MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
UNIDADE ACADÊMICA ESPECIALIZADA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS - UAECIA ESCOLA AGRÍCOLA DE JUNDIAÍ - EAJ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FLORESTAIS
MARCADORES BARCODE EM Spondias DO NORDESTE: O CASO ESPECÍFICO DE S. bahiensis
FRANCISCA JANEKELY BURITI
Macaíba/RN Setembro de 2020
ii FRANCISCA JANEKELY BURITI
MARCADORES BARCODE EM Spondias DO NORDESTE: O CASO ESPECÍFICO DE S. bahiensis
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências Florestais (Área de Concentração em Ciências Florestais - Linha de Pesquisa: Biodiversidade, Conservação e Uso dos Recursos Genéticos Florestais.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Sérgio Marinho Lúcio
Macaíba/RN Setembro de 2020
Buriti, Francisca Janekely.
Marcadores barcode em Spondias do Nordeste: o caso específico de S. bahiensis / Francisca Janekely Buriti. - 2020.
52f.: il.
Dissertação (Mestrado) Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais, Macaíba, RN, 2020.
Orientador: Dr. Paulo Sérgio Marinho Lúcio.
1. Marcadores Moleculares Dissertação. 2. DNA
-Dissertação. 3. Filogenia Molecular - -Dissertação. I. Lúcio, Paulo Sérgio Marinho. II. Título.
RN/UF/BSPRH CDU 575
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN Biblioteca Setorial Prof. Rodolfo Helinski Escola Agrícola de Jundiaí -EAJ
iii MARCADORES BARCODE EM Spondias DO NORDESTE: O CASO ESPECÍFICO DE S.
Bahiensis
FRANCISCA JANEKELY BURITI
Dissertação julgada para obtenção do título de Mestre em Ciências Florestais (Área de Concentração em Ciências Florestais - Linha de Pesquisa: GENOMAS DE ÁRVORES:
CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE GENES, GENÔMICA COMPARATIVA, IDENTIFICAÇAO DE POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO E INTERAÇOES PLANTAS E MICROORGANISMOS e aprovada pela banca examinadora em 28 de agosto
de 2020.
Banca Examinadora
________________________________________________ Prof. Dr. Paulo Sérgio Marinho Lúcio
UAECIA/UFRN Presidente
________________________________________________ Prof. Dr. Aulus Estevão Anjos de Deus Barbosa
UFU
Examinador Externo à Instituição
________________________________________________ Prof. Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha
DBG/UFRN
Examinador externo ao programa
Macaíba/RN Setembro de 2020
iv À Deus, minha fonte de sustentação.
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AGRADECIMENTOS
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Agradeço
Primeiramente agradeço a Deus por ter me dado força, coragem, e por não ter me deixado fraquejar nas diversas vezes que pensei em desistir.
Ao meu orientador Paulo Marinho por ter acreditado em mim desde o início, por ter sido amigo, pai/orientador, e por ter sido compreensivo nos momentos difíceis em que enfrentei durante esse período, agradeço de coração.
Aos meus pais pelos ensinamentos de honestidade e caráter que me fizeram ser hoje o que sou. Aos meus irmãos Janielson e Janiele, pelo apoio e preocupações que tiveram comigo desde sempre.
À minha ex-professora, amiga e mãe espiritual, Eliene Zuza, pelas orações, pelos conselhos, pelos incentivos, e por ter me ajudado financeiramente em um momento difícil, sou muito grata por tê-la em minha vida.
Ao meu primo Eudes por ter embarcado comigo nesse mestrado, mesmo sem condições, passando por diversas necessidades (até de água), perdas dolorosas, foi um dos pilares de apoio e sustentação para que eu não desistisse e hoje eu conseguisse esse título, você faz parte dele.
Aos meus amigos que fiz durante o mestrado: a Vanessa Pulcheria por todo apoio, a Patrícia Balduíno e o Bruno Guirra por toda amizade e companheirismo. Vocês fazem parte dessa conquista.
À senhora Geralda, ao seu Catôta e Netinha por ter me acolhido em Natal, e por todo apoio, vocês são os avós e tia que gostaria de ter.
Ao PPGCFL, ao laboratório de genética molecular do Centro de biociências, consequentemente a UFRN, por ter me proporcionado elementos para a realização da pesquisa.
Agradeço, enfim, a todos aqueles que de uma forma ou outra contribuíram para obtenção deste título.
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RESUMO GERAL
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MARCADORES BARCODE EM Spondias DO NORDESTE: O CASO ESPECÍFICO DE S. Bahiensis
Spondias bahiensis é uma das cinco espécies do gênero Spondias presentes no Brasil, principalmente ocorrendo no Nordeste brasileiro. A planta foi durante muitos anos identificada como Spondias sp em função da dúvida que havia em relação à possibilidade de se tratar de um híbrido entre Spondias tuberosa e Spondias monbim. S. bahiensis foi então assim denominada com base em estudos de biologia molecular envolvendo marcadores barcode que confirmaram tratar-se de uma nova espécie. O objetivo desse estudo é abordar a variabilidade intraespecífica na espécie S. bahiensis com relação à características morfológicas do fruto e do sabor da fruta e dirimir dúvidas quanto à classificação da espécie que por ventura possam existir. Como também, pretende-se averiguar se a variabilidade genética na espécie pode ser acessada com os marcadores barcode disponíveis. A metodologia utilizada consistiu em realizar coletas de material vegetal (folhas jovens) das cinco espécies de Spondias, inclusive de S. bahiensis, em diferentes localidades dos estados do Rio Grande do Norte de e da Paraíba, e a realização de amplificações de PCR com marcadores barcode universais rbcL, matK, trnG-trnS, trnH-psbA, rpoB, e rpoC. A variabilidade intraespecífica de S. bahiensis foi estudada a partir de plantas do plantio experimental da EMPARN - Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte no município de Ipanguaçu, Rio Grande do Norte. Os resultados obtidos permitiram a amplificação e sequenciamento das regiões barcode pelos diferentes marcadores utilizados e a realização de árvores filogenéticas que confirmam, nesta análise, a posição taxonômica de S. bahiensis em comparação com as demais espécies do gênero.
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GENERAL ABSTRACT
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MARCADORES BARCODE EM Spondias DO NORDESTE: O CASO ESPECÍFICO DE S. Bahiensis
Spondias bahiensis P. Carvalho, Van den Berg & M. Machado is one of the five species of Spondias genus present in Brazil, mainly occurring in the Northeast of Brazil. The plant was identified for many years as Spondias sp due to the doubts about the possibility of being a hybrid between Spondias tuberosa and Spondias mombin. S. bahiensis was identified based on molecular biology studies involving barcode markers that confirmed the plant as a new species. The objective of this study is to address the intraspecific variability of S. bahiensis species in relation to the morphological characteristics of the fruit and the fruit flavor and to resolve doubts related to the classification of the specie that could remain exist. We intend to investigate if the genetic variability in the species can be accessed with the available barcode markers. Methodology used consisted in collecting plant material (young leaves) from five species of Spondias, including S. bahiensis, at different locations in the states of Rio Grande do Norte and Paraíba, and carrying out PCR amplifications with universal barcodes markers rbcL, matK, trnG-trnS, trnH-psbA, rpoB, and rpoC. The intraspecific variabilaidae of S. bahiensis was studied from experimental plantings of EMPARN - Agricultural Research Company of Rio Grande do Norte in the municipality of Ipanguaçu, Rio Grande do Norte. The results obtained allowed the amplification and sequencing of the barcode regions by the different markers used and the realization of phylogenetic trees that confirm, in this analysis, the taxonomic position of S. bahiensis in comparison with the other species of the genus.
ix SUMÁRIO __________________________________________________________________________ Página 1. INTRODUÇÃO GERAL ... 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ... 3 2.1. O gênero Spondias ... 3
2.2. Importância Econômica das Spondias ... ...10
2.2.1 Spondias na Agroindústria ... 10
2.2.2 Propriedade farmacológica das Spondias... 11
2.3. Marcadores Barcodes em plantas ... 12
3. MATERIL E METÓDOS ... 16
3.1 Material Vegetal ... 16
3.2 Extração de DNA ... 17
3.3 Condições de amplificação e análise em gel de agarose ... 18
4. RESULTADOS E DISCUSÕES ... 20
4.1 Viabilidade do uso de marcadores barcode universal em Spondia ... 20
4.2 Abordagem em Spondias bahiensis ... 25
REFERÊNCIAS ... 26
ANEXO 1. Alinhamento de sequência entre fragmento de sequência gerada por primers psbA-trnH em Spondias sp do Rio Grande do Norte e genoma plastidial de S.tuberosa 34 ANEXO 2. Alinhamento de sequência entre fragmento de sequência gerada por primers psbA-trnH em Spondias sp do Rio Grande do Norte e genoma plastidial de S. bahiensis ... 35
ANEXO 3. Alinhamento de sequência entre fragmento de sequência gerada por primers psbA-trnH em Spondias sp do Rio Grande do Norte em comparação com a mesma região em de S.tuberosa...36
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LISTA DE FIGURAS
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Figura 1. S. monbim. (cajá verdadeiro), folhas, frutos e endocarpo ...5
Figura 2. S. purpurea (ciriguela), fruto e endocarpo ...6
Figura 3. S. tuberosa, fruto (umbu, imbu) ...7
Figura 4. S. cytherea, (cajá manga), árvore, folhas e frutos ...8
Figura 5. S. bahiensis, (umbucajá), fruto e endocarpo ...9
Figura 6. Localidades de coletas dos espécimes de Spondias utilizadas para extrações de DNA genômico. ... ...17
Figura 7. Amplificações de PCR obtidas com os primers rbcL (1-5), trnG-trnS (6-10), psbA-trnH (11-15), rpoB (16-20), rpoC1 (21-25) e matK (26-30) analisadas em gel de agarose 1,5%. M. marcador 50bp DNA Ladder. Plantas A (S.mombim), J (Spondias sp), M (S.purpurea), P (S.tuberosa) e R (S.cytherea) da esquerda para a direita, para cada conjunto de primers. Modificado a partir de Moura (2012) ...20
Figura 8. Dendrograma UPGMA de distância genética de Nei para um conjunto de nove árvores matrizes de M. caesalpiniaefolia. ... 22
Figura 9. Árvore filogenética gerada com pacote MEGA a partir de sequências obtidas com 4 Spondias (nome acrescido de PSB) e com sequências de bancos de dados públicos (genbank) ...24
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LISTA DE TABELAS
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Tabela 1. Identificação das amostras de folhas de Spondias coletatas e coordenadas
geográficas no momento da coleta ...16
Tabela 2. Condições de PCR para amplificações de marcadores barcode em plantas de
Spondias mombim, Spondias tuberosa, Spondias purpurea, Spondias bahiensis e Spondias cytherea... 18
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LISTA DE ABREVIATURAS
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CTAB - Brometo de cetiltrietilamônio DNA - Ácido desoxirribonucleico mtDNA - DNA mitocondrial
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético CBOL - Consortium for the Barcode of Life BOLD - Barcode of Life Database
COI - Citocromo Oxidase Subunidade I
UPGMA - Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Mean AFLP - Amplification Fragment Length Polymorphism
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1. INTRODUÇÃO GERAL
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Os códigos de barras, ou os atuais QR codes são tecnologias utilizadas comercialmente para a identificação com rapidez e praticidade de produtos. O código de barra universal é uma representação gráfica que emprega 10 algarismos alternados com 11 posições para gerar 100 bilhões de identificadores únicos. No mercado essa ferramenta possibilita o controle e estocagem de produtos em todo o mundo, reduzindo também o erro.
Já no meio biológico, diversos procedimentos são realizados para identificação de espécies, com base em características morfológicas, comportamentais, fisiológicas ou moleculares, entre outros. Em sua maioria são classificados de acordo com a atividade taxonômica existente em determinado grupo de organismos. Dessa forma, Linné no século XVIII, classificou a taxonomia de seres vivos dividindo-a por reinos, filos, classes, ordens, gêneros, famílias e espécies (AGANETTE, et al., 2010).
Para a identificação de espécies biológicas, no ano de 2003, o código de barras de DNA, ou como é mais conhecido, o DNA barcode, foi proposto como um método de identificação taxonômica a partir da sequência de um fragmento do gene mitocondrial citocromo oxidase I (COI) (HERBET et al., 2003). A finalidade desta iniciativa era de identificar a nível de espécie todos os indivíduos por meio não de um código de barras, mas de uma sequência de DNA universal para todas as espécies existentes (TIZARD et al., 2019). E isto se mostrou muito eficaz (BROWN et al., 1979; MOORE 1995; MINDELL et al. 1997). O princípio da técnica de DNA barcode é encontrar uma sequência de DNA que possa ser amplificada por PCR em uma única reação com uso de um par de primers universal e que seja suficientemente variável a ponto de se constituir num marcador molecular universal (CHEN et al., 2019). Isto permitiria a identificação de espécies morfologicamente iguais, mas geneticamente diferentes, como também espécies invasoras (COSTION et al., 2011) entre muitas outras aplicações. O objetivo final seria a manutenção de bancos de dados em plataformas digitais que permitissem a consulta de sequências submetidas e identificar com rapidez e eficácia a taxonomia de um determinado espécime.
O gene COI proposto por Hebert et al. (2003) se mostrou muito eficaz na identificação de animais. Em plantas, no entanto, este gene mitocondrial não apresenta a mesma taxa de mutação observada em animais o que dificulta a identificação de espécies já que diferentes espécies podem ter a mesma sequência alvo. Neste sentido, muitos esforços foram feitos para
2 se chegar ao marcador molecular ideal para plantas por diversos grupos de pesquisa (PENNISI, 2007; LEDFORD, 2008; KRESS & ERICKSON, 2007; FAZEKAS et al., 2008; LAHAYE et al., 2008; ERICKSON et al., 2008; HOLLINGSWORTH et al., 2009)
Em 2009 os resultados dos esforços vieram com a publicação do barcode universal consenso para plantas (CBOL Plant Working Group, 2009). No caso, trata-se não somente de um par de primers, mas da associação de duas regiões codantes do gene plastidial matK e outra do gene rbcl. Este trabalho, embora tenha sido um marco pela importância da revista em que foi publicado e pelo próprio esforço do CBOL em realizá-lo em vários laboratórios do mundo, não se constituiu, necessariamente, numa referência de aceitação automática pela comunidade científica tendo sido então propostos vários marcadores para plantas ao longo dos últimos anos (KREES, 2017).
O interesse desta dissertação foi então de testar os principais barcodes de plantas em cinco espécies do gênero Spondias, Spondias bahiensis P. Carvalho, Van Den Berg & M. Machado (umbu-cajá ou cajarana, antiga Spondia spp.) Spondias tuberosa Arruda (umbu), Spondias purpurea L. (ciriguela ), Spondias mombin L. (cajá ) e Spondias cytherea Sonn (cajá-manga), presentes no Nordeste do Brasil, mais precisamente nos estados do Rio Grande do Norte e Paraíba, onde foram coletadas as amostras de material vegetal.
Especificamente, no caso de S. bahiensis, procurou-se acessar a variabilidade da planta com os marcadores trnH-psbA uma vez que permanecem dúvidas quanto a identificação desta cajarana, antes considerada um híbrido, Spondias sp. (MITCHELL & DALY, 1998) até a sua identificação por Machado et al (2015).
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2. REVISÃO DE LITERATURA
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2.1. O gênero Spondias
Sendo um dos primeiros gêneros a ser descrito por Linnaeus em 1737, o gênero Spondias (BRITO et al., 2018), possui 18 espécies dentre elas: S. acida, S. admirabilis, S. chinensis, S. dulcis, S. mombin, S. dubia, S. graveolens, S. lutea, S. pseudomyrobalanus, S. novoguineensis, S. pinnata, S. purpurea, S. mexicana, S. tuberosa Arruda, S. venulosa. (SAMEH et al., 2018) com 19 táxons, dos quais dez ocorrem em regiões da América Central (NOBRE et al., 2018).
Pertencente à família Anacardiaceae que envolve de 60 a 75 gêneros e aproximadamente 600 espécies, cuja 20 estão distribuídas mundialmente, estando sete delas em regiões neotropicais, dos quais dentre eles 4 possuem relevâncias econômica e por suas propriedades farmacêuticas: S. dulcis, S. purpurea. S. tuberosa, S. monbim (SILVA et al., 2014).
Nativas de regiões da América Central, as espécies S. monbim, S. purpurea, S. tuberosa, S. venulosa , e um suposto híbrido entre S. mombin e S. tuberosa, tem maior ocorrência no Brasil, em específico, nas regiões Norte e Nordeste (SILVA et al., 2015), possuem destaque econômico, as espécies S. mombin L, mais conhecida como cajá, cajá-mirin, a S. purpurea, mais conhecida na região Nordeste de ciriguela, a S. tuberosa popularmente conhecida de imbu ou umbu e S. cytherea, conhecida como cajá-manga (SILVA et al., 2014).
As Spondias possuem métodos de propagações divergentes. As S. cytherea e mombin possuem seus métodos de propagação simples, por meio de estacas, onde são plantadas continuamente no campo, tardando o surgimento de raízes (SILVA et al., 2014). A S. tuberosa, além de ser, é propagada pelo método da estaquia, no entanto também pode ser feita pela semeadura da semente, como também por muda enxertada (FONSECA, 2015). Para a espécie S. purpurea o principal método de propagação pelo método vegetativo se dá por meio exclusivamente de estacas talão.
A espécie S. mombin é uma árvore frutífera que pode atingir até 25 metros de altura, com folhas ímpares, com 11 divisões de 9 a 11 centímetros (OSUNTOKUN, 2017), na extremidade dos ramos possui flores pequenas de coloração branca. Floresce a partir do final de agosto junto com o surgimento da nova folhagem, até dezembro. Regenera espontaneamente tanto a partir de sementes como de estacas e raízes. Seus frutos (Figura 1),
4 do tipo drupa elipsóide e endocarpo súbero-lenhoso, com 3 a 4 centímetros de comprimento, formato oval, oblongo, de epicarpo fino e liso, possuem cor amarelo-alaranjado, polpa fina de sabor ácida (LORENÇO et al., 2018). O período de maturação dos seus frutos ocorre entre os meses de outubro a janeiro, a colheita é feita em plantios espontâneas, possuindo importante valor comercial, pois podem ser consumidos e processados para comercialização na forma in natura (SILVA et al., 2014).
Figura 1. S. monbim. (cajá verdadeiro), folhas, frutos (a) e endocarpo (B). Fonte:
GIACON, 2017; SANTOS e COSTA, 2010.
Nos Estados da região Norte e Nordeste do Brasil, seu fruto possui uma diversidade de nomes populares, os mais conhecidos são: cajá, cajá verdadeiro, cajá-mirim e cajá-manga. Além disso, segundo Brito et al. (2018), os frutos da S. mombin, dispõem de alto valor no agronegócio naquelas regiões decorrentes do sabor específico e aroma exótico, sendo popularmente consumidos in natura, e na forma de polpa processada para sucos ou sorvetes. O desenvolvimento dos frutos é ocasionado pela acelerada divisão e alongamento, com um acréscimo irreversível do peso, diâmetro, e comprimento, dos quais são influídos por fatores genéticos e ambientais, como temperatura, radiação UVA/UVB e precipitação (SILVA et al., 2018).
De acordo com Tijani et al. (2019), o centro da origem da espécie S. monbim é o continente americano onde é amplamente distribuída nos países trópicos, em áreas costeiras,
5 como maior frequência na Nigéria e Brasil. No Brasil tem maior ocorrência nas florestas Amazônicas e Atlânticas, possuindo assim, uma grande variabilidade genética, identificando a presença de açúcares redutores, alcalóides, glicosídeos cardíacos, flavonoides, taninos, saponinas, esteróides, e terpenóides (TIJANI et al., 2019)
Avaliados os parâmetros físico-químicos por Brito et al. (2018), detectaram que a S. mombin possui a capacidade antiulcerogênica, intermediada por atividade antioxidante, provocando a produção de muco gástrico, agindo como um antissecretor, anti-Helicobacter do ácido gástrico no estômago. Além disso, a pesquisa constatou que a fruta inclui compostos fenólicos na sua composição, possibilitando a ação da atividade antioxidante, trazendo poder de reduzir inflamações (BRITO et al., 2018). Lourenço et al. (2018) também analisaram a planta e relataram que, as folhas, polpa e epicarpo são ricos em beta-criptoxantina que é um pigmento natural com funções antioxidantes, como também a luteína, flavonoides e compostos fenólicos. Ainda segundo Tiburski et al. (2011), a polpa do cajá manga contém taninos e níveis de vitamina C.
A espécie possui diversos benefícios terapêuticos. Segundo estudos feitos por Sampaio et al. (2018), afirmam que o extrato hidroetanólico derivado das folhas da S. mombin é eficiente no combate a sintomas decorrentes da ansiedade e depressão como: insônia, insônia, taquicardia, palidez, aumento da respiração, tensão muscular, tremor, tontura e distúrbios como doenças intestinais, agindo como ansiolíticos e antidepressivos. Além disso, Nwidu et al. (2018) realizaram estudos na Nigéria, onde avaliaram o efeito hepatoprotetores e antioxidantes dos extratos metanólicos de folhas e caules para o tratamento de doenças hepáticas, do qual obtiveram resultados significativos.
S. purpurea é uma espécie nativa das florestas tropicais secas do México e da América Central (TEJACAL et al., 2017). Na época da colonização europeia foram amplamente cultivadas desde o México até as regiões setentrionais da América do Sul (MILLER & SCHAAL, 2005). É caracterizada por raramente ultrapassar 7m de altura e possuir ramos que se desenvolvem rente ao solo.
Seus frutos (Figura 2), no formato oval, são lisos, de cor verde quando imaturo, amarelo alaranjado e vermelho quando maduro, com 5,5 centímetros de comprimento, pesando entre 12 a 28 gramas (SILVA et al., 2018) com endocarpo espesso e fibroso (MUÑIZ et al., 2018) podendo ser consumido in natura. Amadurece nos meses de inverno e floresce em meados do verão.
De acordo com Muñiz et al. (2018), o fruto da S purpurea propicia uma elevada densidade calórica, vitamina C, ácidos fenólicos (ácido gálico, ácido clorogênico), taninos,
6 flavonóides, e minerais que agem como antioxidantes naturais, protegendo o organismo de doenças degenerativas crônicas, como o diabetes mellitus. Identificou-se também lipídios em extratos de folhas, do qual contém na sua composição β- cariofileno, δ- caadineno, torreyol e T-muurolol, carotenóides luteína entre outros compostos (SILVA et al., 2018). Além disso, emestudos realizados Arshadi et al. (2015), com a semente da espécie, verificou-se que, a o extrato feito com a semente auxiliou no tratamento de águas sintéticas e naturais, fazendo a retirada de monopartículas de ferro. Na polpa da fruta in natura identificou-se a presença de aldeídos, hidrocarbonetos terpênicos, cetonas, ésteres, álcoois (SILVA et al., 2018).
Figura 2. S. purpurea (ciriguela), fruto (A) e endocarpo (B). Fonte: LIMA, 2009;
SANTOS & COSTA, 2010.
A S. tuberosa pode atingir de 4 a 7 metros de altura, com folhas de 2 a 4 centímetros de comprimento e diâmetros de 10 a 15 metros (BATISTA et al., 2015). De acordo com Santos e Castro, (2010), em tupi-guarani é denominada de "ymbu", que significava "árvore que dá de beber, apresenta sistema radicular responsável pela absorção de água, sais minerais e pela fixação de vegetais, por meio de raízes longas difundidas horizontalmente, próximas à superfície do solo, com espessuras de 20 cm de diâmetro e profundidades entre 10 e 30 centímetros. Seus frutos (Figura 3) do tipo drupa em formato esféricos e ovais possuem em média 4 centímetros de diâmetro, com coloração amarelo esverdeada (SILVA et al., 2018), com período de maturação entre os meses de janeiro e fevereiro e colheita de abril a dezembro (NASCIMENTO et al., 2016). De coloração branca, as flores dispostas em ramos de 10 a 15 centímetros são actinomorfas e hermafroditas contendo 7 a 8 centímetros de diâmetro, perianto apresentando 4 a 5 sépalas e pétalas (SANTOS e CASTRO, 2010). Floresce quase
7 sempre um pouco antes das primeiras chuvas quando ainda sem folhas, ou no início das chuvas quando já enfolhada.
Xerófita e endêmica do semiárido brasileiro por não haver ocorrência da espécie em outras regiões do planeta (SANTOS e CASTRO, 2010) é considerada resistente, podendo viver mais de cem anos sob estresse hídrico. Popularmente é conhecida como “árvore sagrada da seca”, por fornecer águas que são armazenadas no interior de suas raízes, como também pelo fruto que gera renda e suprimento animal (NASCIMENTO et al., 2016).
Figura 3. S. tuberosa, fruto (umbu, imbu) (A) e endocarpo (B). Fonte: GIDSICKI,
2014; SANTOS e COSTA, 2010.
Embora a S. tuberosa seja considerada endêmica do Brasil, ela não é encontrada em todo o país, sua ocorrência tem maior predominância na vegetação Caatinga, nos Estados do Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas e a Chapada Diamantina na Bahia (INSA, 2015) onde é indicada como cultura promissora por possuir capacidade agrossocioeconômica (MEDEITOS et al., 2015), e agroflorestal sendo usada para recuperação e reflorestamento de áreas degradadas. Inúmeros atributos são dados à espécie, ressaltando
sua importância na função sociocultural, ambiental e medicinal (SANTOS, 2008). Por isso, vários estudos foram realizados devidos às propriedades existentes na S.
tuberosa. Avaliações físico-química afirmam que a espécie estudada apresenta alto teor de compostos fenólicos, exercendo assim, a atividade antioxidante no organismo (SILVA et al., 2018), como também possui vitamina C, carotenoides, antocianinas e flavonoides (Silva et al.,
8 2014), atividade antifungicida (CORDEIRO et al., 2018), antidiabéticos (BARBOSA et al., 2018), e antiinflamatória (SIQUEIRA et al., 2016).
A exploração de seus frutos é baseada no extrativismo através de pequenos e médios produtores rurais, que comercializam in natura, para a confecção de polpas, doces, geleias. Os frutos ganharam destaque no setor alimentício, como também no comercial devido ao excêntrico sabor agridoce (SILVA et al., 2018).
A S. cytherea (Figura 4), também conhecida como maçã dourada ou porco-ameixa, é nativa da Polinésia Francesa, introduzida na Jamaica em 1782 sendo cultivada principalmente na região do Caribe, Ásia, América Central, América do Sul e, em menor medida, na África (FOURNET, 2002). Introduzida no Brasil em 1985 e cultivada principalmente na região Nordeste do país, onde a espécie passou a ser mais conhecida pelo nome popular cajá-manga (LAGO-VANZELA et al., 2011). É uma árvore de médio porte, medindo de 15 a 25 metros de altura (FOURNET, 2002). O fruto do tipo drupa (Figura 4), elipsoidal, ovoide, de cor amarelo brilhante, contém em seu interior um endocarpo com espinhos longos e encurvados que penetram na polpa, possuindo 9 centímetros de diâmetros e pesando, aproximadamente, 100 gramas (UMSZA-GUEZ, 2011). Com casca fibrosa e tenra, possui sabor agridoce e ácido, e aroma agradável. Estima-se que 60% da massa dos frutos é constituído de polpa, sendo muito utilizado na preparação de sucos, sorvetes, vinhos e licores, sendo importante para economia (ALMEIDA et al., 2011).
Figura 4. S. cytherea, (cajá manga), árvore, folhas (A), frutos e endocarpo (B). Fonte:
PARMACH, 2018.
A
9 O período de colheita do fruto é curto (UMSZA-GUEZ, 2011), por isso é considerado um fruto climatérico, com períodos de maturação divididos em cinco ciclos diferentes consonantes com as características físico-químicas (AROUCHA et al., 2012; SANCHES, 2017). Assim sendo, os frutos da espécie apresentam em sua composição teores de pectina, cinzas, lipídios, carboidratos totais e baixo teor de umidade, permitindo ser usada pela medicina no tratamento de doenças.
Suas propriedades terapêuticas têm despertado o interesse de vários estudiosos. Segundo Yolande et al. (2018), a casca da S. cytherea é usada no Peru no preparo de soluções antissépticas para pele e mucosas. Já suas raízes são utilizadas para o tratamento de febres, dores de cabeças, enxaquecas e diarreia. As folhas por sua vez, são usadas no método de infusão para o combate da gonorreia, cistite e uretrite, com também no tratamento de infecções oculares. Por conseguinte, o extrato metanólico confirmou a presença de atividades antimicrobianas, atividades antioxidante, citotóxica e trombolítica (YOLANDE et al., 2018).
Recentes estudos realizados por Machado et al. (2015), tem trazido à comunidade científica a descoberta de uma nova espécie pertencente ao gênero Spondias, denominando-a de S. bahiensis, conhecida popularmente como umbucajá e cajarana. A S. bahiensis foi uma espécie considerada por muito tempo híbrida da S.monbim e S. tuberosa. Ela é uma árvore considerada de baixo porte por possuir altura de 6 a 8 metros, facilitando a coleta dos frutos. Seus frutos (Figura 5), que possuem coloração verde-amarelado quando maduro (CARVALHO et al., 2008), são do tipo drupa de formatos piriformes a oval (ARAÚJO et al., 2018), possuem tamanhos de 2,5 a 3,5 centímetros, uma polpa grossa, com sabores menos ácida, no entanto, semelhantes ao da S. tuberosa (MACHADO et al., 2015).
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Figura 5. S. bahiensis, (umbucajá), fruto (A) e endocarpo (B). Fonte: MACHADO, et
al. 2015.
Possui flores com pétalas de 2 a 3 milímetros de comprimento (ARAÚJO et al., 2018), e floração entre os meses de novembro e dezembro, período em que ocorrem as primeiras chuvas, acontecendo consequentemente o surgimento dos frutos, dos quais entram em estado de maturação entre os meses de fevereiro a março (MACHADO et al., 2015).
Araújo et al. (2018) consideram a S. bahiensis endêmica do Brasil, ocorrendo nos estados de Alagoas, Pernambuco, Bahia e Sergipe, onde predomina a vegetação da Caatinga e clima semiárido, podendo também, ocorrer em biomas como a Mata Atlântica. A espécie possui grande valor econômico, nas regiões onde a presença gera renda para pequenos e médios agricultores que cultivam e colhem seus frutos dela (OLIVEIRA et al., 2015).
Bem antes de ser considerada uma nova espécie, vários estudos foram realizados sobre as características físico-química para garantir uma boa qualidade dos produtos derivados da S. bahiensis. Com isso, foram disseminando estudos sobre suas características como os de Franco et al. (2000), que identificaram mais de vinte compostos voláteis, já Silva, et al., (2015), que identificaram em seus estudos a presença de flavonoides, pectina, carotenoides, entre outros; Dutra et al. (2017), por sua vez avaliaram a atividade antioxidante, e Soares et al. (2017) avaliaram a qualidade microbiológica. Dessa forma, é possível destacar a importância para sociedade, e sabendo dos inúmeros benefícios, faz-se necessário manter a espécie em conservação.
De acordo com Araújo et al. (2018), o principal meio de propagação da S. bahiensis, é por estacas, parte vegetativa da espécie, de 35 centímetros de comprimento e 1,5 centímetros de diâmetro. No entanto, os autores ainda afirmam que é possível realizar a propagação por meio de sementes, possibilitando realizar a seleção das melhores plantas, futurando alta qualidade e produção da mesma.
2.2. Importância Econômica das Spondias
2.2.1 Spondias na Agroindústria
Muito presente e de fácil propagação nas regiões norte e nordeste do Brasil, os espécimes pertencentes ao gênero Spondias, são considerados árvores frutíferas, produzindo frutos de sabores pouco ácidos e com bastante valores nutricionais. Já no ano de 1997 a
11 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa, publicava um artigo científico mostrando a importância econômica dos frutos da S. tuberosa para a geração de renda de pequenos agricultores. Hoje, todas os espécimes pertentes ao gênero possuem valores econômicos para médios e pequenos produtores, que comercializam os frutos em feira livres de hortaliças e frutas como também para a indústria (BRASIL, 2005). No entanto, é de conhecimento que sua maior produção corresponde ao setor da agroindústria. Os frutos são utilizados para a produção e comercialização de sucos, geleias, doces, picolés, podendo do mesmo modo ser consumido in natura (VIANA et al., 2015).
De acordo com os dados coletados do censo agropecuário do Sistema IBGE de Recuperação Automática – SIDRA (2018), no ano de 2017 o Brasil produziu na extração vegetal 1.938 toneladas da Spondia sp. (cajarana) e 5.905 toneladas da S. tuberosa (umbu). Ainda segundo o SIDRA (2018), a quantidade produzida na extração vegetal deu destaque a região nordeste, elencando como a maior produtora, totalizando em 1.231 toneladas da Spondias sp. e 5.723 toneladas da S. tuberosa, ficando em segundo lugar a região nordeste com 629 toneladas da Spondias. sp. Assim sendo, os estados com maior produção são: 1º) Bahia com 641 toneladas da Spondias. sp. e 5.272 para a S. tuberosa, 2º) Rio Grande do norte com 80 toneladas da Spondias. sp. e 203 toneladas para S. tuberosa, 3º) Paraíba com 67 toneladas da Spondias sp. e 168 toneladas da S. tuberosa. Todos esses números resultaram em valores aproximados aos dois milhões e meio de reais para a economia brasileira.
O controle de qualidade dos seus frutos foram destaque em diversos trabalhos, entre eles estão: características físico-química e microbiológica (GUIMARÃES et al., 2020 e RIBEIRO et al., 2017) composição nutricional (OLIVEIRA et al., 2018), pH, sólidos solúveis, acidez titulável, ácido ascórbico e umidade (MOURA NETO et al., 2015), temperatura (OLIVEIRA et al., 2014; KOHATSU et al., 2011), resultado de sua valorização econômica.
Além do que já foi citado, segundo as afirmações de Mattietto (2005), os frutos da S. monbim tem apresentado ser aromatizante, sendo identificado trinta e três (33) compostos. Com isso, a espécie se destaca ainda mais no mercado e ganha também espaço no setor de cosméticos e perfumarias, confirmando o seu valor econômico.
2.2.2 Propriedades farmacológicas das Spondias
Já utilizada há muitos anos pela medicina popular para o tratamento de diferentes doenças, as espécies do gênero Spondias têm despertado o interesse da indústria farmacêutica
12 quanto a suas propriedades e benefícios. Para os espécimes presente neste trabalho, foram publicados diversos artigos científicos divulgando os resultados das investigações realizadas em suas pesquisas.
Diante disso, o estudo de Sampaio et al., (2018), nos mostra que o extrato hidroetanólico das folhas de S. mombin foram utilizados como ansiolítico e antidepressivo para a espécie aquática peixe-zebra. No trabalho de Brito et al., (2018), foi avaliada a atividade antiulcerosa através do extrato etánolico das folhas. Ainda sobre a S. mombin, o estudo publicado PAKOUSSI et al., (2018) nos mostra que extratos das folhas são responsáveis pelo aumento das contrações no músculo liso uterino facilitando o parto. Além disso, foi percebido a presença do ácido gálico e ácido elágico, responsáveis pela propriedade antioxidante, nos extratos para a espécie S. monbin. Além das propriedades terapêuticas, de acordo com o estudo de Eze et al., (2014), o extrato da folha possui atividade larvicida, combatendo a disseminação dos mosquitos da dengue, malária, por possuir produtos bioativos na sua composição.
Estudos realizados por Barbosa et al., (2018) tiveram como objetivo avaliar os efeitos do extrato hidroetanólico da casca do caule da espécie S. tuberosa nos valores glicêmicos de ratos diabéticos, no entanto, também foram observados outros efeitos sendo satisfatório para a pesquisa. A Inserção do extrato, não só reduziu a glicose, como também o volume urinário, o consumo de alimentos e água, resultando na diminuição do ganho de massa corpórea. Além disso, os estudos publicados por Santos et al., 2019 e Cordeiro et al., 2018 que utilizaram extratos de hidroalcóolicos da folha e raízes da S. tuberosa foram satisfatórios, comprovando que possuíam atividades antioxidantes e antifúngica. A espécie ainda possui atividade anti-inflamatória, que foi investigada pelo estudo publicado por Siqueira et al., 2016.
A S. purpurea, possui estudos sobre sua atividade anti-inflamatória, como podemos ver no artigo publicado no Jornal of Food Science no ano de 2017 por VILLA-HERNÁNDEZ e colaboradores. Esse estudo objetivou analisar a atividade in vitro e in vivo, obtendo ao término da pesquisa resultados satisfatórios para os testes realizados. Assim como o estudo anteriormente apresentado, Almeida et al., (2017), realizou uma pesquisa sobre a atividade anti-inflamatória, buscando também investigar a atividade antiulcerosa do extrato das folhas. Os ensaios apresentaram resultados eficientes quanto a atividade anti-inflamatória e antiulcerosa, aumentando os níveis de glutationa reduzida, consequentemente também reduziu o fator de necrose tumoral (ALMEIDA et al., 2017). Além disso, segundo o a pesquisa publicada por Arshadi et al., (2015), resíduos da semente possuem a capacidade de adsorção para remover íons de fosfatos de águas residuais e naturais.
13 Yolande et al., (2018), propôs em seu estudo avaliar a atividade anticâncer através do extrato da fruta da S. cytherea. Os resultados encontrados mostraram que os ensaios realizados in vivo reduziram o aparecimento de tumores causados pelo melanoma, afirmando que os frutos da S. cytherea pode ser uma alternativa futura para a fabricação medicamentos.
2.3. Marcadores Barcodes em plantas
Sistemas de identificação moleculares pretendem realizar a discriminação de todas as espécies vivas do planeta através da utilização de um pequeno segmento padronizado de DNA. Esta abordagem representa uma estratégia promissora para o diagnóstico da biodiversidade. Em termos reais, essas sequências podem ser vistas como um “código de barras” que estão contidos em todas as células. O código de barra universal dos produtos, utilizado para identificar produtos do mercado varejista empregam 10 algarismos alternados com 11 posições para gerar 100 bilhões de identificadores únicos. Códigos de barras genômicos têm apenas quatro nucleotídeos alternados em cada posição, mas a sequência de locais disponíveis para a inspeção é maior. Nas células o DNA mitocondrial (mtDNA) se organiza em nucleóides incluindo DNA e inúmeras proteínas, em estruturas organizadas, possibilitando armazenamento, transmissão de informação genética (KOLESNIKOV, 2016).
O DNA mitocondrial (mtDNA) tem sido aplicado em estudos filogenéticos de animais, porque sua evolução é muito mais rápida do que o DNA nuclear, resultando na acumulação de diferenças entre espécies estreitamente relacionadas (OEY et al., 2019; BURNARD e SHAO, 2019). Se uma pequena região do mtDNA que diferencia espécies fosse encontrada e aceita como um padrão, formando uma biblioteca de sequências ligadas aos espécimes de referência, ele seria então um identificador de uma sequência para as espécies, um ''DNA barcode''. E então foi proposto que o sistema de código de barras do DNA para o reino animal poderia se basear na diversidade de uma parte da sequência do gene da subunidade I do citocromo oxidase (COI ou Cox I), um gene mitocondrial. A sequência de código de barras primário é formada pelo segmento de 648 nucleotídeos da extremidade 5’ do gene mitocondrial Citocromo c Oxidase I (COI).
Para Hebert et al., (2003), essa região possui uma série de características consideradas vantajosas para o seu uso como: (1) por ser uma região curta pode ser obtida facilmente para um grande número de táxons com um único par de primers; (2) é uma sequência facilmente alinhada; (3) é informativa para distinguir espécies próximas, pois possui variabilidade semelhante a outros genes codificadores de proteínas. A evolução deste gene é
14 suficientemente rápida para permitir a discriminação não só de espécies estreitamente aliadas, mas também de grupos filogeográficos dentro de uma única espécie (COX e HEBERT, 2001; WARES e CUNNINGHAM, 2001).
DNA barcode, é visto como uma ferramenta útil para taxonomistas e um sistema de custo-benefício com que os não-especialistas podem atribuir espécies não identificadas para conhecer novas espécies. Sua função essencial consiste na habilidade em identificar corretamente um indivíduo dentro de uma espécie, ou de identificar a amostra como pertencente a uma nova espécie, ainda não descrita, levando em consideração que até hoje foram classificadas somente 1,7 milhões dos 10-50 milhões de espécies que se estima existir no planeta.
Em maio de 2004 foi lançado o “Consortium for the Barcode of Life” – CBOL – (www.barcodeoflife.org) com o objetivo de ajudar no desenvolvimento de um sistema capaz de identificar todas as espécies do planeta baseado na utilização de um pequeno fragmento padronizado de DNA. O CBOL agora inclui mais de 120 organizações de 45 nações; promovendo o desenvolvimento de alianças internacionais de pesquisas necessários para que, ao longo dos próximos 20 anos, seja construída uma biblioteca de código de barras de toda vida eucariótica (RATNASINGHAM e HEBERT, 2007). Diversos consórcios foram criados para auxiliar no estabelecimento do CBOL. Por exemplo, “The Lepidoptera Barcode of Life” (www.lepbarcoding.org) que é um banco de dados de sequências de COI que auxilia na caracterização das espécies de borboletas e mariposas; “All Birds Barcoding Initiative” (www.barcodingbirds.org) que surgiu em 2005, visa reunir dados de aproximadamente 10.000 espécies conhecidas de pássaros de todo o mundo; “The Fish Barcode of Life Initiative (Fish-Bol)” (www.fishbol.org) é uma biblioteca eletrônica de referência que contêm sequências de COI de peixes, tanto de água doce quanto marinhos. O “Barcode of Life Data System” – BOLD – (www.boldsystems.org) é uma base de dados on-line que auxilia na coleta, análise, gestão e utilização de DNA barcodes (RATNASINGHAM e HEBERT, 2007).
Três princípios importantes do DNA barcode são: (i) padronização, (ii) minimalismo, e (iii) escalabilidade. O padrão animal de DNA barcode, o COI, se encaixa bem nesses critérios (HEBERT, 2003). No entanto, a aplicação do DNA barcoding em plantas, apesar de aparentemente simples, tem sido mais complexa do que o esperado. A baixa taxa de substituição de nucleotídeos no genoma mitocondrial das plantas impede o uso do COI como um DNA barcode universal (FAZEKAS et al., 2008), pois eles evoluem mais lentamente em plantas do que em animais. Então, na busca de um barcode para plantas era necessário procurar externamente ao genoma mitocondrial, sendo aceito que múltiplos marcadores
15 seriam necessários para fazer a discriminação das espécies (HOLLINGSWORTH et al., 2011). Alguns números de regiões de genes foram sugeridos como candidatos para possíveis barcodes, mas nenhum deles foi totalmente aceito pela comunidade científica de taxonomistas (LEDFORD, 2008; FAZEKAS et al., 2008; LAHAYE et al., 2008; ERICKSON et al., 2008; HOLLINGSWORTH et al., 2009). Vários fatores devem ser considerados na hora de selecionar um DNA barcode para plantas: otimização da reação de PCR, amplo poder de diversidade taxonômica, diferenciação de espécies e fácil análise em bioinformática (KRESS e ERICKSON, 2007).
A partir de investigações iniciais de regiões plastidiais (CHASE et al., 2007; FORD et al., 2009), 7 genes de barcode em plantas surgiram como candidatos principais (PENNISI, 2007; LEDFORD, 2008). Quatro são porções que codificam genes (matK, rbcL, rpoB, e rpoC1), e três são espaçadores correspondentes a genes não codificantes (atpF-atpH, trnHpsbA, e psbK-psbI).
As regiões não codificantes, especialmente trnh-psba, têm um forte potencial como DNA barcodes, mas sofrem com problemas técnicos de produzir sequências de baixa qualidades devido à presença de longas repetições de nucleotídeos. Tais repetições podem fazer com que as sequências sejam mal interpretadas. E o progresso com uma região de barcode de dois locis seria mais barato e mais rápido do que com uma região de três-locis, especialmente se a terceira região é não-codificante e requer edição de sequência manual. O grupo concluiu que o sucesso na resolução de problemas com primers de matk é mais provável do que a solução de problemas da qualidade de sequência para trnh-psba e recomendou-se rbcl e matk como um barcode de dois locis (CBOL Plant Working Group, 2009).
16
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material vegetal
O material vegetal utilizado neste trabalho consistiu em amostras de folhas jovens das espécies Spondias mombim, Spondias tuberosa, Spondias purpurea, Spondias bahiensis e Spondias cytherea coletadas nos Estados do Rio Grande do Norte e da Paraíba A tabela 1 mostra as espécies coletadas e as coordenadas geográficas no momento da coleta de folhas. Para cada tipo de Spondias foram coletadas 4 amostras de folhas e identificadas de A a Z respectivamente.
Tabela 1. Identificação das amostras de folhas de Spondias coletadas e coordenadas
geográficas no momento da coleta. Modificado a partir de Moura (2012).
Amostra Planetas coletas Latitude Longitude
A S. mombin 5° 46'43.32"S 35°12'23.31"O B S. mombin 5°56'21.10"S 35°15'50.10"O C S. mombin 5°56'21.10"S 35°15'50.10"O D S. mombin 5°37'43.04"S 35°36'13.08"O E S. bahiensis 5°38'52.05"S 35°27'11.75"O F S. bahiensis 5°15'32.08"S 36°51'39.08"O G S. bahiensis 5°37'43.04"S 35°36'13.08"O H S. bahiensis 5°12'37.78"S 37°02'00.50"O I S. purpurea 5°38'51.23"S 35°17'26.32"O J S. purpurea 5°38'50.39"S 35°17'26.32"O K S. purpurea 6°22'47.33"S 35°08'42.13"0 L S. purpurea 6°05'47.33"S 35°12'31.10"O M S. tuberosa 7°12'10.01"S 37°15'34.83"O N S. tuberosa 7°12'10.01"S 37°15'34.83"O O S. tuberosa 6°41'45.63"S 36°39'38.74"O P S. tuberosa 6°54'58.42"S 37°26'55.73"O Q S. cytherea 5°38'50.69"S 35°17'25.92"O R S. cytherea 5°38'51.00"S 35°17''26.65"O S S. cytherea 5°26'48.06"S 36°50'52.01"O T S. cytherea 5°26'48.06"S 36°50'52.01"O U S. bahiensis 5º32’44.0’’S 36º52’23.5’’W V S. bahiensis 5º32’43.8’’S 36º52’24.8’’W W S. bahiensis 5º32’43.5’’S 36º52’26.3’’W Y S. bahiensis 5º32’43.4’’S 36º52’24.7’’W
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X S. bahiensis 5º32’43.4’’S 36º52’23.3’’W
Z S. bahiensis 5º32’42.9’’S 36º52’26.2’’W
As coletas dos espécimes de S. Bahiensis (no mapa como Spondias sp) foram feitas na Estação Experimental da Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte – EMPARN, localizada no povoado de base física, as margens da RN 118, em Ipanguaçu, além de uma amostra em Parelhas e outra no município de Ceará Mirim conforme mostra a figura 6. S. tuberosa foi coletada em Lajes no Rio Grande do Norte e em Maturéia no Estado da Paraíba e S. purpúrea, S cytherea e S. mombin em Natal.
Figura 6. Localidades de coletas dos espécimes de Spondias utilizadas para extrações
de DNA genômico.
3.2 Extração de DNA
No laboratório de Genética Molecular de Plantas e Biointerações da UFRN foi extraído DNA com o uso da técnica de Romano & Brasileiro (1999), sendo adaptado na sua utilização. O protocolo de extração consistiu em submeter o material vegetal a 300 μl de tampão de extração contendo CTAB Merck [CTAB, NaCl 5M, Tris-HCl 1M, EDTA Merck 500mM, β-mercaptoetanol] e triturar a amostra com pistilo. Após a trituração, mais 200 μl de tampão CTAB foi adicionado. Seguiu-se a uma incubação em banho-maria a 67°C por 30
18 minutos. Em seguida, o tubo de extração foi adicionado de 500 μl de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1) para extração. Procedeu-se a uma centrifugação a 10.000 g em centrifuga HERMLE Z326K por 10 minutos e a fase aquosa foi removida para um novo tubo. Em seguida, adicionou-se 300 μl de isopropanol (Vetec) 60% gelado, para precipitação do DNA, seguido de uma centrifugação por 20 minutos. Em seguida, removeu-se o isopropanol, e o DNA foi lavado com 300 μl de etanol (Merck) 70% gelado, centrifugado por 3 minutos e o precipitado obtido foi posto para secar a temperatura ambiente por 30 minutos. O DNA foi então ressuspendido em 50 μl de água destilada autoclavada e estocado a -20°C.
3.3 Condições de Amplificação e análise em gel de agarose
Os primers para barcode em plantas utilizados foram rbcL, matK, trnG-trnS, trnH-psbA, rpoB, e rpoC1, para amplificar os espécimes de S. mombin, S. tuberosa, S. purpurea, S. bahiensis, S. cytherea. As PCRs foram realizadas em termociclador Techne, com protocolo padrão adaptados para cada marcador. As reações de base para as amplificações feitas seguiram o seguinte padrão: tampão 2,0 μl [1X final]; MgCl2 1,0 μl [2,5 mM final]; dNTPs 0,8 μl [0,4mM final]; primers forward e reverse 2,0 μl [20 mM final]; Taq polimerase 0,2 μl [1U final]; DNA 1,0 μl e H2O 14,8 μl, em volume final de 25 μl. As condições de amplificação, bem como as sequências dos primers podem ser visualizadas nas tabelas 2 e 3.
Para analisar os produtos de PCR obtidos após as amplificações foram aplicados 5,0 μl de produto de PCR + 1,0 μl de tampão de corrida. As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio e o gel visualizado sob transiluminador de luz UV.
Tabela 2. Sequências de primers utilizados para amplificações de marcadores barcode
em plantas de Spondias mombim, Spondias tuberosa, Spondias purpurea, Spondias bahiensis e Spondias cytherea. Primer Sequência 5’ - 3’ rbcLa_f ATGTCACCACAAACAGAGACTAA rbcLa_r CTTCTGCTACAAATAAGAAATCG matK 2,1f CCTATCCATCTGGAAATCTTAG matK 5r GTTCTAGCACAAGAAAGTCG trnS GCCGCTTTAGTCCACTCAGC trnG GAACGAATCACACTTTTACC trnH-psbA f GTTATGCATGAACGTAATGCTC trnH-psbA r CGCGCATGGTGGATTCACAATCC rpoB 2f ATGCAACGTCAAGCAGTTCC
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Tabela 3. Condições de PCR para amplificações de marcadores barcode em plantas de
Spondias mombim, Spondias tuberosa, Spondias purpurea, Spondias bahiensis e Spondias cytherea. rpoB 4r GATCCCAGCATCACAATTCC rpoC1 3f TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC rpoC1 1r GTGGATACACTTCTTGATATTGG Primer Desnaturação inicial Ciclagem Extensão Final rbcL 95°C por 3 min 40X [1’ a 94°C; 30’’ a 45°C; 2’ a 72°C] 10’ a 72°C matK 95°C por 3 min 1 40X [30” a 94°C; 45’’ a 49°C; 1’ a 72°C] 10’ a 72°C matK 95°C por 3 min 2 40X [30” a 94°C; 1’ a 47°C; 1’ a 72°C] 10’ a 72°C matK 95°C por 3 min 3 40X [30” a 94°C; 1’ a 51°C; 1’ a 72°C] 10’ a 72°C matK 95°C por 3 min 4 40X [30” a 94°C; 1’ a 53°C; 1’ a 72°C] 10’ a 72°C trnG-trnS. 94°C por 5 min 30X [1’ a 94°C; 45” a 58°C; 1’ a 72°C] 5’ a 72°C trnH-psbA. 95°C por 4 min 35X [30” a 94°C; 1’ a 55°C; 1’ a 72°C] 10’ a 72°C
rpoB. 94°C por 1 min 35X [30” a 94°C; 40’’ a 50°C; 40” a 72°C] 10’ a 72°C rpoC1. 94°C por 1 min 35X [30” a 94°C; 40’’ a 53°C; 40” a 72°C] 10’ a 72°C
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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Viabilidade do uso de marcadores barcode universais em Spondias
O objetivo principal deste trabalho foi de contribuir na utilização de marcadores moleculares barcode num gênero específico em plantas, no caso, no gênero Spondias. Isto porque, apesar de esforços importantes terem sido feitos nesta área, permanece sem consenso com relação à qual seria o marcador ideal para espécie de plantas (KRESS, 2017). Neste sentido, utilizou-se uma estratégia de trabalho que consistiu em testar os principais primers utilizados em plantas (rbcL, matK, trnG-trnS, trnH-psbA, rpoB, e rpoC1) tendo como foco o gênero em questão. Isto porque neste grupo de plantas há poucos dados moleculares bem como dúvidas quanto a identificação de espécies que poderiam mais bem elucidadas.
O primeiro resultado a ser considerado diz respeito, especificamente, à amplificação por PCR do DNA genômico das plantas coletadas. Neste sentido, leva-se em conta a eficiência dos marcadores barcode quanto à obtenção de bandas únicas e do número de cópias da região a ser da região amplificada e a intensidade da banda, para que seja possível o seu sequenciamento. Os resultados obtidos para este parâmetro estão na figura 7 em que se mostra um gel de eletroforese de DNA com os resultados das amplificações de PCR para os primers utilizados.
Figura 7. Amplificações de PCR obtidas com os primers rbcL (1-5), trnG-trnS (6-10),
psbA-trnH (11-15), rpoB (16-20), rpoC1 (21-25) e matK (26-30) analisadas em gel de agarose 1,5%. M. marcador 50bp DNA Ladder. Plantas A (S.mombim), J (Spondias sp), M (S.purpurea), P (S.tuberosa) e R (S.cytherea) da esquerda para a direita, para cada conjunto de primers. Modificado a partir de Moura (2012).
As amplificações de PCR realizadas com os 6 marcadores moleculares empregados foram exitosas uma vez que todas elas proporcionaram a obtenção de bandas de tamanho
21 esperado para os primers adicionados às reações. No entanto, observam-se diferenças quanto a intensidade das bandas obtidas. Os primers rbcL e trnG-trnS apresentaram um padrão de amplificação mais discreto do que aquele obtido para os marcadores psbA-trnH, rpoB e rpoC1 com os quais foram obtidas as melhores amplificações do experimento. Já para o gene matK o padrão de bandas obtido foi o mais heterogêneo entre as plantas bem como na intensidade das bandas. Com este marcador, especificamente, somente foram obtidas amplificações com a realização de ajustes nas condições de PCR através da alteração dos programas de ciclagem conforme tabela 3 já apresentada neste trabalho.
A eficiência dos primers utilizados já foi testada por diversos autores que relatam resultados muito semelhantes aos aqui obtidos para os marcadores rbcL e trnG-trnS ou rpoB e rpoC1 (PARVEEN et al, 2017). Para o marcador psbA-trnH, que constitui um dos mais eficientes barcodes em plantas atualmente (KANG et al, 2017), nossos resultados também se reproduzem. O gene matK, indicado em 2009 juntamente com o rbcL como os marcadores universais em plantas (KREES, 2017), se mostrou de difícil amplificação. Ele é, sem dúvida, segundo a literatura, um bom barcode para a identificação de indivíduos, mas apresenta recorrente dificuldade de amplificação o que o se observou aqui, bem como em outros trabalhos (SINGH et al, 2012).
As amplificações de PCR realizadas permitiram o sequenciamento (sequências no anexo 1) de fragmentos para 5 dos marcadores utilizados com exceção das amplificações feitas com o gene matK, que gerou bandas múltiplas e de diferentes tamanhos. As sequências obtidas permitiram a construção de árvores filogenéticas para o grupo em estudo. A figura 8 mostra estas árvores obtidas com as sequências geradas pelos primers rpoC1, rbcL e psbA-trnH respectivamente. Nas três situações, observa-se que as plantas de Spondias, neste trabalho, se agrupam em um “cluster” específico confirmando e validando o sequenciamento obtido. No entanto, há alterações quanto a filogenia dentro do grupo entre as 5 espécies estudadas em função dos primers utilizados. Por outro lado, a situação da Spondias sp., a cajarana, que potencialmente poderia ser um híbrido entre S. mombin e S. tuberosa é interessante. Isto porque, nas três árvores obtidas, ela parece estar, de um ponto de vista da filogenia, mais próxima à S. tuberosa que, em princípio, poderia ser seu parental.
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Figura 8. Árvores filogenéticas geradas a partir de sequências de espécimes de
Spondias (S.mombin, Spondias sp, S.purpurea, S.tuberosa, S.cytherea.) coletadas (A, rpoC1; B, rbcL; C, psbA-trnH) e com demais sequências obtidas em bancos de dados públicos (genbank).
23 4.2 Abordagem barcode em Spondias bahiensis
A outra abordagem alvo deste trabalho foi a de acessar, através do uso de marcadores barcode, a possível variabilidade no caso das Spondias sp., a cajarana. Até 2015, quando da publicação de Machado et al (2015), esta planta, ainda não identificada a nível de espécie, era considerada um híbrido comumente denominado de umbu-cajá por apresentar características taxonômicas possivelmente presentes nos seus potênciais genomas parentais, Spondias tuberosa e Spondias mombin. A planta, que apresenta caraterísticas de uma provável domesticação no Nordeste brasileiro, uma vez que está sempre presente em agrupamentos humanos segundos os mesmos autores, foi estudada por este grupo a partir de coletas realizadas nos estados da Bahia e de Pernambuco. Neste estudo, que envolveu tanto a abordagem molecular quanto a taxonomia clássica, se chegou a conclusão de que cajarana seria uma nova espécie e não um híbrido. Isto com base em diferentes parâmetros taxonômicos e pela análise molecular de reconstituição filogenética realizada. A planta então recebeu o nome de Spondias bahiensis. Estes resultados foram contestados mais recentemente por Nobre et al (2018) que utilizaram uma abordagem de sequenciamento de alta performance dos de fragmentos dos genomas de S. tuberosa, S. bahiensis e de S. mombin. Neste estudo, que envolveu a identificação de polimorfismos de uma única base (SPNs em inglês) nas três plantas chegou-se à conclusão que S. bahiensis teria uma origem hibrida com parentais feminino S. tuberosa e masculino S. dulcis divergindo de Machado (2015) que supõem possíveis genomas parentais como sendo os de S. tuberosa e S. venulosa.
As cajaranas dos estados da Paraíba e do Rio Grande do Norte não foram analisadas no trabalho de Machado et al (2015) e constituem, como citado acima, um dos objetivos desta dissertação. Neste sentido, e aproveitando-se de que na caraterização da Spondias bahiensis foram geradas sequências para os marcadores barcode psbA-trnH tal como no presente trabalho, procurou-se aqui estudar a situação das cajaranas presentes nesta região numa abordagem comparativa. As coletas realizadas permitiram as amplificações da mesma região com os barcodes psbA-trnH. A sequência aqui obtida é 99.67% idêntica àquele presente no genoma plastidial de S. tuberosa diferindo apenas em 2 nucleotídeos (957/599 nucleotídeos). Isso demonstra fortemente a presença, na cajarana, de um possível genitor feminino, a S. tuberosa, na existência de eventual híbrido dado também observado por Nobre et al (2018), autores que afirmam o caráter híbrido em S. bahiensis. Quando a mesma sequência aqui obtida é comparada àquela de S. bahiensis, presente no seu genoma plastidial, a cajarana apresenta 97.69% de identidade (592/606 nucleotídeos). Isto explica a proximidade e o
24 agrupamento da Spondias sp. com a S. tuberosa também observado aqui neste trabalho com o uso dos marcadores rpoC1 e rbcL. Por esta razão, a árvore filogenética apresentada na figura 9 mostra a Spondias sp e o genoma plastidial da Spondias tuberosa tendo o mesmo ancestral comum. Da mesma maneira, a sequência de Spondias tuberosa que obtivemos e que se ramifica na mesma posição dá suporte a afirmação de que no genoma da cajarana há provavelmente o caráter híbrido discutido. Na mesma árvore, Spondias bahiensis e Spondias venulosa apresentam um mesmo ancestral comum confirmando a suposição de Machado et al (2015) para quem S. venulosa seria um potencial parental de S. bahiensis. S. purpurea e S. cytherea estão na árvore para compor a filogenia e são mais distantes evolutivamente de Spondias sp. É interessante observar que S. mombin e S. cytherea dividem um mesmo ponto de ramificação. A suposição recorrente de que a cajarana que se distribui pelo Rio Grande do Norte seria um híbrido de S. mombin e S. tuberosa resta a ser investigada com mais ferramentas moleculares.
Figura 9. Árvore filogenética gerada com pacote MEGA a partir de sequências
obtidas com 4 espécies de Spondias (nome acrescido de PSB) e com sequências de bancos de dados públicos (genbank).
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5. CONCLUSÕES
As abordagens aqui desenvolvidas que visavam testar seis tipos de marcadores de DNA barcode em plantas de Spondias bem como aportar informações adicionais à questão da classificação da cajarana, Spondias bahiensis, foram exitosas sob diferentes aspectos.
Com relação a capacidade de utilização dos primers barcode rbcL, trnG-trnS, psbA-trnH, rpoB, rpoC1 e matK conclui-se que todos, com exceção do gene matk, são capazes de gerar boas amplificações de PCR, sequenciáveis, e passíveis de serem utilizadas na obtenção de arvoes filogenéticas. Neste estudo, observou-se para três destes marcadores, rpoC, psbA-trnH e rbcl que o grupo de Spondias se enraíza nas árvores num grupo monofilético caraterístico. O gene matK mostrou-se de difícil amplificação em todos as plantas testadas, requerendo ajustes nos programas de PCR e não se constitui num bom marcador para Spondias.
A abordagem visando acessar a possível variabilidade observada na cajarana presente nos estados da Rio Grande do Norte e Paraíba em comparação àquela da Spondias bahiensis permitiu se chegar a conclusão, com o uso do marcador psbA-trnH, a partir das plantas coletadas neste estudo, que não se pode afirmar que a cajarana (Spondias sp.) seja a mesma que a Spondias bahiensis. Neste estudo conclui-se, no entanto, que a comparação de sequência realizada entre o genoma plastidial de S. tuberosa e a sequência obtida neste trabalho com os primers psbA-trn é idêntica reforçando a hipótese já citada na literatura que S. tuberosa é o potencial genitor feminino de Spondias sp e de S. bahiensis.
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