CÂMPUS DE BOTUCATU
DIVERSIDADE GENÉTICA E CONSTITUIÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS
ESSENCIAIS DE POPULAÇÕES DE Lychnophora ericoides Mart.
E Lychnophora pinaster Mart.
MARIA APARECIDA RIBEIRO VIEIRA
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp - Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Horticultura)
CÂMPUS DE BOTUCATU
DIVERSIDADE GENÉTICA E CONSTITUIÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS
ESSENCIAIS DE POPULAÇÕES DE Lychnophora ericoides Mart.
E Lychnophora pinaster Mart.
Maria Aparecida Ribeiro Vieira
Orientadora: Profª. Drª. Marcia Ortiz Mayo Marques Co-Orientadora: Profª. Drª. Maria Imaculada Zucchi
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP - Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Horticultura)
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AGRADECIMENTOS
- À Deus, por me dar força para superar os momentos difíceis e por sempre iluminar meu caminho.
- À Profª Drª. Marcia Ortiz Mayo Marques pelos ensinamentos, motivação e amizade. -À Profª. Drª. Maria Imaculada Zucchi pela orientação, confiança e incentivo.
- Ao Prof. Dr. José Baldin Pinheiro e a Profª Drª. Anete Pereira de Souza, pela orientação e oportunidade de desenvolver as atividades moleculares nos seus laboratórios.
- Aos amigos do Laboratório de Produtos Naturais do Centro P&D de Recursos Genéticos Vegetais: Roselaine, Lenita, Beatriz, Talita, Daniela, Régia, Cássia, Rose, Feijão, pelo carinho, amizade e pelas valiosas dicas e colaboração.
- Ao Professor João Semir e Marcelo Monge pela identificação e auxilio no depósito das exsicatas no herbário da UNICAMP.
-Aos amigos Bianca, Miklos, Marisa, Vitor, Camila, Regina, pelos valiosos auxilio na construção do banco de microssatélites, nos desenhos dos primers, padronização das
PCR e tantas outras coisas.
- Aos funcionários do Departamento de Produção Vegetal-Horticultura da FCA e da Pós-Graduação, pela colaboração e atenção.
- À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa.
- À minha querida família, meu eterno agradecimento.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS...………...…… VII LISTA DE FIGURAS...………...…… IX
1. RESUMO…………...………...…… 1
2. SUMMARY... 3
3. INTRODUÇÃO... 5
4. REVISÃO DE LITERATURA... 8
4.1. Óleos essenciais... 8
4.2. O gênero Lychnophora... 13
4.3. Estudos fitoquímicos e biológicos de espécies do gênero Lychnophora... 18
4.4. Marcadores moleculares... 21
5. MATERIAL E MÉTODOS... 24
5.1. Coleta do Material Vegetal... 24
5.2. Extração e análise da composição química dos óleos essenciais... 26
5.2.1. Análise estatística dos dados... 28
5.3. Caracterização molecular via marcador microssatélite (SSR)... 28
5.3.1. Extração e quantificação do DNA... 28
5.3.2. Desenvolvimento e Caracterização de Marcadores Microssatélites... 29
5.3.2.1. Digestão do DNA... 29
5.3.2.2. Ligação dos adaptadores... 29
5.3.2.3. Pré-amplificação via PCR e purificação... 29
5.3.2.4. Seleção dos fragmentos contendo microssatélites... 29
5.3.2.5. Amplificação dos fragmentos selecionados via PCR... 30
5.3.2.6. Clonagem em vetor pGEM-T e transformação em células supercompetentes... 30
5.3.2.8. Seleção e sequenciamento dos clones positivos... 31
5.3.2.8.1. Amplificação dos insertos clonados... 31
5.3.2.8.2. Inoculação e extração plasmidial... 31
5.3.2.8.3. Sequenciamento... 32
5.3.2.9. Identificação e desenho dos motivos microssatélites... 33
5.3.2.10. Caracterização e genotipagem dos microssatélites... 34
5.4. Metodologia de análise estatística dos dados... 34
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 36
6.1. Rendimento dos óleos essenciais de Lychnophora ericoides e Lychnophora pinaster... 36
6.2. Caracterização da composição química dos óleos essenciais das populações de L. ericoides e L. pinaster... 40
6.3. CARACTERIZAÇÃO DA DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA... 58
6.3.1. Construções da biblioteca enriquecida e desenho dos primers... 58
6.3.2. Variação Genética... 60
6.3.3. Estrutura Genética... 66
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS... 73
8. CONCLUSÃO... 74
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 75
APÊNDICE 1... 86
APÊNDICE 2... 89
APÊNDICE 3... 109
LISTA DE TABELAS Página Tabela 1. Número de indivíduos coletados de Lychnophora ericoides e Lychnophora
pinaster no estado de Minas Gerais... 26
Tabela 2. Programação da reação de PCR para a amplificação dos primers de L. ericoides... 34
Tabela 3. Dados de RMN 1H (500 MHz) e 13C (125 MHz) do orto-acetoxi-bisabolol
isolada de Lychnophora ericoides, comparados com dados descritos na
literatura. Deslocamentos químicos em δ (ppm, δC e δH) e constantes de acoplamentos em Hz (entre parênteses)... 43 Tabela 4. Dados de RMN1H (500 MHz) e 13C (125 MHz) do ácido-14-oico-Į
-humuleno isolado de Lychnophora pinaster, comparados com os dados
descritos na literatura. Deslocamentos químicos em δ (ppm, δC e δH) e constantes de acoplamentos em Hz (entre parênteses)... 46 Tabela 5. Composição química média (% relativa) dos óleos essenciais de L.
ericoides (P1 - São Roque de Minas, P2 e P3 - Capitólio) e L. pinaster
(P4 - Olhos D’ Água e P5 - Estrada de Diamantina... 47 Tabela 6. Sequências dos pares de primers sintetizados para Lychnophora ericoides... 58
Tabela 7. Sequências dos pares de primers que amplificaram locos microssatélites em Lychnophora ericoides e Lychnophora pinaster... 60
Tabela 8. Frequências em porcentagem dos alelos nos oitos locos SSR nas populações de Lychnophora ericoides (P1 - São Roque de Minas, P2 e P3
- Capitólio) e Lychnophora pinaster (P4 - Olhos D’ Água e P5 - Estrada
de Diamantina) do estado de Minas Gerais... 61 Tabela 9. Heterozigosidade observada e esperada por loco para as populações
Lychnophora ericoides (P1 - São Roque de Minas, P2 e P3 - Capitólio).... 64
Tabela 10. Heterozigosidade observada e esperada por loco para as populações de
Lychnophora pinaster (P4-Olhos D’ Água e P5-Estrada de Diamantina).... 64
Tabela 11. Probabilidades exatas (Teste Exato de Fisher) dos desvios das proporções de aderência ao equilíbrio de Hardy-Weinberg em locos SSR nas populações Lychnophora ericoides (P1 - São Roque de Minas, P2 e P3 -
Capitólio) e Lychnophora pinaster (P4 - Olhos D’ Água e P5 - Estrada de
Diamantina)... 65 Tabela 12. Frequências de alelos privados nos locos microssatélite de alelos privados
para as populações Lychnophora ericoides (P1 - São Roque de Minas, P2
e P3 -Capitólio) e Lychnophora pinaster (P4 - Olhos D’ Água e P5 -
Tabela 13. Estimativa dos parâmetros indicadores do grau de estruturação genética (estatística F) de 8 locos SSR em três populações naturais de
Lychnophora ericoides (P1 - São Roque de Minas, P2 e P3 -Capitólio)... 67
Tabela 14. Estimativa dos parâmetros indicadores do grau de estruturação genética (estatística F) de 8 locos SSR em 2 populações naturais de Lychnophora pinaster (P4 - Olhos D’ Água e P5 - Estrada de Diamantina)... 68
Tabela 15. Resultados da AMOVA para Lychnophora ericoides (P1 - São Roque de
Minas, P2 e P3 -Capitólio) - MG... 68 Tabela 16. Resultados da AMOVA para Lychnophora pinaster (P4 - Olhos D’ Água
e P5 - Estrada de Diamantina) - MG... 69 Tabela 17. Resultados da AMOVA paraLychnophora ericoides (P1 - São Roque de
Minas,P2 e P3 -Capitólio) e Lychnophora pinaster (P4 - Olhos D’ Água e
P5 - Estrada de Diamantina)- MG... 69 Tabela 18. Distâncias genéticas de NEI (1978), calculadas entre as populações de
LISTA DE FIGURAS Página
Figura 1. Esquema da via metabólica de síntese dos monoterpenos e sesquiterpenos (adaptado de DEWICK, 2009 por MARQUES et al., 2012)... 9 Figura 2. Lychnophora ericoides (A e B – São Roque de Minas - C e D Capitólio -
MG)... 16 Figura 3. Lychnophora pinaster (A e B - Olhos D’ Água – C e D - Estrada de
Diamantina - MG)... 17 Figura 4. Localização das áreas das coletas das populações de Lychnophora ericoides
(P1 - São Roque de Minas e P2 e P3 - Capitólio) e Lychnophora pinaster
(P4 - Olhos D’ Água - P5 - Estrada de Diamantina), no estado de Minas Gerais... 25 Figura 5. Esquema representativo das etapas da construção da biblioteca enriquecida
com microssatélites (NUCCI, 2007)... 33 Figura 6. Rendimento (%) do óleo essencial dos indivíduos de Lychnophora ericoides
- P1 (São Roque de Minas - MG)... 36 Figura 7. Rendimento (%) do óleo essencial dos indivíduos de Lychnophora ericoides
- P2 (Capitólio - MG)... 37 Figura 8. Rendimento (%) do óleo essencial dos indivíduos de Lychnophora ericoides
- P3 (Capitólio - MG)... 37 Figura 9. Rendimento (%) do óleo essencial dos indivíduos de Lychnophora pinaster
P4 (Olhos D’ Água - MG)... 38 Figura 10. Rendimento (%) do óleo essencial dos indivíduos de Lychnophora
pinaster- P5 (Estrada de Diamantina - MG)... 38
Figura 11. Espectro de RMN de 13C da substância da substância com índice de retenção de 1901, isolada do óleo essencial da folha de Lychnophora ericoides... 41
Figura 12. Espectro de RMN de 1H da substância da substância com índice de retenção de 1901, isolada do óleo essencial da folha de Lychnophora ericoides... 41
Figura 13. Espectro de massas da substância da substância com índice de retenção de 1901, isolada do óleo essencial da folha de Lychnophora ericoides... 42
Figura 14. Espectro de RMN de 1H da substância com índice de retenção de 1823, isolada do óleo essencial da folha de Lychnophora pinaster... 44
Figura 15. Espectro de RMN de 13C da substância com índice de retenção de 1823, isolada do óleo essencial da folha de Lychnophora pinaster... 45
Figura 17. Estrutura química das principais substâncias identificadas nos óleos essenciais das populações de Lychnophora ericoides (P1 - São Roque de
Minas, P2 e P3 - Capitólio) e Lychnophora pinaster (P4 - Olhos D’ Água e
P5 - Estrada de Diamantina) - Minas Gerais... 50 Figura 18. Dendrograma das populações de Lychnophora ericoides (P1 - São Roque
de Minas, P2 e P3 - Capitólio) e Lychnophora pinaster (P4 - Olhos D’
Água e P5 - Estrada de Diamantina), em relação à composição química, definido pelo agrupamento UPGMA, a partir da matriz de proximidade (Coeficiente de correlação de Pearson)... 51 Figura 19. Composição química dos óleos essenciais dos indivíduos de Lychnophora
ericoides - P1 (São Roque de Minas - MG)... 53
Figura 20. Composição química dos óleos essenciais dos indivíduos de Lychnophora ericoides - P2 (Capitólio - MG)... 54
Figura 21. Composição química dos óleos essenciais dos indivíduos de Lychnophora ericoides - P3 (Capitólio - MG)... 54
Figura 22. Composição química dos óleos essenciais dos indivíduos de Lychnophora pinaster – P4 (Olhos D’ Água- MG)... 55
Figura 23. Composição química dos óleos essenciais dos indivíduos de Lychnophora pinaster - P5 (Estrada de Diamantina - MG)... 56
Figura 24. Gráficos das frequências alélicas das populações de Lychnophora ericoides
(P1 - São Roque de Minas, P2 e P3 - Capitólio) e Lychnophora pinaster
(P4 - Olhos D’ Água e P5 - Estrada de Diamantina) do estado de Minas Gerais... 62 Figura 25. Padrão de divergência genética entre as cinco populações de Lychnophora
ericoides (P1 - São Roque de Minas, P2 e P3 -Capitólio) e Lychnophora
pinaster (P4 - Olhos D’ Água e P5 - Estrada de Diamantina) – MG,
definido pelo agrupamento UPGMA, a partir das distâncias genéticas de Nei (1978)... 71 Figura 26. Gráfico com o valor de ¨K calculado para a estruturação genética de L.
ericoides pelo programa STRUCTURE, de acordo com o proposto por
Evanno et al. (2005)... 72
Figura 27. Análise de cluster (K=2)utilizando os indivíduos de populações naturais das populações de Lychnophora ericoides (1 = P1 - São Roque de Minas,
2 = P2, 3 = P3 - Capitólio – MG) e Lychnophora pinaster(4 = P4 - Olhos
1. RESUMO
Lychnophora ericoides e Lychnophora pinaster são espécies
medicinais, endêmicas do Brasil utilizadas na medicina popular, como analgésico, anti-inflamatório, no tratamento de contusões e reumatismo. O presente estudo tratou da caracterização genética e da composição química dos óleos essenciais de três populações de L.
ericoides (P1 - São Roque de Minas e P2 e P3 - Capitólio), e duas populações de L. pinaster
(P4 - Olhos D’Água e P5 - Estrada de Diamantina), coletadas no estado de Minas Gerais. Os óleos essenciais foram extraídos por hidrodestilação e a caracterização da composição química realizada em cromatógrafo gasoso acoplado a espectrômetro de massas. A caracterização da diversidade genética foi realizada utilizando marcador molecular microssatélite. As substâncias majoritárias dos óleos essenciais de L. ericoides da população P1 foram Ȗ
-eudesmol, Į-muurolol e Į-eudesmol e das populações P2 e P3 foram terpin-4-ol, ȕ-atlantol e
orto-acetoxi-bisabolol. As principais substâncias da espécie L. pinaster para a população P4
foram o 14-hidroxi-Z-cariofileno e um sesquiterpeno oxigenado e para a população P5 o
14-hidroxi-Į-humuleno e ácido-14-oico-Į-humuleno. O valor médio da heterozigosidade observada (HO) e esperada (HE) foi de 0,297 e 0,406 para L. ericoides e de 0,222 e 0,307 para
L. pinaster, respectivamente. A variabilidade genética foi maior dentro das populações para
ambas as espécies, entretanto as populações de L. ericoides também apresentaram alta
possui baixa variabilidade entre as populações (FST = 0,014). A análise da AMOVA entre grupo de populações separadas por espécie foi de 9%, sugerindo cruzamento entre as espécies. A análise de agrupamento evidenciou a formação de dois grupos, grupo 1 constituído pela população P2 (Capitólio), L. ericoides e grupo 2 constituído pelas populações P1 (São Roque
de Minas) e P3 (Capitólio) de L. ericoides e P4 (Olhos D’Água) e P5 (Estrada de Diamantina)
de L. pinaster.
_____________________
GENETIC DIVERSITY AND CHEMICAL COMPOSITION OF ESSENTIAL OILS OF POPULATIONS OF Lychnophora ericoides Mart. AND Lychnophora pinaster Mart.
Botucatu, 2012. 118 f. Tese (Doutorado em Agronomia/ Horticultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista.
Author: MARIA APARECIDA RIBEIRO VIEIRA Advisor: MARCIA ORTIZ MAYO MARQUES Co-adviser: MARIA IMACULADA ZUCCHI
2. SUMMARY
Lychnophora ericoides and Lychnophora pinaster are endemic
Brazilian medicinal species used in popular medicine as an analgesic and anti-inflammatory for treating bruises and rheumatism. This study considered the genetic characterization and chemical composition of the essential oils of three populations of L. ericoides (P1 - São Roque
de Minas and P2 and P3 – Capitólio), and two populations of L. pinaster (P4 - Olhos D’Água
and P5 – Estrada de Diamantina), collected in the State of Minas Gerais. The essential oils were extracted by hydro-distillation and the characterization of the chemical composition was performed by gas chromatography-mass spectrometry. The characterization of the genetic diversity was made using molecular microsatellite marker. The major substances of the essential oils from L. ericoides of P1-population were Ȗ-eudesmol, Į-muurolol and Į-eudesmol
and P2- and P3-population were terpinen-4-ol, ȕ-atlantol and orto-acetoxy-bisabolol. The
main substances of the species L. pinaster of P4-population were 14-hydroxy-Z-caryophyllene
and an oxygenated sesquiterpene and of P5-population were 14-hydroxy-Į-humulene and Į -humulene-14-oic acid. The average value of the heterozygosity observed (HO) and expected (HE) were 0.297 and 0.406 for L. ericoides, and 0.222 and 0.307 for L. pinaster, respectively.
The genetic variability was higher within populations for both species, however populations of
L. ericoides also presented high diversity among the populations (FST = 0.370), while
group 1, consisting of P2-population (Capitólio), L. ericoides; and group 2, comprising P1-
(São Roque de Minas) and P3-population (Capitólio) of L. ericoides and P4- (Olhos D’Água)
and P5-population (Estrada de Diamantina) of L. pinaster.
_____________________
3. INTRODUÇÃO
A diversidade genética vegetal de uma população contribui com a adaptação da sua estrutura genética a possíveis mudanças, convergindo para a variação entre populações (GRIBEL, 2001; YEEH et al., 1996). Quanto maior a variabilidade genética existente na população, maiores suas chances de perpetuação, desta maneira para o estabelecimento de práticas conservacionistas e manejo sustentável de uma população é importante o conhecimento da sua diversidade genética. Dentre as características mais importantes para a conservação, destacam-se o conhecimento do fluxo gênico, do sistema reprodutivo e da diversidade entre populações. A estrutura genética refere-se à distribuição da diversidade entre e dentro de populações; sua formação resulta de vários fatores, como o sistema de acasalamento, níveis de endogamia, fluxo gênico, bem como a deriva genética entre e dentro das populações, cujo conhecimento é importante para orientar na conservação das espécies (ZUCCHI et al., 2004).
Neste sentido a utilização racional e o manejo sustentável de espécies aromáticas e medicinais, é importante o conhecimento da divergência genética (LANGEREIN, 1994).
Apesar do genótipo, ser o principal determinante das respostas adaptativas das plantas, possibilitando diferenças na síntese dos metabólitos secundários, a quantidade e concentração, podem sofrer variações significativas, influenciadas por fatores ambientais, como a luminosidade (irradiação, qualidade luminosa e fotoperíodo), a latitude, as condições e o tipo de solo, os ventos, a temperatura e a disponibilidade de água, ou mesmo todos os fatores em conjunto, como é o caso da sazonalidade (CASTRO et al., 2004; MACIEL et al., 2002; LANGEREIN, 1994).
O gênero Lychnophora, família Asteraceae, apresenta diversos
problemas taxonômicos decorrentes, principalmente, da grande semelhança morfológica provavelmente devido ao polimorfismo e sobreposição de caracteres, também existe a suposição de ocorrência de possíveis híbridos naturais entre suas espécies (MANSANARES, 2004). As espécies L. ericoides e L. pinaster são muito próximas, sendo a separação entre elas
complicada (SEMIR, 1991). Marcadores moleculares têm sido utilizados para solucionar problemas taxonômicos clássicos e evolutivos para separar botanicamente diferentes espécies (NORRIS, 2002; KRZYWINSKI e BESANSKY, 2003; LEHR et al., 2005).
Dentro do gênero Lychnophora, estão as espécies L. ericoides e L.
pinaster, produtoras de óleos essenciais. A espécie L. ericoides (Mart.), é uma espécie
arbustiva, típica do bioma Cerrado, popularmente conhecida como arnica e falsa-arnica. Ocorre em Minas Gerais e Goiás; cresce em depósitos de minérios de ferro e manganês, afloramentos rochosos, altos platôs de campos rupestres e em pastagens de campo e de cerrado (AVELINO, 2005). Popularmente é utilizada como analgésico e anti-inflamatório (BERTONI et al., 2000). As principais substâncias encontradas nos óleos essenciais das folhas de L.
ericoides coletadas em Vianópolis-GO (denominadas pelos autores como amostras com
perfume) foram o α-bisabolol (76,4%) e o α-cadinol (23,5%), e para as populações coletadas em Cristalina-GO (denominadas pelos autores como amostras sem perfume) foram o (E
)-nerolidol (47,1%) e ar-dihidro-turmerona (15,4%) (CURADO et al., 2006).
A espécie L. pinaster (Mart.), popularmente é conhecida como arnica
mineira e arnica-da-serra (SEMIR, 1991). Suas folhas e flores aromáticas são utilizadas na medicina popular sob a forma de extrato alcoólico, como anti-inflamatório, anestésico e cicatrizante em ferimentos (PINHEIRO, 2002; SOUZA, 2003). A substância majoritária dos óleos essenciais das folhas de L. pinaster,relatados na literatura, pertence à classe dos
fenilpropanóides, o trans-cinamato de metila (HABER, 2008; REIS et al., 2010).
Deste modo, torna importante a compreensão da diversidade genética e a caracterização da composição química dos óleos essenciais, de populações de L. ericoides e
L. pinaster, visando fornecer informações para estudos de conservação das espécies,
O presente trabalho teve como objetivo avaliar populações de
Lychnophora ericoides e Lychnophora pinaster Mart., coletadas no estado de Minas Gerais,
sob o ponto de vista da composição química dos óleos essenciais e da diversidade genética, via marcador molecular microssatélite, com desenho de primers específicos para L. ericoides e
transferência dos primers obtido para L. pinaster, visando fornecer subsídio para a
4. REVISÃO DE LITERATURA 4.1. Óleos essenciais
Muitas enzimas estão envolvidas na biossíntese das substâncias voláteis das plantas, responsáveis pela produção de um grande e variado número de substâncias, com ampla variedade de funções necessárias para a adaptação e sobrevivência das espécies (MARQUES et al., 2012).
A composição química dos óleos essenciais é geralmente característica de uma dada espécie. Nas plantas são armazenados em órgãos especiais, tais como, estruturas celulares (organelas ou células especializadas) compartimentos ou canais esquizógenos e pêlos
glandulares, podendo ainda ser depositados no cerne das árvores (GOTTLIEB, 1985).
Os óleos essenciais, também chamados de óleos voláteis, óleos etéreos e essências, são obtidos a partir de diferentes partes das plantas, como por exemplo, da raiz (vetiver: Vetiveria zizanioides L.), madeira (Pau-rosa: Aniba rosaeodora D.), cascas (canela:
Cinnamomum zeylanicum), folhas (eucalipto: Eucalyptus citriodora H), frutos (laranja: Citrus
aurantium L.), flores (camomila: Matricaria recutita L.), rizomas (gengibre: Zingiber
officinales R.) e sementes (erva-doce: Pimpinella anisum L) (MARQUES et al., 2012).
Na natureza desempenham papel importante na adaptação das plantas ao meio ambiente atuando na defesa contra ataques de patógenos (ALVAREZ-CASTELLANOS et al., 2001), herbivoria (RESTELLO et al., 2009; ARIMURA et al., 2009), pragas (SCHNEE et al., 2006; CHAGA et al., 2002) e na reprodução das espécies vegetais por meio da atração de polinizadores (PICHERSKY e GERSHENZON, 2002). Também podem contribuir com a proteção das plantas contra estresses bióticos (GOUINGUENE e TURLINGS, 2002) e abióticos (COSTA-FILHO et al., 2001).
Os óleos essenciais podem ser usados como marcadores taxonômicos contribuindo com a investigação de aspectos taxonômicos e evolutivos intraespecíficos (ADAMS et al., 1993; GRAYER et al., 1999; TRIGO et al., 2003). O conhecimento dos mecanismos moleculares que regulam a biossíntese dos metabólitos secundários presentes nos óleos essenciais ainda é bastante limitado. Sabe-se que a produção destes pode ser controlada genéticamente ou epigeneticamente (TRAPP e CROTEAU, 2001). As variações epigenéticas são as alterações herdáveis na expressão e função de um gene, que não podem ser explicadas pelas alterações nas sequências do DNA (RICHARDS, 2006; BIRD, 2007).
Estudo em ecótipos de Arabdopsis thaliana detectaram níveis
A interação entre os fatores ambientais com a genética e/ou epigenetica podem causar variações significativas, regulando a produção (rendimento) dos óleos essenciais, bem como sua constituição química, levando a variações inter e intraespecíficas para uma mesma espécie. Ainda que a biossíntese desses compostos seja determinada geneticamente ou epigeneticamente, sendo geralmente específica para um determinado órgão, ou estádio de desenvolvimento das plantas (ROBBERTS et al., 1996;
TRAPP e CROTEAU, 2001), a quantidade, concentração e constituição química, podem sofrer variações significativas, influenciadas por fatores ambientais, como a luminosidade (irradiação, qualidade luminosa e fotoperíodo), a latitude, as condições e o tipo de solo, os ventos, a temperatura e a disponibilidade de água, ou mesmo todos os fatores em conjunto, como é o caso da sazonalidade (CASTRO et al., 2004; MACIEL et al., 2002).
O estudo da variação do teor e da composição química do óleo essencial das folhas de Lippia alba (Mill) N. E. Brown cultivada em São Luiz Gonzaga (RS) e
colhidas nas diferentes estações do ano demonstrou que a sazonalidade afeta de maneira distinta a biossíntese do número de estruturas químicas das duas principais classes de terpenóides presentes no óleo essencial, com o predomínio de estruturas sesquiterpenoídicas
no mês de janeiro e monoterpenoídicas em abril, enquanto nos meses de julho e outubro o número de sesquiterpenóides voltou a predominar (BARROS et al., 2009).
Na avaliação do perfil da variabilidade dos componentes voláteis do óleo essencial das folhas de 10 diferentes acessos de Baccharis dracunculifolia D.C.,
cultivados durante o período de 12 meses, o percentual de espatulenol no óleo essencial foi decrescente, variando de aproximadamente 35% no primeiro mês de análise (maio de 2004), até 18 % no mês de abril de 2005 (SOUSA, 2007).
Na análise da variabilidade sazonal (outono, inverno, primavera e verão) da composição química dos óleos essenciais de Lippia thymoides Mart. & Schauer, o
trans-cariofileno (substância majoritária), apresentou variações de 17,22 a 26,27% nas quatro
estações do ano. E a segunda substância com maior proporção relativa no outono foi a cânfora, no inverno o germacreno D e na primavera e verão o borneol (OLIVEIRA et al., 2010).
Costa et al. (2009) avaliando a influência sazonal no óleo essencial de folhas de Eugenia uniflora L. observou a presença de dois grupos de óleos essenciais,
apresentou as mais elevadas percentagens de espatulenol, trans-cariofileno e óxido de
cariofileno, já o grupo II, com amostras coletadas na estação úmida (outubro-março), apresentou elevadas porcentagens de selina-1,3,7(11)-trien-8-ona epóxido.
Duarte et al. (2009) avaliaram a composição química dos óleos essenciais de populações cultivadas de Eugenia dysenterica D.C., originadas de sementes
coletadas em duas localidades (grupo I - coletadas em Senador Canedo-GO e grupo II - coletadas em Campo Alegre de Goiás-GO), durante o verão e o inverno. Observaram que a composição química dos óleos essenciais divegiram em função da origem das sementes e da estação do ano. Para as amostras do grupo I coletadas no inverno as substâncias majoritárias foram o ȕ-pineno (6,6-14%), Į-pineno (5,9-13%) e (Z)-ȕ-ocimeno (0-13%) e para as amostras
coletadas no verão foram o Ȗ-cadineno (0-33%), limoneno (1,2-28%) e ȕ-pineno (3,2-23%). Os constituintes majoritários do grupo II foram o ȕ-cariofileno (15-74%), į-cadineno (0-24%) e Į-copaeno (0-14%), independentemente da estação do ano.
O rendimento do óleo essencial de Melissa officinalis L. em função do
estágio fenológico da planta, do horário de colheita e do tipo de secagem, em duas localidades (Sinanli e Batiayaz na Turquia) foi avaliado por Ayanoglu et al. (2005), sendo constatado que todos os fatores influenciaram o rendimento do óleo essencial, e que o melhor horário de colheita foi as 6:00hs em Sinanli (0,081%) e as 19:00hs em Batiayaz (0,117%).
Chang et al. (2008) obtiveram um aumento de 70% no rendimento do óleo essencial de folhas frescas de Ocimum basilicum L. quando comparado com as secas a
15°C e 25°C. A composição química também sofreu influência, havendo um maior acúmulo de eugenol no óleo essencial das folhas secas a 25°C, o que contribui para o gosto característicodo manjericão e, apesar de não ter havido efeito sobre a porcentagem relativa de linalol e 1,8-cineol, as porcentagens absolutas em folhas frescas foram significativamente diferentes.
Díaz-Maroto et al. (2004) avaliando a composição química do óleo essencial de folhas de Ocimum basilicum L. submetidas a diferentes processos de secagem,
durante a secagem a 45°C e liofilização, enquanto que, em temperatura ambiente houve apenas pequenas perdas, quando comparado às folhas frescas.
4.2. O gênero Lychnophora
O gênero Lychnophora pertence à subtribo Lychnophorineae, tribo
Vernoniaceae e à família Asteraceae, uma das maiores famílias de plantas existentes
(BRUNETON, 1995). É endêmico do Brasil, exclusiva do cerrado ocorrendo nos estados da Bahia, Goiais, Minas Gerais (SEMIR, 2011) Distrito Federal e São Paulo (LOEUILLE, 2012).
O gênero tem sofrido modificações, principalmente quanto ao número de espécie, desde seu estabelecimento por Martius em 1822 (COILE e JONES, 1981; ROBINSON, 1999; SEMIR, 1991). Na revisão efetuada por Coile e Jones (1981), os autores consideraram 11 espécies para o gênero, descreveram outras espécies como sinonímias e ainda transferiram outras para diferentes gêneros da tribo. Entretando o levantamento realizado por Semir em 1991, estabeleceu para o gênero 68 espécies divididas em seis seções,
Lychnophora; Lychonophoriopsis, Lychonophorioides, Lychonocephaliopsis, Sphaeranthus e
Chronopappus.
Robinson (1999) considerou 34 espécies para o gênero Lychnophora
aceitando algumas espécies sugeridas por Semir (1991). Uma nova espécie foi proposta para o gênero, Lychnophora sericea (HIND, 2000). Atualmente na versão online da lista de
espécies da flora do Brasil consta 35 espécies para o gênero Lychnophora, distribuídas no
cerrado no estado da Bahia, Goiáis, Distrito Federal, Minas Gerais e São Paulo (LOEUILLE, 2012). Semir (2011), destaca que a espécies L. ericoides foi coletada no município de
Pedregulho, distrito de Estreito, no estado de São Paulo divisa com Minas Gerais (SASAKI e MELLO-SILVA, 2008), entretanto, esse local representa apenas um limite político e não ecológico.
Entre as espécies de Lychnophora relatadas na literatura utilizadas na
medicina popular estão a L. salicifolia Mart., L. pinaster Mart. e L. ericoides Mart., utilizadas
A espécie L. ericoides apresenta potencial medicinal sendo a mais
utilizada pela população. É uma espécie arbustiva, hermafrodita de até 3 m de altura, típica do bioma Cerrado, conhecida popularmente como arnica, falsa-arnica ou candeia, floresce e frutifica de novembro a janeiro ou durante o ano inteiro, com épocas reprodutivas que podem variar entre as populações. L. ericoides ocorre em altitudes de 950 a 1800 metros em Minas
Gerais e Goiás; crescem em depósitos de minérios de ferro e manganês, afloramentos rochosos, altos platôs de campos rupestres e em pastagens de campo e de cerrado. Mostra-se como uma espécie xenógama facultativa, formando frutos com semente por polinização cruzada, por autopolinização bem como por agamospermia (Avelino, 2005). As folhas são alternas, simples, subsésseis; limbo com 2 a 15 cm x 1 a 3 cm, linear; ápice angusto; base truncada; margens inteiras; nervura mediana sulcada na face ventral; nervura secundária imperceptível. A inflorescência é um glomérulo de capítulos terminal com 20 a 30 flores; capítulos involucreados (com proteção formada por brácteas na base da inflorescência). Suas flores possuem cerca de 1 cm de comprimento, actinomorfas; cálice transformado em papus; corola violácea, cinco estames, sinânteros; filetes curtos, filiformes, inseridos na corola, anteras sagitadas, ovário ínfero e unilocular, com um só óvulo basal; 1 estilete; filiforme, estigma bífito com ramos pilosos, agudos. Os frutos são aquênio com cerca de 2 a 3 mm de comprimento, castanho, papus com cerca de 6 a 7 mm de comprimento, bisseriado, com paleas desiguais, lineares, aplanadas e ciliadas (SEMIR, 1991).
L. ericoides ocorre na Serra do Espinhaço, apresentando populações
disjuntas no Planalto de Diamantina, Furnas, Serra da Canastra e em alguns locais no sudeste de Minas Gerais, dispersando-se para Góiais , em Cristalina, Chapada dos Viadeiros, Serra Dourada, Serra dos Pirineus e em Serras proximas a Brasilia (SEMIR et al., 2011).
Outra espécie pertencente a este gênero e de importância medicinal é
L. pinaster, popularmente conhecida como arnica, quepode ser encontrada em campos
pinaster, na Serra do Caraça, Ouro Preto, Serra do Ouro Branco, Carrancas, São Joao Del Rei
em Belo Horizonte na Serra da Rola Moça, Moeda, Curral e Lavras, que parace ser o limite sul do gênero. Existem ocorrência de populações na região intermediaria da Serra do Cipó e em alguns pontos no Planalto de Diamantina, tendo seu limite, provavelmente, em Virgem da Lapa e na Serra do Gão Mogol (SEMIR et al., 2011).
A espécie L. pinaster é caracterizada por plantas que variam de
subarbusto ereto bem ramificado a pequenos arbustos e mais raramente, a arbustos mais altos. Suas folhas podem apresentar variações, sendo muito imbricadas e ascendentes na parte superior dos ramos e mais patentes até pouco reflexas abaixo, fortemente rugosas e buladas na face adaxial e indumento curto, tomentoso, que cobre totalmente a face abaxial, mas não mascara as nevuras que são evidentes e salientes. Suas inflorescências possuem formato de glomérulos simples folhosos, geralmente muito congestos, hemisféricos com folhas esparsas entre eles com 1,0 a 1,5 cm de comprimento e 2,0 a 3,0 cm de diâmetro, em ramos folhosos com até 10,0 cm de comprimento e até 0,3 cm, raramente 1,0 cm de diâmetro. Seus capítulos são campanulados cilíndricos com 3 a 5 flores, com 6,5 a 8,0 cm de comprimento e 3,0 a 5,0 mm de diâmetro (SEMIR, 1991).
L. ericoides e L. pinaster, são muito próximas, dificultando a
separação entre elas (SEMIR, 1991). Devido ao polimorfismo e sobreposição de caracteres entreas mesmas, Coile e Jones (1981) sinonimizaram L. pinaster juntamente com L. ericoides.
Ambas, principalmente L. pinaster, são bastante polimórficas no porte, diâmetro dos ramos,
forma, comprimento e largura das folhas. Embora, L. pinaster (Figura 2) normalmente
apresenta indivíduos mais delicados (subarbustos), menores, de ramos mais delgados. É possível encontrar indivíduos com porte semelhante ao de L. ericoides que apresenta
indivíduos com porte geralmente grande com ramos mais robustos (Figura 3). Entre o conjunto de caracteres utilizados para separá-las está o hábito, indumento e atributos foliares. O indumento das folhas da L. ericoides varia de lanoso a subviloso com tricomas grandes, ao
passo que na L. pinaster o indumento varia de tomentoso a subvelutino (SEMIR, 1991).
Os resultados de números cromossômicos, mostrou que as espécies L.
ericoides e L. pinaster apresentarm o mesmo número de cromossomos (2n=34), entretanto o
número de sítios de DNAr 45S da L. ericoides é seis diferindo da L. pinaster que é oito
Fonte: Vieira
Figura 2. Lychnophora pinaster (A e B - Olhos D’ Água - C e D - Estrada de Diamantina -
Fonte: Vieira
4.3. Estudos fitoquímicos e biológicos de espécies do gênero Lychnophora
Os metabólitos das espécies de Lychnophora têm sido alvos de muitos
estudos acerca de suas atividades biológicas e farmacológicas. Foram avaliadas atividades tais como: antioxidante (CHICARO et al., 2004; KANASHIRO et al., 2004), citotóxica (CANALLE et al., 2001), antimicrobiana (SAÚDE et al., 1998), tripanossomicida (JORDÃO et al., 2004; ALCÂNTARA et al., 2005; SILVEIRA et al., 2005), antinociceptiva (BORSATO et al., 2000; SANTOS et al., 2005) e anti-inflamatória (AZEVEDO, 2004; FERRAZ- FILHA et al., 2006).
Miguel et al. (1996) verificou que a espécie L. salicifolia conhecida
popularmente como arnicão, possui ação antibacteriana contra Staphylococcus aureus, e
propriedades antifúngicas contra Candida albicans. No estudo realizado por Jordão et al.
(2004) os extratos das folhas e inflorescências de L.salicifolia apresentam ação tripanocida.
Extratos etanólicos de folhas de Lychnophora affinis (LE QUESNE et
al., 1976) e Lychnophora trichocarpha (SAÚDE, 1994) demonstraram atividade anti-câncer.
O ácido acetil lychnofólico isolado do extrato etanólico das folhas e caules de L. salicifolia e
os sesquiterpenos de L. trichocarpha apresentaram atividade antimicrobiana (MIGUEL et al.,
1996, SAÚDE et al., 1998).
Ferraz-Filha et al. (2006) relataram que os extratos brutos das folhas das espécies L. passerina, L. candelabrum, L. pinaster, L. ericoides, L. staavioides e L.
trichocarpha, coletados em Minas Gerais, possuem elevada atividade inibitória da enzima
xantina oxidase, provavelmente por conter substâncias bioativas úteis no tratamento da gota e outras doenças induzidas pela atividade da xantina oxidase, justificando assim o uso popular dessas espécies no tratamento do reumatismo.
Os extratos etanólicos das partes aéreas da Lychnophoriopsis
candelabrum, Lychnophora ericoides, L. passerina, L. staavioides, L. trichocarpha e L.
pinaster, coletadas no estado de Minas Gerais, foram avaliados quanto à atividade analgésica e
anti-inflamatória. Os extratos etanólicos das espécies L. passerina, L. candelabrum e L.
pinaster na dose 0,75 g/kg e de L. ericoides (0,75 g/kg) e L. trichocarpha (1,50 g/kg)
dos animais. No teste de atividade anti-inflamatória as espécies L. pinaster e L. trichocarpha
mostraram atividade semelhantes ao diclofenaco gel (padrão) (GUZZO et al., 2008).
A atividade antioxidante de 30 compostos fenólicos isolados dos extratos das folhas e inflorescências de L. staavioides, L. gardneri, L. pohlli coletadas em
Diamantina (MG) e L. ericoides, coletada em Ibiraci (MG), revelou que a atividade
antioxidante dos compostos fenólicos é dependente da sua estrutura química, a presença de um grupo catecol e a conjugação com um molécula de ácido cafeíco pode contribuir com a atividade antioxidante (GRAEL et al., 2010).
Silveira et al. (2005), avaliando a atividade biológica do extrato aquoso liofilizado de parte aérea de L. pinaster, coletada na Serra da Moeda (MG),
verificaram que o mesmo exibiu atividade tripanossomicida, mas causou lise das células sanguíneas, provavelmente devidoá presença das saponinas. Observaram ainda, a presença dos ácidos cafeíco e isoclorogênico, da vitexina, isovitexina e da quercetina.
O extrato hexânico da parte aérea de L. pinaster, coletada na Serra da
Moeda (MG) revelou o ácido trans-lichnofórico, além de misturas de hidrocarbonetos
homólogos, dos triterpenos lupeol, Į e ȕ-amirina e friedelina e de ácidos graxos (SILVEIRA et al., 2005).
Alcântara et al. (2005) observaram que o ácido trans-lichnofórico e
seus derivados (ácido metil éster trans-lichnofórico e iso-cariofileno-15-ol), eliminaram
100% das formas tripomastigota do Trypanosoma cruzi nas concentrações de 13,86; 5,68 e
6,48 μg/mL, respectivamente. Sendo que o ácido metil éster trans-lichnofórico e o
iso-cariofileno-15-ol, foram duas vez mais ativos do que o ácido trans-lichnofórico.
Os extratos apolares das folhas e caules de L. pinaster, coletados em
Nova Lima-MG e o triterpeno Į-amirina, isolado destes extratos mostraram ação antibacteriana contra Staphylococcus aureus (ABREU et al., 2011).
Foram isolados 18 compostos das folhas de L. ericoides coletadas em
Pirenópolis (GO), entre flavonóides e lactonas sesquiterpênicas (SARGENTI e VICHNEWSKI, 2000).
Borsato et al. (2000), avaliaram a atividade analgésica de lignanas extraídas dos extratos obtidos de raízes e folhas de L. ericoides, coletadas em Delfinópolis
analgésica significativa, enquanto que, o extrato das folhas não apresentou atividade. Entre as 10 lignanas isoladas, a cubebina foi a que apresentou maior atividade.
Sakamoto et al. (2003) isolaram das folhas de L. ericoides, coletadas
em Ibiraci (MG), duas novas lactonas sesquiterpênicas (C21H28O6 e C20H26O6) e o monitoramento do metabolismo dos furanoheliangolidos, revelou um aumento da biossíntese destes no período de florescimento. Os ácidos 3,5 e 4,5-di-O-[E]- cafeoilquínicos isolados de
extrato polar das raízes de L. ericoides, coletadas em Delfinópolis (MG) apresentaram
atividade analgésica (SANTOS et al., 2005).
O estudo do extrato polar das folhas de L. ericoides, coletadas em
Ibiraci (MG), revelou como constituintes o 6,8-di-C-β-glicosilapigenina e o 6,8-di-C-β -glicosilcrisina, que demonstraram atividade antiedematogênica no método de edema de pata induzido pela carragenina em ratos (GOBBO-NETO et al., 2005).
Gobbo-Neto et al. (2008), Identificaram nos tricomas glandulares das folhas de L. ericoides, coletadas em Ibiraci (MG) e Capitólio (MG), a presença de cinco
flavonoides: crisina, pinocembrina, pinostrobina, pinobanksina e 3-O-acetilpinobanksina.
A caracterização da composição química dos óleos essenciais dos indivíduos de três populações naturais de L. pinaster coletadas no estado de Minas Gerais nos
municípios de Lavras (população Antena), Carrancas (população Estrada Real) e entre os municípios de Lavras e Ingaí (população Poço Bonito) e cultivadas em Botucatu (SP), revelou como substância majoritária o trans-cinamato de metila para os indivíduos das populações
naturais e cultivados de Carrancas e Poço Bonito. Entretanto, para a população de Antena a substância majoritária foi o sesquiterpeno cedr-8(15)-en-9-Į-ol para os indivíduos nativos e o
trans-cinamato de metila para os cultivados (HABER, 2008).
Reis et al. (2010) realizaram a caracterização do óleo essencial das partes aéreas de L. pinaster cultivadas na Universidade Federal de Lavras (MG), nas diferentes
estações do ano, tendo como substância majoritária o trans-cinamato de metila nas quatros
estações.
Na avaliação da composição química do óleo essencial das folhas de duas populações de L. ericoides, observou-se a formação de dois grupos: o grupo I constituído
tendo com substâncias majoritárias o α-bisabolol (76,4%) e o α-cadinol (23,5%) e o grupo II formado pela população coletada em Cristalina - GO (denominadas pelos autores como amostras sem perfume) onde as substâncias majoritárias foram o (E)-nerolidol (47,1%) e ar
-dihidro-turmerona (15,4%) (CURADO et al., 2006).
Lyra et al. (2008), avaliaram a composição química do óleo essencial das folhas em três populações naturais de L. ericoides, aromáticas e não aromáticas e
observaram dois grupos de óleos essenciais. O primeiro formado pelas amostras aromáticas contendo altas porcentagens de Į-tujeno (13%) e o-cimeno (17%), para as amostras do Parque
Estadual da Serra de Caldas Novas (GO) e Į-bisabolol (47% e 45%, respectivamente), para as amostras do Parque Nacional de Brasília (DF) e de Santo Antônio do Descoberto (GO). O segundo grupo, formado por amostras não aromáticas, sendo as substâncias majoritárias o óxido de cariofileno (14% e 13%) e o Į-bisabolol (26% e 25%, respectivamente) para as amostras do Parque Estadual da Serra de Caldas Novas e Santo Antônio do Descoberto e o Į -bisabolol (17%) para as amostras do Parque Nacional de Brasília. As variações químicas sugerem, além da influência geográfica, diferenças genéticas entre indivíduos nas populações.
Costa et al. (2008), avaliaram a variação do óleo essencial das folhas
de L. ericoides, coletadas em Cristalina e Vianópolis (GO), sendo o trans-nerolidol a
substância majoritária para o município de Cristalina e o Į-bisabolol para Vianópolis.
Baldin et al. (2010), avaliaram o efeito acaricida do óleo essencial dos ramos e folhas de L. ericoides coletadas no município de Furnas (MG), sobre o Tetranychus
urticae. A maior parte das substâncias dos óleos essenciais identificadas foram monoterpenos
(44%) e o sesquiterpeno Į- bisabolol (2%). O maior índice de atividade acaricida do óleo essencial foi após 48 e 72 h de exposição.
4.4. Marcadores moleculares
também para investigar questões taxonômicas e evolutivas (CARVALHO e TORRES, 2002; GAIOTTO, 2001; FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1996).
Com base na metodologia utilizada para identificá-los, os marcadores moleculares podem ser divididos em dois grupos. No primeiro grupo, estão os marcadores RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e os minissatélites ou locos VNTR
(Variable Number of Tandem Repeats), identificados por hibridização e os baseados na
amplificação do DNA que incluem os marcadores RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA), os SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions), os STS
(Sequence Tagged Sites), os SSR (Simple Sequence Repeats) e os AFLP (Amplified
Fragment Length Polymorphism) ( BORBA, 2007).
Espécies de fecundação cruzada (alógama) ou mista, com dispersão de pólen pelo vento, apresentam maior variação genética dentro de suas populações que espécies autógamas (HAMRICK e GODT, 1989). Populações de espécies cuja polinização é feita por animais que percorrem longas distâncias, apresentam maior diversidade genética que aquelas polinizadas pelo vento ou animais que percorrem curtas distâncias (HAMRICK e LOVELESS 1986). As populações de Mabea fistulifera e Plathymenia reticulata, que possuem fecundação
cruzada, apresentaram 8,97% e 12,3%, de diferenciação entre as populações, respectivamente (GOULART et al., 2005; LACERDA et al., 2001).
Azevedo (2004) avaliou a variabilidade genética utilizando marcador isoenzimático, de populações de Lychnophora granmogolense, L. rupestris, L. nanusae e L.
ramosissima, com diferentes amplitudes de distribuição geográfica, sendo que dos 18 locos
analisados, 15 foram polimórficos. Foi encontrada uma relação entre a distribuição geográfica e a variabilidade genética, sendo que as espécies com distribuições geográficas mais restritas
(Lychnophora rupestris, L. nanuzae e L. ramosissima) apresentaram variabilidade genética
maior do que a da espécie de distribuição mais ampla (L. granmogolense).
Melo (2006) avaliou a diversidade genética de quatro populações de L.
ericoides coletadas na região do Distrito Federal duas populações no Parque Nacional de
Brasília (uma aromática outra não), uma população na Fazenda Água Limpa - UNB (aromática) e uma população no Jardim Botânico de Brasília (com indivíduos de menor porte e não aromática), por meio de marcador molecular RAPD (dominante), selecionaram 15
(UPGMA) e pelo coeficiente de similaridade de Dice, observou-se a presença de quatro agrupamentos consistentes, com uma variabilidade genética entre populações de 37,5% e, dentro de populações de 64,3%, evidenciando uma alta variação entre e dentro das populações, resultando em importantes informações para estratégias de conservação da espécie.
Wieczorek e Geber (2002), avaliando populações de Solidagosem
pervirens por meio de marcadores microssatélites, observaram polimorfismo em nove dos
vinte primers avaliados, com número de alelos variando de 6 a 25 e heterozigosidades
observadas (HO) e esperadas (HE) variando de 0,309 a 0,671 e 0,389 a 0,864, respectivamente. A variabilidade da diversidade e estrutura genética de três populações nativas de Lychnophora pinaster, coletadas no estado de Minas Gerais nos municípios de
Lavras (população Antena), Carrancas (população Estrada Real) e entre os municípios de Lavras e Ingaí (população Poço Bonito), foi realizada com marcador microssátelite, observou-se a formação de dois grupos, pelo agrupamento UPGMA, um constituído pelas populações de Estrada Real e Antena, e o outro pela população de Poço Bonito. A heterozigosidade observada (Ho) variou de 0,196 a 0,652, sendo consideravelmente menor que a heterozigosidade esperada (HE) que variou de 0,599 a 0,918 apontando um excesso de homozigotos (HABER, 2008).
A transferibilidade de microssátelites entre espécies relacionadas é uma consequência da homologia da sequência de DNA das regiões que flanqueiam os microsatélites. Na transferibilidade dos locos da mandioca (Manihot esculenta) para seis
diferentes espécies selvagens, apenas dois pares de primers não amplificaram para duas espécies selvagens mais distantes, indicando que quanto maior a distância genética entre as espécies, menor é o nível de transferibilidade (ROA et al., 2000)
Collevatti et al. (1999) observaram 100% de transferibilidade dos locos desenvolvidos com Caryocar brasiliense para cinco outras espécies do mesmo gênero (C.
coriaceum, C.edule, C. glabrum, C. pallidum e C. villosum). Steinkellner et al. (1997)
verificaram a transferibilidade de 17 pares de primers desenvolvidos para o carvalho
(Quercus petraea) para a família Fagaceae, utilizando três gêneros e seis espécies de carvalho.
5. MATERIAL E MÉTODOS 5.1. Coleta do Material Vegetal
O material vegetal utilizado para este estudo foi coletado no Cerrado de Minas Gerais e as médias das coordenadas (altitude, latitude e longitude) foram determinadas com receptor GPS (Global Positioning System). Foram coletadas três
populações de L. ericoides, em Junho de 2010, Uma nas proximidades do município de São
Roque de Minas (população 1) e duas na região de Capitólio (populações 2 e 3). Em novembro de 2010 foram coletadas duas populações de L. pinaster nas proximidades dos
municípios de Olhos D’ Água (população 4) e Estrada de Diamantina (população5) em (Figura 4). Os dados com as coordenadas geográficas e o estadio fisiológico dos indivíduos estão listados no apêndice 3 - páginas 110, 111, 112, 113 e 114.
A distância entre as populações de L. ericoides foi de 80 Km entre a
altitude, em uma área de difícil acesso, bem conservada, de pequeno, médio e grande porte, apresentando folhas de coloração verde escura.
As populações de L. pinaster estão geograficamente separadas pelo rio
Jequitinhonha, há uma distância entre si de 15,3 km, situadas em uma região plana e em uma área conservada.
Figura 4. Localização das áreas das coletas das populações de Lychnophora ericoides (P1 -
São Roque de Minas e P2 e P3 - Capitólio) e Lychnophora pinaster (P4 - Olhos D’ Água - P5
- Estrada de Diamantina), no estado de Minas Gerais.
De cada população foram coletadas folhas jovens para a avaliação da variabilidade genética, as quais foram armazenadas em tubos falcon contendo sílica e devidamente identificadas. No laboratório as amostras foram armazenadas em freezer -20. Foram coletados ramos de indivíduos de médio e grande porte para análise da composição química dos óleos essenciais das folhas. O número de indivíduos coletados por população variou de acordo com a quantidade e tamanho das populações (Tabela 1).
(População 2), UEC 160275 (População 3), UEC 160270 (População 4) e UEC 160272 (População 5).
A coleta dos materiais vegetais foram realizadas com autorização do Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio), Ministério do Meio Ambiente, licença: 22772-1.
Tabela 1. Número de indivíduos coletados de Lychnophora ericoides e Lychnophora pinaster
no estado de Minas Gerais.
População Número de indivíduos
Análise química Análise genética
P1 - São Roque de Minas* 10 40
P2 - Capitólio* 30 30
P3 -Capitólio* 40 40
P4 - Olhos D’ Água** 40 40
P5 -Estrada de Diamantina** 40 40
(*) L. ericoides - (**) L. pinaster
5.2. Extração e análise da composição química dos óleos essenciais
Após separar as folhas dos ramos, os óleos essenciais foram extraídos por hidrodestilação em aparato tipo Clevenger por duas horas, a seguir armazenados em frascos de vidro e mantidos em freezer.
A separação e quantificação (método de normalização de área) das substâncias foram realizadas em cromatógrafo gasoso com detector de ionização de chama (CG-DIC, Shimadzu, GC-2010) utilizando coluna capilar de sílica fundida: DB-5 (J&W Scientific; 30,0m x 0,25mm x 0,25ȝm; gás de arraste hélio (1 mL/min), injetor a 240ºC, detector a 230ºC, split 1/20. Foi injetado 1ȝL de solução (1 ȝL do óleo essencial em 1mL de acetato de etila - grau Cromatográfico) no seguinte programa de temperatura: 60°C - 80ºC, 6°C/min; 80°C - 115ºC, 3°C/min; 115°C - 150ºC, 8°C/min; 150°C - 180ºC, 3°C/min, 180°C - 240ºC, 8°C/min, 240°C (10min).
elétrons (70eV). Coluna capilar de sílica fundida: OV-5 (Ohio Valley Specialty Chemical, Inc. 30,0m x 0,25mm x 0,25ȝm); gás de arraste hélio (1 mL/min), injetor a 240ºC, detector a 230ºC, split. 1/20. Foi injetado 1ȝL da solução (1 ȝL do óleo essencial em 1mL de acetato de etila - grau Cromatográfico) operando nas mesmas condições que o CG-DIC. .
As substâncias foram identificadas pela comparação de seus espectros de massas com o banco de dados do sistema (CG-EM) e índices de Retenção (IR) com dados de literatura (Adams, 2007). Para a obtenção dos IR das substâncias foi empregada uma mistura de hidrocarbonetos (C9-C24 - Sigma Aldrich 99%), analisada nas mesmas condições operacionais das amostras e aplicando-se a equação de Van den Dool & Kratz, 1963 (VAN DEN DOOL; KRATZ, 1963).
Nos casos em que a metodologia descrita anteriormente não permitiu a identificação das substâncias, os óleos essenciais foram submetidos cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP), para o isolamento das substâncias. Previamente, os óleos essenciais foram submetidos á cromatografia em camada delgada (CCD) para a escolha do solvente de eluição. A visualização das substâncias realizadas por irradiação com luz ultravioleta em λmáx 254 e 365 nm. Os óleos essenciais (100 mg) foram diluídos em acetato de etila (grau cromátografico) e aplicados em cromatoplacas de sílica 60 F254 (20 x 20, Merck) e eluidas com a mistura de hexano e acetato de etila (95:5) por três vezes. As substancias foram extraídas da sílica por meio da mistura de metanol e diclorometano (PA Merck) e a solução concentrada em rotaevaporador.
As substâncias isoladas foram injetadas no sistema CG-EM nas condições descritas acima, para avaliação do grau de pureza e a obtenção dos respectivos espectros de massas. A seguir foram obtidos os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN1H) e Carbono-13 (RMN13C) uni-(1D) e bidimensional (2D). Os espectros de RMN de 1H e 13C, unidimensional (1D), foram obtidosem espectrômetro Brucker Inova 500 (1H:500 MHz; 13C:125 MHz), utilizando CDCl3 como solvente e TMS como referência internaou o sinal do solvente.
5.2.1. Análise estatística dos dados
Os dados de composição química dos óleos essenciais foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade com auxílio do programa estatístico SANEST (MACHADO e ZONTA, 1995).
Realizou-se a análise de Cluster Aglomerativa Hierárquica (CAH), para avaliar a relação da composição química entre as populações, onde se agrupou os individuos de acordo com a sua composição química, utilizando o programa XLSTAT 2012.
5.3. Caracterização molecular via marcador microssatélite (SSR) 5.3.1. Extração e quantificação do DNA
Realizaram-se as extrações do DNA das folhas liofilizadas e trituradas, dos indivíduos das populações de L. ericoides e L. pinaster seguindo o protocolo de Doyle e
Doyle (1990) com modificações. Em tubo, devidamente identificado, 800 ȝL de tampão de extração pré-aquecido (CTAB 2%, 1,42 M NaCl, 20 mM EDTA, 100mM Tris-HCl pH 8 - PVP 2% e ȕ-mercaptoetanol 0,6%) foram adicionados a 15 mg do material vegetal e mantidos em banho-maria à 65ºC por 60 min. Realizou-se as etapas com a adição de 450 ȝL de fenol e a seguir de 450 ȝL de 1:1 fenol:CIA (CIA, 24:1 clorofórmio:álcool isoamílico), centrifugando por 10 min a 10.000 rpm, transferiu-se o sobrenadante para novos tubos, consecutivamente. A precipitação do DNA foi realizada com 600 ȝL de isopropanol gelado, com incubação a -20ºC por 60 min. O precipitado foi lavado, em duas etapas consecutivas, com etanol 70% e etanol absoluto com centrifugação a 10.000 rpm por 5 min. O precipitado foi seco em temperatura ambiente e ressuspendido em 60 ȝL de TE (10 mM Tris e 1 mM EDTA, pH 8,0). Após as amostras serem tratadas com 1 ȝL de RNase (10 mg mL-1, Ribonuclease A, Sigma) à 37ºC por 60 min, foram armazenadas em freezer à -20ºC.
5.3.2. Desenvolvimento e Caracterização de Marcadores Microssatélites
Para a construção da biblioteca genômica enriquecida com locos microssatélites foi utilizado o protocolo descrito por Billotte et al. (1999), com modificações (Figura 5), conforme descrição a seguir:
5.3.2.1. Digestão do DNA
O DNA de um genótipo de L. ericoides, escolhido aleatoriamente, foi
digerido para gerar fragmentos de tamanhos adequados. Aproximadamente 5μg de DNA genômico foram digeridos pela enzima Afa I (Invitrogen - 10 U/μL). A digestão foi verificada por meio de eletroforese em gel de agarose 1,2% por 1,5 h a 60 V.
5.3.2.2. Ligação dos adaptadores
Com o objetivo de aumentar o número de cópias dos fragmentos genômicos, os adaptadores Afa21 CTC TTG CTT ACG CGT GGA CTA-3´) e Afa25 (5´-TAG TCC ACG CGT AAG CAA GAG CAC A-3´) (Integrated DNA Technologies, Inc.) foram ligados ao produto da digestão a fim de garantir que todos os fragmentos tivessem uma terminação comum e conhecida.
5.3.2.3. Pré-amplificação via PCR e purificação
Após a ligação aos adaptadores, foi realizada uma etapa de pré-amplificação, visando gerar maior quantidade de fragmentos que foram ligados aos adaptadores. Os fragmentos digeridos foram submetidos a uma PCR utilizando como primer um dos adaptadores, o Afa21. Após a ligação, os fragmentos foram amplificados, sendo estes purificados utilizando o “Quiaquick PCR purification kit” (QIAGEN Cat. # 28104).
5.3.2.4. Seleção dos fragmentos contendo microssatélites
das microesferas em SSC 0,1X, em 250 ȝL de água milli-Q (Marca Elga - Purelab Ultra- Modelo: Ultrapuro MK2 - Grau de pureza - 18.2 MW-cm) e armazenado a -20ºC.
5.3.2.5. Amplificação dos fragmentos selecionados via PCR
O número de cópias dos fragmentos selecionados foi amplificado via PCR, utilizando como primer o adaptador Afa21. A reação foi realizada em termociclador BIORAD PTC-100 Peltier, O produto da reação foi analisado por meio de eletroforese em gel de agarose 1%, TBE 1X (100 V), corado com SYBR Safe (Invitrogen).
5.3.2.6. Clonagem em vetor pGEM-T e transformação em células
supercompetentes
Os fragmentos amplificados foram clonados empGEM-T Easy Vector
System (Promega), segundo o protocolo fornecido com o vetor plasmidial e foram transformados em células XL1-Blue competentes.
As colônias brancas (clones transformados) foram isoladas com palitos estéreis e transferidas para meio 2YT-HMFM líquido com 100 ȝg mL-1 de ampicilina em placas do tipo ELISA, fechada com adesivo (ABgene) com furos para aeração. Os clones foram incubados a 37ºC por 18h e em seguida, armazenados em ultrafreezer a -80ºC,
devidamente identificados.
5.3.2.7. Manutenção dos clones
5.3.2.8. Seleção e sequenciamento dos clones positivos 5.3.2.8.1. Amplificação dos insertos clonados
Com o objetivo de identificar os clones contendo microssatélites e verificar a eficiência do procedimento de enriquecimento e clonagem, foi realizada uma reação de amplificação dos insertos diretamente das colônias obtidas na etapa anterior, utilizando o primer Afa21. Colônias individuais foram transferidas com um palito estéril para o tubo de PCR contendo 30,5 μ L de água milliQ autoclavada. Esta suspensão de células foi utilizada em uma reação com volume final de 45,0μL. Para controle, 10 μL do volume da reação foram utilizados na eletroforese em gel de agarose 1,5%.
5.3.2.8.2. Inoculação e extração plasmidial
Com o objetivo de isolar o DNA plasmidial das colônias recombinantes, para posterior sequenciamento, foi colocado 1 mL de meio LB líquido contendo 100 ȝg mL-1 de ampicilina em placa com 96 canaletas de poço fundo (ABgene), a 37ºC por 22 h sob agitação a 300 rpm (G24 Environmental Incubator Shaker). A placa, com as suspensões bacterianas, foi centrifugada a 3.000 rpm por 6 min. O sobrenadante foi descartado e 240 ȝL de GTE (0,92% glicose, 26 mM Tris-HCl - pH 7,4, 10 mM EDTA pH 8) foram adicionados a cada poço, a placa foi agitada em vortex por 2 min. Após centrifugação a 4.000 rpm por 6 min, o sobrenadante foi descartado.
70% gelado, seguido de centrifugação a 4.000 rpm por 5 min a 20ºC. Após descarte do sobrenadante, os precipitados secaram em temperatura ambiente e foram ressuspendidos em 60 ȝL de água milli-Q. A qualidade da extração plasmidial foi verificada em eletroforese em gel de agarose 0,8%, TBE 1X (100 V), corado com SYBR Safe (Invitrogen), com marcador de peso molecular de 100bp (Fermentas Life Science).
5.3.2.8.3. Sequênciamento
A reação da PCR para sequênciamento foi realizada com 2ȝL de tampão Save Money (5 mM MgCl2, 200 mM Tris-HCl, pH 9), 5 pM iniciador SP6 (5´CATACGATT TAGGTGACACTATAG 3´), 2 ȝL da extração plasmidial e 0,4 ȝL de BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) em volume final de 10 ȝL. O programa apresentou desnaturação inicial a 96ºC por 2min; 26 ciclos 96ºC por 45s, 50ºC por 30s e 60ºC por 4min. A reação foi purificada antes do sequenciamento, em cada poço da placa foram adicionados 80μL de isopropanol 65%.
A placa foi deixada em repouso, ao abrigo da luz, por 15min, e então centrifugada a 4.000rpm por 45min. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 200μL de etanol 70% e seco em temperatura ambiente, em local protegido da luz, por 1h. O DNA foi ressuspendido em 4μL de formamida deionizada (Hi-Di, Applied Biosystems). Antes do sequenciamento, as amostras foram desnaturadas em termociclador, a 90ºC por 3 minutos, e colocadas sobre gelo por 5 minutos.
Figura 5. Esquema representativo das etapas da construção da biblioteca enriquecida com microssatélites (NUCCI, 2007).
5.3.2.9. Identificação e desenho dos motivos microssatélites
Após a seleção das sequências, realizadas pelos programas Chromas versão 2.33 (Technelysium) e BioEdit versão 7.0.9.0 (HALL, 1999), estas foram transformadas em formato “FASTA” com o programa BioEdit.
Os trechos relativos ao vetor e aos adaptadores (Afa21 e Afa25) foram eliminados, e em seguida as sequências SSR foram identificadas pelo programa Websat (MARTINS et al., 2009). Os parâmetros utilizados para a identificação de microssatélites foram os seguintes: microssatélites compostos por motivos dinucleotídeos que devem ter no mínimo sete repetições do motivo, microssatélites compostos por motivos trinucleotídeos que devem ter no mínimo cinco repetições do motivo e microssatélites compostos por motivos tetranucleotídeos (ou mais) que deveriam ter no mínimo três repetições do motivo.
O desenho dos primer foi realizado no programa Primer3 (ROZEN e
amplificação tenha no mínimo 100 e no máximo 250 pb e a porcentagem de GC deve estar no intervalo de 40 a 60%.
A probabilidade de formação de estruturas secundárias (hairpins e loops) e a qualidade de cada par de primers obtido foi verificada no software Gene Runner v. 3.1.
5.3.2.10. Caracterização e genotipagem dos microssatélites
Foram testados 21 pares de primers desenvolvidos para a espécie L.
ericoides, para a avaliação do polimorfismo das populações de L. ericoides (P1, P2 e P3) e das
populações de L. pinaster (P4 e P5).
A otimização das condições ideais de amplificação para cada primer, foram realizadas utilizando dois indivíduos de cada população, várias reações de PCR, foram realizadas, variando as condições de temperatura de anelamento (48 a 62ºC), quantidade de DNA (1,0 a 5,0ng), concentração de cada primer (0,16 a 2,0μM), de DNTP (0,2 a 1,0mM) e
de MgCl2 (1,2 a 2,0μM), seguindo a programação demonstrada na Tabela 2.
Tabela 2. Programação da reação de PCR para a amplificação dos primers de L. ericoides
Etapa Temperatura Tempo (min.)
1 94ºC 2
2 94ºC 1
3 TAºC* 1
4 72ºC 1
5 (32 a 40) vezes etapas 2 a 4
6 72ºC 10
7 15ºC
*TA - temperatura de anelamento
5.4. Metodologia de análise estatística dos dados
As frequências alélicas e genotípicas em cada loco foram obtidas a partir da leitura dos dados nos géis de poliacrilamida. Estas frequências foram submetidas a um teste de aderência (Teste exato de Fisher) às proporções de equilíbrio de Hardy-Weinberg, conforme definido por Weir (1996), utilizando o programa TFPGA (Tools For Population
