Avaliação da Saccharomyces cerevisiae como agente ligante na técnica de difusão em filmes finos por gradiente de concentração (DGT) para a determinação de metilmercúrio

CARLOS EDUARDO EISMANN

AVALIAÇÃO DA

Saccharomyces

cerevisiae

COMO AGENTE LIGANTE NA TÉCNICA DE

DIFUSÃO EM FILMES FINOS POR

GRADIENTE DE CONCENTRAÇÃO (DGT)

PARA A DETERMINAÇÃO DE

METILMERCÚRIO

Rio Claro 2015

CARLOS EDUARDO EISMANN

AVALIAÇÃO DA

Saccharomyces

cerevisiae COMO AGENTE

LIGANTE NA TÉCNICA DE DIFUSÃO EM FILMES FINOS POR

GRADIENTE DE CONCENTRAÇÃO (DGT) PARA A

DETERMINAÇÃO DE METILMERCÚRIO

Orientador: Amauri Antonio Menegário

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Câmpus de Rio Claro, para obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas

concentração (DGT) para a determinação de metilmercúrio / Carlos Eduardo Eismann. - Rio Claro, 2015

43 f. : il., figs., gráfs., tabs., fots., mapas

Trabalho de conclusão de curso (bacharelado - Ciências Biológicas) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro

Orientador: Amauri Antonio Menegário

1. Fungos. 2. Amostradores passivos. 3. Levedura. 4. AFS. I. Título.

AVALIAÇÃO DA Saccharomyces cerevisiae COMO AGENTE LIGANTE NA TÉCNICA DE DIFUSÃO EM FILMES FINOS POR GRADIENTES DE

CONCENTRAÇÃO (DGT) PARA A DETERMINAÇÃO DE METILMERCÚRIO

RESUMO

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Fundidor ... 19

Figura 2 - Discos de levedura ... 20

Figura 3 - Dispositivos do DGT ... 23

Figura 4 - Imersão dos dispositivos ... 24

Figura 5 - Curva de imersão 48h (MeHg 100 µg L-1_{; pH 5,5; FI 0,05 mol L}-1_{) ... 29}

Figura 6 - Curva de Imersão 6h (MeHg 100 µg L-1_{; pH 5,5; FI 0,05 mol L}-1_{) ... 29}

Figura 7 - Efeito dos diferentes pH testados na capacidade de ligação da S. cerevisiae (MeHg = 100 µg L-1; força iônica = 0,05 mol L-1 NaCl) ... 32

Figura 8 – Efeito das diferentes forças iônicas testadas na capacidade de ligação da S. cerevisiae (MeHg = 100µg L-1. pH = 5,0) ... 33

LISTA DE TABELAS

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ... 6

2. REVISÃO DA LITERATURA ... 8

2.1. Mercúrio inorgânico e DGT ... 8

2.2. Metilmercúrio e DGT ... 11

2.3. Especiação de Hg usando AFS ... 13

3. OBJETIVOS ... 16

4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 16

4.1. Equipamentos e acessórios ... 16

4.2. Reagentes e soluções ... 17

4.3. Princípios da técnica DGT ... 21

4.4. Procedimento de eluição ... 22

4.5. Pré tratamento das amostras ... 22

4.6. Montagem dos dispositivos DGT ... 23

4.7. Imersão de 48h ... 23

4.8. Cálculo do coeficiente de difusão. ... 24

4.9. Efeito da Força Iônica na capacidade de ligação da S. cerevisiae Efetivo... 25

4.10. Efeito do pH na capacidade de ligação da S. cerevisiae ... 25

4.11. Teste de Interferentes ... 26

4.12. Teste de Especiação ... 26

4.13. Determinação de MeHg por CV-AFS ... 27

4.14. Condições de operação do CV-AFS ... 28

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 28

5.1. Curvas de Imersão ... 28

5.2. Coeficiente de Difusão S. cerevisiae ... 30

5.4. Teste de interferentes ... 33

5.5. Testes de Especiação ... 34

6. CONCLUSÃO ... 35

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

O mercúrio é um metal conhecido pela sua toxicidade, sendo considerado como de grande preocupação, uma vez que a constante entrada deste metal no meio ambiente e a ocupação populacional têm colocado continuamente pessoas em risco de contaminação (HORVAT, 2001).

Calcula-se que apenas um terço do mercúrio presente no meio ambiente seja proveniente da natureza (principalmente erupções vulcânicas), sendo aproximadamente dois terços originários de atividades antrópicas (USEPA, 1997). Dentre as várias formas em que o mercúrio chega ao meio ambiente, a mineração tem papel de destaque, onde o mercúrio aparece como subproduto da refinação de metais como cobre, ouro, chumbo e zinco. Em países como Colômbia, Venezuela e Brasil, onde a mineração é muito comum, inúmeros casos de contaminação por mercúrio são conhecidos (WEINBERG, 2010).

No ambiente aquático, o mercúrio é transformado em metilmercúrio (MeHg) de maneira biótica principalmente através de bactérias sulfato redutoras, podendo ocorrer também metilação abiótica em ambientes ricos em matéria orgânica. Esta metilação pode acontecer tanto a partir do mercúrio inorgânico quanto do mercúrio metálico, evidenciando a participação da atividade garimpeira na formação do metilmercúrio (BISNOTI e JARDIM, 2004). O MeHg é altamente solúvel e é rapidamente absorvido pelos organismos por difusão, ligando-se a proteínas de forma relativamente estável. A taxa de eliminação do composto pelos organismos é, portanto, muito baixa e por este motivo o MeHg acaba sendo bioacumulado nos organismos e biomagnificado ao percorrer os diferentes níveis da cadeia trófica aquática quando um organismo é consumido por outro (HORVAT, 2001). Através do consumo de peixes, mariscos e outros animais aquáticos o MeHg chega até o ser humano, onde é rapidamente absorvido através do intestino, de onde passa rapidamente a corrente sanguínea, onde será transportado para todo o corpo, causando inúmeros efeitos adversos em órgãos como o cérebro, coração, rins, entre outros (WEINBERG, 2010).

e 1960 onde a causa de centenas de mortes foi relacionada a esse composto (HORVAT, 2001; WEINBERG, 2010; BISINOTI e JARDIM, 2004).

O MeHg é, portanto, a forma do mercúrio mais danosa para a biota e diante deste fato, faz-se necessária a quantificação de forma específica e eficiente do metilmercúrio para que decisões mais eficientes na forma de lidar com a presença desta forma do metal no ambiente possam ser tomadas.

Nesse sentido a técnica de difusão em filmes finos por gradientes de concentração (DGT) (DAVISON e ZHANG, 1994), que já vem sendo utilizada para medir concentrações de diferentes metais e suas espécies em águas, solos e sedimentos aparece como uma possibilidade satisfatória para tal perspectiva. A DGT apresenta uma série de vantagens em comparação com outras técnicas analíticas como capacidade de amostragem in situ, pré-concentração das espécies de interesse, amostragem integrada durante o tempo (DAHLQVIST et al, 2002; GILLAN et al, 2012; LI et al, 2007).

O dispositivo DGT convencional consiste principalmente de duas camadas. Uma camada de ligante, convencionalmente a resina Chelex-100 imobilizada em um gel de poliacrilamida (acrilamida (15%) e agarose (0,3 %)). Sobre esta, uma camada permeável, com porosidade controlada, chamada de difusivo, sendo também, convencionalmente, um gel de poliacrilamida. As duas camadas são fixadas a um pistão de polipropileno com um anel tendo uma abertura de 20 mm de diâmetro, onde ocorre a difusão dos analitos da solução para o interior do da camada mais interna. Um filtro, geralmente de nitrato ou acetato de celulose é colocado sobre as camadas de géis ligante e difuso, com função de proteger os géis de possíveis danos ao longo da imersão (ZHANG & DAVISON, 1995). A especiação dos metais depende das propriedades da fase ligante (ligação seletiva de espécies diferentes) e da camada difusiva (LI et al, 2007).

O presente trabalho pretende utilizar a técnica de DGT, propondo, porém, outro material como agente ligante, sendo este a levedura Saccharomyces

cerevisiae.

A S. cerevisiae é um substrato biológico interessante, já tendo sido avaliado

seu potencial para especiação e concentração de vários metais (BAG et al, 1998; BAG, 1999; MAQUIEIRA, 1994; BISCARO et al, 2007), além disso, é um material barato e encontrado facilmente e em grandes quantidades na sua forma desidratada nos comércios locais (MENEGÁRIO et al, 2010). Seu uso já foi testado com sucesso anteriormente para a determinação seletiva de espécies de MeHg na presença de Hg2+ _{(MADRID et al, 1995). Estudos preliminares realizados nos laboratórios do} Centro de Estudos Ambientais da UNESP - Rio Claro utilizando Saccharomyces

cerevisiae imobilizada em agarose mostraram a potencialidade de sua utilização

como agente ligante na técnica DGT para a determinação de Cd(II) e Pb(II) (MENEGÁRIO et al, 2010; MADRID et al, 1995; PESCIM et al, 2012). Deste modo, considerando a capacidade da Saccharomyces cerevisiae para reter as espécies químicas descritas acima, pode-se considerar que a possibilidade da ampliação do uso da levedura imobilizada em agarose.

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Mercúrio inorgânico e DGT

Divis et al (2010) avaliaram o desempenho quatro diferentes géis ligantes para determinação de mercúrio na técnica de DGT, as resinas Chelex 100, Duolite GT73, Lantosorb modificada, Sheron-Thiol, utilizando sempre a agarose como gel difusivo. A Duolite GT73 demonstrou melhor capacidade de sorção para o mercúrio, porém todas as resinas demonstraram capacidade de sorção para amostragem em longos períodos (semanas). Concentrações abaixo de 5 ng L-1 _{puderam ser medidas} em períodos de imersão 3 a 5 dias. A Duolite GT73 também foi considerada o melhor gel ligante entre os quatro testados, por permitir trabalhar em uma faixa mais larga de pH e boa capacidade para mensurar também o mercúrio ligado em complexos fortes. Todos os outros géis ligantes podem ser usados para medir o mercúrio em uma faixa de pH de 6 a 8 e, exceto a Spheron-Thiol, são capazes de reter apenas espécies lábeis de mercúrio.

Fernándes-Gómez et al (2011) compararam diferentes configurações dos dispositivos de DGT para determinação de mercúrio biodisponível em águas. O primeiro consistiu de Spheron-Thiol imobilizada em poliacrilamida como gel ligante e a agarose (0,76 mm de espessura) como gel difusivo (C-DGT); o segundo, a sílica gel funcionalizada com 3-mercatopropil como gel ligante e a agarose (0,5 mm de espessura) como gel difusivo (A-DGT); e a sílica gel funcionalizada com 3-mercatopropil como gel ligante e a poliacrilamida (0,4 mm de espessura) como gel difusivo (P-DGT). O estudo foi realizado em águas com e sem matéria orgânica dissolvida (MOD). Os três dispositivos se mostraram eficientes na água sem MOD, demonstrando a possibilidade de utilização da poliacrilamida como agente difusivo, uma vez que esta não compete com o gel ligante pela ligação com os íons de Hg2+_. Contanto, nas amostras com MOD a C-DGT não foi eficiente para retenção do analito. Dentre os dispositivos testados o P-DGT demonstrou maior linearidade com o tempo (R² = 0,983 e 0,989 com e sem MOD respectivamente) e menor limite de detecção.

Chelex 100 não demonstrou linearidade entre a retenção e o tempo enquanto as outras 4 resinas mostraram resultados positivos, não diferindo muito entre os valores (coeficiente de difusão em média 8.44 + 0.33×10−6 _cm2 _s−1_{. A SH-PMO mostrou-se} ligeiramente melhor (maior taxa de retenção) que as outras três, seguida por SQR, SH-SBA e SH-KG.

Zhou et al (2013) testaram um novo material ligante, baseado em sílica gel com grupos tióis funcionalizados para a técnica DGT, para a determinação de Hg em águas. Como agente difusivo os autores utilizaram uma camada híbrida de amido orgânico/sílica. O coeficiente de difusão obtido foi de 0,09x 10-6 _cm2 _s-1 _{e a} capacidade de retenção foi de 0,64 µg cm-2_{. Este valor para o coeficiente de difusão} está abaixo quando comparado a estudos semelhantes realizados anteriormente. O dispositivo proposto no estudo representa uma nova perspectiva para a técnica de DGT, porém, estudos mais detalhados em condições variadas são necessários para um melhor entendimento do método.

Szkandera et al (2014) utilizaram dióxido de titânio imobilizado em poliacrilamida como agente ligante para a determinação de diferentes espécies de mercúrio lábil em sistemas aquáticos. Os estudos demonstraram pouca influencia do pH e da força iônica sobre a eficiência dos dispositivos. Os estudos da influência da substância húmica mostraram interferências muito baixas quando comparadas com a resina Chelex-100 comumente utilizada. A aplicação do método em água do mar é limitada, uma vez que foi verificada grande influência de cloretos na retenção do Hg pelo ligante.

2.2. Metilmercúrio e DGT

Clarisse e Hintelmann (2006) já aplicaram com sucesso técnica de difusão em filmes finos por gradientes de concentração para determinação de MeHg em águas utilizando a sílica gel funcionalizada com 3-mercatopropil e a poliacrilamida como géis ligantes e difusivos, respectivamente. A quantificação foi feita por ICP-MS depois da derivatização de MeHg com borato de tetraetila e pré-concentração no adsorvente Tenax, seguido por separação cromatográfica. Os resultados demonstraram uma acumulação eficiente (>75%) em pH 3-9 ([NaCl] 0,01 mol L-1_{) e} um forte efeito de matriz causado pela presença de tiouréia. A tiouréia foi utilizada juntamente com o ácido hidroclorídrico para a eluição do analito, porém, este forma complexos muito estáveis com o metilmercúrio, interferindo na reação de etilação utilizada no procedimento analítico. Para analisar o potencial de interferência, foram realizados experimentos com diferentes concentrações de tiouréia para a eluição. Os resultados mostraram a concentração máxima de 1,3 mmol L-1 _{como ideal para} uma eficiente eluição com pouco efeito de matriz na determinação por ICP-MS.

Resultados positivos também foram obtidos na caracterização das espécies de mercúrio em solos através de HPLC-ICP-MS, utilizando agarose como gel difusivo e testando as resinas Chelex-100 e Spheron-Thiol como possíveis ligantes. Os estudos demonstraram recuperações melhores para a Spheron-Thiol (83-97%) em relação a Chelex-100 (50-58%), sendo assim os experimentos seguintes foram realizados utilizando-se apenas a Spheron-Thiol. A utilização da técnica de HPLC-ICP-MS demonstrou boa separação e sensibilidade para as espécies investigadas (Hg2+_{, CH3Hg}+ _{e CH3CH2Hg}+_{) (CATTANI et al, 2008).}

bons resultados demonstrando que o DGT é capaz de prever razoavelmente a absorção de MeHg pelo molusco, evidenciando a possibilidade da utilização do dispositivo como substituto para organismos sentinela (CLARISSE et al, 2012). Os três estudos utilizaram a sílica gel funcionalizada com 3-mercatopropil como gel ligante e a poliacrilamida como gel difusivo, quantificando o material por GC-ICP-MS. Gao et al (2014) utilizaram a sílica gel funcionalizada com 3-mercatopropil como gel ligante, substituindo a poliacrilamida como gel difusivo pelo gel de agarose, para a determinação de MeHg pelo DGT em águas. Os autores testaram dois processos para a extração do analito do gel ligante: Um utilizando a tiouréia como complexante e outro através de extração ácida A tiouréia demonstrou recuperações muito baixas, enquanto a extração ácida obteve recuperações do analito de 100%. Após a extração, seguiu-se a etilação do MeHg liberado, permitindo assim a sua determinação em concentrações muito baixas através de cromatografia gasosa com amostragem por headspace acoplado a AFS. O coeficiente de difusão obtido no experimento foi de 5,1 ± 0,20 x 10-6 _cm2 _s-1 _{e o dispositivo testado demonstrou pouca} influência das diferentes foças iônicas e pH.

mais baixos (6,87 ± 0,23 x 10-6 _cm2 _s-1 _{e 3,86 ± 0,19 x 10}-6 _cm2 _s-1 _{respectivamente)} (PELCOVA et al, 2014).

Fernández-Gómez et al (2014) estudaram uma resina funcionalizada com grupos tióis como agente ligante, comparando a agarose (A-DGT) e a poliacrilamida (P-DGT) como agentes difusivos para a determinação de MeHg. Os autores observaram diferenças significativas entre os valores do coeficiente de difusão (D) na presença e ausência de matéria orgânica dissolvida (MOD). Para o A-DGT, os valores de D obtidos na ausência e presença de MOD foram de 3,15 x 10-6 _{e 2,68 x} 10-6 _cm2 _s-1 _{respectivamente. Para o P-DGT, estes valores foram de 2,49 x 10}-6 _e 1,69 x 10-6 _cm2 _s-1_{. Os autores afirmam ainda que mesmo com um coeficiente de} difusão maior para a agarose na ausência e presença de MOD, a poliacrilamida parece ser uma escolha melhor para monitoramento de concentrações muito baixas em águas eutróficas.

2.3. Especiação de Hg usando AFS

Tabela 01 - Técnica para mercúrio em AFS

Sigla Técnica Referência

HG-CT-GC-AFS Hydride Generation Cryofocussing Gas

Chromatography Atomic Fluorescence Spectrometry STOICHEV et al, 2009

Eth-CT-GC-AFS Ethylation Cryofocussing Gas

Chromatography Atomic Fluorescence Spectrometry STOICHEV et al, 2009

FIA-GC-CV-AFS Flow Injection Analysis Gas Chromatography

Cold Vapor Atomic Fluorescence Spectrometry TSENG et al, 2004

CPE-HPLC-CV-AFS

Cloud Gas Extraction High Performance Liquid Chromatography Cold Vapor Atomic

Fluorescence Spectrometry

YU, 2005

HPLC-CV-AFS High Performance Liquid Chromatography

Cold Vapor Atomic Fluorescence Spectrometry LI et al, 2005

FIA-CE-AFS Flow Injection Analysis Capillary

Electrophoresis Atomic Fluorescence Spectrometry WANG et al, 2006

FIA-KR-CV-AFS

Flow Injection Analysis Capillary Knotted Reactor Cold Vapor Atomic Fluorescence

Spectrometry

WU et al, 2006

CR-PVG-AFS Coiled Reactor Photochemical Vapor

Generation Atomic Fluorescence Spectrometry GAO et al, 2010

MSC-CV-AFS Multisyringe Chromatography Cold Vapor

Atomic Fluorescence Spectrometry GUMÁN-MAR, 2011

ECV-AFS Eletrochemical Cold Vapor Atomic

Fluorescence Spectrometry ZHANG et al, 2012

MCV-AFS Microwave-enhanced Vold Vapor Atomic

Fluorescence Spectrometry WU et al, 2012

HPLC-CV-AFS High Performance Liquid Chromatography

Cold Vapor Atomic Fluorescence Spectrometry LENG et al, 2012

Tabela 02 - Especiação de Hg em AFS

Técnica LD Hg2+ _{LD MeHg LD EtHg Amostra Referência}

HG-CT-GC-AFS 0,13 ng L−1 _{0,01 ng L}−1 _{- Água.} STOICHEV

et al, 2004

Eth-CT-GC-AFS 0,22 ng L−1 _{0,2 ng L}−1 _{- Sedimento} STOICHEV

et al, 2004

FIA-GC-CV-AFS - 10 ng L−1 _- Sedimento e

água

TSENG et al, 2004

CPE-HPLC-P-CVAFS 2 ng L-1 9 ng L-1 4 ng L-1 Biológica YU, 2005

HPLC-CV-AFS 190 ng L−1 _{270 ng L}−1 _{260 ng L}−1 Frutos do

mar LI et al, 2005

FIA-CE-AFS 100000 ng L−1 _{200000 ng L}−1 _{- Água} WANG et al,

2006

FIA-KR-CV-AFS 3,6 ng L−1 _{2,0 ng L}−1 _- Biológicas e

Ambiental

WU et al, 2006

CR-PVG-AFS 4 - 8 ng L−1 _{4 – 8 ng L}−1 _{- Água} GAO et al,

2010

MSC-CV-AFS 110000 ng L−1 _{30000 ng L}−1 90000 ng

L−1

Biológica e Ambiental

GUMÁN-MAR et al,

2011

ECV-AFS 98 ng L−1 _{73 ng L}−1 _- Frutos do

mar

ZHANG et al, 2012

MCV-AFS 5 ng L−1 _{5 ng L}−1 _- Biológica e

geológica

WU et a, 2012

HPLC-CV-AFS 29 ng L−1 _{28 ng L}−1 _{57 ng L}−1 _Sedimento LENG et al,

2012

Hg = Mercúrio inorgânico MeHg = Metilmercúrio EtHg = Etilmercúrio

pré-concentração para atingir baixos limites de detecção, por exemplo, extração em ponto nuvem (YU et al, 2005).

Dentre os métodos não cromatográficos, com exceção da eletroforese capilar, que não apresentou limites de detecção satisfatórios para aplicações ambientais (WANG et al, 2006), os métodos propostos apresentaram bons limites de detecção (na faixa de ng L-1_).

3. OBJETIVOS

Desenvolver um método para determinar MeHg in situ em águas de rios usando a técnica de difusão em filmes finos por gradiente de concentração (DGT) baseado no uso da Saccharomyces cerevisiae imobilizada em agarose como agente ligante.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Equipamentos e acessórios

- Espectrômetro de fluorescência atômica- AFS (Millenium Merlin, PS Analytical, UK);

- Espectrômetro de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente (ICP OES) (ICap 6300, Thermo Scientific, UK);

- Sistema de purificação de água com resistividade final de 18,2 MΩ cm-1 (Milli-Q, Millipore, USA)

- Dispositivos de DGT de polipropileno (pistão e anel) (DGT Research Lda, UK)

- Agitador magnético (Fisatom – modelo 752, Brazil)

- Agitador com movimento orbital (PR70, Hoeter Pharmacia Biotech, USA) - Balança analítica (AG 200, Gehaka, Brazil).

-Vidrarias, acessórios de laboratório e equipamentos de uso rotineiro em laboratórios de química analítica, como, medidores de pH, micropipetas e termômetros.

4.2. Reagentes e soluções

Preparo da solução-estoque de MeHg 100 mg L-1

A preparação da solução de estoque de 100 mg L-1 _{de MeHg foi feita a partir} cloreto de metilmercúrio (Aldrich). Foram diluídas 0,0130 g do soluto com 20 mL de metanol, completando-se com água ultrapura até 100 mL, formando assim uma solução de 100 mg L-1 _{de MeHg em metanol 20% (v/v). A solução foi mantida} refrigerada e livre de luz, evitando assim a degradação do MeHg ( FERNÁNDEZ-GÓMEZ et al, 2011).

Preparo da solução de KBrO3 (0,0333 mol L-1)

A solução de brometo de potássio foi preparada semanalmente segundo procedimento descrito no manual PS Analytical (PS Analytical, 2002). Foram diluídos 1,39 g de KBrO3 (Merck) em 250 mL de água ultrapura.

Preparo da solução de KBr (0,2 mol L-1₎

A solução de bromato de potássio foi preparada mensalmente segundo procedimento descrito no manual PS Analytical (PS Analytical, 2002). Foram diluídos 5,95 g de KBr (Merck) em 250 mL de água ultrapura.

A solução brometo de potássio – bromato de potássio utilizada para a oxidação das diferentes espécies de mercúrio para Hg (II) foi preparada diariamente misturando-se partes iguais de KBr e KBrO3.

Preparo da OHNH3Cl (12%m/v)

A solução de hidroxilamina utilizada para a neutralização do excesso de KBr-KBrO3 foi preparada semanalmente segundo procedimento descrito no manual PS Analytical (PS Analytical, 2002). Foram diluídos 12 g de cloridrato de hidroxilamina (Mallinckrodt) em 100 mL de água ultrapura.

Preparo dos padrões de MeHg

Os padrões de metilmercúrio utilizados nas curvas analíticas foram preparados conforme procedimento descrito no manual PS Analytical. Foram preparados padrões de 0,25 - 0,5 – 1,0 – 2,0 – 4,0 – 5,0 – 10,0 mol L-1_{. Em frascos} de 50 mL adicionou-se os volumes de MeHg correspondentes às respectivas concentrações, em seguida foram adicionados 7,5 mL de HCl 33% (m/v) e 1 mL de KBr/KBrO3, completando-se o volume para 50 mL com água ultrapura. Os padrões são deixados para reagir durante 30 minutos. Após este período foram adicionados 30 µL de OHNH3Cl 12% (m/v) e as amostras são então levadas à leitura.

Preparo da solução de SnCl2 2%(m/v)

A solução de cloreto estanoso 2% (m/v) utilizada para a redução do Hg (II) na geração de vapor frio foi preparada segundo o método descrito no manual PS Analytical, 2002. Para o preparo de 500ml de SnCl2 2% foram diluídas 10 g de SnCl2 (Caledon)em 225 mL de HCl 33% (v/v). Em seguida a solução foi aquecida para que haja a completa dissolução do SnCl2, completando-se posteriormente até 500 mL com água ultrapura.

A solução do reagente branco utilizada na geração de vapor frio foi preparada segundo o método descrito no manual PS Analytical, 2002. Para o preparo de 1 L de reagente branco foi preparada uma solução com 150 mL de HCl 33% (m/v), 20 mL de solução KBr/KBrO3 e o restante do volume de água ultrapura. Esta solução foi deixada para reagir durante 30 minutos e após este período foram adicionados 600 µL de OHNH3Cl 12% (m/v)

Preparo dos discos de S. cerevisiae (agente ligante)

A preparação do gel de levedura foi realizada dissolvendo-se a agarose (Pharmacia Biotech AB) (0,9 g, 3% m/v) em 50 mL de água em banho-maria (80ºC) e adicionando-se S. cerevisiae desidratada (6 g, 20% m/v) sob agitação com bastão de vidro. Em seguida a suspensão foi transferida para o molde de vidro com espaçadores de 0,6mm (Figura 1) e mantida em repouso até atingir a temperatura ambiente. A lâmina de gel formada foi cortada na forma de discos de 25 mm de diâmetro e 1 mm de espessura (Figura 2). Os discos foram então lavados e preservados a 4ºC em água purificada até sua utilização.

Figura 2 - Discos de levedura

Preparo do gel de poliacrilamida (agente difusivo)

O gel de poliacrilamida é vendido comercialmente por DGT Research LTD sendo obtido em forma de lâminas de, com 0,8 mm de espessura. A partir da lâmina são cortados discos de 2,5 cm de diâmetro. Os discos são então armazenados em solução NaCl 0,05 mol L-1_{, por pelo menos 24h, podendo ser utilizados após este} período.

Preparo do nitrato de celulose (filtro)

O filtro de nitrato de celulose (Sartorius Stedim Biotech Ltda) utilizado no estudo é encontrado na forma de discos de 2,5 cm de diâmetro com porosidade de 0,45 µm e espessura entre 115-145 µm.

Após o processo de descontaminação os filtros foram acondicionados em solução de NaCl 0,05 mol L-1_.

4.3. Princípios da técnica DGT

Na técnica DGT (DAVISON e ZHANG, 1994), um dispositivo é imerso no sistema a ser monitorado (por exemplo, no mar ou em um rio) durante um intervalo de tempo definido. A quantidade dos íons acumulados é recuperada do dispositivo, determinada por uma técnica analítica apropriada e usada para quantificar as concentrações das espécies lábeis no sistema.

Espécies lábeis podem ser íons livres hidratados ou espécies (orgânicas ou inorgânicas) fracamente complexadas que podem se dissociar rapidamente. Para o avaliações ambientais e controle de contaminações o estudo da fração lábil dos metais se faz importante por estar diretamente relacionado a biodisponibilidade destes metais (ZHANG e DAVISON, 1995).

A técnica DGT se baseia na 1a _{lei de difusão de Fick. O fluxo (F) dos íons que} difundem da camada do gel difusivo para a resina é dado pela eq. 1:

g C C D

F  ( b  ')/ (1)

onde D é o coeficiente de difusão do gel, Cb é a concentração do íon lábil na

solução externa, C’ é a concentração do íon livre na resina e Δg é a espessura do gel difusivo. Se os íons estiverem em rápido equilíbrio com a resina e apresentarem uma forte ligação, a concentração C’ será zero, caso não ocorra a saturação da resina, assim temos a eq, 2:

g DC

F  _b / (2)

Sendo a definição de fluxo F M/At, onde M é a massa do íon, A a área da janela do dispositivo e t o tempo, podemos reescrever a eq. 2 :

g tA DC

Determina-se a massa M do íon e calcula-se a concentração Cbdo metal na

solução externa (solução onde dispositivo foi imerso) com a eq. 4:

DtA g M

C_b   / (4)

A massa do íon acumulada M no disco de gel com resina é obtida através da equação (5).

e bgel eluente

e V V f

C

M  (  )/ (5)

onde Ce é a concentração do íon determinada no eluído, Veluente é o volume

de eluente adicionado ao gel com resina, Vgel é o volume do gel com resina e feé o

fator de eluição para cada íon.

4.4. Procedimento de eluição

Após a retirada dos dispositivos de DGT das soluções, os dispositivos são desmontados, sendo o nitrato de celulose e a poliacrilamida descartados. Os discos de levedura foram então lavados e colocados, todos no mesmo momento, em tubos de 15ml contendo 5ml de HCl 1 mol L-1 _{e mantidos sob agitação durante 24h. Este} procedimento visa a recuperação de todos os íons retidos nos discos de levedura.

4.5. Pré tratamento das amostras

µL de OHNH3Cl. Após este procedimento, as amostras foram então levadas para a leitura por CV-AFS.

4.6. Montagem dos dispositivos DGT

Os dispositivos foram montados em capela de fluxo laminar, minimizando assim o risco de contaminação, colocando-se sobre o pistão de polipropileno (parte inferior do dispositivo) um disco de gel de levedura (agente ligante), sobre este um disco poliacrilamida (agente difusivo) e sobre ambos um filtro de acetato de celulose. Os discos foram fixados por uma luva de polipropileno (parte superior do dispositivo), com abertura de 20 mm de diâmetro, permitindo assim a difusão dos íons para dentro do dispositivo (Figura 3).

Figura 3 - Dispositivos do DGT

4.7. Imersão de 48h

Após o período de estabilização foram imersos 8 dispositivos DGTs montados conforme procedimento descrito anteriormente. Os dispositivos foram mantidos imersos durante 4, 12, 24 e 48h, retirando-se dois dispositivos em cada um dos tempos de imersão. Após a retirada, os DGTs foram desmontados, sendo o nitrato de celulose e a poliacrilamida descartados. Os discos de levedura são então lavados e colocados em tubos de 15 mL vazios para posterior eluição, 1 dispositivo por tubo.

Figura 4 - Imersão dos dispositivos

4.8. Cálculo do coeficiente de difusão.

O coeficiente de difusão foi calculado segundo a eq. (6) D = (a∆g).(CAS)-1 ₍₆₎

Onde D é coeficiente de difusão (cm2 _s-1_{); a é o coeficiente angular da reta} definida pela relação massa do íon retida por unidade de tempo (nq s-1_{); ∆g é a} espessura do agente difusivo (cm), CA é a concentração do metal livre ou lábil na

4.9. Efeito da Força Iônica na capacidade de ligação da S. cerevisiae

Efetivo

Para o experimento que visou avaliar a influência da força iônica foram preparadas 4 soluções de 2 L de MeHg 100 µg L-1 _{(pH 5,5 ajustado com HCl 0,1 mol} L-1 _{e NaOH 1,0 mol L}-1_{). As soluções foram preparadas com as seguintes forças} iônicas: 0,1 mol L-_{1 – 0,05 mol L}-1 _{– 0,005 mol L}-1 _{– 0,0005 mol L}-1_{. Para o ajuste das} forças iônicas das soluções de imersão foi utilizada solução de NaCl 2,0 mol L-1_{. A} solução foi mantida em constantemente sob agitação em incubadora a 23 ± 1 ºC (Figura 4) durante 24h para estabilização.

Após o período de estabilização, em cada uma das soluções foram imersos 3 dispositivos DGT preparados conforme procedimento descrito anteriormente, que ficaram imersos durante 6h, sendo todos retirados no final deste período. Após a retirada, os DGTs foram desmontados, sendo o nitrato de celulose e a poliacrilamida descartados. Os discos de levedura são então lavados e colocados em tubos de 15 mL vazios para posterior eluição, 1 dispositivo por tubo.

4.10. Efeito do pH na capacidade de ligação da S. cerevisiae

Para o experimento que visou avaliar a influência do pH foram preparadas 4 soluções de 2 L de MeHg 100 µg L-1 _{(Força iônica 0,05 mol L}-1 _{ajustada com NaCl} 2,0 mol L-1_{). As soluções foram preparadas com os seguintes pH: 3,5 – 5,0 – 6,5 –} 8,5. Para o ajuste do pH das soluções de imersão foram utilizadas soluções de HCl 1,0 mol L-1 _{e NaOH 0,1 mol L}-1_{. A solução foi mantida em constantemente sob} agitação em incubadora a 23 ± 1 ºC (Figura 4) durante 24h para estabilização.

descartados. Os discos de levedura são então lavados e colocados em tubos de 15 mL vazios para posterior eluição, 1 dispositivo por tubo.

4.11. Teste de Interferentes

Para avaliar a influência de interferentes na retenção de MeHg pela S.

cerevisiae foram conduzidas imersões dos dispositivos S. cerevisiae + poliacrilamida

em soluções de Mn, Cu, Zn, Fe, Pb e Cd. As imersões ocorreram durante 6h em soluções de 1L de MeHg 10 µg L-1 _{(pH = 5,0; Força Iônica = NaNO3 0,05 mol L-1)} com cada um dos elementos (Mn, Cu, Zn e Fe = 100 µg L-1_{; Pb Cd = 1000 µg L}-1_{). A} determinação da concentração dos interferentes foi feita por Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry (ICP-OES).

.

4.12. Teste de Especiação

Foram realizados três experimentos utilizando-se diferentes dispositivos na tentativa de obter a especiação do mercúrio.

No Teste 1 foram preparadas 3 soluções de 3 L cada: Hg2+ _{(30 µg L}-1 _de Hg2+_{), MeHg (30 µg L}-1 _{de MeHg) e Mistura (30 µg L}-1 _{de Hg}2+ _{+30 µg L}-1 _{de MeHg).} As soluções foram mantidas em incubadora a 23 ºC. O pH (5,0) e a força Iônica (0,05 mol L-1 _{NaCl) foram mantidos para as três soluções. Foram imersos três} dispositivos DGT montados com S. cerevisiae + poliacrilamida. Os dispositivos ficaram imersos por um período de 6 horas. Após este período os dispositivos foram retirados, desmontados e os ligantes seguiram então para o procedimento de eluição, conforme descrito no relatório anterior.

No Teste 3 os dispositivos foram imersos por 4h. Foram preparadas 3 soluções de 3 L cada: Hg2+ _{(75 µg L}-1 _{de Hg}2+_{), MeHg (75 µg L}-1 _{de MeHg) e Mistura} (75 µg L-1 _{de Hg}2+ _{+75 µg L}-1 _{de MeHg). As soluções foram mantidas em incubadora} a 23 ºC. O pH (6,5) e a força Iônica (0,05 mol L-1 _{NaNO3) foram mantidos para as} três soluções. Neste experimento foram imersos dois dispositivos DGT montados

com S. cerevisiae + poliacrilamida.

Nos experimentos com mercúrio, verifica-se uma grande diminuição da concentração do elemento no momento final da imersão em relação ao momento do preparo da solução devido à adsorção do elemento à superfície dos recipientes e dispositivos. Na tentativa de minimizar as dificuldades causadas por este efeito, todos os dispositivos (apenas pistão e capa, sem os discos) e suportes foram mantidos imersos nas suas respectivas soluções durante 24h. Após este período, os materiais são retirados das soluções, os dispositivos são montados e a imersão é realizada. Este procedimento minimiza as diferenças entre concentração do mercúrio no momento inicial e final da imersão dos dispositivos, permitindo-se assim, uma quantificação mais precisa do analito.

4.13. Determinação de MeHg por CV-AFS

. Para a determinação de MeHg foi utilizado o espectrômetro de fluorescência atômica equipado com detector de Hg Merlin. O gás de arraste e de secagem utilizado foi o argônio. Para a determinação do MeHg e do Hg2+ _{nos experimentos} conduzidos foi utilizado o espectrômetro de fluorescência atômica equipado com detector de Hg Merlin. O gás de arraste e de secagem utilizado foi o argônio.

A geração de vapor frio foi montada utilizando-se o cloreto estanoso (SnCl2) 2% m/v para a redução do Hg (II) e reagente branco preparado conforme procedimento descrito no manual PS Analytical (PS Analytical, 2002).

4.14. Condições de operação do CV-AFS

A Tabela 03 apresenta os principais parâmetros utilizados nas análises pelo CV-ICP-OES.

Tabela 03 - Condições de operação do CV-AFS

Condições de Operação CV-AFS

Vazão do gás de arraste (Ar) 0,3 L / min Vazão do gás de secagem (Ar) 2,5 L / min

Vazão do branco/amostra 5,6 mL / min

Vazão do redutor 2,8 mL / min

Ganho 10

Delay time 15 s

Analysis time 30 s

Memory time 20 s

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Curvas de Imersão

Figura 5 - Curva de imersão 48h (MeHg 100 µg L-1_{; pH 5,5; FI 0,05 mol L}-1₎

A retenção do analito foi significativa (média de 75,03 ng MeHg h-1_{) e} linearidade da relação M/C em função do tempo foi bastante alta (R2 _{= 0,9954 e} 0,9917 para as imersões longa e curta, respectivamente), evidenciando que o Mehg é quantitativamente retido pelos discos de S. cerevisiae imobilizada em agarose e confirmam a possibilidade de utilização do material proposto na técnica de DGT para a determinação de MeHg em sistemas aquáticos. Os valores dos coeficientes de difusão obtidos na imersão longa e curta foram de 8,08 ± 0,32 x 10-6 _cm2 _s-1 _{e 7,91 ±} 0,51 x 10-6 _cm2 _s-1 _{(23 ºC), respectivamente. Os dois valores não apresentam} diferença significativa entre si e ambos estão próximos àquele obtido por Pelcova et al, 2014(9,6 ± 0,3 x 10-6 _cm2 _s-1_{). Os valores obtidos também são superiores em} relação a outros experimentos com MeHg e DGT realizados anteriormente (5 – 5,26 cm2 _s-1 _{(GAO et al, 2014; CLARISSE e HINTELMANN, 2006; CLARISSE et al, 2009;} HONG et al, 2011)

As determinações usando CV-AFS foram caracterizadas por um limite de detecção instrumental de 8,1 ng mL-1 _{(LD = 3 x SDbranco). Considerando um fator de} pré concentração de 8,43, obtido com imersões de 48 horas, pode-se se estimar um limite de detecção para a associação da DGT com AFS-CV de 0.96 ng mL-1_{. Estes} valores evidenciam a possibilidade de aplicação da técnica para a determinação quantificação do analito em concentrações muito baixas.

5.2. Coeficiente de Difusão S. cerevisiae

Tabela 04 - Coeficientes de Difusão (D) determinados nos diferentes experimentos realizados no laboratório. Curvas de imersão, efeitos do pH e força iônica e estudos de especiação

Expe

rimento D 23ºC (cm2 s-1)

1 8,08 x 10-6

2 7,91 x 10-6

3 6,24 x 10-6

4 6,62 x 10-6

5 6,64 x 10-6

6 6,69 x 10-6

Média 7,03 x 10-6

SD 0,77 x 10-6

O valor médio do coeficiente de difusão obtido foi de 7,03 ± 0,77 x 10-6 _cm2 _s-1 a 23 ºC. Este resultado está próximo aos valores obtidos em trabalhos anteriores de determinação de MeHg pelo DGT (Tabela 05).

Tabela 05 - Coeficientes de difusão obtidos em trabalhos anteriores

Trabalho D (cm2 _s-1₎

CLARISSE e HINTELMANN, 2006 5,0 x 10-6

GAO et al 2014 5,1 ± 0,2 x 10-6

PELCOVA et al 2014 9,6 ± 0,3 x 10-6

FERNÁNDEZ-GÓMEZ, 2014

3,15 x 10-6

2,68 x 10-6

Média 5,1 x 10-6

5.3. Efeito da Força Iônica na capacidade de ligação da S. cerevisiae

Os resultados sobre a influência da Força Iônica e do pH na capacidade de retenção da S. cerevisiae imobilizada em agarose para o MeHg foram apresentados normalizados em função do pH 5,0 e da Força Iônica = 0,005 mol L-1 _{NaCl. Os} dados foram expostos desta forma uma vez que estes parâmetros foram definidos como os ideais de aplicação do método e foram aqueles utilizados na maioria dos experimentos subsequentes. Os dados expostos na sequência utilizam o coeficiente de difusão médio dos experimentos (7,03 ± 0,77 x 10-6 _cm2 _s-1_{). As figuras 7 e 8} demonstram respectivamente a influência do pH e da Força Iônica na capacidade de retenção da S. cerevisiae imobilizada em agarose para MeHg.

Figura 7 - Efeito dos diferentes pH testados na capacidade de ligação da S. cerevisiae

Figura 8 – Efeito das diferentes forças iônicas testadas na capacidade de ligação da S. cerevisiae (MeHg = 100µg L-1_{. pH = 5,0)}

Foi verificada uma baixa influência do pH e da Força Iônica na capacidade de retenção do ligante. Os valores de pH testados demonstraram recuperações de 84 a 98%, enquanto as Forças Iônicas testadas demonstraram recuperações de 84 a 105%. Estes valores evidenciam a capacidade de aplicação do método em uma larga faixa de pH e Força Iônica.

5.4. Teste de interferentes

Figura 9 - Efeito da interferência de Mn, Cu, Zn, Fe, Pb e Cd na retenção de MeHg pelo ligante S. cerevisiae

As recuperações de MeHg obtidas no experimento (70-87%) demonstram baixa interferência do Mn, Cu, Zn e Fe na retenção do analito pelo ligante. Em relação ao Pb (62 ± 5 %) e ao Cd (54 ± 6 %), foi verificada recuperações abaixo do esperado, indicando influência destes elementos na retenção de MeHg pela S.

cerevisiae. É provável que estes elementos, por estarem em concentração mais alta

que o MeHg, estejam competindo fortemente pelos sítios de ligação da levedura, uma vez que o ligante já foi utilizado com sucesso para a determinação dos dois elementos (PESCIM et al, 2012; MENEGARIO et al, 2010)

.

5.5. Testes de Especiação

Tabela 06 - Recuperações dos analitos pelos ligantes nos testes de especiação

Teste [Sol] Hg

2+ [DGT]

Hg2+ _MeHg [Sol] [DGT] MeHg [Sol] Hg

2+ ₊

MeHg [DGT] Hg

2+ ₊

MeHg

(µg L-1_{) (µg L}-1_{) (µg L}-1_{) (µg L}-1_{) (µg L}-1_{) (µg L}-1₎

T1 30,5 ± 6,5 0,06 ± _0,03 29,3 ± 1,3 16,2 ± 0,7 50,4 ± 1,2 18,5 ± 2,0

T2 16,5 ± 5,3 0,2 ± 0,04 30,7 ± 7,3 27,7 ± 4,6 67,5 ± 1,0 33,4 ± 5,7

T3 23,5 ± 3,9 0,01 ± _0,01 76,6 ± 4,8 73,4 ± 7,1 87,6 ± 3,5 64,0 ± 4,0

T1 = Teste 1; T2 = Teste 2; T3 = Teste 3

Os resultados obtidos com a S. cereivisiae demonstraram baixíssima retenção de Hg2+ _{(< 1,0%) pelo ligante em todos os 3 testes realizados. A recuperação de} MeHg no teste 1 ficou abaixo do valor esperado. Este resultado justifica-se pelo fato de, neste experimento, as amostras não terem sido centrifugadas antes da leitura, havendo muita matriz no sobrenatante das amostras, levando a uma supressão no sinal na hora de leitura. Nos demais testes os resultados mostraram-se positivos (recuperações acima de 90%), evidenciando a seletividade dos dispositivos propostos, confirmando os resultados obtidos anteriormente.

6. CONCLUSÃO

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