potencial dos venenos como fonte de novos compostos com aplicações potenciais agroquímicas, farmacológicas ou biotecnológicas foi percebido (ESCOUBAS, 2006). Diversos trabalhos têm descrito nos últimos anos, as análises de transcriptomas de glândulas produtoras de venenos de serpentes, escorpiões e aranhas (JUNQUEIRA-DE-AZEVEDO e HO, 2002; KASHIMA et al, 2004; CIDADE et al, 2006; NEIVA et al, 2009; WAGSTAFF e HARRISON, 2006; ZHANG et al, 2010; SCHWARTZ et al, 2007; PAHARI et al, 2007; FERNANDES-PEDROSA et al, 2008; CHEN et al, 2008; VALENTE et al, 2009; BOLDRINI-FRANÇA et al, 2009; MA et al,
21
II – OBJETIVOS
1. Objetivo geral
Descrever o perfil de expressão das proteínas e identificar novas toxinas da glândula de veneno de Loxosceles intermedia, utilizando a análise do transcriptoma.
2. Objetivos específicos
1. Construir uma biblioteca de cDNA representativa de glândulas produtoras de veneno de Loxosceles intermedia e caracterizar funcionalmente os transcritos para descrever o perfil de expressão da glândula e identificar novas toxinas.
22
III – JUSTIFICATIVA
23
IV – RESULTADOS
O presente trabalho relata os resultados relativos à análise do transcriptoma da glândula produtora de veneno da aranha Loxosceles intermedia. O trabalho descreve também as etapas para a produção de um inibidor de serino-protease recombinante identificado no transcriptoma.
24 A – Item 1: “Um novo perfil de expressão da glândula de veneno da aranha Loxosceles intermedia demonstrado por análise transcriptômica ”
Autores: Luiza Helena Gremski, Rafael Bertoni da Silveira, Olga Meiri Chaim, Christian Macagnan Probst, Valéria Pereira Ferrer, Jenifer Nowatzki, Hellen Chris Weinschutz, Humberto Maciel França Madeira, Waldemiro Gremski, Helena Bonciani Nader, Andrea Senff-Ribeiro, Silvio Sanches Veiga
Revista: Molecular Biosystems
DOI: 10.1039/c004118a – artigo convidado para ilustrar a capa do volume.
25 Fw: Article Ref : C004118A - Molecular BioSystems
From:MOLBIOSYST (shared) To:veigass@ufpr.br
Sent: Wednesday, April 07, 2010 5:29 AM
Subject: Article Ref : C004118A - Molecular BioSystems
Dear Professor Dr Veiga Paper Ref.: C004118A
Title : A novel expression profile of the Loxosceles intermedia venomous gland revealed by transcriptome analysis
I am writing to inform you that I have now received a full set of referee reports for your submission and that based on these reports I will be pleased to publish your
manuscript in Molecular BioSystems subject to its satisfactory revision in light of the reports below.
I look forward to hearing from you and thank you for submitting your work to Molecular BioSystems.
Best wishes,
Nikki Moran
Publishing Editor, Molecular BioSystems
Royal Society of Chemistry, Thomas Graham House, Science Park , Cambridge , CB4 0WF , UK
Tel +44 (0)1223 432657
http://www.rsc.org
Report A
The manuscript (C004118A) by Veiga et al., presents very interesting results of the transcriptome analysis of L. intermedia venom gland. A literature search indicates that the research group of Veiga has considerable experience in the field of spider venom proteins and their action.
The experiments have been carefully conducted and the results have been properly interpreted.
The introduction presents results to date, the manuscript is very well written, is concise, presents the results in a very clear manner, and the discussion along with the figures provides a clear view.
Conclusion: Manuscript should be accepted without corrections.
Report B
26 Fw: c004118a cover invitation
From:MOLBIOSYST (shared) To:'veigass@ufpr.br'
Sent: Wednesday, June 30, 2010 10:57 AM
Subject: c004118a cover invitation
Dear ProfD Silvio Veiga
Your paper has been highly rated by the reviewers, and therefore we would like to invite you to submit some artwork for consideration for the cover of Molecular BioSystems.
If chosen for the front cover (outside / inside), we will also promote your article and increase its visibility in a number of ways:
• It will be made free to access to all for 6 weeks
• It will be highlighted in the contents pages of the journal online and in print
• The cover will be featured in the journal gallery
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(http://www.rsc.org/Publishing/Magazines/index.asp)
You will also receive:
• A free print copy of the issue which features your cover
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article that is published in the issue for readers to download will contain your cover as the first page
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your desk top
We usually request a contribution of £250 (plus applicable tax) to help contribute towards the cost of producing a cover.
If you would like to be considered to have your work featured, then please could you let me know as soon as possible and provide some eye-catching artwork for
consideration. I would be grateful if you could submit the cover artwork as soon as possible.
If I can be of any assistance please do not hesitate to contact me.
Best Wishes
Nikki Moran
Publishing Editor, Molecular BioSystems
Royal Society of Chemistry, Thomas Graham House, Science Park , Cambridge , CB4 0WF , UK
Tel +44 (0)1223 432657
This journal is c The Royal Society of Chemistry 2010 Mol. BioSyst.
A novel expression profile of the
Loxosceles intermedia
spider venomous
gland revealed by transcriptome analysis
Luiza Helena Gremski,aRafael Bertoni da Silveira,bOlga Meiri Chaim,ac Christian Macagnan Probst,dVale´ria Pereira Ferrer,cJenifer Nowatzki,c Hellen Chris Weinschutz,eHumberto Maciel Madeira,eWaldemiro Gremski,e Helena Bonciani Nader,aAndrea Senff-Ribeirocand Silvio Sanches Veigaac
Received 10th March 2010, Accepted 15th April 2010 DOI: 10.1039/c004118a
Spiders of theLoxoscelesgenus are cosmopolitan, and their venom components possess remarkable biological properties associated with their ability to act upon different molecules and receptors. Accidents withLoxosceles intermediaspecimens are recognized as a public health problem in the south of Brazil. To describe the transcriptional profile of theL. intermediavenom gland, we generated a wide cDNA library, and its transcripts were functionally and structurally analyzed. After initial analyses, 1843 expressed sequence tags (ESTs) produced readable sequences that were grouped into 538 clusters, 281 of which were singletons. 985 reads (53% of total ESTs) matched to known proteins. Similarity searches showed that toxin-encoding transcripts account for 43% of the total library and comprise a great number of ESTs. The most frequent toxins were from the LiTx family, which are known for their insecticidal activity. Both phospholipase D and astacin-like metalloproteases toxins account for approximately 9% of total transcripts. Toxins components such as serine proteases, hyaluronidases and venom allergens were also found but with minor representation. Almost 10% of the ESTs encode for proteins involved in cellular processes. These data provide an important overview of theL. intermediavenom gland expression scenario and revealed significant differences from profiles of other spiders from the
Loxoscelesgenus. Furthermore, our results also confirm that this venom constitutes an amazing source of novel compounds with potential agrochemical, industrial and pharmacological applications.
Introduction
TheLoxoscelesgenus is one of four groups of spiders capable of causing human fatality.1 They are distributed worldwide, and specifically in Brazil, only three species have been impli-cated in envenoming: L. intermedia,L. gaucho andL. laeta. The bites of brown spiders (Loxoscelesgenus) led to several clinical manifestations such as necrotic skin degeneration and gravitational spread at the bite site, renal failure and hemato-logical disturbances.2Loxoscelism is the term used to describe the set of symptoms that commonly appear after accidents with brown spiders. The molecular and physiological mechanisms of loxoscelism are currently under investigation.
Several studies conducted over the past 30 years concerning the structural and biological roles of various venom components have shown the complex nature of these secretions.3Likewise, the venom of Loxosceles spiders is a complex mixture of
protein toxins with a molecular mass profile ranging from 5 to 40 kDa.4
Today, it is evident that venom constituents are endowed with remarkable biological properties associated with their ability to act upon a number of specific and non-specific molecules and receptors in order to incapacitate their target organisms.3Spider venom has received less attention than the venom produced by other animals due to their minimal impact on human health.5Alternatively, spider venom constitutes an amazing putative source of novel compounds with potential agrochemical, industrial and pharmacological applications. Spiders are highly successful and one of the most diversified groups of arthropods, but only a few species have had their venom investigated.6
In Loxosceles venom, many proteins have been identified
and biochemically characterized. Some of the components are not involved in the noxious activities of the venom, and others, such as members of the phospolipase D family (also known as dermonecrotic toxins) can produce deleterious effects that contribute significantly to the typical response after envenoming.7 Despite this accumulated knowledge, it is essential to conduct a wider study concerning the nature of venom components and their proportion in the mixture. Today, modern molecular biology techniques for DNA and RNA manipulation allow the construction of vast transcript libraries that further the
a
Department of Biochemistry, Federal University of Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, Brazil
bDepartment of Structural, Molecular Biology and Genetics, State University of Ponta Grossa, Parana´, Brazil
cDepartment of Cell Biology, Federal University of Parana´, Parana´, Brazil
dInstituto Carlos Chagas, Fiocruz, Parana´, Brazil e
Catholic University of Parana´, Health and Biological Sciences Institute, Parana´, Brazil
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Downloaded on 12 August 2010
Published on 19 July 2010 on http://pubs.rsc.org | doi:10.1039/C004118A
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Mol. BioSyst. This journal is c The Royal Society of Chemistry 2010 understanding of the behavior of complex biological processes
by identifying their molecular constituents. Also, a library will create an overview of the venom and may enable the discovery of new molecules of biotechnological interest.
Various studies of the repertoire of transcripts expressed in venom glands of diverse animals have been published recently.8–12 The majority of these studies refer to the venom glands of snakes, whereas only a few studies were conducted concerning the transcripts present in spider venom glands.13–16As mentioned earlier, spider venom has become a valuable resource for the isolation of potentially useful molecules. Also, an expressed sequence tag (EST) analysis approach provides a rapid and reliable method for identifying new components as well as a resource for the analysis of the expression of known and unknown genes.
L. intermediavenom is a focus of different studies performed by our group for the last decade. Various components of the venom were identified and characterized, and some com-ponents were produced as active recombinant molecules for isolated studies and biological characterizations.2,7,17–22Up to now, two proteomic analyses of L. intermedia venom were performed: one focused on dermonecrotic proteins23and one more diverse that identified 39 proteins.24Therefore, in order
to expand the knowledge aboutL. intermediavenom, a cDNA library was generated from venom glands and partial sequencing of cDNAs was performed, which resulted in thousands of ESTs that were subsequently analyzed.
Results and discussion
cDNA library and EST clustering
The length of cloned cDNAs was estimated by agarose gel electrophoresis analysis of PCR amplified products. The results showed a distribution between 200 and 2300 bp, with an average of 700 bp (data not shown). After sequencing and analysis, 1843 ESTs produced readable sequences. Subsequently, all ESTs were submitted to clustering, and 538 clusters were generated, of which 281 were singletons. Clusters including two or more sequences were named ‘‘LIC’’ followed by the number of the cluster (LIC179–LIC438). Analyses resulted in two classes of singletons: some with similar sequences when compared to other clusters (LIS1–LIS178) and others with no similarity with other clusters (LIS179–LIS282).
Cluster identification
Resulting clusters were analyzed against the GenBank database (blastx, blastn and tblastx) and submitted to GenBank dbEST under accession numbers HO002618–HO004460. Of 538 clusters, 246 (45.7%) resulted in significant hits to known sequences. The other 292 clusters, of which 153 were singletons, were similar to proteins with no associated function (hypothetical proteins), were not matched (no hits) or matched against depositedL. laetamRNA sequences that presented no similarity to database sequences (L. laeta cDNA). Identified sequences were classified into two main classes according to their general attribution: toxic function (toxins) and proteins involved in cellular processes.
The overview of the annotated L. intermedia venom gland transcriptome is presented in Fig. 1 and in more detail in Table 1. Based on data analysis, the majority of ESTs annotated as toxins are transcripts that were included in contigs (90%). These ratios are similar to other venom gland transcriptome studies11,13 and reflect the tissue speciality, particularly during the phase of venom replacement.
The number of transcripts with no known function is significant (47%). As accounted by Fernandes-Pedrosa,14this
number is understandable as Loxosceles genus sequences deposited in the public databases are still restricted. Further-more, the complete function and components of the venom gland ofLoxoscelesare not yet fully characterized. Data also reveal that 68% ofL. intermediatranscripts with no attributed function are similar to L. laeta ESTs sequences that do not match with known proteins. This ratio reveals that, as observed with already characterized proteins, unknown venom proteins produced by the two species are very similar. Further-more, this finding demonstrates that a close evolutionary relationship exists between these species.
Transcripts assigned as toxins represent 43.4% of the total library and comprise the majority of ESTs. There are 801 toxin sequences grouped into 88 clusters and 80 singletons. The redundancy of clustering is in agreement with previous data and is due to the peculiar function of venom gland tissue in producing proteins that function in capturing prey and as a defense mechanism. Toxin clusters were grouped according to the structural and functional features of the protein: phospho-lipases; knottins LiTx1, 2, 3 or 4 (insecticidal peptides);27 astacin-like metalloproteases; neurotoxins, and others. Fig. 2 shows the proportion of each group of toxins over the total of toxin-encoding transcripts. Table 2 describes the absolute numbers of each group of toxin-encoding messengers and their proportion among all transcriptome ESTs. A list of the putative identities of representative toxin-related clusters is provided in Table 3.
Data reveal that insecticidal peptides, structurally asso-ciated to knottins, comprise the majority of expressed toxins inL. intermediavenom glands. The proportion of transcripts encoding for phospholipases and astacin-like metalloproteases are next in size and are followed by lower expressed but not less important toxins, like neurotoxins and serine-proteases.
Fig. 1 The annotated L. intermedia venom gland transcriptome:
relative proportions of toxin-encoding, hypothetical proteins,
cellular processes, similar toL. laetacDNA and non-significant hit
ESTs.
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Knottins—insecticidal peptides
Insecticidal peptides isoforms LiTx1, LiTx2 and LiTx3 were initially described in the venom of L. intermedia and func-tionally characterized by de Castro.27The sequence of a new isoform of this class, LiTx4, was deposited in 2006 under the
accession numbers DQ388598 (nucleotide) and Q27Q53 (amino acid).
Briefly, after submitting L. intermedia venom to various chromatography steps, the authors isolated three peptides with insecticidal activity, which were then sequenced by the Edman degradation method. Based on the peptide sequences, degenerated probes were used to screen a cDNA library of
L. intermedia venom glands and positive clones had their
plasmids sequenced. Similarity analysis revealed three iso-forms of insecticidal peptides: LiTx1, LiTx2 and LiTx3. These three peptides, and the fourth isoform later described, are small disulfide-rich proteins that have a ‘‘disulfide through disulfide knot’’ that structurally defines the peptides as knottins.27,28
The biologically characterized components are polypeptides with molecular weights ranging from 5.6 to 7.9 kDa, and they presented insecticidal activity against highly destructive pests such as Spodoptera frugiperda and Spodoptera cosmioides. Sequence similarity analyses indicate that these molecules act on specific ion channels.27
The LiTx1 peptide has a calculated molecular weight of 7431.63 Da and may presentN-myristoylation, protein kinase C phosphorylation, amidation and casein kinase II phosphoryl-ation sites. Based on sequence similarity, it was not possible to
Table 1 Summary statistics after clustering of 1843 EST sequences
No. of clusters No. of ESTs
Percentage over total ESTs
Percentage over identified ESTs
Total no. of clusters (reads41) 257 1562 84.75 87
Similar to toxins 88 721 39.12 73.2
Similar to cellular processes proteins 30 136 7.38 13.8
No hits 36 135 7.32 —
Similar toL. laetacDNA 97 530 28.76 —
Hypothetical proteins 6 40 2.17 —
Total no. of singletons 281 281 15.25 13
Similar to toxins — 80 4.34 8.1
Similar to cellular processes proteins — 48 2.60 4.9
No hits — 89 4.83 —
Similar toL. laetacDNA — 51 2.78 —
Hypothetical proteins — 13 0.70 —
Total 538 1843 100 100
Fig. 2 Relative proportions of each group of toxins over the total toxin-encoding transcripts.
Table 2 Putative toxin transcripts classes identified inL. intermediavenom gland transcriptome
Toxins No. of clusters No. of ESTs % of total
LiTx3a 70 257 13.9
Astacin-like metalloprotease 39 181 9.8
Phospholipase D 27 162 8.8
LiTx2a 1 91 4.9
LiTx1a 11 50 2.7
LiTx4a 5 30 1.6
Neurotoxinb 9 19 1
Serine proteinase 2 4 0.3
TCTPc 1 3 0.2
Venom allergen 1 2 0.1
Hyaluronidase 1 1 0.05
Serine proteinase inhibitor 1 1 0.05
Total 168 801 43.4
a
LiTx—Knottins/Similar to insecticidal toxins ofL. intermedia.bNeurotoxin—Similar to Neurotoxin Magi 3.46.cTCTP—Similar to
Transla-tionally controlled tumor protein.
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