Apostila de Aulas Praticas Microbiologia do Solo - Aulas 1 a 6a

1. AMOSTRAGEM DE SOLO E RAÍZES PARA ANÁLISES

MICROBIOLÓGICAS

1.1. INTRODUÇÃO

O solo apresenta grande

heterogeneidade devido aos arranjos estruturais e texturais específicos que formam as camadas diferenciadas dos horizontes, definidos por convenção pelas letras A, B, C, a partir da superfície do solo. Para a análise microbiológica do solo, interessa sobremaneira o horizonte A, onde se concentra mais de 90% da atividade biológica. As características e as propriedades desses horizontes podem ser variáveis. Além disso, a presença ou não de cobertura vegetal, o relevo e regimes sazonais tornam o solo ainda mais complexo. A combinação desses fatores determina variações locais que devem ser levados em consideração quando da amostragem de solo destinado às análises microbiológicas.

Quando um volume de solo precisa ser caracterizado, normalmente não existe a possibilidade de que todo ele seja examinado, sendo necessário que amostras do mesmo sejam coletadas. A amostra deve ser o mais representativa possível do material original ou área a ser caracterizada. Por isso é recomendável fazer várias amostras simples e a partir delas constituir uma amostra composta.

A amostragem correta é de fundamental importância para que o resultado analítico dê uma idéia, a mais exata possível, da composição do solo

amostrado. A coleta de amostra incorreta pode invalidar a determinação de laboratório.

A amostragem de solo para análises microbiológicas deve seguir procedimentos apropriados e obedecer algumas etapas: - Delimitação da área experimental e unidades de amostragem;

- Coleta de amostras;

- Composição das amostras compostas; - Armazenamento e transporte;

- Processamento.

A coleta de amostras requer a utilização de ferramentas limpas, mas não necessariamente esterilizadas. A análise microbiológica geralmente requer amostras na condição mais natural possível. Para isso, devemos:

a) Evitar extremos de temperatura durante a coleta e transporte;

b) Para amostras aeróbias, utilizar sacos de polietileno. Para amostras anaeróbias, utilizar frascos de vidro ou metal impermeáveis a gazes. Evitar empilhar os sacos plásticos com amostras, para evitar a compactação;

c) As amstras colhidas devem ser processadas rapidamente. Caso a coleta seja distante do ponde de processamento é necessário refrigerar a amostra e evitar o ressecamento do solo;

d) Anotar dados da área: inclinação, tipo de solo, cobertura vegetal, etc.

1.2. OBJETIVO

- Discutir os principais cuidados que devem ser tomados durante amostragem de solo para análises microbiológicas.

- Demonstrar os procedimento para as coletas de amostras de solos e raízes para as análises microbiológicas.

- Demonstrar a presença de hifas fúngicas nos agregados do solo e seu papel na formação destes agregados.

1.3. MATERIAL - Balde; - Caixa de isopor; - Enxada e, ou enxadão; - Pá; - Sacos plásticos;

- Caneta de retro projetor;

1.4. PROCEDIMENTO a) Solo

- Limpar superficialmente com uma enxada o local onde será feita a coleta.

- Coletar aproximadamente 10 amostras simples na camada de 0 a 10 cm de profundidade, com uma pá ou enxada e transferi-las para um balde. Isto em um pequeno lote, em áreas maiores, é necessário dividir a gleba em lotes menores de acordo com a cor, textura e declividade, a coleta de amostras simples é feita caminhando em zigue-zague sobre a área.

- Homogeneizar as amostras simples formando uma amostra composta. - Coletar aproximadamente 1.000 g da amostra composta.

- Para amostras aeróbias utilizar sacos de polietileno.

- Para amostras anaeróbicas, utilizar frascos de vidro ou de metal impermeáveis a gazes.

- Identificadas as amostras com nome, data, local, natureza do material e com outras informações que sejam úteis.

- Acondicionar em caixas térmicas.

- Evitar extremos de temperatura durante a coleta e transporte.

- Evitar empilhar os sacos de plástico com amostras, para evitar a compactação. - As amostras devem ser enviadas o mais breve possível ao laboratório.

- No laboratório as amostras devem ser armazenadas em geladeira, de tal forma que não comprometa a qualidade do material.

b) Raízes

- Coletar pelo menos 10 amostras simples de raízes na camada de 0 a 10 cm de profundidade; Arbórea:

- Cada planta pode ser uma sub-amostra;

- Traçar de forma imaginária um circulo na projeção da copa; - Selecionar um quadrante;

- Coletar aproximadamente 50 g de raízes finas dentro deste quadrante.

- Juntar as sub-amostras e misturá-las a amostra de solo correspondente para transporte e

armazenamento;

Gramíneas:

- Coletar aleatoriamente 10 sub-amostras de aproximadamente 50 g de raízes finas.

- Juntar as sub-amostras e misturá-las a amostra de solo correspondente para transporte e

armazenamento;

Arbóreas e gramíneas:

- Embalar em sacos de plástico.

- Lacrar os sacos plásticos para não perder a umidade.

- Anotar dados da área: inclinação, tipo de solo, cobertura vegetal, etc.

- Identificar as amostras com nome, data, local, natureza do material, bem como as demais informações úteis para o caso.

- acondicioná-las em caixa térmicas.

1.5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BORGES, A.C. et al. Microbiologia do Solo Praticas de Laboratório. Viçosa. 48p.

KIEHL, E.J. Fertilizantes Orgânicos. Piracicaba, Editora Agronômica “Ceres” Ltda., p. 407 – 412, 1985.

2. PREPARO E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS DE SOLO E

RAÍZES PARA ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS

2.1. INTRODUÇÃO

O preparo e armazenamento das amostras de solo devem ser feitos em laboratório de tal forma que não comprometa a qualidade do material, o armazenamento deve ser feito em local arejado e livre de contaminação.

Quando um grande número de amostras são coletas no mesmo dia e quando a metodologia ou a mão-de-obra disponível não permitem o processamento e análises laboratoriais das amostras imediatamente, as amostras devem ser estocadas sob condições que causem menores alterações possíveis nas características das mesmas.

A escolha das condições de estocagem devem levar em consideração: a) o objetivo de interesse, ou seja, se os microrganismos analisados serão os mortos, moribundos, resistentes ou metabolicamente ativos (Anderson 1987); b) qual característica do solo será estudada, por exemplo, se a atividade e biomassa microbiana serão analisadas (Skujins, 1967); e c) se processos influenciados pela microbiota serão analisados, por exemplo, a dissipação de biocidas ou a dinâmica o nitrogênio inorgânico.

Nenhuma regra geral pode ser obtida da literatura, pois os trabalhos têm investigado os efeitos da estocagem em apenas uma característica em diferentes horizontes de solo (Ross, 1970, 1972; Shen et al., 1987; Zelles et al. 1991). Contudo, tem sido mostrado que distribuição de tamanho de partículas, conteúdo inicial de água e tempo e temperatura de estocagem influênciam diferente, por exemplo, a atividade e a biomassa microbiana. Assim, a secagem das amostras ao ar não é

recomendada para as análises

microbiológicas. As amostras podem ser estocadas preferencialmente de 2 a 4oC por um período pequeno, quanto menor o tempo de estocagem melhor. A estocagem por um período de até quatro semanas parece ser aceitável. A estocagem em a temperatura de -20oC devem ser preferidas para tempos de estocagem maiores. Uma pré-incubação de 24 a 48 h pode ser útil, especialmente se análises fisiológicas foram planejadas. O mais importante é o tratamento igual para todas as amostras para permitir a comparação dos resultados.

2.2. OBJETIVO

- Discutir e demonstrar os principais cuidados que devem ser tomados durante o preparo e armazenamento de amostras de solo e raízes para análises microbiológicas;

2.3. MATERIAL

- Geladeira; - Tesoura;

- Piseta com álcool 50 %; - Papel toalha;

- Bandeja;

- Peneira com abertura de malha de 2 mm;

- Vidros para armazenar as raízes; - Jornal;

- Pinça; - Etiquetas;

2.4. PROCEDIMENTO a) Solo

- Forrar a bandeja com jornal;

- Colocar a peneira sobre o conjunto bandeja/jornal;

- Despejar todo o conteúdo de cada amostra (solo e raízes) sobre a peneira; - Separar as raízes (cuidado para não perder a identificação da amostra); - Peneirar o solo descartando o que não passar pela peneira;

- Voltar 1 L do solo para o saco plástico e colocar a identificação dentro; - O restante da amostra pode ser descartado;

- As amostras de solo deverão voltar para geladeira até o momento das análises.

OBS: Amostras de solo para quantificação de esporos de fungos micorrízicos arbusculares serão mais bem preservadas se o solo estiver bem seco.

b) Raízes

- As amostras de raízes previamente separadas do solo devem ser colocadas sobre a peneira de abertura de malha de 2 mm;

- O conjunto raízes/peneira deve ser apoiado sobre um balde colocado dentro de uma pia profunda;

- Usar a água corrente para remover todo o restante de solo ou substrato que estiver aderido às raízes (Cuidado para não quebrar as raízes finas);

- Separa as raízes finas colocando-as sobre um papel toalha;

- Fazer uma trouxinha das raízes finas e cortá-las em pedaços de aproximadamente 1 a 2 cm; - Com o auxílio de uma pinça colocar as raízes finas cortadas dentro de vidros;

- Adicionar álcool 50 % até atingir 2/3 do volume do vidro. Certifique-se que todas as raízes foram encobertas pelo álcool para que não ocorra ressecamento das mesmas;

- Armazenar as raízes a temperatura ambiente até o momento das análises.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BORGES, A.C. et al. Microbiologia do Solo Praticas de Laboratório. Viçosa. 48p.

KIEHL, E.J. Fertilizantes Orgânicos. Piracicaba, Editora Agronômica “Ceres” Ltda., p. 407 – 412, 1985.

3. DETERMINAÇÃO DA UMIDADE A 100-110ºC E CAPACIDADE

MÁXIMA DE RETENÇÃO DE ÁGUA

3.1. INTRODUÇÃO

As avaliações microbiológicas são conduzidas após o ajuste do conteúdo de água a um valor constante para todos os solos, preferencialmente, à 60% da CMRA (Capacidade Máxima de Retenção de Água). Isso assegura condições semelhantes aos microrganismos quanto à disponibilidade de

água, condição crucial para o seu crescimento e atividade metabólica. A determinação do teor de umidade a 100-110ºC é essencial na determinação da CMRA, uma vez que a umidade nessa faixa de temperatura representa o valor absoluto de água contida na amostra de solo.

3.2. OBJETIVOS

- Determinar a capacidade máxima de retenção de água em amostras de solo. - Determinar o teor de umidade de amostras de solo.

3.3. MATERIAL

- Funil de filtração;

- Papel de filtro (o mesmo para todas as análises); - Frasco coletor (copos descartáveis de 100 mL); - Colherzinha descartável de mexer café;

- Papel alumínio - Proveta de 100 mL; - Latas de alumínio; - Dessecador; - Balança analítica; - Estufa à 105 ºC. 3.3.1. UMIDADE A 100-110ºC 3.3.1.1. PROCEDIMENTO

- Peneirar o solo em peneira 2 mm.

- Pesar as latinhas tampadas e vazias e anotar os valores.

- Pesar duas sub-amostras de aproximadamente 5,0000 g de cada amostra de solo peneirado e colocar nas latinhas de alumínio.

- Colocar as latinhas com o solo abertas dentro de uma estufa ajustada com temperatura 105°C, até peso constante (aproximadamente 48 horas).

- As amostras após saírem da estufa são colocadas para esfriarem em dessecador por 15 minutos e pesadas em seguida.

3.3.1.2. CÁLCULO

% Umidade a 100-110°C = (P - P1) x 100 P

P = peso da amostra ao natural

P1 = peso da amostra seca a 100-110°C No da lata Amostra Peso da lata Peso do solo

fresco Peso do solo seco %U 100-110ºC 1 Braquiara 26,8215 5,112 2 Braquiara 28,8077 5,0399 3 Eucalipto 29,1491 5,0784 4 Eucalipto 25,9119 5,0226

3.3.2. CAPACIDADE MÁXIMA DE RETENÇÃO DE ÁGUA 3.3.2.1. PROCEDIMENTO

- Pesar os frascos coletores (copos descartáveis).

- Pesar duas sub-amostras de aproximadamente 20,0000 g em balança analítica e anotar o peso. - Colocar o solo sobre o papel de filtro acondicionado no funil e montado sobre o frasco coletor. - Medir 100 mL de água destilada em proveta e em seguida pesá-la em balança analítica.

- Adicionar a água destilada em pequenas quantidades. Obs.: com o auxílio de uma colherzinha descartável de mexer café, mexa o solo ao adicionar água e certifique-se de que todo o solo esteja úmido (não retire a colherzinha).

- Cubra o funil com papel alumínio para evitar evaporação.

- Faça dois controles passando 100 mL de água (previamente pesada) pelo conjunto funil/filtro sem solo. Estes serão os brancos.

- Deixe descansar por uma noite.

- No outro dia, pela manhã, bata levemente na haste do funil para liberar as últimas gotas de água que ficam presas nele.

- Pese em balança analítica o frasco (copinho descartável) com a água coletada. Os brancos também são pesados.

OBS: Este procedimento deverá ser realizado somente no final da tarde para evitar perda de água por evaporação.

3.3.2.2. CÁLCULOS No da lata Amostra Repet. Frasco coletor (FC), g Solo (S), g Água adicionad a (AD), g Água percolada (AP) + FC, g AP, g (AP-FC) Água retida (AR), g (AD-AP) Braquiara 1 1,6005 20,0278 100,0713 Braquiara 2 1,5826 20,1423 100,0403 Eucalipto 1 1,6131 20,0514 100,0634 Eucalipto 2 1,6245 20,0877 100,0509 Branco 1 1,5453 100,0256 Branco 2 1,5497 100,0827 Média do branco (MB) = Continua....

Continuação.... Amostra Repet. Água retida no solo (ARS), g (AR-MB) Umidade (U%), % Água na amostra (AA), g Solo seco (SS), g (S-AA) CMRA, g (ARS+A A) CMRA, % [CMRA * 100/SS] Média CMR A, % Braquiara 1 Braquiara 2 Eucalipto 1 Eucalipto 2 Continua.... Continuação.... Amostra Repet . 60% CMRA, % 60% CMRA, mL para 20 g de solo (20*60% CMRA/100) Umidade em 20 g de solo, g (20*U%/100) Quantidade de água a ser adicionada em 20 g para atingir 60% da CMRA, mL Braquiara 1 Braquiara 2 Eucalipto 1 Eucalipto 2 Branco 1 Branco 2 3.4. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

MONTEIRO, R.T.R.; FRIGHETTO, R.T.S. Determinação da umidade, pH e capacidade de

retenção de água do solo. In: FRIGHETTO, R.T.S.; VALARINI, P.J.,Coord. Indicadores

Biológicos e Bioquímicos da Qualidade do Solo: Manual Técnico. Januária: Embrapa Meio Ambiente, 2000. 198 p.

4.

4.1. INTRODUÇÃO

A respiração do solo é um dos parâmetros mais antigos e ainda mais para quantificar a atividade microbiana no solo (KIEFT e ROSACKER, 1991).

A respiração é um processo universal no solo, executada por diversos organismos, e não somente restrita aos microrganismos. Da mesma forma que outras atividades metabólicas, esta depende do estado fisiológico das células e é influenciado por diferentes fatores como

umidade do solo, temperatura,

disponibilidade de nutrientes e estrutura do solo. A secagem do solo ao ar reduz significativamente a respiração. Solos re-umidecidos, contudo, apresentam uma atividade inicial muito alta, provavelmente devido liberação de compostos orgânicos facilmente degradáveis (aminoácidos e ácidos orgânicos) causada pelos processos químicos e físicos promovidos pela água no solo seco (KIEFT et al., 1987).

A respiração do solo decresce com a profundidade do solo e correlaciona-se com a matéria orgânica do solo (Corg) e a maioria

dos parâmetros microbiológicos, (VAN DE WERF, 1989/1990).

A respiração do solo responde diferentemente a tratamentos e manejo do solo e tem sido usado frequentemente para avaliar o efeito de produtos químicos como os pesticidas, metais pesados, etc. (Alef et al., 1988).

A temperatura de incubação usada varia entre 20 a 30oC e a capacidade máxima de retenção de água entre 50 a 70%. O valor de pH é usualmente o natural do solo, medido em água. A respiração do solo pode ser determinada pelo uso de técnicas simples tais como a incubação do solo em potes ou jarras (Pochon e Tardieux, 1962) ou em diferentes tipos de frascos (Alef e Nannipieri, 1995). O dióxido de carbono é usualmente adsorvido em NaOH e determinado por titulação com HCl.

4.2. OBJETIVO

- Demonstrar o método Respiração Basal do solo para avaliação da atividade microbiana do solo pela medição do CO2 liberado.

- Avaliar a respiração basal de duas amostras de solo.

4.3. MATERIAL

- Amostras de solo sob eucalipto e braquiara - Potes de 1 L (plásticos brancos com

tampas de rosca ou borracha na tampa para vedar);

- Vaselina (para lacrar a tampa dos potes impedindo a entrada de ar dentro do frasco)

- Beckers ou potes plásticos com capacidade para 20 g de solo;

- Câmara de incubação a 25 oC; - Barra magnética;

- Agitador magnético; - Bureta;

4.4. SOLUÇÕES

- Solução de Hidróxido de sódio (NaOH) 0,3 M (previamente padronizada); - Solução de Ácido clorídrico (HCl) 0,1 M (previamente padronizada); - Solução de Cloreto de Bário (BaCl2.12H2O) 20%;

- Solução de Fenolfitaleína 0,1 %.

4.5. PROCEDIMENTO

- Pesar 04 sub-amostras de 20 g de cada amostra de solo dentro de potes ou beckerss, umidece-las com água até atingirem 60 % da CMRA, depois colocar as amostras no fundo de um pote de 1 L.

- Pipetar com pipeta volumétria10 mL de NaOH (0,3 M) em potes ou beckers - Colocar o pote contendo a solução de NaOH também dentro do pote de 1 L.

- Fechar bem os potes de maneira que o CO2 produzido não escape.

- Deve-se preparar quatro potes controles, com o NaOH (0,3 M) e sem solo. - Incubar os potes por três dias a 25 oC.

Estimativa do CO2

- Abrir um pote de cada vez, retirar o becker com NaOH. - Adicionar 5 mL da solução de cloreto de bário 20%.

- No momento da titulação adicionar 3 gotas do indicador fenolfitaleína.

- Titular com HCl (0,1 M) até a cor da solução mudar de vermelho para branco (sob agitação, por causa do precipitado em suspensão).

CÁLCULOS

A B C D E F G H I

No do

pote Amostra Rep. HCl,

mL

Média HCl, mL

HCl equivalente ao NaOH que reagiu com CO2 produzido no solo, mL (HCL do Br – HCl da A) Molaridade Real do HCl, M Moles de HCl/NaOH equival., M (FxG) CO2, mol (H/2)1/ 1 Braquiara 1 2 Braquiara 2 3 Braquiara 3 4 Braquiara 4 5 Eucalipto 1 6 Eucalipto 2 7 Eucalipto 3 8 Eucalipto 4 9 Branco (Br) 1 10 branco 2 11 branco 3 12 branco 4

1/ Estequiometria entre C e NaOH = 2:1

A B C J K L M N

No do

pote Amostra Rep.

CO2, mg (Ix44x103)2/ U%, % Solo seco (SS), g ((100-K)*20/100)3/ CO2 mg/kg SS (J/L*1000) CO2, mg/kg SS/h (M/72)4/ 1 Braquiara 1 2 Braquiara 2 3 Braquiara 3 4 Braquiara 4 5 Eucalipto 1 6 Eucalipto 2 7 Eucalipto 3 8 Eucalipto 4 2/ PM do CO2 = 44;

3/ 20 = 20,00 gramas de solo úmido usado nos potes. 4/ 3 dias = 72 horas.

4.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALEF K.; KLEINER, D. Applicability of arginine ammonification as na indicator of microbial activity in different soils. Biol. Fertil. Soils, v.5, p.148-151, 1987.

KIEFT, T.L.; ROSACKER, L.L. Application of respiration- and adenylate-based soil microbiological assay to deep subsurface terrestrial sediments. Soil Biol. Biochem., v.23, p.563-568, 1991.

KIEFT, T.L.; SOROKER, E. FIRESTONE Microbial biomass response to a rapid increase in water potential when dry soil is wetted. Soil Biol. Biochem., v.12, p.119-126, 1987.

POCHON, J.; TARDIEUX, P. Techniques d’Analyses en Microbiologie du Sol. Edition de la Tourelle, St. Mandé, 1962.

VAN DE WERF, H. A respiration-simulation method for estimating active soil microbial biomass. Ph.D. thesis, Faculty of Agricultural Sciences, Gent., 1989/1990.

5.

(Vance et al., 1987)

5.1. INTRODUÇÃO

Dentre os nutrientes imprescindíveis aos microrganismos destacam-se o carbono, na forma de aminoácidos, ácidos graxos e açúcares, e o nitrogênio, como amônia e nitratos, que são absorvidos pelos microrganismos decompositores e o nitrogênio molecular atmosférico pelos fixadores deste elemento (PICCOLO, 1996). A avaliação da biomassa é útil para:

- Obter informações rápidas sobre mudanças nas propriedades orgânicas do solo;

- Detectar mudanças causadas por cultivos ou por devastação de florestas;

- Medir regeneração dos solos após a remoção da camada superficial;

- Avaliar os efeitos dos poluentes como metais pesados e pesticidas.

Esta metodologia analisa a biomassa microbiana extraível em solução aquosa de sulfato de potássio (K2SO4) a 0,5 M

(VANCE et al., 1987). A fumigação do solo com o clorofórmio, além de matar, rompe as células microbianas liberando o constituinte microbiano, principalmente o citoplasma, para o solo e permitindo assim sua extração (POWLSON & JENKINSON, 1976). Esta metodologia pode ser usada para estimar a biomassa microbiana (BM-C) do solo tanto em solos neutros como ácidos.

5.2. OBJETIVO

- Determinar o conteúdo de carbono da biomassa microbiana em duas amostras de solos distintas. 5.3. MATERIAL  Agitador horizontal;  Agitador magnético;  Balança analítica;  Balão volumétrico de 1000 mL;  Barra magnética;  Bastão de vidro;  Becker de 50 mL;  Becker de 1000 mL;  Bloco de digestão;  Bomba de vácuo;  Bureta;

 Câmara com temperatura controlada (25°);

 Capela para exaustão de gases;

 Dessecador;

 Erlenmeyer (125 mL)

 Frascos de 50 mL;

 Funil de condensação;

 Funil de plástico;

 Papel de filtro quantitativo (filtração lenta; 11 cm Ø);  Pipeta graduada de 10 mL;  Pipeta volumétrica de 2 mL;  Pipeta volumétrica de 15 mL;  Pipeta volumétrica de 25 mL;  Pipeta automática de 3 mL e 5 mL;  Proveta de 100 mL;  Proveta de 500 mL;  Proveta de 1000 mL;  Tubo de digestão.

Obs: Se não houver funil de condensação, pode ser utilizado funil de vidro comum pequeno

5.4. SOLUÇÕES

- Solução de Sulfato de Potássio (K2SO4) 0,5 M

- Solução de Dicromato de Potássio (K2Cr2O7) 66,7 mM

- Solução de Ácido Sulfúrico (H2SO4) 0,4 M

- Solução de Sulfato Ferroso Amoniacal (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O 33,3 mM

- Solução de H2SO4/H3PO4 2:1

- Solução de Difenilamina (1%)

5.5. PROCEDIMENTO

Extração do carbono com K2SO4 a 0,5 M

Para cada amostra de solo, serão pesadas oito sub-amostras de 20 g, 4 em beckers de vidro para serem fumigadas (Figura 1.1) e 4 em erlenmeyer, para controle não fumigado.

Sub-amostras NÃO fumigadas: O Carbono das 4 sub-amostras controles será imediatamente

extraído com 50 mL de K2SO4 0,5 M sob agitação por 45 minutos a 150 rpm. Em seguida, o

sobrenadante é filtrado em papel de filtro faixa preta - 11 cm Ø (Fig. 1). O extrato pode ser armazenado em geladeira em frascos com tampa até a digestão para determinação do Carbono (nunca além de duas semanas).

OBS: a) Para obter uma melhor separação do sobrenadante, pode-se usar uma centrífuga.

b) Se o solo for muito rico em MO, aumentar a proporção entre o solo e o extrator.

Sub-amostras fumigadas: As outras 4 sub-amostras deverão ser umedecidas a 60% da CMRA

adicionando-se a água com auxílio de uma pipeta e adicionando gotas de água para o melhor uniformidade do umedecimento, em seguida as amostras são colocadas em dessecador forrado com papel toalha úmido (Figura 2) contendo aproximadamente 25 mL de clorofórmio purificado (livre de álcool) em uma placa de Petri pequena. O dessecador é tampado e submetido a um vácuo (utilizar bomba de vácuo) até atingir uma pressão de 15 psi (repetir 3 vezes) e incubadas à 25 oC por 24 h no escuro.

Após este período retira-se a placa com clorofórmio do dessecador dentro da capela, fecha-se novamente o dessecador e efetua-se vácuos sucessivos (3 vezes) para retirar o excesso do clorofórmio, após a retirada do vácuo abrir a tampa e deixar sair o cheiro ao ar livre. Em seguida, as sub-amostras de solo são transferidas para erlenmeyer de 125 mL, adicionando-se cinco porções de 10 mL de sulfato de potássio (K2SO4) 0,5 M para a completa transferência do solo.

Após esse processo proceder à extração como descrito acima para as sub-amostras controles. Fig. 1. Suspensão filtrada

Oxidação do carbono pelo dicromato (ANDERSON & INGRAM, 1993)

Na presença de ácido forte, a matéria orgânica é oxidada e o cromo (+VI) é reduzido ao cromo (+III). O dicromato remanescente é quantificado por titulação.

- Pipetar 8 mL do extrato filtrado do solo (Temperatura ambiente) e transferir para um tubo digestor.

Fig. 3- Tubo digestor.

- Pipetar 2 mL da solução de dicromato de potássio (K2Cr2O7) 66,7 mM com pipeta

volumétrica e 15 mL da mistura ácido sulfúrico P.A. (H2SO4)/ácido fosfórico P.A.

(H3PO4) (2:1)

Efetuar a digestão ácida, colocando os tubos com pequenos funis de condensação (Fig. 4), em bloco digestor a 120oC por 30 minutos até o surgimento das primeiras bolhas

- Preparar 4 brancos, todos os reagentes menos o solo.

Fig. 4- Tubo de digestão com funil de vidro comum.

- Deixe resfriar, e ao retirar os funis de condensação lave-os com 5 mL de água destilada (2x), com o auxílio de uma pipeta automática, voltando o condensado para o tubo, e transfira o volume dos tubos para um erlenmeyer de 125 mL, lavando os tubos com três porções de 5 mL de água destilada.

- O excesso de dicromato de potássio é determinado por titulação com sulfato ferroso amoniacal, usando difenilamina (4 gotas) como indicador até a mudança da cor azul escuro para a cor verde garrafa. Nas amostras em branco utiliza-se o mesmo procedimento.

EXEMPLO DE CÁLCULO

A quantidade de dicromato de potássio consumida é calculada pela diferença entre uma digestão “em branco” de 8 mL de extrator (sulfato de potássio) menos aquela que sobra na digestão do extrato de solo.

Passos:

a) Fazer a média aritmética das titulações dos brancos. Ex. 21,525 mL. b) Determinar a quantidade de dicromato que reage com 1 mL de sal.

Ex. para 2 mL K2Cr2O7 --- gastou 21,525 mL de sal

X mL K2Cr2O7 --- para 1 mL de sal

X = 0,092915 mL K2Cr2O7

c) Determinar a quantidade de dicromato que reagiu (oxidou) com o carbono.

Ex. Dados: média da amostra =21,35 mL média do branco = 21,525 mL

Diferença entre o branco e a amostra resulta na quantidade de sal que não reagiu com dicromato, que significa a parte do dicromato que oxidou o carbono.

Então: 23,5 mL – 15,5 mL = 8 mL de sal que não reagiu.

Pois sabe-se que 1 mL do sal reage com 0,085106 mL K2Cr2O7, então:

1 mL de sal --- 0,092915 mL K2Cr2O7

0,175 mL de sal --- X mL de K2Cr2O7

d) Determinar a quantidade de carbono na amostra.

Assume-se que 1 mL de K2Cr2O7 é equivalente a 1.200 g de carbono.

Então: 1 mL K2Cr2O7 ---1.200 g de C

0,01626 mL K2Cr2O7 --- X g de C

X = 19,512 g de C

Pois 816,96 g de C em 8 mL no extrator, sendo que foi usado para extração 50 mL do mesmo.

Então: 8 mL K2SO4 --- 19,512g de C

50 mL K2SO4 --- X g de C

X = 121,95 g de C

e) Determinar para g de C/g de solo seco

Descontar o teor de água contida na amostra.

Após, dividir a quantidade de carbono na amostra pela massa de solo usando na extração. Ex. 20 g de solo --- 121,95 g de C 1 g de solo --- X g de C X = 6,0975 g de C.g solo seco-1 f) Por último: BM-C = F – NF kec Onde: - BM-C = g de C.g solo seco-1 - F = amostra fumigada

- NF = amostra não fumigada

- kec = fator de correção 0,30 proposto por FEIGL et al. (1995), específico para solos

tropicais

5.6. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

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6.

(Autor, ????)

6.1. INTRODUÇÃO

A família Leguminosae possui cerca de 727 gêneros e 19.325 espécies sendo reconhecida pela maioria dos especialistas como uma única família estando subdividida em três subfamílias: Caesalpinoideae, Mimosoideae e Papilionoideae (Lewis et al, 2005). É uma das mais ricas em espécies, compreendendo árvores, arbustos, ervas e lianas, das quais, muitas possuem capacidade de se associar a bactérias diazotróficas (comumente chamadas de “rizóbios”) e fixar o nitrogênio do ar (N2)

formando estruturas hipertróficas nas raízes e em alguns casos no caule (Faria et al., 1999).

A fixação biológica de nitrogênio é um processo essencial para a vida na terra. O nitrogênio faz parte de componentes essenciais à nutrição animal como as proteínas, aminoácidos e vitaminas. Estes são sintetizados pelas plantas a partir de carboidratos produzidos pela fotossíntese e de íons como NH4+ e NO3- absorvidos do

solo. As principais fontes desses íons no solo são: a fixação biológica de nitrogênio (175 x 106 t ano-1 de N), a fixação industrial (49 x 106 t ano-1 de N) e a fixação atmosférica (10 x 106 t ano-1 de N). Apenas algumas espécies de bactérias possuem a enzima nitrogenase capaz de transformar N2

em NH3, podendo viver livremente no solo

ou em simbiose e associações com algumas espécies vegetais e até animais (Moreira & Siqueira, 2006).

Até 2001 eram conhecidos apenas seis gêneros de -Proteobacteria (Rhizobium,

Azorhizobium, Bradyrhizobium,

Sinorhizobium, Mesorhizobium,

Alorhizobium) denominadas coletivamente de “rizóbios”, capazes de nodular leguminosas (e Parasponia spp.). Em 2010, genes simbiônticos foram revelados em Pseudomonas, indicando que estas bactérias endofíticas de nódulos podem evoluir para

bactérias simbióticas por meio da transferência horizontal de genes (Shiraishi et al., 2010). Entretanto, os gêneros

Burkholderia e Cupriavidus foram

descobertos como simbiontes pertencentes a subclasse β-proteobacteria, sendo os demais α-proteobacteria (Moulin et al., 2001; Chen et al., 2001).

Assim, apesar de uma pesquisa intensiva por novos gêneros e espécies nodulíferas ter sido realizada nos últimos anos, especialmente no Brasil (Moreira et al., 2000; Moreira et al 2004., Moreira et al., 2006), ainda existe a possibilidade de que novas simbioses possam ser descobertas em ecossistemas naturais (florestas tropicais). A capacidade de nodular já foi estudada para 23% das espécies da família Leguminosae, e destas 88% revelaram a capacidade de nodulação (Faria et al., 1999).

A existência de um grande número de espécies de leguminosas e o fato de que nem todas foram analisadas quanto à diversidade dos microssimbiontes associados, leva a crer que a diversidade de grupos de micro-organismos seja bastante superior ao identificado até o presente momento.

O isolamento e a caracterização morfológica das colônias (produção de expolissacarídeos, o tamanho, a forma, a cor, o tempo de aparecimento de colônias e a alteração do pH do meio de cultura) (Vincent, 1970) são passos primordiais para classificar novos micro-organismos e auxiliar nos estudos de diversidade (Jesus et al., 2005). Mas, as características culturais, no entanto, não geram informações sobre as relações evolutivas entre os organismos e as técnicas moleculares vieram para suprir esta deficiência dos métodos tradicionais e, junto a dados fenotípicos, integrar a taxonomia polifásica, tornando mais completa e precisa a identificação de micro-organismos.

O estudo dos micro-organismos muitas vezes depende da possibilidade de cultivar e manter micro-organismos viáveis no laboratório, sob a forma de culturas puras. Estas se apresentam como culturas que contêm apenas um tipo de micro-organismo (Madigan et al., 2004).

Com o conhecimento dos nutrientes necessários ao crescimento dos micro-organismos, é possível a formulação de

meios de cultura que promovam o

crescimento de um determinado micro-organismo no laboratório

O isolamento de um determinado micro-organismo em cultura pura a partir de uma população mista (presente numa amostra de solo, nódulos, na água de um rio, num esgoto, num alimento ou tecido contaminado, etc.) envolve uso de meios de cultura sólidos e técnicas de isolamento de colônias.

Os meios de cultura sólidos são soluções nutrientes utilizadas para promover o crescimento dos micro-organismos em laboratórios (Madigan et al., 2004). O conteúdo destes meios contém nutrientes de

interesse, quantidade de água necessária, pH ajustado, oxigênio ausente ou presente, esterilidade (tudo isso sob temperatura adequada).

Uma das técnicas para obtenção de culturas puras é a técnica de esgotamento por meio de estrias superficiais onde se usa uma alça ou agulha de semeadura para fazer o esgotamento do material por meio de estrias na superfície do meio.

Figura 1. Técnica de esgotamento por meio

de estrias superficiais.

6.2. OBJETIVO

- Isolar bactérias fixadoras de nitrogênio presentes em nódulos de leguminosas. -Caracterizar culturalmente as colônias de bactérias fixadoras de nitrogênio.

6.3. MATERIAL  Agitador horizontal;  Alça de platina  Fluxo laminar  Álcool  Peróxido de hidrogênio

 Peneira (estilo de bola)

 Pinça

 Placas de petri contendo Meio de cultura YMA ou Meio 79

 pHmetro

6.4. MEIOS E SOLUÇÕES Meio 79 ou YMA

(FRED & WAKSMAN, Laboratory manual of general microbiology. New York : McGraw Hill, 1928. 145p.)

Reagente Concentração da solução estoque Quantidade

por Litro Manitol, g --- 10 g K2HPO4 10% 1 mL KH2PO4 10% 4 mL MgSO4. 7H2O 10% 2 mL NaCl 10% 1 mL Extrato de levedura --- 0,4 g

Azul de bromotimol 0,5% em 0,2 N de KOH 5 mL

Dissolver os reagentes em 900 mL de água destilada Ajustar pH para 6,8-7,0 com solução de KOH a 10% Completar para 1.000 mL com H2O

Adicionar 15 g L-1 de ágar para meio de cultura sólido

6.5. PROCEDIMENTO

7.5.1- Isolamento das bactérias fixadoras de nitrogênio

Os nódulos são primeiramente imersos em álcool etilíco 95%, por 30 segundos, com o objetivo de quebrar a tensão superficial, sendo posteriormente imersos em H2O2 por 1 a 3

minutos (dependendo do tamanho do nódulo) para desinfetar a superfície do nódulo, e depois lavados seis vezes em água esterilizada para a retirada da H2O2 (Figura 2). Os nódulos são então

esmagados com o auxílio de uma pinça devidamente esterilizada, em placas contendo meio de cultura 79 (Fred & Waksman 1928), com azul de bromotimol, sendo o material interno espalhado nas placas para a obtenção de colônias isoladas (Vincent, 1970).

7.5.2- Caracterização cultural dos isolados

Após a purificação dos isolados, as seguintes características culturais serão avaliadas: alteração do pH do meio de cultura após o crescimento da bactéria (ácido, neutro ou alcalino); taxa de crescimento, avaliada pelo tempo de formação de colônias isoladas (1 dia, crescimento muito rápido; 2-3 dias, crescimento rápido; 4-5 dias, crescimento intermediário; 6-10 dias, crescimento lento; mais de 10 dias, crescimento muito lento); características das colônias: cor das colônias (creme, branca, amarela ou rosa); diâmetro das colônias (mm); borda (inteira, irregular ou lobada); forma (circular, irregular ou puntiforme); elevação (plana, lenticular, convexa ou pulvinada); detalhes ópticos (translúcida, transparente, brilhante ou opaca) e consistência da colônia (seca, aquosa, gomosa, butírica ou viscosa). O muco produzido pelas células foi avaliado quanto à quantidade (escasso, pouco, moderada ou abundante) (Moreira, 1991) (Anexo A).

Figura 2. Esquema do isolamento de bactérias fixadoras de nitrogênio.

6.6. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

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Anexo B