Efeitos da restrição de sono em ratas prenhes no desenvolvimento da prole

DEPARTAMENTO DE PSICOBIOLOGIA

TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO

EFEITOS DA RESTRIÇÃO DE SONO EM RATAS

PRENHES NO DESENVOLVIMENTO DA PROLE

Aluna: Marina Fontes de Paula Aguiar

Orientadora: Profa. Dra. Monica Levy Andersen

Colaboradores: Dra. Tathiana Alvarenga

Profa. Dra. Renata Mázaro e Costa Prof. Dr. Sergio Tufik

Supervisor: Prof. Dr. Gilson Volpato

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO DEPARTAMENTO DE PSICOBIOLOGIA

EFEITOS DA RESTRIÇÃO DE SONO EM RATAS

PRENHES NO DESENVOLVIMENTO DA PROLE

São Paulo

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE

Aguiar, Marina Fontes de Paula.

Efeitos da restrição de sono em ratas prenhes no desenvolvimento da prole/ Marina Fontes de Paula Aguiar. – Botucatu : [s.n.], 2011

Trabalho de conclusão de curso (bacharelado - Ciências Biológicas) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: Mônica Levy Andersen

Capes: 20701004

1. Distúrbios do sono. 2. Comportamento sexual. 2. Capacidade motora. 3. Avaliação sensorial.

AGRADECIMENTOS

- Aos meus pais, irmãos e avós por estarem sempre presentes em todos os momentos da minha vida. Meu eterno amor e devoção.

- Agradecimento especial à orientadora Monica Levy Andersen, por todos os preciosos ensinamentos, pelo contagiante entusiasmo e amor à Ciência, pela oportunidade e pelo apoio em todas as situações. Minha eterna gratidão e admiração.

- À amiga e companheira de madrugadas durante os experimentos Tathiana Alvarenga, pela contribuição essencial em todos os sentidos e em todos os momentos.

- À professora Renata Mázaro Costa, por me ceder os animais de seu projeto de Pós-doutorado para que eu pudesse dar continuidade aos experimentos e realizar este projeto.

- Aos companheiros de trabalho Camila Hirotsu, Flávia Egydio, Francielli Ruiz, Paula Araújo, Lucas Maia, Gabriela Pimenta, Vanessa Kahan e Gabriel Pires, por toda ajuda e amizade.

- À todos os funcionários e professores do Departamento de Psicobiologia da UNIFESP.

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO...1

1.1-Sono...1

1.2-Sono em roedores...6

1.3-Sono na sociedade moderna...10

1.4-Sono e gravidez...13

1.5-Interação sono e sistema reprodutor...14

1.6-Desenvolvimento sensório-motor...16

1.7-Falta de sono durante a gravidez e desenvolvimento da prole...18

2- JUSTIFICATIVA...20

3- OBJETIVO GERAL...21

4- MATERIAL E MÉTODO...22

4.1-Animais...22

4.2-Determinação do ciclo estral...23

4.3-Metodologia de restrição de sono...25

4.4-Acasalamento e confirmação de prenhez...27

4.5-Parto e padronização da ninhada...27

4.6-Avaliação do desenvolvimento físico...28

4.7-Avaliação do desenvolvimento reflexológico (ou sensório-motor)...29

4.8-Avaliação do comportamento sexual da prole...30

4.9-Grupos experimentais...34

4.10-Delineamento experimental...34

4.11-Dosagens hormonais...35

4.12-Análise estatística...35

5- RESULTADOS...36

5.1-Número de filhotes...36

5.2-Desenvolvimento físico e reflexológico...37

5.3-Perfil hormonal...46

5.4-Comportamento sexual dos descendentes machos...49

5.5-Comportamento sexual das descendentes fêmeas...53

6- DISCUSSÃO...56

7- CONCLUSÕES...60

RESUMO

1.1-Sono

O sono é um fenômeno biológico que ocupa cerca de um terço das nossas vidas, comprometimento extraordinário de tempo que indica um papel crucial no organismo. A julgar por documentos, lendas e tradições orais ou escritas, o sono desperta o fascínio de todos os povos do mundo desde a mais remota Antiguidade. Trata-se de um estado fisiológico caracterizado por abolição prontamente reversível da consciência, suspensão temporária da atividade motora voluntária e elevação do limiar de respostas ao meio ambiente. Alternando-se de forma rítmica com o estado de vigília, o sono se desenrola em diversas fases consecutivas que se repetem ciclicamente. Está presente em todas as faixas etárias e na maioria das espécies animais, sendo um processo fundamental para a manutenção da saúde mental, física e emocional (Banks e Dinges, 2007; Tufik et al, 2009; Bittencourt et al, 2010).

A compreensão atual do sono originou-se dos primeiros registros da atividade elétrica cerebral em seres humanos denominado de eletroencefalograma (EEG), descrito por Hans Berger em 1929. Com o advento desta técnica, que capta a atividade elétrica cerebral resultante de populações de neurônios corticais em função do tempo, ficou evidente a relação entre a fenomenologia do sono e os potenciais elétricos do sistema nervoso. A análise do sono é feita conforme a frequência (número de ondas na

unidade de tempo) e a amplitude (tamanho) das ondas cerebrais. Além disso, o EEG

sono paradoxal é usada para se referir aos estágios de sono em roedores, e sono NREM e REM usada para seres humanos.

O estágio NREM do sono é caracterizado pela sincronização dos potenciais e lentificação progressiva da atividade cortical, sendo dividido em fases I, II, III e IV. As fases III e IV correspondem ao sono de ondas lentas ou sono delta, enquanto as fases I (sonolência) e II (sono “leve”) são caracterizadas por ondas dessincronizadas e de

baixa amplitude no EEG (Rechtschaffen e Kales, 1968). Esses estágios usualmente

ocorrem em sequência, frequentemente com flutuações ao longo da noite. Já a fase REM do sono é caracterizada pelo predomínio de potenciais de baixa voltagem e alta frequência. Além disso, nessa fase ocorre atonia muscular, verificada pela perda da atividade eletromiográfica nos músculos do pescoço.

A denominação de sono REM (do inglês rapid eye movements) foi feita por

Aserinsky e Kleitman em 1953, que identificaram os movimentos oculares rápidos que ocorrem sob as pálpebras fechadas de indivíduos adormecidos nesse estágio. Outra denominação, a de sono paradoxal, foi feita por Jouvet em 1959, devido à semelhança no EEG desse estágio com a vigília. Essa similaridade formava um paradoxo, que

diferia apenas na ocorrência de atonia muscular durante o sono REM. O EEG, o

Um sono adequado envolve 3 aspectos: quantidade, qualidade e ritmicidade. A quantidade necessária de sono parece ser determinada geneticamente e o sono suficiente não é medido em horas absolutas obtidas. O importante é a qualidade do sono natural de cada individuo, isto é, ao acordar sentir-se restabelecido fisicamente e psicologicamente. Embora a média total de tempo de sono a noite seja de 7,5 a 8 horas, adultos saudáveis podem precisar de 4 a 10 horas de sono, caracterizados como pequenos dormidores e grandes dormidores, respectivamente. Desta forma, pessoas que precisam de 10 horas de sono por noite, mas têm apenas 8 horas, podem ficar significativamente privadas de sono e notavelmente hipersonolentas.

Figura 1: Hipnograma representativo das fases e duração dos ciclos de sono

O mundo atual gira em ciclos de luz e escuridão a cada 24 horas. Assim, a maioria das espécies que vivem na superfície se adaptou a essa mudança regular em seu ambiente, desenvolvendo os ritmos circadianos. Estes, por sua vez, são mantidos regulares por pistas temporais encontradas no ambiente, sendo a mais importante o ciclo claro-escuro. Os ritmos e os processos biológicos são sincronizados e, assim, o corpo pode trabalhar eficientemente, atingindo o objetivo esperado no tempo certo, mas com alguma flexibilidade. Em ambientes de laboratório controlados, por exemplo, é possível aumentar ou diminuir os ciclos circadianos, ajustando-se a duração do ciclo claro-escuro. As pistas ambientais capazes de sincronizar o relógio biológico das

espécies são denominadas de zeitgebers (do alemão “doadores de tempo”).

O corpo humano foi programado para dormir a noite e permanecer em vigília durante o dia, ao contrário dos roedores, animais notívagos que dormem a maior parte do dia e ficam acordados à noite. São os ritmos biológicos que regulam esses processos comportamentais e fisiológicos. Existe, para tanto, um “relógio biológico” interno localizado no Núcleo Supraquiasmático (NSQ) do hipotálamo medial,

evidenciado por estudos feitos na ausência de zeitgebers. Mesmo sob condições em

ritmos circadianos (ritmos de livre-curso), que duram aproximadamente 25 horas na maioria dos seres humanos (Czeisler et al, 1999; Moore, 1998). Ratos que nascem e crescem em um ambiente de laboratório sem mudanças (com iluminação ou escuridão contínua) também apresentam ciclos de vigília-sono em livre-curso regulares de aproximadamente 25 horas (Richter, 1971). Evidências para constatação de que o NSQ contém mecanismos de arrastamento circadiano podem ser analisadas quando são feitas lesões nessa região. Nessas situações não ocorrem redução da quantidade de tempo de sono, porém há uma interrupção da peridiocidade circadiana. Além disso, quando essa região é cirurgicamente isolada do restante do cérebro, os ciclos circadianos de atividade elétrica, metabólica e bioquímica continuam a acontecer (Moore, 1997). Outra evidência é a estimulação elétrica do NSQ que produz mudanças de fase nos ciclos em livre-curso (Rusak e Groos, 1982).

As sociedades industrializadas modernas enfrentam diversos tipos de

perturbações à ritmicidade circadiana, entre eles o jet lag e o trabalho em turno. O

primeiro caso ocorre quando os zeitgebers que controlam as fases de vários ritmos

circadianos são acelerados em viagens aéreas para o leste (adiantamento de fase) ou desacelerados em vôos para o oeste (atraso de fase). No segundo caso, os trabalhadores são obrigados a ajustar os seus ciclos vigília-sono naturais para cumprir com as demandas de horários de trabalho inconstantes. Essas alterações no padrão do ciclo vigília-sono podem causar diversos prejuízos. Esses danos, por sua vez, podem ser físicos, como cansaço e fadiga, comprometendo o nível de vigilância e de atividades que requerem concentração e atenção; ou psicológicos, podendo causar irritabilidade, tensão, depressão, transtornos de humor, desconforto social, ansiedade e

1.2-

Sono em roedores

Todos os mamíferos e aves dormem. Mesmo peixes, répteis, anfíbios e insetos passam por períodos de inatividade e ausência de respostas que se assemelham ao sono dos mamíferos (Shaw et al, 2000). Comum a todos os animais, o sono é marcado por um padrão de quiescência, repouso e redução cognitiva (Timo-Iaria, 1985). Porém,

de forma geral o sono varia conforme a idade, diferenças individuais, maturação

cerebral, tamanho do corpo e condição presa ou predador. Essas variações predizem que o tempo de sono diário de cada espécie está relacionado com o quão vulnerável ela fica enquanto dorme, além de quanto tempo ela deve gastar por dia para alimentar-se e cuidar de outros requisitos para sua sobrevivência. As zebras, por exemplo, devem pastar continuamente para comer o suficiente e são extremamente vulneráveis a ataques de predadores enquanto dormem, o que acontece apenas 2 horas por dia. Os leões africanos, ao contrário, dormem de forma contínua por 2 ou 3 dias após devorarem uma presa. Existem também espécies que evoluíram mecanismos complexos que proporcionam que elas durmam. Alguns mamíferos marinhos, por exemplo, dormem com apenas um hemisfério do cérebro por vez, de modo que o outro hemisfério controla a busca de ar na superfície da água.

Ratos e camundongos possuem um padrão de sono polifásico, apresentando ciclo vigília-sono frequentemente irregular. Os primeiros ciclos são incompletos, terminando quase sempre com despertar breve, cuja duração em geral não passa de 1 segundo. É possível que no rato esses curtos períodos de vigília tenham por finalidade explorar olfativamente o ambiente para identificar alguma eventual ameaça próxima. Isso se deve ao fato de serem animais naturalmente predados quando inseridos em

seu habitat natural. Esse breve despertar, no entanto, raramente ocorre nos predadores

naturais (homem, gato, cão) que apresentam um padrão de sono monofásico. Entretanto, breves períodos de vigília ou pelo menos de forte superficialização do sono (microdespertares) também ocorrem em seres humanos.

Os roedores dormem, em média, 62% do período claro e 33% do período escuro, sendo que, durante a vigília, realizam suas atividades vitais e sociais (alimentação, procriação, interação social e exploração do ambiente) (Figura 2). Somando-se os períodos de sono, verifica-se que os roedores dormem cerca de 50% das 24 horas, dividindo-se em sono de ondas lentas e sono paradoxal (Timo-Iaria et al, 1970).

Figura 2: Foto ilustrativa de um rato em estágio de vigília (A) e em sono (B). Fonte: Andersen et al (2004).

O estudo do ciclo vigília-sono em roedores requer registro de potenciais eletrofisiológicos corticais e subcorticais. Nesses animais, a análise do padrão de sono é feita implantando-se eletrodos diretamente sobre a superfície cortical (Eletrocorticograma – ECoG) ou no interior do encéfalo, através de cirurgia estereotáxica. O ciclo vigília-sono em roedores pode ser classificado nos seguintes estágios (Figura 3):

• Vigília: apresenta traçado dessincronizado de alta freqüência (> 25 Hz) e

baixa amplitude (< 50 µV), podendo aparecer o ritmo theta (5 a 8 Hz) no EEG. No canal

de eletromiograma (EMG) apresenta um traçado de alta amplitude (> 40 µV), exceto na

vigília relaxada, na qual a amplitude do EMG está tão reduzida quanto no sono de ondas lentas (SOL).

• Sono de ondas lentas (SOL): caracterizado pela maior amplitude da

onda nos canais corticais (> 50 µV), presença de ritmo delta e diminuição na freqüência

de onda (< 25 Hz). Além disso, o EMG apresenta uma amplitude mais reduzida (20 a

50 µV).

• Sono paradoxal (SP): observado quando um dos canais corticais

demonstra uma redução na amplitude (< 50 µV) e aumento na freqüência de onda (>

40 Hz), enquanto que o outro canal cortical apresenta um padrão de onda de ritmo theta (5 a 8 Hz) praticamente monotônico. O EMG, por sua vez, se mostra com a

amplitude quase nula (< 20 µV) (Timo-Iaria et al, 1970; Bergmann et al, 1989; Andersen

Figura 3: Padrões de ondas característicos durante as fases do sono de roedores: vigília, sono de ondas lentas (SOL) e sono paradoxal (SP). A figura representa épocas de 30 segundos para cada estágio do ciclo vigília-sono.

Na década de 70, uma análise detalhada das fases do sono de ratos mostrou que existe uma enorme equivalência com o padrão de sono em humanos (Timo-Iaria et

al, 1970). O sono NREM humano, por exemplo, caracteriza-se pela presença de fusos

1.3- Sono na sociedade moderna

Principalmente após a Revolução Industrial, com o rápido desenvolvimento da economia, observa-se uma crescente tendência à diminuição do tempo de sono da população. Existe um claro contraste entre os hábitos de sono atuais e os hábitos apresentados na era Pré-Industrial (Foster e Wullf, 2005). A falta de sono é uma das consequências da pressão exercida pela sociedade sobre os indivíduos, que necessitam cumprir uma demanda cada vez maior de exigências da rotina diária de trabalho, estudos e compromissos sociais. Além disso, a exposição à luz artificial ampliou o período das atividades de lazer, aumentando o tempo de vigília. Como resultado, o estresse e as perturbações circadianas causadas podem ser responsáveis por alguns dos efeitos adversos atribuídos à falta de sono. Uma noite mal dormida pode trazer consequências indesejáveis e até mesmo provocar acidentes.

Estudos recentes mostraram que o tempo de sono diminuiu cerca de 2 horas por

noite nos últimos 50 anos (National Health Interview Survey, 2005; Roth, 2009). Esta

condição quase que inerente à vida moderna pode levar a repercussões nítidas na saúde e bem-estar tanto a curto como a longo prazo. Essas modificações podem ser evidenciadas pelo aumento na prevalência de distúrbios de sono (Bittencourt et al, 2009). Em roedores, a falta de sono provoca alterações em vários aspectos, como memória (Moreira et al, 2003; Alvarenga et al, 2009, 2010), ansiedade (Suchecki et al, 2002), atenção (Godoi et al, 2005), comportamento sexual (Andersen e Tufik, 2002, 2006; Andersen et al, 2007; Alvarenga et al, 2009), modificações hormonais (Andersen et al, 2005, 2007; Antunes et al, 2006; Alvarenga et al, 2009), além de alterações marcantes no sistema imunológico (Bryant et al, 2004; Ruiz et al, 2007; Zager et al, 2007, 2009). Em estudo utilizando o método do disco giratório, modelo no qual o animal privado de sono cai em uma piscina de água rasa pela rotação do disco quando adormece, os ratos morrem após vários dias, enquanto os animais controles, acoplados no mesmo ambiente, permanecem razoavelmente saudáveis (Rechtschaffen e Bermann, 1995).

modelos de privação e restrição de sono têm sido usados de maneira eficiente para simular a situação atual da sociedade em relação ao padrão de sono.

1.4- Sono e gravidez

O papel da mulher na sociedade sofreu significativas mudanças nos últimos anos. A participação ativa da mulher no mercado de trabalho e na divisão de tarefas e responsabilidades com o parceiro, assim como seus compromissos sociais faz com que o estresse da vida moderna seja incorporado ao seu dia-a-dia. Nesse sentido, encontra-se a privação ou restrição de sono na qual as mulheres se submetem a fim de atender plena ou parcialmente as múltiplas demandas dos dias atuais. Em função destas adaptações aos hábitos de vida moderna e às suas consequências negativas, é possível afirmar que a falta de sono pode influenciar diretamente a gravidez, condição essencial da mulher para perpetuação da espécie.

O padrão e a homeostasia do sono são naturalmente modificados durante a gravidez, que naturalmente já implica em diversas condições fisiológicas estressantes. As diversas alterações hormonais que ocorrem durante esse período, como o aumento gradual nas concentrações de progesterona e estrógeno (Kleinlogel, 1983), também influenciam o sono. Esses hormônios sexuais estão diretamente relacionados à gestação e ao parto, e têm efeito redutor no tempo de sono paradoxal quando testados em animais (Kleinlogel, 1983; Lancel et al, 1996). As modificações físicas, como o ganho natural de peso durante esse período, também podem influenciar na quantidade e qualidade de sono. Assim, gestantes são acometidas por fragmentação, restrição e eventuais distúrbios de sono, como a Síndrome das Pernas Inquietas (SPI) e a Síndrome da Apnéia Obstrutiva do Sono (SAOS) (Pien e Schwab, 2004; Hachul et al, 2011).

trimestre de gravidez em 75% das entrevistadas, essencialmente pelo aumento da vontade de urinar, movimentos do feto, dores nas costas e SPI. A qualidade de sono foi afetada no começo do terceiro trimestre de gestação e aumentou ao longo do tempo. As queixas de sonolência diurna, no entanto, foram mais frequentes apenas durante o primeiro trimestre da gravidez. Além disso, também foi documentado a redução do tempo de sono REM e os estágios III e IV do sono NREM durante o terceiro trimestre

de gestação (Ursava e Karadağ, 2009).

Sabe-se que a falta de sono é um fator inerente de estresse. Estudos realizados em humanos mostraram que o aumento do cortisol não ocorre somente devido à privação contínua de sono, mas também como resultado da fragmentação de sono (Spath-Schwalbe et al, 1991; Ekstedt et al, 2004). Assim, indivíduos sadios que tiveram o sono reduzido em 4 horas por noite durante 6 dias consecutivos apresentaram, após esse período, um aumento significativo no cortisol noturno (Spiegel et al, 1999). As elevações nos níveis de glicocorticóides podem alterar diretamente a neurogênese e a neuroplasticidade. Essas modificações, por sua vez, aumentam as chances de desenvolvimento de doenças como a depressão e a insônia crônica, principalmente em indivíduos vulneráveis (Meerlo et al, 2008). Especula-se, nesse sentido, que as gestantes apresentariam maior susceptibilidade ao desenvolvimento dessas doenças, tendo em vista as alterações no padrão de sono intrínsecas à gravidez.

1.5- Interação sono e sistema reprodutor

têm suas concentrações alteradas pela falta de sono. Em seres humanos, Nindl e colaboradores (2006) relataram que em homens após um período de restrição crônica de sono devido ao treinamento militar, houve um aumento da concentração de LH, enquanto que a concentração de FSH se manteve inalterada após uma privação parcial de sono (Baumgartner et al, 1993).

Em modelos animais, a falta de sono exerce uma influência importante sobre os hormônios sexuais, causando diminuição da testosterona e estradiol e aumento da progesterona e glicocorticóides em ratos machos (Andersen et al, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007), prejudicando o desempenho sexual masculino (Alvarenga et al, 2009, 2010). Em ratas privadas de sono ocorrem modificações hormonais conforme a fase estral em que foram submetidas a esta condição, indicando que a falta de sono modula a liberação dos hormônios ovarianos através de alterações nos mecanismos neuroquímicos hormonais. Assim, ratas em fase de diestro (período equivalente a fase lútea nas mulheres) submetidas a um protocolo de privação de sono paradoxal (PSP por 96 horas) tiveram o ciclo estral interrompido, permanecendo em anestro por 10 dias (Antunes et al, 2006). Essas fêmeas também apresentaram um aumento significativo de corticosterona e redução de estradiol em relação às ratas controle na mesma fase do ciclo estral, além de alterações no padrão de sono (Andersen et al, 2008).

fisiológicas, anatômicas e comportamentais que distinguem homens e mulheres. A segunda é ativando o comportamento reprodutivo na vida adulta.

O sono exerce também efeito modulatório importante na maioria dos componentes do sistema endócrino. Desta forma, as situações descritas decorrentes da gravidez e estilo de vida atual que interferem negativamente no sono podem desenvolver respostas fisiopatológicas sobre aspectos neuroendócrinos envolvidos na reprodução. Sabe-se que o estresse, físico ou psicológico, interfere com a capacidade reprodutiva masculina e feminina em diferentes espécies animais (Rivier e Rivest, 1991; Stratakis e Chrousos, 1997) e que a falta de sono representa um estresse (Meerlo et al, 2008). Considerando que nos últimos anos têm-se observado uma redução na taxa de fertilidade em mulheres (OMS, 2009) concomitante a uma diminuição no tempo de sono, é de grande relevância um estudo visando uma compreensão melhor dos efeitos da falta de sono durante a gravidez e as possíveis consequências para o desenvolvimento reprodutivo da prole.

1.6- Desenvolvimento sensório-motor

Para um desenvolvimento reprodutivo normal é necessário que o aparelho

reprodutor seja anatômico e funcionalmente normal.Segundo a Organização Mundial

(Kempinas, 2001). Os métodos de avaliação desses parâmetros estão associados à avaliação do desenvolvimento físico, sensorial e motor da prole (Silva, 1991).

O sistema reflexológico (ou sensório-motor) é responsável pelas reações motoras provocadas por estímulos sensoriais e tem importância vital na avaliação da evolução maturativa da função motora. Este processo é dirigido por comandos que atuam em cascata por meio de níveis hierárquicos do córtex de associação aos músculos (Sakata et al, 1997). Os sinais que saem do córtex especificam objetivos gerais, havendo, no entanto, uma segregação funcional. Assim, qualquer alteração nesse sistema pode acarretar modificações profundas no desenvolvimento da prole.

O déficit funcional é caracterizado pela presença de defeitos estruturais, certos tipos de retardo mental e alguns tipos de erros metabólicos que podem ser acessados somente durante o desenvolvimento pós-natal do filhote. Algumas anormalidades do sistema nervoso central, por exemplo, são associadas a defeitos estruturais perceptíveis ou mesmo demonstráveis através de autopsia (Wilson, 1973). Desta forma, o estudo da primeira geração está entre os protocolos de avaliação do desenvolvimento pós-natal. Além disso, o estudo do desenvolvimento pode envolver o tratamento apenas paterno, materno ou de ambos, ocorrendo somente antes do cruzamento, durante toda a gravidez (ação intra-uterina), em períodos específicos da gestação e/ou durante a lactação (Preston e Hoffmann, 2001).

crescimento pós-natal, os marcos do desenvolvimento da puberdade (abertura vaginal, descida testicular), a atividade motora e o surgimento de reflexos (Kempinas, 2001).

1.7- Falta de sono durante a gravidez e desenvolvimento da prole

Resultados de Goyal e colaboradores (2008) mostraram que gestantes que dormem menos de 4 horas apresentam maior risco de desenvolver depressão pós-parto. Em casos mais graves e não tratados, a depressão pós-parto pode levar à negligência da prole e até mesmo ao infanticídio (Friedman e Resnick, 2009). De fato, a restrição de sono parece ser capaz de induzir esse transtorno mental, embora mais estudos sejam necessários (Chang et al, 2009; Dørheim et al, 2009). Em estudo recente feito por White e colaboradores (2009) foi demonstrado que a relação materno-infantil pode se tornar prejudicada por fatores estressantes durante a gravidez, evidenciada por aumento da fadiga materna. Como consequência, é possível que haja uma diminuição do cuidado materno, podendo alterar diretamente o desenvolvimento da prole.

JUSTIFICATIVA

Na sociedade moderna, houve uma mudança no papel da mulher. Além das obrigações domésticas, a mulher assumiu uma posição de destaque no mercado de trabalho. Exerce atividades remuneradas e divide tarefas e responsabilidades com o parceiro. Ao enfrentar e modificar os comportamentos, a mulher traz para o seu dia-a-dia o estresse da vida moderna. Neste aspecto encontra-se a privação ou restrição de sono, condição nas quais as mulheres se submetem a fim de atender plena ou parcialmente as múltiplas jornadas de trabalho e demandas domésticas as quais são expostas. Além disso, há uma maior prevalência de alguns distúrbios de sono no gênero feminino, como por exemplo, a insônia. Essa maior prevalência para o sexo feminino pode ser atribuída às modificações hormonais e psicológicas associadas às mudanças do estilo de vida.

OBJETIVO GERAL

O objetivo do presente estudo foi avaliar as consequências da restrição de sono durante a prenhez sobre o desenvolvimento da prole.

3.1. Objetivos específicos

- Avaliar o desenvolvimento sensório-motor dos descendentes de ratas restritas de sono durante a prenhez;

- Investigar as possíveis implicações da restrição de sono pré-natal no comportamento sexual da prole;

MATERIAL E MÉTODO

4.1- Animais

Os animais foram provenientes do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia (CEDEME-UNIFESP). Além disso, foram

mantidos em gaiolas-moradia de policarbonato e receberam água e ração ad libitum.

As condições de luz (ciclo claro-escuro das 7 às 19 horas) e temperatura (22 ± 1°C)

foram controladas automaticamente. Os experimentos foram conduzidos segundo os princípios éticos (Andersen et al, 2004, 2010) e sob aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP (CEP#1444/09).

Foram utilizadas neste estudo 24 fêmeas Wistar naïves e 10 machos Wistar

sexualmente maduros e experientes para realização do acasalamento. As fêmeas tinham aproximadamente 75 dias de idade e os machos 90 dias no início do experimento. Dentre os descendentes, foram utilizados 4 filhotes por mãe para análise do desenvolvimento sensório-motor, padronizando-se 2 machos e 2 fêmeas. Para os testes de comportamento sexual, todos os filhotes de cada mãe foram utilizados. Em todos os procedimentos, considerou-se a rata mãe como unidade.

A limpeza das gaiolas-moradia foi feita em dias alternados para remoção da serragem utilizada para forração. A troca da água do tanque para restrição de sono foi feita diariamente. Ao final dos testes propostos os animais foram eutanasiados

utilizando o método de decapitação para extração do sangue utilizado para as

4.2- Determinação do ciclo estral

Para a determinação do ciclo estral das fêmeas e confirmação do dia do acasalamento foi utilizada a técnica do esfregaço vaginal durante 14 dias. A técnica consiste na introdução de solução salina (0,9%) na abertura vaginal da rata utilizando

um conta-gotas e uma pipeta de 100µl. Feito isso, retirou-se a solução salina da

abertura vaginal. A solução foi espalhada sobre uma lâmina para a identificação do tipo celular predominante em cada fase do ciclo. Logo após o esfregaço, foi feita a visualização microscópica para identificação da fase do ciclo estral.

O ciclo estral divide-se em 3 fases que diferem pela predominância de tipos celulares da secreção vaginal:

- Proestro: predomínio de células epiteliais grandes, nucleadas e redondas. Possui duração de 12 a 14 horas e precede o estro (Figura 4);

Figura 4: Imagem representativa da fase proesto.

Figura 5: Imagem representativa da fase estro.

- Diestro: divide-se em diestro I ou metaestro, e diestro II. Na fase diestro I existem 3 tipos celulares: leucócitos, células epiteliais e células corneificadas, com duração aproximadamente de 6 a 8 horas (Figura 6). A fase diestro II dura cerca de 55 a 57 horas e nela predominam os leucócitos (Figura 7).

Figura 6: Imagem representativa da fase diestro I ou metaestro.

4.3- Metodologia de restrição de sono

Juntamente com as técnicas eletrofisiológicas, a restrição de sono (RS) é uma

das principais ferramentas de estudo que permite a compreensão da fisiologia e dos mecanismos de regulação do ciclo vigília-sono. Assim, a adoção de modelos animais em experimentos de restrição de sono tornou-se necessária, permitindo também a

realização de avaliações bioquímicas, farmacológicas, neuronatômicas,

comportamentais, entre outras associadas à supressão do sono.

Torna-se complexo o estudo dos efeitos da falta de sono em indivíduos

não-humanos de forma adequada por causa dos inevitáveis efeitos inerentes de estresse (D’Almeida et al, 1997; Benington e Heller, 1999; Tufik et al, 1995; Papale et al, 2005). O método de privação de sono pela plataforma única por si só constitui-se de um fator de estresse para os animais, principalmente pela contenção de movimentos que o método induz. Assim, adotou-se mais 6 plataformas, permitindo que o rato se movimentasse durante o período de privação de sono. No entanto, em ambos os métodos (plataforma única e plataformas múltiplas), os animais mostram fortes indícios de estresse, como a perda de peso, atrofia do timo e o aumento do peso das glândulas adrenais. O isolamento social presente nessas metodologias constitui outro importante fator estressante. Devido a isso, foi proposto o método das plataformas múltiplas modificadas, em que é possível privar de sono vários animais simultaneamente, sempre com um número excedente de plataformas, permitindo a movimentação e a interação social dos ratos durante a privação de sono.

17,5 cm), onde permaneceram até às 16:00 horas, permitindo assim 6 horas de sono (10:00 às 16:00 horas) (Machado et al, 2005). A atonia muscular presente no sono paradoxal faz com que o animal acorde ao encostar o focinho ou, ainda, o corpo inteiro na água. Os animais controle para essa metodologia foram mantidos em suas gaiolas-moradia durante todo o período experimental.

Esse modelo foi desenvolvido na tentativa de mimetizar as condições de

restrição parcial de sono crônica da sociedade atual. Desta forma, os animais têm o sono restrito por longos períodos, assim como ocorre em humanos.

Figura 8: Ratos restritos de sono pelo método das plataformas múltiplas modificas.

4.4- Acasalamento e confirmação de prenhez

O acasalamento foi realizado em uma gaiola com 1 fêmea na fase receptiva (período final da fase proestro e início da fase estro do ciclo estral) e 1 macho sexualmente experimente durante o ciclo escuro. A presença do tampão vaginal e a identificação de espermatozóides no esfregaço vaginal indicam a ocorrência da cópula e da ejaculação, confirmando a prenhez. No período gestacional (21 dias), as fêmeas foram mantidas individualmente nas gaiolas-moradia.

4.5- Parto e padronização da ninhada

O dia do parto foi definido como dia pós-natal zero (D0) (Figura 9). Após o nascimento, os filhotes foram contados, pesados e avaliados quanto à presença de malformações e/ou anomalias externas. Após 21 dias, foi realizada a padronização das ninhadas em números e sexo (2 machos e 2 fêmeas), e os filhotes de cada ninhada foram identificados nas patas para acompanhamento do desenvolvimento pós-natal. A padronização das ninhadas teve como objetivo evitar que o tamanho das mesmas interferisse no desenvolvimento dos filhotes. As ratas com menos de 4 filhotes não foram descartadas.

Figura 9: Imagem ilustrativa de uma ninhada no dia pós-natal 0 (D0).

4.6- Avaliação do desenvolvimento físico

Após o nascimento as ninhadas foram avaliadas quanto ao desenvolvimento físico através de observações diretas, sendo anotado para cada filhote o dia em que ocorreu cada parâmetro:

- Peso da ninhada: Analisou-se o peso da ninhada no 1º e 7º dias após o nascimento.

- Peso individual: Foi feito o acompanhamento do ganho de peso de cada filhote individualmente toda semana do 14° dia ao 5 1° dias pós-natal.

- Desdobramento das orelhas: Foi verificado o dia da ocorrência do deslocamento da parte superior das orelhas a partir do 1° dia de vida pós-natal. Este parâmetro ocorre provavelmente entre o 2° e o 5° di a de vida pós-natal.

do animal, afastando-se os lábios, expondo-se a gengiva e verificando a presença de dentes.

- Abertura de olhos: Foi considerado como abertura dos olhos o dia no qual o animal apresentou uma fissura longitudinal nas pálpebras dos 2 globos oculares. A observação deste parâmetro foi iniciada no 11° dia de vida pós-natal, sendo que a abertura dos olhos surge por volta do 12° ao 15° di a de vida pós-natal dos filhotes.

- Descida dos testículos: Foi observado o dia em que os 2 testículos puderam ser apalpados na bolsa escrotal. Esta observação foi feita a partir do 15° dia de vida pós-natal.

- Abertura do canal vaginal: Essa observação foi realizada a partir do 30° dia de vida pós-natal, até ser constatada a presença do orifício na região genital das fêmeas.

4.7- Avaliação do desenvolvimento reflexológico (ou sensório-motor)

Foram realizados testes até que todos os filhotes de cada ninhada apresentassem os reflexos. Nos casos negativos, os testes foram repetidos nos dias subsequentes até a ocorrência do reflexo analisado. A duração de cada observação foi de 15 segundos para cada filhote, exceto para o teste de equilíbrio de borda, no qual o animal teve 60 segundos para completá-lo.

Nos primeiros 14 dias de experimento, os filhotes foram mantidos aquecidos durante os testes para evitar hipotermia, pois nessa fase os filhotes têm dificuldade de

manter a temperatura corporal (Kempinas, 2001).

- Reflexo postural: O animal foi colocado em decúbito dorsal, sobre uma superfície lisa, verificando-se a ocorrência ou não da resposta de girar o corpo para a posição de decúbito ventral, com as 4 patas apoiadas na superfície.

- Reflexo de esquiva ao abismo: O animal foi colocado com as patas dianteiras tocando a borda da bancada, verificando-se a ocorrência ou não de resposta reflexa de afastamento da borda do abismo.

- Geotaxia negativa: O animal foi colocado com a cabeça para baixo em uma plataforma a 25° e verificou-se a ocorrência de reo rientação, ou seja, quando o animal conseguiu virar o corpo em 180°.

- Reflexo postural em queda livre: O filhote foi solto a partir de uma altura de 35 cm em decúbito dorsal sobre uma superfície macia. Foi observada a presença ou ausência da resposta do animal de virar-se durante a queda para cair em decúbito ventral na superfície.

- Reflexo de sobressalto auditivo: O animal foi colocado próximo a um objeto capaz de emitir estalos altos. Foi observado o reflexo ou não de sobressalto do animal ao estalo emitido.

- Teste do equilíbrio em borda: O animal foi colocado sobre a borda de um béquer de 2 litros localizado de frente para uma plataforma. Foi observado o primeiro dia em que o animal atingiu a plataforma e a latência em segundos para fazê-lo.

4.8- Avaliação do comportamento sexual da prole

dorso flexão, elevação da região pélvica e deflexão da cauda para o lado para melhor acesso do macho a vagina.

As medidas comuns do comportamento sexual do macho são: número de

montas necessárias para alcançar a intromissão, número de intromissões necessárias para chegar à ejaculação e o intervalo entre a ejaculação e o reinício da monta seguinte. A medida mais comum de comportamento sexual da fêmea é o quociente de lordose (proporção de montas que provocam lordose) (Figura 10).

O comportamento sexual é registrado sob uma luz difusa vermelha indetectável ao rato albino, o que permite ao pesquisador observar claramente o comportamento.

Todos os testes foram realizados durante o período escuro (a partir das 19:00 horas)

do ciclo claro-escuro. As análises foram feitas dentro de um cilindro de acrílico (45 cm de diâmetro e 50 cm de altura), com serragem para forração.

4.8.1- Comportamento sexual das fêmeas

Avaliou-se a latência da primeira lordose e o número de lordoses apresentadas

pelas fêmeas durante 20 minutos de observação. Analisou-se também a presença ou não de receptividade e proceptividade. A receptividade é caracterizada pela aceitação da cópula e determinada pelo quociente de lordose [LQ= (número de lordoses /10 montas x 100)]. A proceptividade é representada pelo interesse ao macho, sinalizando disposição para o ato sexual através de comportamentos como saltar, tremer as orelhas e correr. Para realização dos testes, as ratas foram colocadas na presença de machos sexualmente experientes dentro dos cilindros de acrílico.

4.8.2- Comportamento sexual dos machos

Os machos foram avaliados usando-se uma fêmea receptiva artificialmente

Os seguintes parâmetros do CS foram avaliados:

• Latência de monta (LM) e de intromissão (LI): consiste no tempo (medido em

segundos) que cada animal demora a atingir a primeira monta ou primeira intromissão de cada série copulatória.

• Latência de ejaculação (LE): corresponde ao tempo (em segundos) entre a

primeira intromissão até a ejaculação. Para os animais que não ejacularam foi determinada a latência máxima de avaliação (30 minutos);

• Número de montas (NM) e de intromissões (NI): consiste no número de eventos

que ocorreu durante cada série copulatória;

• Número total de montas (NTM) e de intromissões (NTI): corresponde ao número

total de montas e intromissões que apresenta cada rato no período total de 30 minutos de avaliação;

• Número total de ejaculações (NTE):corresponde ao número total de ejaculações

no período de 30 minutos.

4.9- Grupos experimentais

Os filhotes foram distribuídos no seguintes grupos experimentais:

- Fêmeas CTRL (n=21) e Machos CTRL (n=28): Filhotes de ratas que tiveram padrão normal de sono durante a gestação.

- Fêmeas RS (n=21) e Machos RS (n=25): Filhotes de ratas que foram restritas de sono durante a gestação.

4.10- Delineamento experimental

Inicialmente, esfregaços vaginais periódicos foram realizados nas fêmeas. Determinado o dia da fase receptiva, foi feito o acasalamento com ratos machos adultos sexualmente experientes. Após a confirmação da prenhez, padronizou-se o dia G0 como sendo o primeiro dia de prenhez. Durante os 21 dias de gestação, as ratas foram mantidas no tanque de restrição de sono das 16:00 às 10:00 horas.

O dia do nascimento dos filhotes foi padronizado como dia D0. Os filhotes foram pesados ao nascer e a cada 7 dias até a fase adulta, afim de acompanhar a evolução do peso corporal. No dia D21 foi feito o desmame e os filhotes foram distribuídos nos grupos experimentais propostos, considerando-se como unidade a mãe. Os procedimentos de avaliação sensório-motora foram realizados conforme descrito anteriormente. A partir do dia D90, período em que os filhotes já se encontram na fase adulta reprodutiva, os testes de comportamento sexual foram realizados.

4.11- Dosagens hormonais

Ao final de cada teste de comportamento sexual, os animais foram imediatamente eutanasiados pelo método da decapitação para coleta de sangue e posterior análise das concentrações de testosterona e progesterona. Saliente-se que esse procedimento requer muita experiência e destreza para imobilizar o animal corretamente e precisão no manejo da guilhotina. Deste modo, somente uma pessoa realizou a decapitação no decorrer dos experimentos. Os animais foram eutanasiados numa sala adjacente, minimizando o desconforto animal e evitando-se possíveis interferências nas dosagens hormonais e bioquímicas, como ocorre na eutanásia por dose excessiva de anestésicos.

O sangue foi recolhido em tubos de acrílico sem anticoagulante (soro) para a determinação das concentrações de testosterona e progesterona. Após a coleta, os tubos foram centrifugados a 3.500 rpm por 10 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi pipetado e armazenado em tubos menores a -80°C até a realização dos ensaios. A determinação da concentração de testosterona foi realizada por meio de ensaio de quimioluminescência imunométrica (Advia Centauro) e a de progesterona pelo método imunocompetitivo (Advia Centauro).

4.12- Análise estatística

Inicialmente os dados foram testados quanto à normalidade e à homogeneidade. Em seguida, para avaliação do desenvolvimento sensório-motor e CS masculino, foi utilizado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney. No CS feminino, a latência foi analisada por ANOVA de uma via e o teste de Fisher foi usado para porcentagens (receptividade e proceptividade). A avaliação hormonal foi feita por ANOVA e após isso,

RESULTADOS

5.1- Número de filhotes

O teste de Mann-Whitney demonstrou que, em relação ao número total de

filhotes por rata-mãe, não houve diferenças significativas na quantidade de descendentes, comparando-se os filhotes dos grupos CTRL e RS. Em análise feita por gênero, também não houve diferença significativa entre os grupos (Figuras 12, 13 e 14).

Figura 12: Número total de filhotes provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

Figura 13: Média da quantidade de fêmeas provenientes de mães que tiveram padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

Figura 14: Média da quantidade de machos provenientes de mães que tiveram padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

5.2- Desenvolvimento físico e reflexológico

De modo geral, não houve diferenças significativas no desenvolvimento físico e

reflexológico comparando-se os descentes dos grupos CTRL e RS (Figuras 15 a 40). O peso da ninhada foi feito no 1° e 7° dias pós-nat al para obtenção do peso médio dos filhotes. Esse parâmetro não apresentou diferença significativa entre os grupos CTRL e RS (Figuras 15 e 16). A partir do 14° dia pós-nat al, no entanto, os filhotes foram pesados individualmente. Também não houve efeito grupo evidente (Figuras 17 e 18).

Em relação aos parâmetros físicos, o tempo para o desdobramento das orelhas

Figura 15: Peso da ninhada no 1° dia pós-natal proveniente de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

Figura 16: Peso da ninhada no 7° dia pós-natal proveniente de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

Figura 17: Evolução do peso corporal dos machos provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

0 10 20 30 40 50 60 70 CTRL RS Pe so d a ni nh ad a 1° di a 0 20 40 60 80 100 120 140 CTRL RS P es o da n inha da 7 °di a 0 50 100 150 200 250

14 21 28 35 42 51

P es o d o s m ac h o s (g ) RS CTRL 0 50 100 150 200 250

14 21 28 35 42 51

Figura 18: Evolução do peso corporal das fêmeas provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

Figura 19: Tempo para ocorrência da resposta de girar o corpo para a posição de decúbito ventral observado entre os machos provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

Figura 20: Tempo para ocorrência da resposta de girar o corpo para a posição de decúbito ventral observado entre as fêmeas provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

14 21 28 35 42 51

P es o d as f êm ea s (g ) RS CTRL 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

14 21 28 35 42 51

Figura 21: Tempo para ocorrência da resposta de girar o corpo em 180° em uma plataforma com inclinação de 25° observado entre os machos proveni entes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

Figura 22: Tempo para ocorrência da resposta de girar o corpo em 180° em uma plataforma com inclinação de 25° observado entre as fêmeas proveni entes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

Figura 24: Tempo para ocorrência da resposta reflexa de afastamento da borda do abismo observado entre as fêmeas provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

Figura 25: Tempo no qual o animal cessou a resposta de agarrar o objeto observado entre os machos provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período. CTRL e RS.

Figura 27: Tempo para o aparecimento dos dentes incisivos, analisado a partir do 6° dia de vida entre os machos provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

Figura 28: Tempo para o aparecimento dos dentes incisivos, analisado a partir do 6° dia de vida entre as fêmeas provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

Figura 30: Tempo para ocorrência do deslocamento da parte superior das orelhas, analisado desde o 1° dia pós-natal entre as fêmeas provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período. * Difere significativamente do grupo CTRL (p<0,03).

Figura 31: Tempo para o aparecimento de fissura longitudinal nas pálpebras dos 2 globos oculares nos machos provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período. * Difere significativamente do grupo CTRL (p<0,004).

Figura 33: Tempo para a ocorrência do reflexo ao barulho emitido pela queda de um objeto observado entre os machos provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período. * Difere significativamente do grupo CTRL (p<0,03).

Figura 34: Tempo para a ocorrência do reflexo ao barulho emitido pela queda de um objeto observado entre as fêmeas provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período. * Diferente significativamente do grupo CTRL (p<0,02)

Figura 36: Tempo para a ocorrência da resposta de virar-se durante a queda para cair em decúbito ventral observado entre as fêmeas provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

Figura 37: Tempo para o animal atingir a plataforma de frente ao béquer no qual foi colocado na borda verificado entre os machos provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

Figura 39: Tempo para que fosse constatada a presença do orifício na região vaginal, analisado a partir do 30° dia pós-natal entre as fêmeas provenientes d e mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

Figura 40: Tempo para que os 2 testículos pudessem ser apalpados na bolsa escrotal, analisado a partir do 15° dia pós-natal entre os machos provenientes d e mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

5.3- Perfil hormonal

O teste t-Student seguido pelo post-hoc de Duncan revelou um aumento

concentração de testosterona nos machos, no entanto, houve uma tendência à diminuição desse hormônio no grupo RS (Figura 44).

Figura 41: Concentração de testosterona nas descendentes fêmeas provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período * Difere significativamente do grupo CTRL.

Figura 42: Concentração de progesterona nas descendentes fêmeas provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período. * Difere significativamente do grupo CTRL.

Figura 43: Concentração de progesterona nos descendentes machos provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período. * Difere significativamente do grupo CTRL.

1120 1140 1160 1180 1200 1220 1240 CTRL RS

T

e

st

o

st

e

ro

n

a

(n

g

/d

L)

Figura 44: Concentração de testosterona nos descendentes machos provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período. Observa-se uma tendência à diminuição de testosterona no grupo RS.

5.4- Comportamento sexual dos descendentes machos

Os dados analisados pelo teste de Mann-Whitney demonstram que os animais

provenientes de mães que foram restritas de sono (RS) durante a gravidez apresentaram um aumento significativo na latência para a primeira monta (p<0,008) (Figura 45), assim como uma diminuição na quantidade de montas na primeira série ejaculatória (p<0,03) (Figura 46) e na quantidade total de montas durante os 30 minutos de avaliação (p<0,01) (Figura 47). Esse resultado representa um comprometimento na motivação sexual. Quanto aos outros parâmetros do comportamento sexual: latência de intromissão (Figura 47), quantidade de intromissões (Figuras 48 e 49), latência de ejaculação (Figura 50) e número total de ejaculações (Figura 51), nenhuma diferença significativa foi observada, indicando que não houve comprometimento do desempenho sexual.

Figura 45: Latência para a primeira monta em uma série ejaculatória observada entre os machos provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período. * Difere significativamente do grupo CTRL.

Figura 46: Número de montas na primeira série ejaculatória observado entre os machos provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período. * Difere significativamente do grupo CTRL.

Figura 47: Número total de montas durante observado entre os machos provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período. * Difere significativamente do grupo CTRL.

0 100 200 300 400 500 600 CTRL RS

La

tê

n

ci

a

i

n

tr

o

m

is

sã

o

(s

e

c)

Figura 48: Latência para a primeira intromissão em uma série ejaculatória observada entre os machos provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

0 2 4 6 8 10 12 CTRL RS

N

ú

m

e

ro

d

e

i

n

tr

o

m

is

sõ

e

s

11,1 11,2 11,2 11,3 11,3 11,4 11,4 11,5 11,5 11,6 11,6 CTRL RS N ú m e ro t o ta l d e i n tr o m is sõ e s CTRL RS

Figura 50: Número total de intromissões observado entre os machos provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

1350 1400 1450 1500 1550 1600 CTRL RS

La

tê

n

ci

a

e

ja

cu

la

çã

o

(s

e

c)

Figura 51: Latência para a primeira ejaculação observada entre os machos provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 CTRL RS N ú m e ro t o ta l d e e ja cu la çõ e s CTRL RS

Figura 52: Número total de ejaculações observado entre os machos os provenientes de mães com padrão de sono normal (CTRL) durante a gestação e de mães restritas de sono (RS) durante esse período.

5.5- Comportamento sexual das descendentes fêmeas

Os dados analisados pelo teste de Mann-Whitney e teste de Fisher, quando

latência para lordose entre as fêmeas RS durante a fase diestro, indicando maior

motivação sexual (Figura 55).

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Diestro Proestro Estro

R

e

ce

p

ti

v

id

a

d

e

(%

)

Figura 53: Porcentagem de fêmeas que apresentaram receptividade nas diferentes fases do ciclo estral. CTRL: fêmeas provenientes de mães que tiveram padrão de sono durante a gestação. RS: fêmeas provenientes de mães restritas de sono durante a prenhez.

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Diestro Proestro Estro

P

ro

ce

p

ti

v

id

a

d

e

(

%

)

Figura 54: Porcentagem de fêmeas que apresentaram proceptividade nas diferentes fases do ciclo estral. CTRL: fêmeas provenientes de mães que tiveram padrão de sono durante a gestação. RS: fêmeas provenientes de mães restritas de sono durante a prenhez.

Figura 55: Latência para ocorrência da primeira lordose nas diferentes fases do ciclo estral. CTRL: fêmeas provenientes de mães que tiveram padrão de sono durante a gestação. RS: fêmeas provenientes de mães restritas de sono durante a prenhez. * Difere significativamente do grupo CTRL.

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Diestro Proestro Estro

La tê n ci a ( se c) CTRL RS

*

Diestro Proestro Estro

DISCUSSÃO

e nos avanços tecnológicos, fornecendo informações relevantes para o mundo da Ciência e para a vida dos seres humanos e dos animais. Embora o estudo básico experimental em animais apresente algumas limitações quanto à sua aplicabilidade clínica, é ainda o melhor análogo para se estudar as condições encontradas em humanos (Stables et al, 2003).

Nesse contexto, torna-se de grande importância a adoção de modelos animais em experimentos, por exemplo, de restrição de sono, considerado um problema de saúde pública na sociedade atual (Sigurdson e Ayas, 2007; Alghanim et al, 2008; Tufik et al, 2009). Desta forma, torna-se relevante avaliar as consequências de diversos fatores que possam afetar o sono através do uso de modelos animais e sua validação, permitindo também a realização de avaliações bioquímicas, farmacológicas, neuronatômicas, comportamentais, entre outras associadas à supressão do sono.

O uso de ratos no estudo de neuroendocrinologia comportamental também é

bastante difundido. Isso se deve principalmente ao padrão de comportamento desses animais, incluindo o ato sexual, caracterizado por comportamentos estereotipados que são facilmente identificáveis e facilmente manipulados por hormônios. Existem inúmeros estudos que demonstram a influência dos fatores hormonais que determinam a expressão global da atividade copulatória, de modo que as alterações nas

concentrações hormonais circulantes podem acarretar mudanças neste

comportamento.

O sono inadequado é um problema presente na população como um todo.

al, 2001; Ohayon e Lemoine, 2004; Bittencourt et al, 2009). Considerando que, se a falta de sono afeta principalmente as mulheres, inevitavelmente afetará o período gestacional, o presente projeto se propôs a avaliar as consequências da restrição crônica de sono durante a gravidez para o desenvolvimento da prole.

Nossos experimentos demonstraram que a falta de sono durante a gravidez

pode prejudicar não só o comportamento sexual dos descendentes na vida adulta, mas também alguns parâmetros do desenvolvimento físico e sensório-motor. Neste último, critérios de avaliação do desenvolvimento físico do infante, como o tempo para abertura dos olhos e o tempo para ocorrência do desdobramento das orelhas, foram significativamente aumentados nos filhotes de mães que foram restritas de sono durante a gestação. Além disso, o reflexo de sobressalto auditivo, parâmetro de avaliação do desenvolvimento sensório-motor, também se mostrou significativamente prejudicado nos animais provenientes de mães RS.

A avaliação do comportamento sexual dos filhotes também apresentou

diferenças significativas entre os grupos CTRL e RS. Nos descendentes machos de ratas restritas de sono durante a prenhez, houve significativa diminuição da motivação sexual, evidenciada pelo aumento na latência para primeira monta e diminuição na quantidade de montas feitas por esses animais durante o teste experimental. Esses resultados provavelmente ocorreram devido à significativa diminuição de progesterona que esses mesmos animais apresentaram.

É bem documentado que a função sexual é modulada por hormônios

feminina. No entanto, pouca atenção tem sido dirigida para o seu possível papel na função do CS masculino. Nosso grupo de pesquisa tem proposto que a progesterona pode ser um fator hormonal relevante para promover uma boa resposta sexual masculina (Andersen e Tufik, 2006; Alvarenga et al, 2010). Em ratos machos castrados, foi relatado que a suplementação de progesterona poderia iniciar um vasto conjunto de CS, mesmo na ausência de outros esteróides sexuais (Witt et al, 1995; Andersen et al, 2004). Em estudo feito por nosso grupo, o pré-tratamento com mifepristona, antagonista do receptor de progesterona, reduziu significativamente o percentual de ratos que apresentaram ereções (Andersen e Tufik, 2005). Assim, pode-se dizer que a progesterona também depode-sempenha um papel no comportamento copulatório de ratos machos.

Em relação ao comportamento de cópula, nosso grupo também mostrou que a

progesterona está envolvida nos mecanismos de ejaculação em ratos privados de sono, uma vez que os ratos que apresentaram frequência de ejaculação normal tinham maiores concentrações de progesterona (Alvarenga et al, 2009, 2010). Há indícios da necessidade de uma concentração ideal de progesterona para que os animais apresentem alta atividade copulatória. Desta forma, pode-se dizer que evidências têm apontado que o bom desempenho sexual é acompanhado por altos níveis de progesterona, podendo ser considerada um fator limitante para a promoção da motivação sexual em ratos machos.

Apesar da diminuição da motivação sexual dos descendentes machos de mães

A análise do comportamento sexual das fêmeas também apresentou resultados interessantes. De forma geral, não houve diferenças significativas na receptividade, proceptividade ou latência de lordose entre as descendentes dos grupos CTRL e RS. Entretanto, as fêmeas do grupo RS apresentaram uma exacerbação do comportamento sexual, caracterizada por diversas montas realizadas nos machos indiscriminadamente durante todos os testes. Essa inesperada exacerbação do comportamento sexual feminino possivelmente se deve ao aumento significativo da concentração de testosterona no grupo RS, hormônio que influencia diretamente a motivação sexual.

Além disso, a maioria das fêmeas do grupo RS, exceto durante a fase proestro

do ciclo estral, apresentaram comportamentos agressivos durante o teste de comportamento sexual, tais como gritos e patadas quando o macho se aproximava.