CÂMPUS DE BOTUCATU
CARACTERIZAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA, VIA
MARCADOR MICROSSATÉLITE, E CONSTITUINTES DO ÓLEO
ESSENCIAL DE
Lychnophora pinaster
MART.
LENITA LIMA HABER
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP - Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Horticultura).
CÂMPUS DE BOTUCATU
CARACTERIZAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA, VIA
MARCADOR MICROSSATÉLITE, E CONSTITUINTES DO ÓLEO
ESSENCIAL DE
Lychnophora pinaster
MART.
LENITA LIMA HABER Bacharel em Biologia
Orientador: Profa. Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques Co-orientador: Profa. Dra. Maria Imaculada Zucchi
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP - Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Horticultura).
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO – SERVIÇO TÉCNICO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO – UNESP - FCA LAGEADO - BOTUCATU (SP)
Haber, Lenita Lima, 1976-
H114c Caracterização da diversidade genética, via marcador microssatélite, e constituintes do óleo essencial de Lychnophora pinaste MART./ Lenita Lima Haber. – Botucatu :
[s.n.], 2008.
xi, 138 f. : il. color., gráfs., tabs. Tese (Doutorado)-Universidade Estadual Paulista, Facul- dade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 2008
Orientador: Márcia Ortiz Mayo Marques Co-orientador: Maria Imaculada Zucchi Inclui bibliografia
1. Essência e óleos essencias. 2. Diversidade genética. 3. Arnica. 4. Plantas medicinais. 5. Marcadores molecu- lares. I. Marques, Márcia Ortiz Mayo. II. Zucchi, Maria Imaculada. III. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Campus de Botucatu). Faculdade de Ciên- cias Agronômicas. IV. Título.
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AGRADECIMENTOS
- À Dra. Márcia Ortiz Mayo Marques, pela orientação, confiança, ensinamentos, pela dedicação e apoio sinceros e acima de tudo, pela amizade e exemplo de vida, de caráter, de honestidade, de luta. Aprendi e cresci muito nesses anos de convivência e trabalho ao seu lado. O mais sincero MUITO OBRIGADA!!
- À Dra. Maria Imaculada Zucchi, pela orientação, compreensão, paciência, por seu tempo dispendido, pelos conselhos e bate-papos, enfim, por todo meu aprendizado. MUITO OBRIGADA!!
- Ao CNPq e a Capes, pela concessão da bolsa de doutorado e auxílio financeiro do projeto.
- Ao Dr. Marcos Eduardo Paron, pela orientação e ajuda durante as expedições de coleta.
- Aos Professores Lin Chau Ming e Rumy Goto, por terem me ajudado e orientado nos momentos de aperto em Botucatu e, principalmente pela amizade de vocês. Obrigada!!
- Aos amigos e técnicos agrícolas Marcela, Ariovaldo, Edmir (Zoinho) e Eduardo (Maizena) pela grande ajuda durante toda a condução dos experimentos e da tese. Sem a ajuda de vocês não teria conseguido!!
- Aos amigos do laboratório de Biologia Molecular do Centro P&D de Recursos Genéticos Vegetais: Paula Lima, Regina, Stella, Thiaguinho, Miklos, que me auxiliaram nos momentos mais delicados e, especialmente à Fernanda Raquel, que dedicou parte de seu tempo para me ajudar nos géis, muito obrigada, Fer!!
- Aos amigos maravilhosos que conquistei e que me conquistaram durante a caminhada em Botuca: Soró, Raquel, Jub’s, Bete, Rosa, Milena, Lívia, Cris, Minero, Rafa, Bigorna, Richard, Jubinha. Obrigada pela amizade, pelo companheirismo, pela troca de experiência, pelos “churras” e baladas. Adoro vocês!! Ah e, se esqueci de alguém, foi só no papel, pois todos estão no meu coração.
- Aos funcionários do Departamento de Produção Vegetal – Horticultura, pela ajuda e compreensão.
SUMÁRIO
Página LISTA DE TABELAS... VIII
LISTA DE FIGURAS... X
1. RESUMO... 1
2. SUMMARY... 3
3. INTRODUÇÃO... 5
4.OBJETIVOS... 8
5. REVISÃO DE LITERATURA... 9
5.1. O bioma cerrado e os campos rupestres... 9
5.2. O gênero Lychnophora ea espécie L. pinaster... 12
5.3. Óleos essenciais... 20
5.4. Aspectos genéticos e moleculares... 24
6. MATERIAL E MÉTODOS... 30
6.1. Coleta do material vegetal... 30
6.2. Estabelecimento do Banco de Germoplasma de L. pinaster.... 32
6.3. Secagem, extração e caracterização química dos óleos essenciais... 35
6.4. Caracterização genética... 37
6.4.1. Extração e quantificação do DNA... 37
6.4.2. Avaliação do polimorfismo... 39
6.5. Desenvolvimento e Caracterização de Marcadores Microssatélites... 41
6.5.1. Construção de biblioteca genômica enriquecida com microssatélites... 41
6.5.1.1. Seleção e seqüênciamento dos clones positivos... 43
6.5.2. Análise estatística... 48
6.5.2.1. Avaliação dos locos... 48
6.5.2.2. Teste do Equilíbrio de Hardy-Weinberg... 48
6.5.2.3. Desequilíbrio genotípico entre pares de locos... 48
6.5.2.4. Diversidade genética... 48
6.5.2.5. Estrutura genética... 49
7. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 51
7.1.1. Caracterização química dos óleos essenciais das populações
nativas... 51
7.1.1.1. Antena (ANT) e Estrada Real (ERE)... 52
7.1.1.2. Poço Bonito (PBO) e Estrada Real 1 (ERE 1)... 53
7.1.1.3. Estrada Real (ERE) e Estrada Real 1 (ERE 1)... 54
7.1.1.4. Análise comparativa da composição química das populações Antena, Estrada Real, Estrada Real 1 e Poço Bonito... 56
7.1.2. Caracterização química dos óleos essenciais das populações cultivadas... 60
7.1.2.1. Comparação da composição química dos óleos essenciais na População Antena: nativa x cultivada... 60
7.1.2.2. Comparação da composição química dos óleos essenciais na População de Estrada Real (ERE): nativa x cultivada... 63
7.1.2.3. Comparação da composição química dos óleos essenciais na População Poço Bonito (PBO): nativa x cultivada... 65
7.1.2.4. Comparação da composição química dos óleos essenciais na População Estrada Real 1 (ERE 1): nativa x cultivada... 66
7.2. Discussão... 69
7.3. Caracterização molecular... 72
7.3.1. Desenvolvimento de bibliotecas enriquecidas com locos microssatélites... 72
7.3.2. Análise das seqüências, desenvolvimento e utilização dos primers... 72
7.3.3. Variação genética... 78
7.3.4. Estrutura genética... 83
7.4. Discussão... 89
7.5. Caracterização química x caracterização genética... 93
8. CONCLUSÃO... 95
9. CONSIDERAÇÕES FINAIS... 97
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 98
APÊNDICE 1... 118
LISTA DE TABELAS
Tabela Página
1 Programação da reação de PCR para a amplificação dos primers de L. pinaster.... 39 2 Condições de temperatura, volumes de DNA, dos primers (F e R) e de
MgCl2 utilizadas para melhor amplificação dos locos utilizados na
genotipagem das populações de L. pinaster... 40 3 Composição química média (%) do óleo essencial de folhas de L.
pinater, nativas de Lavras (Antena) e Carrancas (Estrada Real), Estado de Minas Gerais... 53 4 Composição química média (%) do óleo essencial de folhas de L.
pinater nativas de Lavras (Poço Bonito) e Carrancas (Estrada Real 1), Estado de Minas Gerais... 54 5 Composição química média (%) do óleo essencial de folhas de L.
pinater nativas de Carrancas, Estado de Minas Gerais... 55 6 Componentes majoritários (% relativa média) do óleo essencial dos
indivíduos genotipados de L. pinaster provenientes das populações, Antena, Estrada Real e Poço Bonito... 58 7 Composição química média (%) do óleo essencial de folhas de L.
pinaster, oriundas de Antena, município de Lavras - MG, e cultivadas em Botucatu - SP... 61 8 Composição química média do óleo essencial de folhas de L. pinaster,
oriundas de Estrada Real, município de Carrancas - MG, e cultivadas em Botucatu - SP... 63 9 Composição química média do óleo essencial de folhas de L. pinaster,
oriundas de Lavras - MG, população Poço Bonito, e cultivadas em Botucatu - SP... 65 10 Composição química média do óleo essencial de folhas de L. pinaster,
oriundas de Estrada Real 1, município de Carrancas - MG, e cultivadas em Botucatu - SP... 67 11 Seqüências dos pares de primers desenvolvidos para L. pinaster, com as
12 Seqüências dos pares de primers que amplificaram locos microssatélites, com suas respectivas amplitudes alélicas, número de alelos, heterozigosidades esperadas e observadas, temperatura de anelamento, quantidade de cloreto de magnésio e dos primers, conteúdo de informação polimórfica (PIC) e número de acesso no Genebank... 77 13 Freqüências alélicas dos treze locos microssatélites, estimados para 46
indivíduos de Lychnophora pinaster... 78 14 Estimativas de parâmetros genéticos em 3 populações de L.
pinaster... 79 15 Probabilidade do teste exato de Fisher para aderência ao equilíbrio de
Hardy-Weinberg para os locos SSR... 80 16 Probabilidade do teste exato de Fisher para aderência ao equilíbrio de
Hardy-Weinberg das populações Antena, Estrada Real e Poço Bonito e dos locos SSR de Lychnophora pinaster... 81 17 Freqüência de alelos exclusivos, por loco, nas populações Antena,
Estrada Real e Poço Bonito de L. pinaster... 83 18 Índices de fixação para as três populações de L. pinaster
avaliadas... 84 19 Distâncias genéticas de Nei (1972) calculadas entre as
populações... 85 20 Distâncias genéticas de Nei (1972) calculadas entre os indivíduos das
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1 Vias metabólicas e substâncias sintetizadas a partir da glicose, no metabolismo secundário das plantas... 21 2 Localização das populações de L. pinaster, Antena e Poço Bonito
coletadas no Município de Lavras - MG, e Estrada Real, coletada no Município de Carrancas - MG... 31 3 Plantio de estacas apicais de L. pinaster em badejas de poliestireno
expandido... 32 4 Plantio, no campo, das estacas de L. pinaster... 33 5 Plantio das estacas de L. pinaster, detalhe para a tela de
sombreamento... 34
6 Banco de germoplasma das populações Lychnophora
pinaster... 35 7 Esquema representativo das etapas de extração de DNA pelo método
CTAB... 38 8 Esquema representativo das etapas da construção da biblioteca
enriquecida com microssatélites... 46 9 Estrutura química dos componentes majoritários do óleo essencial das
populações de Lychnophora pinaster..... 51 10 Padrão de divergência química entre os indivíduos genotipados das três
populações de L. pinaster definido pela Análise de Componentes Principais, com base nos principais componentes do óleo essencial... 57 11 Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleo
essencial de folhas de L. pinaster, oriundas de Antena, município de Lavras (MG), e cultivadas em Botucatu (SP)... 62 12 Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleo
13 Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleo essencial de folhas de L. pinaster, oriundas de Poço Bonito, município de Lavras (MG), e cultivadas em Botucatu (SP)... 66 14 Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleo
essencial de folhas de L. pinaster, oriundas de Estrada Real 1, município de Carrancas (MG), e cultivadas em Botucatu (SP)... 68 15 Porcentagem de motivos microssatélites encontrados nos 178 insertos
seqüenciados que apresentaram pelo menos uma região microssatélite... 73 16 Freqüência de motivos perfeitos e compostos perfeitos encontrados nos 17
primers desenhados para L. pinaster... 75 17 Motivos microssatélites mais freqüentes identificados nos 17 primers
desenhados para L. pinaster... 76 18 Número de alelos exclusivos obtidos em 89 alelos de marcadores SSR,
em 3 populações de Lychnophora pinaster... 82 19 Padrão de divergência genética entre as três populações de L. pinaster
definido pelo agrupamento UPGMA, a partir das distâncias genéticas de Nei (1972). Correlação cofenética igual 0,96% (1000 reamostragens bootstrap para porcentagem de consistência dos nós)... 85 20 Padrão de divergência genética entre os indivíduos das três populações de
L. pinaster definida pelo agrupamento UPGMA, a partir nas das distâncias genéticas de Nei (1972). Correlação cofenética igual 0,67% (1000 reamostragens bootstrap para porcentagem de consistência dos nós)...... 88 21 Análise de cluster utilizando genótipos multilocos, admitindo admixture
1. RESUMO
Atualmente, Lychnophora pinaster, encontra-se classificada na
categoria de plantas vulneráveis, ou seja, os “taxa” cujas populações encontram-se em risco de extinção. Suas folhas e flores são aromáticas e utilizadas na medicina popular sob a forma de extrato alcoólico, como antinflamatório, anestésico e cicatrizante. O presente estudo objetivou realizar a caracterização genética, via marcador molecular microssatélite, e a química dos óleos essenciais de populações de Lychnophora pinaster Mart, visando sua
relativa dos principais constituintes do óleo essencial, obtendo-se uma maior proporção relativa média do trans-cinamato de metila no outono e do trans-cariofileno, no verão.
Palavras-chave: Lychnophora pinaster, campo rupestre, óleo essencial, microssatélite em
CHARACTERIZATION OF THE GENETIC DIVERSITY BY MICROSSATELLITE MARKERS AND COMPOUNDS OF THE ESSENTIAL OIL OF LYCHNOPHORA PINASTER MART. Botucatu, 2007. 112p. Tese (Doutorado em Agronomia/Horticultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho.
Author: LENITA LIMA HABER
Adviser: MARCIA ORTIZ MAYO MARQUES Co-adviser: MARIA IMACULADA ZUCCHI
2. SUMMARY
Currently, Lychnophora pinaster is considered an endangered
species, that is, it belongs to the taxa whose native populations are risking extinction. Its leaves and flowers are aromatic and used in popular medicine in the form of alcohol extracts as anti-inflammatory, anesthetic and curative agent in wounds. Therefore, the present study aimed to characterize the genetic diversity, using microsatellite molecular markers, and the chemical composition of the essential oil from Lychnophora pinaster Mart
proportion of the major components of the essential oil was influence by seasonality; methyl trans-cinnamate was obtained in a higher mean relative proportion in the Autumn whereas, trans-caryophyllene was obtained in the summer.
3. INTRODUÇÃO
O Brasil está incluído no grupo dos países com altos níveis de diversidade biológica ou megadiversidade, uma decorrência dos diferentes biomas e ecossistemas que caracterizam o país. Detém a maior diversidade genética vegetal do mundo, contando com mais de 55.000 espécies catalogadas, de um total estimado entre 350.000 a 550.000, das quais cerca de 1100 já foram estudadas para uso medicinal e 590 registradas para comercialização (Nodari e Guerra, 1999).
Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) estimam que aproximadamente 80% da população mundial dos países em desenvolvimento utilizam para atendimento primário de saúde, a medicina tradicional, cuja maior parte envolve o uso de extratos vegetais ou seus princípios ativos (Ministério da Saúde, 2001).
No entanto, a exploração de recursos genéticos de plantas medicinais no Brasil está relacionada, em grande parte, à coleta extensiva e extrativista do material silvestre. Apesar do volume considerável de exportação de várias espécies medicinais na forma bruta ou de seus subprodutos, e de seu amplo uso pela população, pouquíssimas espécies chegaram a ser cultivadas, mesmo em pequena escala. O fato torna-se marcante quando se consideram as espécies nativas, cujas pesquisas básicas ainda são incipientes (Vieira, 1994).
proteja e promova uma exploração racional de sua diversidade genética. Desta forma, a pesquisa biotecnológica, principalmente com plantas de interesse comercial, vem crescendo muito nos últimos anos.
Entre as diversas técnicas da biotecnologia utilizadas como ferramentas nestas pesquisas, destaca-se a de microssatélites, que permite fazer o mapeamento genético das espécies, e, conseqüentemente, a localização de genes de interesse econômico. A importância deste conhecimento reside no fato de se obterem informações, principalmente de espécies vegetais que estejam em risco de extinção e possuam grande potencial de emprego em escala comercial na indústria farmacêutica.
Todas as ações relacionadas com a conservação genética dependem do conhecimento da diversidade genética, onde os marcadores moleculares são ferramentas importantes para sua caracterização e monitoramento (Nodari e Guerra, 1999).
Dentre as espécies com potencial de uso farmacológico encontra-se a
Lychnophora pinaster (Asteraceae), popularmente conhecida como arnica, cujas folhas e
flores aromáticas são bastante utilizadas na medicina popular, sob a forma de extrato alcoólico, como antiinflamatório, anestésico e cicatrizante, em ferimentos, contusões ou hematomas, em picadas de insetos, além de pomadas para os mesmos sintomas (Pinheiro, 2002; Souza, 2003) e uso cosmético, na forma de sabonete de arnica, para eliminar asperezas, rachaduras e suavizar hematomas e contusões (Almeida et al., 1998).
Estudos fitoquímicos de espécies do gênero Lychnophora, dentre elas
L. pinaster, relatam a presença de substâncias pertencentes às classes dos flavonóides e dos
terpenos (sesquiterpenos), algumas das quais, com significativa atividade in vitro, contra
Trypanossona cruzi, agente causador da doença de Chagas (Oliveira et al., 1996; Duarte, et
al., 1999).
Poucas são as abordagens fitoquímicas sobre L. pinaster,
principalmente em relação à caracterização química de suas substâncias voláteis, bem como em relação ao estudo da diversidade genética de populações. A literatura corrente relata a ocorrência de óleos essenciais nas folhas de um acesso coletado na Serra da Bocaina, no Estado de Minas Gerais, porém sua composição química não foi elucidada (Pinheiro, 2002).
de alimentos, perfumaria e farmacêutica. São empregados principalmente como antimicrobianos (alho), antiinflamatórios (camomila), expectorantes (eucalipto), em afecções do sistema digestivo (menta e gengibre), e até mesmo como estimulantes do sistema nervoso central (cânfora), dentre muitas outras aplicações. Recentemente, alguns óleos essenciais brutos e até mesmos seus principais constituintes, como o Į-bisabolol, o
farnesol e o calareno têm sido avaliados quanto à atividade anticâncer (Leal et al., 2003). Outra aplicação dos óleos essenciais está relacionada diretamente à sistemática vegetal, uma vez que o uso de metabólitos secundários em taxonomia é bem reconhecido, podendo auxiliar na identificação e na classificação das espécies. Mais recentemente, a utilização conjunta da química (quimiotaxonomia ou quimiossistemática) e da bioquímica (sistemática ou taxonomia molecular) tem-se mostrado uma ferramenta complementar e eficiente em sistemática vegetal (Hegnauer, 1966; Gottlieb, 1982).
Como a maioria das plantas nativas do Brasil, Lychnophora pinaster
não é cultivada, é obtida por extrativismo e encontra-se na categoria de plantas vulneráveis, ou seja, os “taxa”, cujas populações encontram-se em declínio em conseqüência de exploração excessiva, destruição dos habitats ou outra alteração ambiental; sua sobrevivência definitiva ainda não foi assegurada, o que poderá levar a espécie à extinção (Sociedade Botânica do Brasil,1992; Base de Dados Tropical, 2005).
Deste modo, levando-se em consideração a importância farmacológica de L. pinaster e o fato da espécie constar na lista da flora brasileira ameaçada de extinção,
4. OBJETIVOS
Geral
Estudar a variabilidade genética e a química de populações nativas e cultivadas de Lychnophora pinaster Mart. a fim de fornecer informações relevantes para
programas de conservação da espécie, uso sustentável e estudos futuros de melhoramento genético vegetal.
Específicos
- Avaliar a variabilidade genética de Lychnophorapinaster, por meio
de marcador molecular microssatélite e a composição química dos óleos essenciais de folhas, em indivíduos coletados em três populações nativas no Estado de Minas Gerais e cultivados em Botucatu - SP;
5. Revisão de Literatura
5.1. O bioma cerrado e os campos rupestres
O Cerrado é um domínio fitogeográfico do tipo savana que ocorre no Brasil, em partes do Paraguai e da Bolívia. Exibe uma enorme biodiversidade vegetal e animal, é um patrimônio ameaçado pelo crescimento de monoculturas, como a soja, o milho e o arroz, além da pecuária extensiva, da carvoaria, do desmatamento causado pela atividade marceneira e por freqüentes queimadas, devidas tanto às altas temperaturas, quanto ao infortúnio do descuido humano.
No Brasil, localiza-se principalmente no Planalto Central, ocupando 24% do território nacional, pouco mais de 2 milhões de Km2, abrangendo os Estados de São Paulo, Minas Gerais, Goiás, Tocantins, Bahia, Maranhão, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Piauí e o Distrito Federal (Rodrigues e Carvalho, 2001). Segundo estudos atuais, restam 61,2% desse total, em áreas distribuídas no Planalto Central e no Nordeste, estando a maior parte na região Meio-Norte, nos estados do Maranhão e do Piauí. Existem áreas de cerrado também em Rondônia, Roraima, Amapá e Pará. É a segunda maior formação vegetal brasileira, depois da Amazônia, e a savana tropical mais rica do mundo em biodiversidade, concentrando nada menos que um terço da biodiversidade nacional e 5% da flora e da fauna mundiais (Embrapa, 2007).
sempre no período da seca. A vegetação, em sua maior parte, é semelhante à de Savana, com uma vegetação rasteira, constituída principalmente por gramíneas, coexistindo com arbustos e árvores esparsas, baixos, tortuosos, de casca grossa, folhas largas e sistema radicular profundo, que permite a absorção da água - disponível nos solos abaixo de 2 metros de profundidade, mesmo durante a estação seca (Rodrigues e Carvalho, 2001; Wikipédia, 2007).
Neste complexo, são encontrados uma grande variedade de sistemas ecológicos, variados climas, relevos e altitudes, prevalecendo em quase toda sua extensão uma peculiar combinação de condições edáficas e climáticas, as quais originaram a vegetação que a caracteriza, uma vegetação xeromórfica, de ocorrência preferencial em clima estacional, mas que pode ser encontrada também em clima ombrófilo. Diferentes tipos de solo são também encontrados (Rodrigues e Carvalho, 2001).
Dependendo de sua concentração e das condições de vida do lugar, pode apresentar mudanças diferenciadas denominadas de cerradão, campo limpo e cerrado, intercalado por formações de florestas, várzeas, campos rupestres, dentre outros.
No Estado de Minas Gerais, o Cerrado predomina dentre todos os tipos de vegetação existentes, com cerca de 53% da área, localizando-se a oeste, em sua maior parte, e em áreas disjuntas, a sudeste e sul do Estado.
Localizada no sul do Estado, a microrregião do Alto Rio Grande, é constituída por 26 municípios, dentre eles os de Carrancas com 702 km2 e de Lavras com 537 km² de extensão territorial, respectivamente. Essa região é caracterizada por superfícies planas e onduladas, de onde sobressai a elevação do complexo da Serra da Bocaina, com uma altitude aproximada de 1200 m e extensão de 90 km2, recebendo diferentes denominações locais, como Serrinha, Serra do Carrapato, Serra do Campestre, Serra de Carrancas, entre outras (Rodrigues e Carvalho, 2001). O clima predominante na região é o tropical de altitude, com temperatura média anual variando de 19ºC a 21ºC e com precipitação média anual entre 1200 e 1500 mm de chuvas.
Solos Hidromórficos e Solos Aluviais e, os que ocorrem na região de Carrancas, são os Latossolos Variação UNA, Cambissolos, Latossolos Vermelhos-Escuros e Solos Litóticos.
A região do Alto Rio Grande apresenta uma vegetação bastante diversificada, com formações florestais (floresta hidrófila pluvial, floresta tropical latifoliada baixo montana e floresta esclerófita) constituídas por prolongamentos da Floresta Atlântica através do Planalto Central; formações compestres (cerrado propriamente dito, campo sujo, campo limpo, campo rupestre e campo de várzea) e formações antrópicas (capoeirões, capoeiras e campos antrópicos), formando um mosaico vegetacional muitas vezes devastado ou com pouca conservação. Os campos cerrados constituem a fisionomia vegetal predominante nas encostas com até 900 m de altitude, dando lugar aos campos rupestres ou de altitude naquelas mais elevadas; as florestas semidecíduas ocorrem em fragmentos localizados nas margens dos cursos d’água, nas depressões entre elevações, em ondulações com solo de melhor qualidade e também nos topos de morros (Rodrigues e Carvalho, 2001).
O campo rupestre é um tipo de vegetação predominantemente herbáceo-arbustiva, com a presença eventual de arvoretas pouco desenvolvidas com até dois metros de altura. Abrange um complexo de vegetação que agrupa paisagens em microrrelevos com espécies típicas, ocupando trechos de afloramentos rochosos. Geralmente ocorre em altitudes superiores a 900 metros, ocasionalmente a partir de 700 metros, em áreas onde há ventos constantes e variações extremas de temperatura, com dias quentes e noites frias (Ribeiro e Walter, 2007).
Este tipo de vegetação ocorre geralmente em solos ácidos, pobres em nutrientes ou nas frestas de afloramentos rochosos. Em geral, a disponibilidade de água no solo é restrita, pois as águas pluviais escoam rapidamente para os rios, devido a pouca profundidade e a reduzida capacidade de retenção do solo.
predomina. Também são comuns agrupamentos de uma única espécie, cuja presença é condicionada, entre outros fatores, pela umidade disponível no solo. Algumas espécies podem crescer diretamente sobre as rochas (rupícolas), sem que haja solo, como ocorre com algumas aráceas e orquidáceas.
Pela dependência das condições restritivas do solo e do clima peculiar, a flora é típica, contendo muitos endemismos - espécies com ocorrência restrita a determinados locais e plantas raras. Entre as espécies comuns há inúmeras características xeromórficas (presença de estruturas que diminuem a perda de água), tais como folhas pequenas, espessadas e coriáceas, além de ramos com filotaxia oposta cruzada.
Segundo Ribeiro e Walter (2007), as espécies mais freqüentes pertencem às seguintes famílias e gêneros: Asteraceae (Baccharis, Calea, Lychnophora,
Wunderlichia e Vernonia – sensu lato), Bromeliaceae (Dyckia, Tillandsia), Cactaceae
(Melocactus, Pilosocereus), Cyperaceae (Bulbostylis, Rhynchospora), Eriocaulaceae
(Eriocaulon, Leiothrix, Paepalanthus, Syngonanthus), Gentianaceae (Curtia, Irlbachia),
Iridaceae (Sisyrinchium, Trimezia), Labiatae (Eriope, Hyptis), Leguminosae (Calliandra,
Chamaecrista, Galactia, Mimosa), Lentibulariaceae (Genlisea, Utricularia), Lythraceae
(Cuphea, Diplusodon), Melastomataceae (Cambessedesia, Miconia, Microlicia), Myrtaceae
(Myrcia), Orchidaceae (Cleistes, Cyrtopodium, Epidendrum, Habenaria, Koellensteinia,
Pelexia), Poaceae (Aristida, Axonopus, Panicum, Mesosetum, Paspalum, Trachypogon),
Rubiaceae (Chiococca, Declieuxia), Velloziaceae (Barbacenia, Vellozia), Vochysiaceae
(Qualea) e Xyridaceae (Xyris).
5.2. O gênero Lychnophora ea espécie L. pinaster
O gênero Lychnophora pertencente à sub-tribo Lychnophorineae,
tribo Vernoniaceae e à família Asteraceae, foi estabelecido por Martius em 1822 e, desde
então, tem sido revisado por vários autores.
seis seções: Lychonophora; Lychonophoriopsis, Lychonophorioides, Lychonocephaliopsis,
Sphaeranthus e Chronopappus.
Semir (1991) relata espécies do gênero com microendemismo pronunciado, com distribuição restrita aos complexos rupestres de quartizito da Bahia, Goiás e Minas Gerais. Esses campos rupestres são caracterizados como habitats com topografia desigual, clima e solos secos. As condições ecológicas destes habitats possibilitam intensa especificação, uma das razões para o endemismo e isolamento encontrados nas espécies e gêneros nesses locais de ocorrência (Giulietti e Pirani, 1988; Semir, 1991).
Desde a década de 80, muitas espécies do gênero Lychnophora vêm
sendo intensamente investigadas, uma vez que há relatos de seu emprego na medicina tradicional como antiinflamatório e analgésico. Segundo alguns autores, o perfil químico do gênero é basicamente caracterizado pela ocorrência de sesquiterpenos; diterpenos; triterpenos; lactonas sesquiterpênicas derivadas de goiazensolidos; eremantolidos, guaianolidos e eudesmanolidos; flavonóides; esteróides e poliacetilenos e derivados do cariofileno (Bohlmann et al., 1980; 1982; Cunha et al., 1995; Borella et al., 1998).
Em 1980, Bohlmann et al., investigando a química de L. salicifolia,
L. phylicaefolia e L. hakeaefolia observaram, nas três espécies, a presença de lupeol, do
acetato de lupeila e de eremantina. Em L. salicifolia foram observados três derivados do
cariofileno, inclusive o ácido lichnofórico; em L. hakeaefolia, foi encontrado um novo
heliangolido, denominado 15-desoxigoiazensolido. No mesmo ano, Vichewski et al., isolaram de L. martiana dois sesquiterpenos, um deles idêntico ao ácido lichnofórico,
isolado anteriormente de L. affins (Raffaul et al., 1978 apud Bohlmann et al., 1980) e de L.
salicifolia (Bohlmann et al., 1980) e, o segundo sesquiterpeno era constituído por uma
mistura de acetatos.
No ano seguinte, Bohlmann et al. (1981) constataram a presença de
do acetato de lipeila, da β-amirina e de seu acetato e um derivado do cariofileno, epóxi álcool, na parte aérea de L. salicifolia. Isolaram das raízes de L. passerina o taraxasterol, a
β-amirina, lupeol e seus acetatos, o estigmasterol, o costunolido e a eremantina, duas
cetonas e um novo guaianolido, o 11-β-13-dihidroeremantino. Da parte aérea foram
-humuleno, a eremantina, duas cetonas e o goiazensolido. Das raízes de L. uniflora isolaram
o lupeol e seu acetato, o acetato de taraxasterila e a eremantina, enquanto que, da parte aérea, isolaram a β-amirina e o lupeol e seus acetatos, o acetato de taraxasterila, o
estigmasterol, a lupenona, o epóxido de cariofileno, dois eremantolidos e dois derivados do lupeol.
Com base nos trabalhos realizados Bohlmann et al. (1981) concluíram que a quimiotaxonomia do gênero Lychnophora continuava diversa, com uma
seção caracterizada por derivados do cariofileno e, a outra caracterizada por lactonas sesquiterpênicas, presentes também no gênero Eremanthus, muito próximo de
Lychnophora. Em 1982, Bohlmann et al., mostraram que os furanoheliangolidos são
característicos do gênero, bem como derivados do cariofileno e do humuleno, freqüentemente encontrados.
King (1986) observou a presença de 52 flavonóides nas folhas de 11 espécies de gênero, baseados em quatro tipos de agliconas: apigenina, luteolina, kaempferol e quercetina, as quais ocorrem como derivados metilados, glicosídeos oxigenados e glicoflavonas cíclicas. O autor observou ainda que, em algumas espécies, não foi comum encontrar dois indivíduos com perfis idênticos, concluindo que, em Lychnophora 20-50%
dos flavonóides de uma espécie podem ser esperados como sendo caracteres químicos variáveis.
Em 1992, Borella et al., observaram que a principal lactona sesquiterpênica do extrato de folhas de L. pseudovillosissima era um furoheliangolido, o
15-deoxigoiazensolido, identificando-se também, um grupo de seis novos eudesmanolidos. Costa et al. (1993) isolaram, a partir de L. diamantinana, três flavonóides: o flavonóide
iso-rhamentina, já identificado no gênero; a flavonona pinocembrina, substância nova na tribo e, a pinobanksina, o primeiro dihidroflavonol isolado em uma espécie da tribo. Foram isoladas duas lactonas sesquiterpênicas já conhecidas no gênero, a centraterina e o
goiazensolido, e duas novas lactonas sesquiterpênicas, denominadas de 15-acetoxicentraterina e de 15-acetoxigoiazensolido.
Borella et al. (1998) investigando diferenças químicas entre L.
pseudovilosissima e L. ericoides, devido à grande similaridade morfológica entre as duas
substâncias predominantes em L. pseudovilosissima são eudesmanolidos e as
predominantes em L. ericoides são eremantolidos.
Em 2000, Sargenti e Vichnewski isolaram de L. ericoides 18
compostos, entre flavonóides e lactonas sesquiterpênicas. Sartori et al. (2002), estudando a fitoquímica de L. markgravii, observaram a presença de lactonas sesquiterpênicas derivadas
de guaianolidos e de tipos de furanoheliangolidos, sendo essas duas classes de compostos consideradas como marcadores taxonômicos de Asteraceae e as lactonas sesquiterpênicas encontradas são típicas de algumas tribos e subtribos. Em 2003, Sakamoto et al., isolaram de folhas de L. ericoides 18 furanoheliangolidos, três flavonóides e dois novos
sesquiterpenos (1 e 2), cujas fórmulas moleculares são C21H28O6 e C20H26O6,
respectivamente.
Estudos farmacológicos mostram que essas espécies possuem atividade antinflamatória e antitumoral (Bastos et al., 1987; Saúde et al., 1994) e efeitos antimicrobianos (Miguel et al., 1996). Atividade tripanossomicida de sesquiterpenos de algumas espécies de Lychnophora foi relatada por Chiari et al. (1994).
As pesquisas realizadas por Oliveira et al. (1992) demonstraram 100% de atividade tripanomicida em seis espécies de asteráceas, encontrando-se, dentre essas, L. pinaster Mart., L. passeriana (Mart. Ex DC.) Gard. E L. trichocarpha (Spreng.)
Spreng. Borsato et al. (2000) observaram que o extrato das raízes de L. ericoides, do qual
foram obtidas 10 lignanas, mostrou atividade analgésica em camundongos, sendo a lignana cubebina uma das mais ativas; no entanto, a mesma não mostrou atividade antiinflamatória e antipirética significantes. Os antiinflamatórios goiasensolido e a centraterina armazenados na estrutura das folhas foram testados diretamente sobre as proteínas associadas ao processo inflamatório e apresentaram ação eficaz na inibição do fator NF-kB, mensageiro celular responsável pelo início da inflamação.
Outras pesquisas envolvendo as espécies do gênero vêm sendo desenvolvidas. Como exemplo, pode-se citar o trabalho de Luque et al. (1999) que estudaram a anatomia foliar de 34 espécies de Lychnophora, comprovando a existência de
caracteres xerofíticos em suas folhas. Segundo os autores, foi possível corroborar a existência de seis seções, considerando Chronopappus e Sphaeranthus as mais primitivas,
Lychnocephaliopsis como intermediárias, em função dos caracteres observados, como a
presença de um espessa cutícula, a estratificação da epiderme adaxial, a presença de parênquima aqüífero e o tipo de tricoma da superfície abaxial.
Apesar da grande disponibilidade de informações a respeito da química e de outras características de espécies do gênero, pouco é sabido a respeito de
Lychnophora pinaster.
Espécie conhecida popularmente por arnica mineira, arnica da serra, entre outros, possui como sinonímia Vernonia pinaster (Mart.) Less, Vernoniatrichocarpa
Spreng., Lychnophora trichocarpa (Spreng) Spreng., Piptopcoma lychnophorioides Less.,
Lychnophora affins Gardn., Lychnophora brunoides var. affins (Gardner), Lychnophora
rosmarinus Pohl. Ex. Schultz-Bip., Lychnophora rosmarinus var. rosmarinus Schultz-Bip.,
Lychnophora brunioides var. pinifolia Baker, Lychnophora pumiio Pohl e Lychnophora
piptocoma Schultz-Bip (Semir, 1991).
Segundo a descrição realizada por Semir (1991), Lychnophora
pinaster é uma espécie caracterizada por plantas que variam de subarbusto ereto bem
ramificado a pequenos arbustos ericóides e, mais raramente, a arbustos mais altos, com 0,4 a 2,4m. Suas folhas podem apresentar variações, sendo muito imbricadas e ascendentes na parte superior dos ramos e mais patentes até pouco reflexas abaixo, geralmente lineares, linearoblongas, rosmarinióides e ericóides e, às vezes longamente lineares em forma de fita, com base de arredondada a auriculada, ligeiramente atenuada, com ápice obtuso a pouco arredondado, raramente pouco agudo. Suas inflorescências são em formato de glomérulos simples folhosos, geralmente muito congestos, hemisféricos com folhas esparsas entre eles com 1,0 a 1,5 cm de comprimento e 2,0 a 3,0 cm de diâmetro, em ramos folhosos com até 10,0 cm de comprimento e até 0,3 cm, raramente 1,0 cm de diâmetro. Seus capítulos são campanulados a cilíndricos com 3 a 5 flores, com 6,5 a 8,0 cm de comprimento e 3,0 a 5,0 mm de diâmetro.
Lavras, onde foi encontrada na Serrinha; em Itumirim, na Serra da Bocaina/Morro Janela; em Carrancas, na Cachoeira da Fumaça e na Serra de Carrancas (Semir, 1991). Carvalho (1992) descreve o crescimento de arbustos nos campos rupestres da Serra da Bocaina sobre depressões rochosas com acúmulo de matéria orgânica.
Suas folhas e flores aromáticas são intensamente utilizadas na medicina tradicional, na forma de extrato alcoólico ou pomada, por possuir atividades antinflamatória, analgésica e cicatrizante; é aplicada em machucados, contusões ou hematomas, bem como em picadas de insetos. Seu uso na forma de cosmético, como sabonete, também é indicado, por eliminar asperezas e rachaduras na pele, além de suavizar hematomas e contusões (Almeida et al., 1998).
Devido à ampla utilização dessa espécie pela medicina tradicional e de sua importância regional, (Scheffer, 1999; Rodrigues e Carvalho, 2001), aliado ao fato de a mesma constar na relação das espécies ameaçadas de extinção, por ser obtida apenas por extrativismo, é de suma importância pesquisas que englobem o maior número de informações possíveis, para que se tracem estratégias de conservação e preservação da espécie in situ, bem como para tentativas de domesticação e de seu cultivo.
Abordando aspectos da fenologia e da reprodução sexuada de L.
pinaster, Silva (1998), observou um comportamento fenológico sazonal com relação aos
aspectos vegetativos, reprodutivos e de dispersão dos frutos, em função das variações climáticas, com a floração ocorrendo entre os meses de agosto a outubro e a dispersão dos frutos entre dezembro, janeiro e fevereiro, considerada a época mais provável para a coleta dos aquênios. Com relação à germinação, a autora observou que, em condições de laboratório, os aquênios obtiveram um melhor desempenho quando germinados entre papel, com alternância de temperatura de 20° a 30ºC.
Souza (2003), estudando a propagação in vitro e os aspectos
anatômicos de L. pinaster, constatou que a cultura de tecidos é altamente segura para a
O enraizamento de estacas dessa espécie, em diferentes concentrações de ácido indol-butírico (AIB) foi avaliado por Paron et al. (2003), constatando-se que a concentração de 300 mg L água-1, por 24 horas, foi ideal para o enraizamento das estacas.
O teor e o rendimento do óleo essencial bem como a produção de massa fresca da parte aérea de L. pinaster em função da calagem e das adubações orgânica,
mineral e mista, foram avaliados por Oliveira Júnior et al. (2005). Os autores observaram uma maior produção de massa fresca da parte aérea com a adubação mineral, decrescendo com a adubação mista e orgânica, havendo influencia da calagem somente nesta última. As maiores concentrações de óleo essencial foram obtidas com a adubação orgânica, independente da calagem e com a adubação mista sem calagem. Os maiores rendimentos do óleo essencial, em mg planta-1, foram obtidos nos tratamentos mineral e misto sem calagem, sendo recomendado a adubação mista sem calagem por ter aliado altas concentração e rendimento do óleo essencial, aproximando-se das condições naturais da arnica.
Oliveira Junior et al. (2006) avaliaram os efeitos da calagem e de três tipos de adubação no crescimento e na nutrição de L. pinaster, constatando que os maiores
valores de massa seca da parte aérea, da raiz e crescimento relativo foram obtidos com a adubação mineral, e os menores, com a adubação orgânica, concluindo ainda que a arnica é tolerante ao alumínio, embora não acumuladora, exigente em zinco e manganês e não exigente em macronutrientes.
Silveira et al. (2005a), avaliando a atividade biológica do extrato aquoso liofilizado de L. pinaster, verificaram que o mesmo exibiu atividade
tripanossomicida, mas causou lise das células sangüíneas, provavelmente devido a presença das saponinas. Observaram ainda, a presença dos ácidos cafeico e isoclorogênico, da vitexina e isovitexina e da quercetina. De acordo com a classificação de Meyer et al. (1982) o aquoso liofilizado de L. pinaster foi considerado não-tóxico, considerando-se a toxicidade
dos extratos brutos.
Alcântara et al. (2005) observaram que o ácido E-lichnofórico e seus
derivados éster e álcooleliminaram 100% das formas tripomastigota de Trypanosoma cruzi
nas concentrações de 13,86; 5,68 e 6,48 ȝg mL, respectivamente. Os autores compararam
numericamente os resultados obtidos de cálculos de otimização de geometria e de propriedades químicas com os resultados de atividade tripanossomicida e constataram que o sistema ʌ-endocíclico (C-4 e C-5) não é um sítio determinante dessa atividade; porém, a
estrutura do grupo oxigenado influencia fortemente o potencial de outros sítios do esqueleto cariofilênico, sugerindo que o sistema ʌ-exocíclico (C-8 e C-14) e os carbonos C-1 e C-9
promovem a atividade tripanossomicida dessas substâncias.
Um estudo de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e Carbono 13 (RMN de 1H e 13C) do extrato hexânico da parte aérea de L. pinaster revelou a
presença de um derivado do cariofileno, o ácido trans-lichnofórico, além de misturas de hidrocarbonetos homólogos, dos triterpenos lupeol, α e β-amirina e friedelina e de ácidos
graxos, identificados por cromatografia gasosa como metil-ésteres na fração hexânica. Na fração extraída com diclorometano foram encontradas misturas de hidrocarbonetos homólogos, a quercetina e o 15-deoxigoiazensolido (Silveira et al., 2005b).
Com o objetivo de se comparar as características físico-químicas, químicas e a estabilidade das tinturas preparadas a partir de L. pinaster e L. rupestris com a
da Arnica montana, Maciel et al. (2006) observaram semelhanças entre as tinturas,
5.3. Óleos essenciais
Como já foi discutido no item 5.2., todas as informações a respeito da composição química de L. pinaster fazem menção à caracterização das substâncias
presentes em diferentes extratos e suas ações. Nenhum trabalho científico encontrado na revisão refere-se à química das substâncias voláteis da espécie.
Esse grupo de substâncias, também chamado de óleos essenciais, constitui um dos mais importantes grupos de matérias-primas para as indústrias alimentícias, de perfumaria, farmacêuticas e afins. São resultantes do metabolismo secundário das plantas, constituídos por fenilpropanóides, mono e sesquiterpenos, dentre outros, podendo ser influenciados por fatores genéticos e epigenéticos, ontogênicos e ambientais (Roberts et al., 1996).
Na via do chiquimato, a fenilalanina, pela ação da fenilalanina amonialiase (PAL), elimina uma molécula de amônia, dando origem ao ácido cinâmico, precursor da maioria dos fenilpropanóides, compostos aromáticos com uma cadeia lateral, composta por três átomos de carbono, ligada ao anel aromático. A redução da cadeia lateral dos ácidos cinâmicos origina importantes substâncias presentes nos óleos essenciais, como o eugenol, o anetol e o safrol (Simões e Spitzer, 2000).
Segundo Dewick (2002) e Lichtenthaler (1999), a formação dos isoprenóides procede a partir de duas vias independentes. A biossíntese dos esteróides, dos triterpenos e dos sesquiterpenos se dá a partir da via acetato/mevalonato e, a via alternativa do 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato origina os carotenóides, os mono e diterpenos. Ambas as vias utilizam o acoplamento de isopentenil-PP e dimetilalil-PP como precursores dos compostos formados (Figura 1).
Nas plantas os óleos essenciais, desempenham importantes funções ecológicas, agindo como sinais químicos para a comunicação entre espécies, na proteção contra microorganismos patogênicos, herbívoros e insetos fitófagos, na atração de animais polinizadores e dispersores de sementes, promovendo assim a perpetuação e contribuem também com a coloração, aroma e odor de folhas, flores e frutos (Taiz e Zeiger, 2006; Maraschim e Vepoorte, 1999; Roberts et al., 1996).
No organismo humano, podem ter ações carminativa, antiespasmódica, estimulante do sistema digestivo, cardiovascular, secretolítica, antiinflamatória e anti-séptica. No sistema nervoso central, agem como estimulantes ou depressivos, além de possuírem ação anestésica local (Simões e Spitzer, 2000).
Além dessas propriedades, os óleos essenciais mostram grande importância como marcadores taxonômicos nos diferentes níveis de hierarquia, inclusive na investigação de problemas taxonômicos e evolutivos intraespecíficos (Adams et al., 1993; Grayer et al., 1999; Trigo et al., 2003).
Dos metabólitos secundários, os terpenos, constituem o maior grupo de substâncias (Taiz e Zeiger, 2006), sendo encontrados em todas as famílias de plantas (Theis e Lerdau, 2003; Raven et al., 2001). Segundo Gershenzon et al. (1978) os estudos da
influência de fatores ambientais na variabilidade dos terpenos são de grande importância, pelo fato de essas substâncias terem significado biossistemático, ecológico, fisiológico e implicações evolutivas, além da possibilidade do uso em diversos setores das indústrias farmacêutica, química, de cosméticos e alimentícia. No entanto, um ponto chave para sua produção é a grande variação que essas substâncias sofrem, dependendo das condições de crescimento das plantas. Em muitas espécies, as taxas de síntese desses terpenos é dependente da luz e da temperatura, bem como de níveis de assimilação de carbono (Schuh et al., 1997; Shao et al., 2001).
Apesar de sua produção ser controlada geneticamente (Trapp e Croteau, 2001), e especifica para um determinado órgão ou estádio de desenvolvimento (Raven et al., 2001; Teuscher, 1990), condições ambientais podem causar variações significativas, regulando a quantidade, concentração e constituição química dos óleos essenciais. Dentre os fatores ambientais, destacam-se a luminosidade (irradiação, qualidade luminosa e fotoperíodo), a latitude, as condições e o tipo de solo, os ventos, a temperatura e a disponibilidade de água, ou mesmo todos os fatores em conjunto, como é o caso da sazonalidade (Castro etal., 2004; Maciel et al., 2002).
Pesquisas recentes indicam grande variação na produção dos óleos essenciais em plantas medicinais, de acordo com suas relações ecológicas e com a sazonalidade. Em Lippia alba, Silva et al. (2006), observaram que o rendimento do óleo
essencial da espécie foi semelhante nas estações da primavera, verão e outono, variando de 0,19 a 0,17%, ao passo que a maior produção do principal componente, o citral (mistura de neral e geranial) foi durante a primavera (79%), outono (76,6%) e inverno (78,4%). Andrade e Gomes (2000) obsevaram que folhas de Eucalyptus citriodora, coletadas no
outono (período de estiagem), proporcionaram maiores rendimentos em óleo essencial, comparadas com as coletadas no verão (período chuvoso).
Curado et al. (2006) constataram uma grande variabilidade química no óleo essencial de duas populações de L. ericoides, em função das épocas de coleta ao
diferentes, constatando, mais uma vez, que a via biossintética dos terpenos pode ser alterada em função das condições ambientais (Figueiredo et al., 1997; Robles e Garzino, 2000).
5.4. Aspectos genéticos e moleculares
Diversas técnicas empregadas pela Biologia Molecular estão hoje disponíveis para detecção de variabilidade genética no DNA, isto é, para a detecção de casos de polimorfismo genético. Estas técnicas permitem a obtenção de um número virtualmente ilimitado de marcadores moleculares cobrindo todo o genoma do organismo, os quais podem ser utilizados para as mais diversas aplicações, tanto no estudo da Genética como no Melhoramento de Plantas.
Marcadores moleculares são características do DNA que diferenciam dois ou mais indivíduos. A utilização desta ferramenta facilitou o trabalho do melhoramento genético, por fornecer um número ilimitado de polimorfismos, além de serem independentes dos efeitos ambientais e do estádio fenológico da planta, permitindo ainda a identificação precoce e precisa de indivíduos com uma melhor combinação de alelos favoráveis (Lanza et al., 2000).
O uso dos marcadores moleculares revolucionou grandemente as pesquisas nas áreas da Genética e do Melhoramento de Plantas. Até a década de 60, eram utilizados marcadores morfológicos baseados em características de fácil identificação, como coloração de pétalas e nanismo. Apesar dessa facilidade, a possibilidade de serem afetados por genes controladores de outros caracteres, do pequeno número de marcadores distintos em uma mesma linhagem e de poucas espécies de plantas apresentarem tais características, reduzia a probabilidade de se encontrar associações significativas entre os marcadores e caracteres de importância econômica. Apesar de todas as dificuldades e restrições de uso, os marcadores morfológicos contribuíram significativamente para o desenvolvimento teórico da análise de ligação gênica e para a construção das primeiras versões de mapas genéticos (Borba, 2007).
qualquer estágio de desenvolvimento. Já na década de 80, com o advento das técnicas modernas da Biologia Molecular, surgiram diversos métodos de detecção de polimorfismo genético diretamente no DNA. Inicialmente, a utilização de enzimas de restrição permitiu a análise de comprimento de fragmentos de restrição de DNA. Com o desenvolvimento do processo de amplificação em cadeia utilizando uma DNA polimerase (PCR), outras classes de marcadores moleculares foram desenvolvidas. Aliadas às técnicas de clonagem e seqüênciamento de DNA, estas metodologias têm possibilitado um rápido acúmulo de informações sobre a estrutura de genomas eucariotos (Borba, 2007; Lanza et al., 2000; Ferreira e Grattapaglia, 1988).
Segundo Borba (2007), os principais marcadores moleculares podem ser divididos em dois grupos, de acordo com a metodologia utilizada para sua identificação, sendo hibridização ou amplificação de DNA. No primeiro grupo, podem ser mencionados os marcadores RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e os minissatélites ou
locos VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) e os baseados na amplificação do
DNA incluem os marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), os SCAR
(Sequence Characterized Amplified Regions), os STS (Sequence Tagged Sites), os
microssatélite e os AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism).
Nos anos 80, foi demonstrado que os genomas eucariotos são densamente povoados por diferentes classes de seqüências repetidas, umas de maior complexidade e outras mais simples. As seqüências simples repetidas (SSR - Simple
Sequence Repeats), mais tarde denominadas de microssatélites, são regiões do DNA que
contêm pequenas seqüências repetidas em tandem, as quais podem variar de 1 a 6 pares de
bases (Litt e Luty, 1989; Edwards et al., 1991; Jacob et al., 1991).
germoplasma, estudos de diversidade, análise gênica e de locos quantitativos (QTL), dentre outros.
Atualmente, esses marcadores têm sido indicados e amplamente utilizados em estudos de genética de populações de plantas nativas, por sua reprodutibilidade, e por serem geneticamente mais informativos para esse tipo de estudo (Brondani et al., 2002), contribuindo grandemente na obtenção das estimativas de parâmetros genéticos, especialmente no caso de populações com baixa diversidade genética ou com diversidade não detectada por outros marcadores (Peatkau et al., 1995).
Karasawa (2005), utilizando marcadores microssatélites, observou grande diversidade genética entre 11 populações de arroz selvagem (Oryza glumaepatula),
bem como níveis variáveis de autofecundação natural e ausência de estruturação espacial, indicando que estratégias de conservação para a espécie devem abranger o maior número possível de populações.
O uso de microssatélites em estudo de genética de populações com diversas espécies de palmeiras é bastante intenso. Nucci (2007), analisando a estrutura genética de populações de Acrocomia aculeata, observou uma elevada diversidade entre
populações, porém com comprometimento da estrutura metapopulacional: as populações avaliadas sofreram deriva genética devida à antropização e apresentam fluxo gênico restrito.
Conte (2004), analisando plântulas, indivíduos jovens e adultos em populações naturais com e sem ação antrópica de Euterpe edulis com marcadores alozímicos
e microssatélites, constatou que os efeitos da exploração dessas populações não foram significativos, até o momento, em relação aos níveis de diversidade e estrutura genética; entretanto, houve uma redução de cruzamentos na população, resultando em alterações no comportamento reprodutivo, com aumento nos níveis de endogamia nos indivíduos mais jovens das populações exploradas.
Existem ainda estudos que relatam, com sucesso, informações sobre o sistema reprodutivo, fluxo gênico e a estrutura genética de populações de algumas espécies medicinais nativas, como é o caso da carqueja (Baccharis trimera), do
araticunzeiro (Annona crassiflora), da erva-de-santa-maria (Chenopodium ambrosioides),
pimenta-longa (Piper hispidinervum) e da alfavaca-cravo (Ocimum selloi); dentro do
gênero Lychnophora, as pesquisas envolvem as espécies L. ericoides, L. granmogolense, L.
rupestris, L. nanusae e L. ramosissima.
Para os trabalhos acima mencionados foram utilizados os marcadores alozímicos para a carqueja (Auler, 2004), para a cagaiteira (Telles et al., 2001), para o araticunzeiro (Telles et al., 2003), para a erva-de-bicho (Lopes et al., 2003) e para L.
granmogolense, L. rupestris, L. nanusae e L. ramosissima (Azevedo, 2004). Zucchi (2002)
utilizou marcadores RAPD e SSR para caracterizar populações de cagaiteira, enquanto que em Zucchi et al. (2003), utilizaram-se somente dos SSR. Para os estudos com a aroeira foram utilizados os marcadores AFLP e, para a erva-de-santa-maria (Santos e Corrêa, 2006), pimenta- longa (Wadt e Kageyama, 2004) e L. ericoides (Melo, 2006) foram
utilizados os RAPD.
Auler (2004), avaliando populações de carqueja, evidenciou que 96,7% da variabilidade existente encontra-se distribuída dentro das populações, contra apenas 3,3% entre populações. Ficou patente, também, o alto nível de diversidade para a espécie, com a ocorrência de alelos exclusivos, que permitem uma melhor adaptação aos mais diversos microambientes.
Com a intenção de avaliar a magnitude e a distribuição da variabilidade genética existente em populações naturais de araticunzeiro, Telles et al. (2003) estudaram seis populações em duas regiões do Estado de Goiás, encontrando valores médios de heterozigosidade total da ordem de 0,357, indicando a existência de elevada variabilidade genética na região. Cerca de 19% dessa variação total foi devido a diferenças interpopulacionais, indicando uma elevada divergência genética entre as populações.
Santos e Corrêa (2006), avaliando 16 indivíduos de erva-de-santa-maria, constataram que, apesar de terem sido coletados em uma grande área, a espécie apresenta baixo polimorfismo genético, permitindo inferir que essa espécie tenha se disseminado na região a partir de poucos exemplares ou pode refletir a natureza pouco polimórfica do grupo. Observaram ainda não haver separação de grupos genéticos por localidade de coleta.
similaridade entre si, enquanto que os outros dois foram mais dissimilares. Com base no agrupamento por otimização, os acessos foram divididos em três grupos, o primeiro com os acessos de maior similaridade e, o segundo e o terceiro, com um acesso cada, evidenciando um baixo grau de diversidade genética como suporte à hipótese de origem comum dos acessos, com grau muito próximo de parentesco.
Wadt e Kageyama (2003), estudando populações de P. hispidinervum
distribuídas em regiões do Alto e baixo Acre, constataram que a maior parte da variabilidade genética foi encontrada dentro das populações, porém a diferenciação entre populações, como um todo, foi alta (θP = 0,28). O agrupamento das populações, pela
distância genética (FST), mostrou dois grupos distintos, os quais representam as regiões
avaliadas, com 20,61% da variabilidade total entre as duas regiões.
Wieczorek e Geber (2002), avaliando populações de Solidago
sempervirens por meio de marcadores microssatélites, observaram polimorfismo em 9 dos
vinte primers avaliados, com número de alelos variando de 6 a 25, e heterozigosidades observadas (HO) e esperadas (He) variando de 0,309 a 0,671 e 0,389 a 0,864,
respectivamente. Os altos níveis de polimorfismo sugerem a validade desses marcadores para estudos de genética de populações. Desse modo, os autores testaram a reprodutibilidade dos nove primers em 11 espécies de Asteraceae, sendo que dois
amplificaram em apenas 1 espécie, enquanto que os demais amplificaram em pelo menos 5 delas, comprovando, desta maneira a reprodutibilidade dos marcadores microssatélites. Melo (2006), avaliando a variabilidade genética de quatro populações de Lychnophora ericoides por meio de marcadores RAPD, selecionou 15 primers de um
total de 147, os quais geraram 60 bandas polimórficas. Pelo dendograma (UPGMA) e pelo coeficiente de similaridade Dice, observou-se a presença de quatro agrupamentos consistentes, com uma variabilidade genética entre populações de 37,5% e, dentro de populações de 64,3%, evidenciando uma alta variação entre e dentro das populações, resultando em importantes informações para estratégias de conservação da espécie.
Azevedo (2004) avaliou, por meio de marcadores isoenzimáticos, a variabilidade genética em um complexo de espécies de Lychnophora com diferentes
amplitudes de distribuição geográfica, composto por L. granmogolense, L. rupestris, L.
em pelo menos uma amostra de L. nanusae e L. ramosissima, em L. rupestris 16 foram
polimórficos e, em L. granmogolense, todos os locos foram polimórficos em pelo menos
uma amostra. Foi obtido um número de alelos que variou de 52 a 67 entre as espécies, com a ocorrência de alelos exclusivos em todas elas. Observou-se uma maior variabilidade genética nas espécies L. rupestris, L. nanusae e L. ramosissima enquanto que para L.
granmogolense essa variabilidade foi menor, sugerindo-se a existência de dois grupos
genéticos no complexo, um formado por L. ramosissima e o outro formado por L. rupestris,
6. MATERIAL E MÉTODOS 6.1. Coleta do Material Vegetal
Foram realizadas duas expedições de coleta de material vegetal
Lychnophora pinaster. Na primeira, realizada em maio de 2004, foram amostradas duas
Figura 2 - Localização das populações de L. pinaster, Antena e Poço Bonito coletadas no
Município de Lavras - MG, e Estrada Real, coletada no Município de Carrancas - MG.
Foram amostrados 20 indivíduos em cada população, e coletadas folhas para análise da composição química dos óleos essenciais e da variabilidade genética das populações. Estacas apicais para formação do banco de germoplasma e para a análise da composição química dos óleos essenciais das populações cultivadas também foram coletadas.
Além disso, coletou-se material botânico fértil, sendo confeccionadas 06 exsicatas referentes a cada população, as quais foram depositadas no herbário do Instituto Agronômico de Campinas – IAC, cadastradas sob os números IAC 46585 (População Antena); IAC 46586 (População Poço Bonito) e IAC 46587 (População Estrada Real) e identificadas pelo Dr. João Semir, docente do Instituto Biológico da Universidade Estadual de Campinas.
Amostras de solo dos locais de coleta foram coletadas e conduzidas ao laboratório de Análises de Solo do Centro de P&D de Solos e Recursos Ambientais do Instituto Agronômico de Campinas, para análise de macro e micronutrientes (Raij et al., 2001).
6.2. Estabelecimento do Banco de Germoplasma de L. pinaster
Após cada coleta (população Antena e Estrada Real: 05/2004; Poço Bonito e Estrada Real 1: 10/2005), as estacas foram acondicionadas em caixas de isopor, alternando-se ramos das plantas com folhas de jornal umedecido com água, para manutenção da umidade, lacradas e encaminhadas para o Laboratório de Plantas Medicinas do Departamento de Produção Vegetal/Horticultura, da Unesp - Botucatu.
O preparo das estacas, cujo tamanho foi padronizado para 10 cm, foi realizado por indivíduo coletado e as folhas retiradas manualmente, deixando apenas aquelas compreendidas na região do meristema apical e as com 01 cm abaixo. Após esse procedimento, as estacas foram lavadas em água destilada, cortando-se a base do caule em bisel, e mantidas, por 24 horas, em solução de ácido indolbutírico (IBA) a 300 mg L-1, sem aeração (Paron, 2003). As folhas retiradas das estacas de cada indivíduo foram devidamente identificadas e destinadas para extração e análise da composição química do óleo essencial, conforme metodologia descrita no item 6.3.
Após o período de imersão em solução com o bioregulador vegetal, as estacas, devidamente identificadas, foram plantadas em bandejas de poliestireno expandido com 72 células, tendo como substrato para enraizamento a vermiculita (Figura 3).
As bandejas foram mantidas em ambiente protegido com tela de sombreamento de 50%, e irrigadas duas vezes ao dia, por 1 minuto, com o auxílio de aspersores.
Passados cerca de 03 meses, período no qual as estacas tiveram seu melhor enraizamento, as mesmas foram transplantadas para vasos plásticos de 3 litros, preenchidos com terra. As estacas foram mantidas em sombreamento de 50% com irrigação diária por um período de 03 meses para seu pleno estabelecimento.
Após o período de aclimatação, as estacas foram transplantadas para o campo, localizado na Área Experimental do Departamento de Horticultura da Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp/Botucatu, nas seguintes coordenadas geográficas: 22º51’S, 48º26’WO, 786 m de altitude. Foram plantadas um total de 174 estacas da população Antena, 95 estacas da população Estrada Real, 92 estacas da população Poço Bonito e 89 estacas da população Estrada Real 1, em espaçamento de 1m entre covas e 1,30m entre linhas, com apenas uma adubação, no plantio, colocando-se 2 g de cloreto de potássio, 3,5 g de sulfato de amônia e 3,5 g de supertriplo, por cova, e irrigação diária (Figura 4).
Figura 4 -Plantio, no campo, das estacas de L. pinaster.
das estacas no campo (Figura 5). Para as populações Poço Bonito e Estrada Real 1, esse procedimento não foi realizado, pelo fato de observar-se que, após a retirada da tela de sombreamento das primeiras populações as estacas tiveram crescimento mais rápido.
Figura 5 - Plantio das estacas de L. pinaster, detalhe para a tela de sombreamento.
Para acompanhar o desenvolvimento dos indivíduos e determinar a taxa de crescimento das plantas, foram coletados dados de altura da planta e diâmetro do caule, de cada indivíduo. Esses dados foram coletados durante o período de avaliação sazonal do óleo essencial, em todas as populações. Durante a experimentação em campo houve algumas perdas de plantas devido ao tombamento causado pelo vento e ataque de formigas (Atta sp.) que cortaram a região apical, levando a planta a rebrota e, em alguns
casos, à morte. Houve um caso de fungo de solo, atacando a raiz, causando secamento da planta.
O único controle realizado constituiu na aplicação do inseticida granulado Mirex, para combate de formigas cortadeiras (Atta sp) e, em alguns casos, de
inseticida em pó, aplicado diretamente no olheiro dos formigueiros.
observam-se ainda algumas perdas, pelo fato de estarem no período de aclimatação, com apenas 1 ano e 8 meses em campo, tendo a primeira população 7 indivíduos e, a segunda, 13 (Figuras 6).
Figura 6 - Banco de germoplasma das populações Lychnophora pinaster.
As populações cultivadas foram submetidas a três épocas de colheita, verão, outono e inverno. Para Antena e Estrada Real, as colheitas foram realizadas em 15/04/2005, 15/07/05 e 15/01/06, sendo as datas respectivas ao outono, inverno e verão. As colheitas de Poço Bonito e Estrada Real 1 foram realizadas em 15/01/2007, 15/04/05 e 15/07/06, referentes ao verão, outono e inverno. Em todas as colheitas, as plantas das populações encontravam-se em estádio fisiológico vegetativo.
6.3. Secagem, extração e caracterização química dos óleos essenciais
Após as coletas do material nativo e depois de cada colheita do material cultivado, as folhas de cada indivíduo foram manualmente separadas dos caules e das inflorescências, acondicionadas em sacos de papel devidamente identificados e colocadas para secagem em estufa de circulação forçada de ar, em temperatura controlada a
40°C, realizadando-se pesagens diárias subseqüentes, até que se obtivesse massa da matéria seca constante.
Os óleos essenciais foram extraídos por hidrodestilação, em aparelho tipo Clevenger (Craveiro et al., 1981) por duas horas, e, posteriormente, armazenados em frascos de vidro transparente devidamente identificados e mantidos no freezer a 4ºC até a análise da composição química, conduzida em cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massas (Shimadzu, QP-5000), operando a 70 eV, dotado de coluna capilar de sílica fundida DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 um), hélio como gás de arraste (1,7 mL/min), injetor a 240ºC, detector a 230ºC e o seguinte programa de temperatura: 80ºC - 150ºC, 6ºC/min; 150ºC - 190ºC, 2ºC/min; 190ºC - 280ºC, 10ºC/min; 280ºC (6 min.) e split 1/20.
A identificação dos constituintes químicos foi realizada por meio da análise comparativa dos espectros de massas das substâncias com o banco de dados do sistema CG-EM (Nist 62.lib), literatura (Mclafferty e Stauffer, 1989) e índice de retenção (Adams, 1995). Os índices de retenção de Kovat’s (IR) das substâncias foram obtidos através da co-injeção do óleo essencial com uma mistura padrão de n-alcanos (C9H20 -
C25H52 Sigma Aldrich, 99%), aplicando-se a equação de Van den Dool e Kratz (Van den
Dool e Kratz, 1963).
Os resultados foram submetidos a uma análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey (p 0,05) com auxílio do programa estatístico
SANEST (Zonta e Machado, 1985). Para realização das análises, considerou-se cada indivíduo um tratamento, com 03 replicatas de injeção e, cada composto químico foi considerado uma variável.
