CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
GESSIANE FERREIRA GERMANO
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO INDICATIVO DE ESTABILIDADE DE MONOCROTALINA POR CL/EM, ANÁLISE TÉRMICA E TÉCNICAS
COMPLEMENTARES
ORIENTADOR: Prof. Dr. Cícero Flavio Soares Aragão
CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Fernando Henrique Andrade Nogueira
NATAL-RN 2017
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
GESSIANE FERREIRA GERMANO
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO INDICATIVO DE ESTABILIDADE DE MONOCROTALINA POR CL/EM, ANÁLISE TÉRMICA E TÉCNICAS
COMPLEMENTARES
Dissertação apresentada a Coordenação do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Cícero Flavio Soares Aragão
CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Fernando Henrique Andrade Nogueira
NATAL-RN 2017
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN – Biblioteca Setorial do Centro de Ciências da Saúde - CCS
Germano, Gessiane Ferreira.
Desenvolvimento de método indicativo de estabilidade de monocrotalina por CL/EM, análise térmica e técnicas complementares / Gessiane Ferreira Germano. - 2017. 72f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós Graduação de Ciências Farmacêuticas. Natal, RN, 2017. Orientador: Prof. Dr. Cícero Flavio Soares Aragão.
Coorientador: Prof. Dr. Fernando Henrique Andrade Nogueira. 1. Monocrotalina. 2. Termogravimetria. 3. Calorimetria exploratória diferencial. 4. Cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas. I. Aragão, Prof. Dr. Cícero Flavio Soares. II. Nogueira, CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Fernando Henrique Andrade. III. Título.
A Deus, pela minha vida, por tudo que ele tem me oferecido e pela realizações dos meus sonhos, só tenho a agradecer.
A minha família, meus pais Cícera Raimunda e João Germano, meus irmãos Gerson e Geilson, por todo o apoio, ajuda e amor.
Ao meu noivo Talles Diego e sua família, pelo amor, incentivo, dedicação, paciência e compreensão.
Ao meu orientador Prof. Cícero Flavio Soares Aragão, sempre presente e interessado, que me ajudou bastante, com apoio, compreensão e incentivo, fazendo parte da minha formação tanto profissional quanto pessoal.
Ao meu Co-orientador Prof. Fernando Henrique Andrade Nogueira, sempre que necessitava ele ajudava no que estivesse ao seu alcance.
Aos Profs. Ana Paula Barreto Gomes e Prof. Leandro de Santis Ferreira por todos os ensinamentos, apoio, estímulo e incentivo.
A família LCQmed pelo companheirismo em todos os momentos, união, alegrias, ajudas, apoio, conversas, carinho e incentivo. Em especial a Nilma, sempre com um sorriso no rosto para nos alegrar, Thereza Milene e Dayanne, sempre disposta a ajudar no que fosse necessário, a Maxciara, companheira durante todo o mestrado, Geovana e Fátima, pelos ensinamentos, incentivação e ajuda. Sou muitíssimo grata a vocês!
A Professora Rhaquel Brandt Giordani pela doação da amostra.
Enfim, a todos os professores, funcionários, amigos e familiares que contribuíram para a conclusão desse trabalho.
“Agradeço todas as dificuldades que enfrentei; não fosse por elas, eu não teria saído do lugar. As facilidades nos impedem de caminhar. Mesmo as críticas nos auxiliam muito.”
A monocrotalina é um alcalóide pirrolizidínico isolado da Crotalaria retusa com ações contra o Trichomonas vaginalis, quando utilizado por via tópica. Nesse estudo, tem-se a finalidade de caracterizar esse isolado utilizando técnicas térmicas e não térmicas e realizar a identificação e quantificação da monocrotalina através do Cromatograma líquido acoplado ao espectrômetro de massas (CL/EM). As seguintes técnicas térmicas e complementares foram utilizadas: Térmicas (Termogravimetria – TG; Calorimetria exploratória diferencial – DSC e Análise térmica diferencial – DTA), outras técnicas complementares (Infravermelho com transformada de Fourier – FTIR; Microscopia óptica – MO; Captura de imagens do processo de decomposição e Difração de Raios-x – DRX). Para as técnicas térmicas foram empregadas cinco razões de aquecimento (2,5; 5; 10; 20; 40 °C.min-1), na faixa de temperatura de 25 a 900 ºC para TG e DTA e 25 a 500 ºC para DSC, ambos sob atmosfera de nitrogênio a 100 mL.min-1. Observou-se, nas curvas TG e nas curvas DSC que ocorreram cinco eventos em cada curva em ambas as técnicas, com exceção na curva DSC na razão de aquecimento de 2,5 °C.min-1, nele observou-se apenas 4 eventos. Avaliando-se a razão de 10 °C.min-1, pode-se observar na curva TG que a maior decomposição ocorre no terceiro evento, entre as temperaturas de 204 a 286 ºC, tendo uma perda de massa de 65%, além disso, visualiza que a monocrotalina é estável até 100 °C. Já no DSC, nessa mesma razão de aquecimento, no primeiro evento, quando comparado com as imagens capturadas no processo de decomposição observa-se uma contração da amostra, acontecendo entre as temperaturas de 124 e 152 °C. Também é observado com as curvas DSC e com a captura de imagens do processo de decomposição a fusão da monocrotalina em 202 °C e seguida dela ocorre a decomposição da amostra. Também se avaliou os resultados da curva DTA, que foram bem semelhantes aos resultados das curvas DSC. Com os resultados das técnicas de DRX, FTIR e MO, observou-se que a monocrotalina tem um caráter cristalino e que, com o aquecimento, a molécula sofre mudanças significativas na sua estrutura a partir de 150 °C. Além disso, a monocrotalina foi identificada pelo CL/EM, com um tempo de retenção de 1,7 min, um fluxo de 0,2 mL.min-1, coluna de 50mm x 3,0 mm e
Palavras chave: Monocrotalina; Termogravimetria; Calorimetria exploratória
The monocrotaline is a pyrrolizidine alkaloids isolad from the Crotalaria
retusa with activity against Trichomonas vaginalis, when used topically. This
study has the aim of characterize this isolad used thermal and non-thermal techniques and and identification and quantification of monocrotaline through of the liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS). The thermal and complementary techniques using were: Thermal (Thermogravimetry – TG; differential scanning calorimetry – DSC and differential termal analysis – DTA), complementary (Fourier-transform infrared spectroscopy – FTIR; optical microscopy – OM; Capturing images of the decomposition process and X-ray diffraction – XRD). In the thermal techniques were employed five heating rate (2.5; 5; 10; 20 and 40 °C.min-1), from room temperature to 900 ºC in TG and DTA, and from room temperature to 500 ºC in DSC, both under nitrogen atmosphere flowing at 100 mL.min-1. In the TG and DSC curves were observed five events in both techniques, exception in DSC curve in the heating rate 2.5 °C.min-1, was observed four events. In the heating rate of 10 °C.min-1, the largest decomposition occurs in the third event, between the temperatures 204 and 286 °C, with mass loss of 65% and with an initial decomposition temperature of about 100 °C. In the DSC, this same heating rate, the first event when compared with the images of the decomposition process, there is a sample contraction between the temperatures of 124 and 152° C. And with the images of the decomposition process demonstrated that the monocrotaline melts around 202 °C followed by decomposition of the sample. Futhermore observed that the results of the DTA curve were similar with the DSC curves. The results of the DRX, FTIR e MO techniques revealed that the monocrotaline has a crystalline character and with the heat the molecule has significant changes in your structure in 150 °C. Besides, the monocrotaline was identified by LC/MS, in a retention time of 1.7 min, flow 0.2 mL.min-1, with a column of 50mm x 3.0 mm and 2.2 μm particles and quantified in extract of Crotalaria
retusa, using the analytical curve.
Keywords: Monocrotaline; Thermogravimetry; Differential scanning calorimetry;
Figura 1 Estrutura química do alcalóide pirrolizidínico monocrotalina. 20 Figura 2 Curvas TG da monocrotalina, nas razões de aquecimento de
2,5 °C.min-1 (vermelho); 5 °C.min-1 (azul); 10 °C.min-1 (verde); 20 °C.min-1 (roxo) e 40°C.min-1 (cinza).
42
Figura 3 Curvas TG/DTG na razão de aquecimento de 10 °C.min-1 43
Figura 4 Provavel reação de degradação da monocrotalina com o aquecimento
44
Figura 5 Curvas DSC da monocrotalina, nas razões de aquecimento de 2,5 °C.min-1 (vermelho); 5 °C.min-1 (azul); 10° C.min-1 (verde); 20 °C.min-1 (roxo) e 40 °C.min-1 (cinza).
45
Figura 6 Curvas DTA e DSC na razão de aquecimento de 10 °C.min-1 46
Figura 7 Curvas TG/DTG, DTA e DSC para monocrotalina na razão de
aquecimento de 10 °C.min-1.
48
Figura 8 Destaque do primeiro evento das curvas DSC em maior aumento, para melhor visualização, quando ocorre a contração da monocrotalina nas razões de aquecimento de 2,5; 5; 10; 20 e 40 °C.min-1
49
Figura 9 Cálculo de Ozawa imagem a) contendo a função G(X) versus o tempo reduzido e b) o log (razão de aquecimento) versus T-1
50
Figura 10 Espectros da região do infravermelho nas seguintes
temperaturas: A – 50 °C; B – 100 °C; C – 150 °C e D – 200 °C. Todos comparados com o infravermelho da temperatura
ambiente e a correlação de Pearson
53
Figura 11 Espectros na região do infravermelho aquecido até 250 °C comparado com a amostra em temperatura ambiente e a correlação de Pearson
54
Figura 12 Difratograma da monocrotalina à temperatura ambiente 55
Figura 13 Microscopia óptica da monocrotalina com as objetivas de 10x e 40x nas seguintes imagens: 1 – Temperatura ambiente, 10x; 2 – Temperatura ambiente, 40x; 3 – 50 °C, 10x; 4 – 50 °C, 40x; 5 – 100 °C, 10x; 6 – 100 °C, 40x; 7 – 150 °C, 10x; 8 – 150 °C,
aparelho de ponto de fusão por capilaridade
Figura 15 Cromatograma e espectro de massas da monocrotalina com a fase móvel Água:Acetonitrila
59
Figura 16 Cromatograma e espectro de massas da monocrotalina com a fase móvel Ácido fórmico 0,1 %:Acetonitrila
60
Figura 17 Cromatograma e espectro de massas da monocrotalina após o ajuste da condição cromatográfica
61
Figura 18 Curva analítica obtida com os pontos 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1 e 2 ppm, com a presença da equação da reta e o coeficiente de determinação (R2)
62
Figura 19 Cromatograma e espectro de massas do extrato de Crotalaria
retusa
Tabela 1 Condições cromatográficas utilizado na análise do CLUE 37 Tabela 2 Esquema na análise em gradiente da monocrotalina por
CLUE
37
Tabela 3 Condições cromatográficas utilizada na análise do CL/EM 38
Tabela 4 Esquema da análise em gradiente da monocrotaliba por CL/EM
39
Tabela 5 Condição cromatográfica utilizada na análise CM/EM, após otimização
39
Tabela 6 Esquema na análise em gradiente da monocrotalina por CL/EM, após otimização
40
Tabela 7 Relação dos eventos térmicos observados nas curvas TG 44
Tabela 8 Relação dos eventos térmicos observados nas curvas DSC
Equação 1 Equação do método de Ozawa 33
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
ACN Acetonitrila
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
DRX Difração de Raio-X
DSC Calorimetria Exploratória Diferencial
DTA Análise Térmica Diferencial
DTG Derivada Termogravimetria
FM Fase Móvel
FTIR Infravermelho com transformada de Fourier
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia
LDM Laboratório de Desenvolvimento de Medicamentos
CL/EM Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massa
CLUE Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência
LCQMED Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos
MeOH Metanol
Min Minuto
MO Microscopia óptica
NUPLAM Núcleo de Pesquisa em Alimentos e Medicamentos
PFC Ponto de Fusão por Capilaridade
pH Potencial Hidrogeniônico
PNBio Grupo de Pesquisa em Produtos Naturais Bioativos
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
T Temperatura
Tonset Temperatura onset
Tendset Temperatura endset
Tpeak Temperatura do pico
TG Termogravimetria
TOF Time-of Flight
US-FDA United States-Food and Drug Administration
1 INTRODUÇÃO 15 2 OBJETIVOS 18 2.1 Objetivo Geral 18 2.2 Objetivos Específicos 18 3 REVISÃO DA LITERATURA 19 3.1 Monocrotalina 19 3.2 Controle de Qualidade 21 3.2.1 Técnicas térmicas 22
3.2.1.1 Cinética de degradação pelo método de Ozawa 24
3.2.2 Técnicas complementares 25
3.2.2.1 Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier – FTIR 25 3.2.2.2 Difração de raios-x – DRX 27 3.2.2.2.1 A produção de raios-X 27 3.2.2.2.2 Difractômetro 29 3.2.2.3 Microscopia óptica – MO 29 3.2.3 Técnicas cromatográficas 29 4 MATERIAIS E MÉTODOS 32 4.1 Monocrotalina 32 4.2 TG/DTG, DSC e DTA da Monocrotalina 32
4.2.1 Cinética de degradação por método de Ozawa 33
4.3 Técnicas Complementares 34
4.3.1 Espectroscopia de infravermelho por transformada de
Fourier – FTIR
34
4.3.2 Difração de raios-x – DRX 34
4.3.3 Microscopia óptica – MO 35
4.3.4 Captura de imagens do processo de decomposição 35
4.4 Técnicas cromatográficas 35
4.4.1 Cromatografia líquida de ultra eficiência – CLUE 35
4.4.1.1 Preparo de amostras 36
massas – CL/EM
4.4.2.1 Preparo de amostras 38
4.4.2.2 Preparo de fase móvel 40
4.4.2.3 Preparo da curva analítica 40
4.4.2.4 Praparo do extrato 41
5 RESULTADOS 42
5.1 TG/DTG, DSC e DTA da Monocrotalina 42
5.2 Cinética de Degradação pelo Método de Ozawa 49
5.3 Técnicas Complementares para Caracterização 51
5.3.1 Espectroscopia de infravermelho por transformada de
Fourier – FTIR
51
5.3.2 Difração de raio-x – DRX 54
5.3.3 Microscopia óptica – MO 55
5.3.4 Captura de imagens do processo de decomposição 56
5.4 Técnicas cromatográficas 58
6 CONCLUSÕES 64
1 INTRODUÇÃO
Os alcalóides pirrolizidínicos são metabólitos que estão presentes nas plantas e, dentre eles a monocrotalina é um metabólito isolado da Crotalaria
retusa, tendo um rendimento de 5% m/m (NEGREIROS NETO et al., 2016).
A Crotalaria retusa é uma planta encontrada no nordeste brasileiro. Apesar dessa planta ser utilizada na medicina popular, devido principalmente aos alcalóides pirrolizidínicos nela presentes, ela apresenta alta toxicidade. A monocrotalina é o principal alcalóide pirrolizidínico presente no extrato da Crotalaria retusa (MATTOCKS, 1986).
Sabe-se que quando se utiliza a monocrotalina por via sistêmica, a sua toxicidade é muito alta (PITANGA et al., 2011), entretanto, ao ser utilizada por via tópica, em células do epitélio vaginal, não foi observada nenhuma citotoxicidade e nem potencial hemolítico. Além disso, foi observado que a monocrotalina tem ação contra o Trichomonas vaginalis, eliminando 80% dos trofozoítos na concentração de 1 mg.mL-1, sendo então necessário fazer mais estudos sobre essa substância (NEGREIROS NETO et al., 2016).
O Trichomonas vaginalis (T. vaginalis) é o agente etiológico da tricomoníase, que é a doença sexualmente transmissível (DST) não viral mais comum no mundo, com uma prevalência mundial anual de 180 milhões de casos. O medicamento de escolha para o tratamento da tricomoníase é o metronidazol (MACIEL et al., 2004), com o surgimento de cepas resistentes, torna-se bastante interessante o estudo de novas substâncias com ação contra o Trichomonas vaginalis. Isto demonstra a importância de se estudar novas moléculas com ação contra o T. vaginalis, como a monocrotalina.
Nesse contexto, a análise térmica são técnicas que caracterizam as substâncias fisicamente em função da temperatura, auxiliam na avaliação de inúmeras variáveis como determinação do calor específico, cinética de reação, decomposição térmica, determinação do teor de cinzas, diagrama de fases, oxidação térmica, dentre outras. Por meio dessas análises, é possível obter a caraterização química de substâncias, e também a determinação da estabilidade térmica, determinação de pureza, estudo da interação fármaco-
excipiente, polimorfismo, determinação de parâmetros cinéticos, entre outros. Sendo assim é essencial a utilização de técnicas térmicas como a termogravimetria (TG), calorimetria exploratória diferencial (DSC) e análise térmica diferencial (DTA), para análises de fármacos, e de substâncias que tem potencial de serem novos fármacos (GIRON, 2002), como podem serem observados em vários estudos como TITA, et al., 2014 e SILVA, et al., 2014;
Para complementar os resultados da análise térmica, outras técnicas são necessárias para se obter uma melhor compreensão e confiabilidade dos dados obtidos. Dentre estas técnicas complementares, temos as técnicas não térmicas, sendo as mais utilizadas para a caracterização química das substâncias: o infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), a microscopia óptica (MO), difração de raios-x (DRX) e a captura de imagem do processo de decomposição.
Uma outra técnica bastante utilizada para a identificação, quantificação, análises dos produtos de degradação e impurezas, é a cromatografia. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é atualmente uma das técnicas instrumentais mais utilizadas para análise de produtos farmacêuticos. Esta é uma técnica bastante utilizada, devido a sua precisão e confiabilidade. Um dos detectores mais utilizado nessa técnica é o ultravioleta do tipo rede de diodo (UV/DAD) e, com ele, é possível aplicar um programa de varredura de comprimento de onda múltiplo e assim avaliar diversos comprimentos de ondas concomitantemente (SIDDIQUI et al, 2017).
A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (CL/EM) é considerada uma das técnicas mais importantes da última década do século XX. Nas indústrias farmacêuticas, essa técnica vem sendo o método de escolha para a análises necessárias em diversos estágios de desenvolvimento do fármaco (NILSEN, 1999). Existe estudos que fazem a separação de alcalóides pirrolizidínicos em extratos vegetais com o CLUE, entretanto o CL/EM é mais sensível porque nas suas estruturas tem um nitrogênio e no modo de ionização positivo é possível identificar facilmente esses alcalóides protonados. Devido a isso essa técnica tem sido intensamente utilizada para identificação de alcalóides (AYDIN; LETZEL, 2013).
Devido a toxicidade da monocrotalina causando principalmente hipertensão pulmonar, como pode ser observado com os estudos seguintes ITO, 2000; VIGNOZZI, 2017; LIAN, 2017; YANG, 2017 e NASCIMENTO, 2017 não existem muitos estudos para caracterização da monocrotalina e como foi comprovado por NETO, 2016, que a monocrotalina tem ação contra o
Trichomonas vaginalis é de extrema importância fazer os estudos de controle
de qualidade desse isolado como uma contribuição para que ele venha a ser utilizado, no futuro, como fitofármaco contra o Trichomonas vaginalis. Por isso foram realizados estudos térmicos juntamente com técnicas não térmicas, para complementação, e desenvolvido um método cromatográfico, utilizando o cromatógrafo a líquido acoplado ao espectrômetro de massas.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Caracterizar o alcalóide pirrolizidínico da Crotalaria retusa
(monocrotalina) através de técnicas térmicas e cromatográficas.
2.2. Objetivos Específicos
• Caracterizar termicamente por meio de termogravimetria (TG), calorimetria exploratória diferencial (DSC), análise térmica diferencial (DTA)
• Caracterizar a monocrotalina por espectroscopia de infravermelho com transformadas de Fourier (FTIR), difração de raios X (DRX), microscopia óptica (MO) e captura de imagem no processo de decomposição.
• Desenvolver método analítico em cromatografia líquida acoplado à espectrometria de massas para identificação e quantificação da monocrotalina (CL/EM).
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Monocrotalina
Plantas do gênero Crotalaria são pertencentes à família Leguminosae, crescendo abundantemente em zonas tropicais e subtropicais. Essas plantas são numerosas na África, Índia, México e Brasil, os quais representam os principais centros de diversidade das espécies (CHEECKE, 1988; PALOMINO; VASQUEZ, 1991). No Brasil, foram encontradas, até o momento, 49 espécies desse gênero (NEGREIROS NETO et al., 2016).
As crotalarias são importantes fontes de alcalóides. Os alcalóides são compostos de caráter básico que possuem um anel heterocíclico com um átomo de nitrogênio. Os alcalóides tem sabor amargo e servem como uma defesa da planta para afastar os herbívoros. (SIMÕES, 1999; MCLEAN, 1970; CHEEKE; SHULL, 1985; CHEECKE, 1988).
A Crotalaria retusa, é uma planta que contém uma grande quantidade de alcalóide pirrolizidínico, no Brasil, recebe comumente nomes como “Xique xique”, “Guizo-de-cascavel”, “Chocalho-de-cascavel” e possui vagens secas que, quando tocadas, se assemelham ao som emitido pela cauda da cascavel (WILLIAMS; MOLYNEUX, 1987) (ARAGÃO, et al., 2017)
Os alcalóides pirrolizidínicos são amplamente encontrados na natureza, sendo que mais de 660 alcalóides já foram identificados em mais de 6000 plantas das famílias Boraginaceae, Compositae e Legumionsae (WANG et al., 2005).
A monocrotalina é o principal alcalóide pirrolizidínico encontrado na
Crotalaria retusa, sendo extraído através da semente presente nas vagens
secas, sendo isolada com um rendimento de 5% m.m-1 (NEGREIROS NETO et
al., 2016). Estruturalmente (figura 1), ela se caracteriza como um diéster formado por uma base nécica, localizada no anel com o nitrogênio e o ácido monocrotálico, que seria outro anel. Na base nécica é encontrada uma insaturação entre os carbonos 1 e 2, é nessa dupla ligação que ocorre a reação, ao ser metabolizado, que a torna uma substância tóxica (MATTOCKS, 1986). A monocrotalina possui uma fórmula molecular C16H23NO6, com uma
massa molecular de 335,361 g.mol-1, com um coeficiente de partição -1,18 e o seu pKa é determinado em 5,83.
Essa toxicidade ocorre após a ingestão e metabolização hepática, a monocrotalina pode causar lesões hepáticas e pulmonares, podendo ter também um efeito neurotóxico (PITANGA et al, 2011). A hepatotoxicidade dos alcalóides pirrolizidínicos acontece devido essa insaturação (MATTOCKS, 1986), após a ingestão desses alcalóides pirroliziíinicos, em presença de oxidases (citocromo P450) é formado derivados pirrólicos, que são eletrofílicos e
atacam os nucleófilos biológicos como proteínas e DNA, formando ligações irreversíveis, causando efeitos citotóxicos, mutagênicos e carcinogênicos. (NOBRE et al., 2004, MINGATTO et al., 2008).
Devido a esses efeitos venosos que ocorrem ao serem metabolizados tanto em animais quanto em humanos, a caracterização desses alcalóides pirrolizidínicos não são muito estudadas. (MORALES et al, 2012).
Figura 1 – Estrutura química do alcalóide pirrolizidínico monocrotalina
Fonte: Autor próprio
Existem estudo na literatura que mostra que Comfrey (Symphytum sp.) que é uma planta rica em alcalóides pirrolizidínicos, assim como a Crotalaria
retusa, quando utilizada por via tópica não foi visualizado nenhum efeito tóxico
e foram obtidos interessantes atividades no tratamento de distorções de tornozelo (KOLL et al, 2004), sintomas musculares e distúrbios locomotores funcionais (KUCERA et al, 2000), mialgia (KUCERA et al, 2005), cicatrização de feridas (BARNA et al, 2007), osteoartrite do joelho (GRUBE et al, 2007).
Embora haja a limitação de uso sistêmico com finalidade farmacológica, torna-se relevante investigar o uso tópico da monocrotalina como fitofármaco.
Segundo Negreiro Neto, et al (2016) a monocrotalina tem uma atividade antiparasitária onde 1 mg.mL-1 de monocrotalina causou a morte de 80% dos trofozoítos de Trichomonas vaginalis, o agente etiológico da tricomonose, DST de origem não viral mais comum no mundo. Além disso, ele também observou que o isolado não apresentou citotoxicidade contra células epiteliais vaginais e também não foi observado potencial hemolítico sugerindo uma potencial aplicação em alternativas terapêuticas para uso tópico contra a tricomonose. Dessa forma, esse alcalóide torna-se relevante como objeto de estudo, sendo extremamente importante fazer mais estudos para o controle de qualidade dessa substância, e desta forma se consiga caracterizar, identificar e quantificar a monocrotalina, para isso foram realizadas técnicas térmicas, algumas técnicas não térmicas e as técnicas cromatográficas.
A análise térmica é um conjunto de técnicas que permite fazer a caracterização física e química de uma substância enquanto ele é submetido a uma programação controlada de temperatura (MENDONÇA et al., 2013).
A análise cromatográfica consiste numa técnica físico-química de separação e fundamenta-se na migração dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações desses componentes, entre as fases móvel e estacionária, que são imiscíveis. A classificação das técnicas cromatográficas mais comuns referem-se quanto ao mecanismo de separação, quanto à técnica empregada e em relação ao tipo de fase móvel usada (LANÇAS, 2009)
3.2 Controle de Qualidade
O Controle de Qualidade de produtos farmacêuticos constitui o conjunto de medidas destinadas a garantir, a qualquer momento, a produção de lotes de medicamentos e outros produtos, que satisfaçam às normas de identidade, atividade, teor, pureza, eficácia e inocuidade (BRASIL, 2010).
A definição de parâmetros de qualidade e o fornecimento de especificações mínimas de qualidade para os produtos farmacêuticos e todos os insumos utilizados em sua fabricação são de responsabilidade legal e exclusiva das farmacopeias. A indústria é responsável pela realização de controle de qualidade das matérias-primas, embalagens, processos e o produto
acabado. E para ter qualidade, eficácia e segurança do produto farmacêutico os órgãos sanitários de todo o pais são responsáveis pelo monitoramento desse processo. (OLIVEIRA, 2011).
Algumas das técnicas mais utilizadas no controle e caracterização físico- químico das substâncias são: As técnicas térmicas (análise termogravimétrica, calorimetria exploratória diferencial, análise térmica diferencial), técnicas espectrofotométricas (infravermelho), difração de raio X, microscopia óptica, cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e sendo cada vez mais utilizado a cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas (CL/EM).
3.2.1 Técnicas térmicas
O termo análise térmica é utilizado para descrever técnicas experimentais analíticas que analisam o comportamento de uma amostra em função da temperatura (HATAKEYAMA, 1999).
As técnicas termoanalíticas estão sendo utilizadas cada vez mais no controle de qualidade devido a sua rapidez, praticidade e precisão dos resultados. Em um sistema de análise térmica genérico, a amostra é colocada em um ambiente no qual é possível observar, direta ou indiretamente, uma modificação em função da temperatura e do tempo. As mudanças ocorridas na amostra são monitoradas por um transdutor apropriado, que conduz um sinal elétrico análogo à mudança física ou química. Este sinal é ampliado eletronicamente e aplicado ao dispositivo de leitura e registro (MALEIXO, 2002).
O conceito de análise térmica segundo a farmacopeia brasileira é que ela é um conjunto de técnicas que iram possibilitar medir as propriedades fisico-químicas de uma substância em função da temperatura, as técnicas mais utilizadas são aquelas que medem a variação de energia ou de massa (Farmacopeia Brasileira, 2010).
As técnicas mais utilizadas na análise térmica são a termogravimetria (TG), calorimetria exploratória diferencial (DSC), análise termomecânica (TMA) e análise de gás desprendido (EGD). A análise térmica é uma ferramenta bastante importante na área farmacêutica. Na literatura, são descritos vários estudos relacionados à aplicação dessas técnicas na caracterização,
determinação de pureza e de umidade, compatibilidade de formulação farmacêutica, identificação de polimorfismo, avaliação de estabilidade e decomposição térmica de fármacos e medicamentos (MEDEIROS et al., 2007; GOMES et al., 2008; MEDEIROS et al., 2007; MOURA et al., 2010; da SILVA et al., 2009; PROCÓPIO et al., 2011; PINTO et al., 2010; GOMES et al., 2007). As análises utilizadas para o estudo serão a TG, DTA e a DSC, que são técnicas térmicas amplamente utilizadas para avaliar as propriedades físicas e químicas das substâncias (SOUZA, 2011).
A TG é a técnica de análise térmica em que a variação de massa da amostra é determinada em função da temperatura, ou tempo de aquecimento, utilizando um programa controlado de temperatura (BRASIL, 2010). Ela pode ser utilizada para caracterização e identificação quando se compara curvas realizadas nas mesmas condições de análise. As curvas obtidas fornecem a informação sobre a composição e a estabilidade térmica da amostra, dos produtos intermediários e de resíduos finais (SILVA; PAOLA; MATOS, 2007), para a avaliação do comportamento térmico; determinação do teor de umidade e/ou solventes; determinação da temperatura de ebulição e sublimação; determinação da temperatura de decomposição térmica e determinação do teor de cinzas (BRASIL, 2010).
Os métodos termogravimétricos podem ser classificados como: dinâmico (ou não isotérmico) em que a perda de massa é registrada continuamente à medida que a temperatura aumenta a uma razão constante ou linear; isotérmico, quando a variação de massa da amostra é registrada em função do tempo mantendo-se a temperatura constante; e quasi-isotérmico, no momento em que a amostra começa a perder massa a temperatura é mantida constante até que a massa se estabilize, quando isto ocorre, o aquecimento é retomado, este procedimento pode se repetir em cada etapa da decomposição térmica (LOPES, 2005). Na área farmacêutica a TG é utilizada na caracterização, determinação de umidade, identificação de pseudopolimorfismo, avaliação da estabilidade de fármacos e medicamentos e em estudos de cinética de degradação (OLIVEIRA; YOSHIDA; GOMES, 2011).
O DSC é uma técnica que possibilita medir o fluxo de calor diferencial entre a amostra e um material de referência termicamente inerte em função da temperatura e/ou tempo de aquecimento sob um programa controlado de
temperatura. A amostra e o material de referência são mantidos a aproximadamente a mesma temperatura durante o experimento. Podem-se determinar as variações de entalpia; as mudanças de calor específico e a temperatura de eventos endotérmicos e exotérmicos (BRASIL, 2010).
O DSC é uma técnica que proporciona dados como: transição vítrea, temperatura e tempo de cristalização, ponto de fusão, calor específico, oxidação, pureza, estabilidade térmica, ponto de ebulição, cinética de reação, decomposição e outros (MOTHÉ; AZEVEDO, 2002), (Araújo et al., 2006).
Por regra geral considera-se que transição de fase, desidratação, redução, e algumas reações de decomposição produzem efeitos endotérmicos, ao passo que cristalização, oxidação e algumas reações de decomposição produzem efeitos exotérmicos. Isto é válido tanto para DSC quanto para DTA, entretanto o DTA, não é termicamente isolado. (DANTAS, 2006).
Existem equipamentos de análise térmica vem sendo desenvolvidos que fazem com que as técnicas sejam utilizadas de forma simultâneas, por exemplo, TG/TFIR, TG/DTA, TG/CG/MS aplicadas à mesma amostra, levando em consideração a variações de massa e aspectos energéticos. As medidas simultâneas são utilizadas, principalmente, para o estudo de estabilidade de produtos químicos e materiais poliméricos (OZAWA, 2000; CHENG et al., 2000).
3.2.1.1 Cinética de degradação pelo método de Ozawa
Os estudos da cinética e do processo de decomposição térmica vem sendo realizados através da técnica termogravimétrica.
Para a aplicação do método de Ozawa é necessária à obtenção de pelo menos três curvas TG em diferentes razões de aquecimento. Com ele são determinados os seguintes parâmetros cinéticos: constante de velocidade (k), energia de ativação (Ea) e fator pré-exponencial (A).
A energia de ativação é a energia necessária para que uma reação química ocorra, ou seja, é a energia para mover os reagentes através de uma “barreira energética” de forma que a reação possa iniciar (LEIVA, 2005).
Define-se a ordem de reação como a variação da velocidade de reação com a concentração de reagentes. A cinética de reação com decomposição de
fármacos e medicamentos é classificada da seguinte forma: reação de ordem zero, reação de primeira ordem e reação de segunda ordem. Sendo que a de ordem zero é quando ocorre a perda ou decomposição do fármaco independente da concentração do reagente, ela é constante em relação ao tempo; A reação de primeira ordem é quando ocorre a perda ou decomposição do fármaco diretamente proporcional à concentração do reagente, em relação ao tempo; E a reação de segunda ordem ocorre quando a degradação do fármaco for proporcional ao quadrado da concentração atual da reagente (SALVIO NETO, 2010).
Os estudos de cinética utilizando a TG são bastante usados, pois é uma técnica simples e rápida quando comparada aos estudos de estabilidade, entretanto ele não tem o objetivo de substituir a estes estudos de estabilidade, mas sim complementa-los.
Um método há muito tempo utilizado para a determinação dos parâmetros cinéticos é o método proposto por Ozawa, ele é um modelo isoconvencional e que pode se determinado os parâmetros cinéticos, inclusive a energia de ativação (Ea) sem conhecer o mecanismo de reação (OZAWA, 1965).
3.2.2 Técnicas complementares
Os resultados de análises térmicas muitas vezes são complementados com os resultados de outras técnicas, tais como espectroscopia, difração de raios X, microscopia, entre outras, visando à interpretação de fenômenos de maior complexidade, além de confirmação de resultados.
3.2.2.1 Espectroscopia de infravermelho com transformadas de Fourier – FTIR
As técnicas de espectroscopia são baseadas na absorção de energia eletromagnética por moléculas variando devido tanto a concentração quanto a estrutura da amostra, assim pode-se caracterizar, quantificar e identificar substâncias a partir de técnicas espectrofotométricas. De acordo com o intervalo, frequência da energia aplicada a espectrofotometria, a absorção pode ser dividida em ultravioleta, visível e infravermelho. A identificação de diversas
substâncias pode ser realizada utilizando as regiões ultravioleta, visível, de infravermelho médio e infravermelho próximo (BRASIL, 2010).
A radiação eletromagnética é uma forma de energia que se propaga como ondas e pode ser subdividida em regiões de comprimento de onda característico, para a região do infravermelho, existem a infravermelho próximo (NIR), com faixa de comprimento de onda 12800-4000 cm-1; infravermelho médio (MIR), na faixa de comprimento de onda de 2500-400 cm-1 e o Infravermelho distante, com faixa de comprimento de onda entre 400-33 cm-1 (BRASIL, 2010).
Os instrumentos usados para esta técnica são chamados
espectrômetros de infravermelho, e a propriedade física medida é a capacidade da substância para absorver, transmitir, ou refletir radiação infravermelho (FIORINI, 2000).
A amostra utilizada nessa análise é não destrutiva, ou seja, após o uso nessa técnica a amostra pode ser recuperada para ser utilizada novamente nessa ou em outra técnica (FIORINI, 2000).
Os espectrômetros podem serem dispersivos (feixe simples e feixe duplo) e não dispersivos (FTIR).
A maioria dos espectrômetros dispersivos são de feixe duplo, nele o feixe passa alternando a amostra e a referência, para que a luz policromática seja dispersada em várias faixas de comprimento de onda, usa-se para essa analise prisma ou grade de difração e assim obter-se uma radiação monocromática. Após atravessar a amostra, esta radiação é refletida por um sistema de espelhos, passa por fendas estreitas indo em direção ao detector e deste para um registrador. As dificuldades nessa análise é porque ele tem fraca potência de radiação infravermelho, dificultando sua medição, além disso, necessita de grades de difração apuradas e a precisão é afetada pelo frequente desalinhamento do sistema óptico (FIORINI, 2000).
Os espectrômetros não dispersivos (FTIR) tem como princípio o interferômetro de Michelson. Nesse princípio um feixe de radiação monocromática incide no interferômetro, o mesmo atinge o divisor de feixe (Beam Splitter), teoricamente, nesse divisor metade da luz é refletida pelo material e a outra passa através dele. Esta parte refletida vai para o espelho fixo e é refletida novamente voltando para o divisor de feixes, atravessando-o,
indo para o detector. A outra parte que atravessou o divisor de feixe atinge um espelho móvel e é refletida por este, onde é refletida dirigindo-se ao detector (FIORINI, 2000, STRONG et al, 1979).
O encontro dos dois feixes pode ter uma interferência construtiva ou destrutiva, isto irá depender do comprimento de onda (λ) e da diferença do caminho ótico (FIORINI, 2000).
A técnica de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) é bastante utilizada na caracterização de sistemas sólidos.
As vantagens mais importantes dessas técnicas são: não serem destrutivos, permitirem informações químicas, serem rápidos, utilizarem pequenas quantidades de material, serem aplicáveis em materiais sólidos, líquidos e gasosos e ser um método automatizado. (PARISOTTO et al, 2009) (FIORINI, 2000). E as vantagens dos espectrômetros FTIR em relação aos dispersivos são: relação sinal/ruído muito superior para uni espectro acumulado no mesmo intervalo de tempo e maior exatidão nos números de onda, associada a uma resolução constante em toda a gama espectral (ILHARCO, 1998).
Com essa técnica é possível analisar a presença de determinados compostos na substância, a avaliando as bandas que estão vibrando.
3.2.2.2 Difração de raios-x – DRX
A difração de raios-x é uma das principais técnicas para analisar a estrutura cristalina de materiais sólidos, com essa ferramenta é possível determinar nos materiais cristalinos a estrutura e a organização dos átomos (da CUNHA, 2009).
3.2.2.2.1 A produção de raios-x
Os raios-x são gerados quando uma partícula de alta energia cinética é rapidamente desacelerada. Quando o elétron altamente energético (gerada no
cátodo) atinge uma placa metálica (ânodo), um elétron da camada K de um átomo da placa é liberado como fotoelétron, ocorrendo então uma vacância nessa camada, por isso, outro elétron da camada mais externa passa para a camada K, e essa troca de camada faz com que ocorra uma liberação de energia na forma de um fóton de raio-x (BLEICHER, 2000).
Os elétrons são desacelerados de formas diferentes. Alguns elétrons desaceleram em um único impacto liberando então toda a sua energia de uma única vez. Outros eletros são desviados várias vezes pelos átomos do alvo, e a cada desviada vão perdendo uma fração de sua energia cinética total até que essa energia esteja totalmente gasta (efeito Compton) (da CUNHA, 2009).
A difração de raio-x é uma das técnicas mais utilizadas para analisar a estrutura cristalina dos materiais e isso determina a estrutura e a organização dos átomos em materiais cristalinos.
3.2.2.2.2 Difratômetro
É um equipamento que difrata raios-x de comprimento de onda conhecidos. Os difratômetros tem como rearranjo geométrico básico pode ser um goniômetro horizontal (θ-2θ) ou vertical (θ-2θ ou θ-θ). Outras configurações, mais sofisticadas e específicas para estudos na área de ciências de materiais e de monocristais, podem ser também encontradas (da CUNHA, 2009).
Com os difratômetros com goniômetro horizontal a amostra é girada de um ângulo θ, enquanto o detector é girado de um ângulo 2θ. Se a condição de Bragg for satisfatória tem-se um pico no sinal do detector. Cada pico corresponde à difração por um plano cristalino. Sabendo-se o valor de 2θ e do comprimento de onda dos raios X pode ser determinado o espaço entre os planos cristalinos que difrataram os raios X (da CUNHA, 2009).
3.2.2.3 Microscopia óptica – MO
O Microscópio vem de duas palavras gregas e quer dizer "pequeno" e "observar". Não se sabe exatamente quem o inventou. Mas, sabe-se que no século XVII, foram construídos os primeiros microscópios. O microscópio composto são os que tem no mínimo, uma lente objetiva e outra ocular, a maioria dos historiadores dizem que ele foi inventado na Holanda, por volta de 1600 por Zacarias Janssen ou Hans Lippershey. Entretanto em 1609, Galileu fez seu primeiro microscópio. Todavia, o microcóspio só foi assim chamado em 1925, por Geovanni Faber (MANNHEIMER, 2002).
O microscópio óptico é composto por duas partes, a primeira é uma parte mecânica, que faz o suporte e a segunda é a parte óptica que é responsável pela ampliação das imagens. Essa parte óptica é constituída por um conjunto de lentes, que são o sistema de lentes oculares e o sistema de lentes objetivas, e a ampliação que ocorre é igual ao produto da ampliação da objetiva pela ampliação da ocular (BURGGRAAFF, 1985).
Em todos os microscópios ópticos, atuais e antigos, teremos uma fonte de luz que é concentrada por um sistema de lentes condensadoras sobre uma amostra montada sobre uma lâmina. O feixe luminoso atravessa a amostra e é captado por uma lente objetiva que produz uma primeira imagem ampliada do objeto, que será em seguida captada pela lente ocular que projetará a imagem final na retina do observador (ATTIAS, 2010).
3.2.3 Técnicas cromatográficas
A cromatografia é uma técnica bastante utilizada para a identificação e quantificação de fármacos. Consiste em uma técnica físico-química de separação e fundamenta-se na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre as duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A classificação das técnicas cromatográficas mais comuns refere-se quanto ao mecanismo de separação;
quanto à técnica empregada e em relação ao tipo de fase móvel utilizada (LANÇAS, 2009).
A Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência (CLAE) e, mais recentemente, a Cromatografia a Líquido de Ultra Eficiência (CLUE) são técnicas bastante utilizadas para análise de substâncias, fármacos, medicamentos e matérias-primas devido à obtenção de resultados mais precisos, rápidos, utilizando partículas cada vez menores e menos solvente em comparação a outras técnicas cromatográficas (SIDDIQUI et al, 2017)
O detector mais utilizado em CLAE e CLUE é o ultravioleta (UV) do tipo rede de diodo (DAD), com este detector é possível monitorar vários comprimentos de onda ao mesmo tempo, isto porque se aplica um programa de varredura de comprimento de onda múltiplo. O detector UV/DAD assegura que todos os componentes que absorvem UV são detectados (SIDDIQUI et al, 2017)
A técnica cromatográfica mais importante do século XX é a cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas (CL/EM) (NIESSEN, 1999). Como pode ser observado por Nicolas e Scholz, 1998, ela é a técnica de escolha em muitas etapas do controle de qualidade na indústria farmacêutica. Existem muitos artigos que utilizam o CL/EM para identificação e quantificação de metabólitos como, por exemplo, BOLECHOVÁ et al, 2015 e de fármacos como por exemplo HILHORST et al, 2011; ZHOU et al, 2011.
O fundamento da espectrometria de massas envolve a produção de íons em fase gasosa a partir da amostra, em uma fonte de ionização. Em seguida, no analisador de cargas, acontece a separação desses íons baseado na sua razão massa-carga. Neste momento pode ser que ocorra a fragmentação dos íons e esses fragmentos serão analisados em um segundo analisador. A abundância desses íons é medida então por um detector que converte os íons em sinais elétricos (HOFFMANN, 1996).
Existem vários tipos de analisadores de massas, entre eles temos o tempo de voo (TOF), íon trap e orbitrap. Esses analisados diferem quanto aos seus princípios, vantagens e desvantagens.
Os mais simples são os do tipo TOF, baseando-se na separação dos íons de diferentes m/z, entretanto, com a mesma quantidade de energia cinética e, sua velocidade será inversamente proporcional à raiz quadrada da sua massa. Logo, se dois íons com massas diferentes e com a mesma carga, são aceleradas através de um campo elétrico com potencial constante, suas velocidades irão depender de suas massas, e eles atingirão o detector com diferentes “tempos de voo”. Assim, o íon de menor massa atingirá o detector primeiro, enquanto que o de maior massa levará mais tempo para chegar ao detector (HOFFMANN, STROOBANT, 2007; DASS, 2007).
4 MATERIAL E MÉTODOS
A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos (LCQM) na Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) em parceria com Núcleo de Pesquisa em Alimentos e Medicamentos (NUPLAM) na Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), o Laboratório de Desenvolvimento de Medicamentos (LDM) na Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Laboratório de Hematologia na Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
4.1 Monocrotalina
A Monocrotalina utilizada foi isolada da Crotalaria retusa pelo grupo pesquisa de produtos naturais bioativos (PNBio) na Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), os solvente utilizados nesse trabalho foram o MEOH, ACN, Ácido Fórmico todos grau HPLC (J.T.Baker Solusors, México).
Para as análises de FTIR e MO, a monocrotalina foram aquecidas nas temperaturas de 50, 100, 150, 200 e 250 ºC, em estufa de secagem da Quimis. A outra amostra utilizada foi a semente de monocrotalina para o preparo do extrato, e com ele foi feito a quantificação de monocrotalina.
4.2 TG/DTG, DSC e DTA da Monocrotalina
A caracterização termoanalítica por TG dinâmica e DTA foi realizada em
uma termobalança DTG-60 da Shimadzu®. Foram pesados 10 mg da amostra
de monocrotalina em cadinho de alumina sob atmosfera dinâmica de nitrogênio com vazão de 100 mL.min1, com razões de aquecimento de 2,5; 5; 10; 20 e 40 °C.min-1 na faixa de temperatura de 25 a 900 ºC. E em seguida, com esses resultados, foram obtidas as curvas termogravimétricas e as de análise térmica diferencial. O equipamento foi previamente calibrado empregando-se uma amostra de oxalato de cálcio monoidratado.
Para se obter as curvas DSC foram pesados em cadinhos de alumínio aproximadamente 2 mg da amostra, que, em seguida, foram hermeticamente fechados, e colocados no DSC-60 (Shimadzu), nas razões de aquecimento de
( )
2,5; 5; 10; 20 e 40 ºC.min-1 até a temperatura de 25 a 500 ºC, numa atmosfera de nitrogênio a um fluxo de 100 mL.min-1. Antes dos ensaios verificou-se a calibração do instrumento empregando-se uma amostra o padrão índio através de seu pico de fusão (156,6 ºC ± 0,3 ºC) e a entalpia calibrada com o calor de fusão do índio (28,58 J.g-1 ± 030 J.g-1). Também foram obtidas as curvas DSC. O software TASTY 60 (Shimadzu) foi utilizado para analisar as curvas TG, DTA e DSC, e para obter e analisar a DTG.
4.2.1 Cinética de degradação por método de Ozawa
Para ser realizado o tratamento matemático foi escolhido o modelo matemático de Ozawa, que é um modelo isoconvencional, apartir das curvas TG dinâmicas obtidas, escolheu-se o terceiro evento, que é o local que ocorre a maior perda de massa. Para se obter os dados cinética foi realizado um tratamento matemático.
Nesse estudo foram determinados os seguintes parâmetros cinéticos: Ordem de reação, energia de ativação e o fator de frequência.
Para esse modelo de Ozawa (Ozawa, 1965) foi utilizada a seguite equação:
[
] (1)
Onde: α = fração decomposta, T = Temperatura, A = fator de frequência, R =
Constante dos gases, E = Energia de ativação, Φ = razão de aquecimento, Ts = Temperatura do pico.
Os parâmetros cinéticos foram obtidos pelo programa TASYS da Shimadzu (Kinetic Analysis TG).
4.3 Técnicas Complementares
4.3.1 Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier – FTIR
Os espectros do infravermelho da monocrotalina, foram obtidos em um espectrofotômetro ATR-FTIR, modelo IRprestige-21 da Shimadzu, na faixa espectral compreendida de 700 a 4000 cm-1 com uma média de 20 varreduras por amostra. Utilizou-se para avaliar os resultados a Correlação de Pearson, que é calculado fazendo uma correlação entre o espectro teórico da monocrotalina em temperatura ambiente (25°C) e os espectros experimentais da substância submetidos a diferentes temperaturas. Os dados foram exportados no formato ASCII e posteriormente tratados em software Mallab®, os dados de transmitância foram convertidos em absorbância.
Foi obtida a Correlação de Pearson para cada temperatura, entre os espectros teóricos e o experimental e quanto mais próximo de 1 indica-se a ausência de decomposição térmica entre a monocrotalina nos diferentes aquecimentos.
As amostras de monocrotalina foram aquecidas até as seguintes temperaturas: 25, 50, 100, 150, 200 e 250 °C, em estufa de secagem, foram utilizados 300mg para cada aquecimento, após serem aquecidas as amostras foram analisadas e ao obter os resultados foram comparados com os resultados das curvas TG e DSC, um complementando o outro, obtendo-se assim as características físicas e químicas da monocrotalina.
4.3.2 Difração de raios-x – DRX
Para a técnica de DRX, o diafratômetro de raios-x Shimadzu, modelo Maxima_X XRD-7000. Foram utilizados 300 mg da amostra que foi submetida a rápida exposição dos raios em um intervalo angular de 5-80°(2θ). O equipamento é operado com uma tensão de 40.0 kV, 30.0 mA e os dados foram tratados no software Origin 8.0.
4.3.3 Microscopia óptica - MO
Na MO, a amostra foi observada com as lentes objetivas de 10x e de 40x. O microscópio equipado com câmera embutida (Leica microsystems DM500 micro, com módulo ICC50 W alta definição) Avaliado pelo Software Leica Las E Z.
4.3.4 Captura de imagens do processo de decomposição
Foram capturadas imagem da amostra através do ponto de fusão utilizando o método de determinação por capilaridade no aparelho de ponto de fusão Quimis modelo Q340S23, sob aquecimento direto, onde a amostra foi aquecida até 300 °C. As imagens dos principais eventos térmicos foram adquiridas utilizando uma câmera marca Motorola, modelo XT1540.
4.4 Técnicas Cromatográficas
4.4.1 Cromatografia líquida de ultra eficiência – CLUE
O cromatógrafo utilizado foi o UFLC XR (Shimadzu) equipado com degaseificador DGU-20A3, sistema de bombas binário LC-20AD XR, auto amostrador SIL-20AC XR, forno da coluna CTO-20AC, sistema de detecção DAD SPD-M20A e módulo de comunicação com o computador CBM-20A. Foram utilizadas colunas Shim-pack com grupos octadecilsilano (C18), modelo XR-ODS: 50 mm x 3 mm e 75 mm x 4.6 mm. O diâmetro interno de partícula foi 2,2 µm. Antes de introduzidos no sistema os solventes, em ambos os métodos, foram filtrados em membrana de 0,22 μm (Millipore) e desgaseificados por ultrassom (QUIMIS-Q3350).
4.4.1.1 Preparo de amostras
Para preparar a solução estoque foi pesado 10 mg de monocrotalina em um balão volumétrico de 10mL, e completou-se o balão com água:metanol (50:50), obtendo-se assim uma solução estoque de 1000ppm (1 mg.mL-1), essa solução foi armazenada na temperatura de 4°C e envolvida com papel alumínio para proteção da luz.
A partir dessa solução é preparada a solução padrão, em que pega 300 µL da solução estoque e coloca em um microtubo de 1,5 mL, se obtendo então uma concentração de 100 ppm (0,1 mg.mL-1), sendo assim foram preparados 4 microtubos, pois foram realizadas 4 análises diferentes, cada uma com uma fase móvel diferente. Nesses microtubos, para ser obter a concentração de 100ppm, foram adicionados 1200 µL de suas fases móveis utilizadas na proporção de 50%. A amostra que foi analisada com a fase móvel de água:metanol, foi completado o microtubo com àgua:metanol (50:50), a que foi analisada com a fase móvel água:acetonitrila, se adicionaou no microtubo água:acetonitrila (50:50), a que foi analisada com ácido fórmico 0,1%:metanol, foi colocado no microtubo ácido fórmico 0,1%:metanol (50:50) e para a fase móvel de ácido fórmico 0,1 %: acetonitrila, foi completado o microtubo com ácido fórmico 0,1 %: acetonitrila (50:50).
Foram realizados quatro métodos com o CLUE: Método 1 composta por água e metanol (MeOH); método 2 composta por ácido fórmico (AF) 0,1% e MeOH; método 3 constituída por água e acetonitrila (ACN) e método 4 formada por AF 0,1% e ACN. Esses métodos foram realizados de acordo com as condições da Tabela 1.
Tabela 1 – Condições cromatográficas utilizadas na análise do CLUE.
Parâmetros Condições
Composição de Fase Móvel Água:MeoH/ AF 0,1 %: MeOH / Água:ACN / AF 0,1 %:ACN Fase estacionária C18: 50x3 mm e 75x4,6 mm, partículas 2,2µm
Concentração 200 ppm (0,2 mg.mL-1) Gradiente (%) 5 – 100 solvente orgânico Fluxo (mL.min-1) 0,2
Volume de injeção (µL) 1 Temperatura (°C) 30
Tempo (min) 45
O gradiente utilizado no CLUE está esquematizado na Tabela 2
Tabela 2 - Esquema da análise em gradiente da monocrotalina por CLUE
4.4.2 Cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas – CL/EM
O equipamento utilizado foi o CL-EM/TOF (Agilent) constituído pelos seguintes módulos: Sistema de Cromatografia Líquida 1260 Infinity® (Bomba quaternária, autoinjetor, forno para coluna, equipado com bomba, pré- aquecimento de fase móvel e termostatizador de amostras) acoplado a sistema de espectrometria de massas do tipo TOF, modelo 6230BA, de alta resolução (22.000 FWHM) e exatidão de massa, erros <1 ppm com fonte Electrospray, as quais cobrem todo o espectro de compostos químicos, de polares a apolares e em diferentes matrizes e gerador de nitrogênio de capacidade para vazão de 32L.min-1. Foi utilizada coluna Shim-pack com grupos octadecilsilano (C18), modelo XR-ODS de 50 mm x 3 mm com partícula de 2,2 µm.
Time (min) Solvente A (água/ácido fórmico 0,1%) Solvente B (metanol/acetonitrila) 1 0 – 5 95 5 2 5 – 35 0 100 3 35 – 40 0 100 3 40 – 41 95 5 4 41 – 45 95 5
4.4.2.1 Preparo de amostras
A solução estoque utilizada foi a mesma que a utilizada no CLUE.
Para o preparo da solução padrão foi retirado da solução estoque 3 µL e colocado em um microtubo de 1,5 mL, atingindo uma concentrado de 2 ppm (0,002 mg.mL-1), foram preparados dois diferente microtubos e eles foram completados de acordo com a fase móvel utilizada.
Os que utilizaram água:acetronitrila foram utilizados para diluição água:acetonitrila (50:50), e os que utilizaram ácido fórmico 0,1%:acetonitrila, para completar o microtubo foi utilizado ácido fórmico 0,1 %: acetonitrila (50:50).
Sendo assim foram realizados mais dois métodos com o CL/EM, que foram os seguintes: Método 5 composta por água e ACN; método 6 constituída por AF 0,1% e ACN. Esses métodos foram analisados de acordo com as condições da Tabela 3.
Tabela 3 – Condições cromatográficas utilizadas na análise no CL/EM
PARÂMETROS CONDIÇÕES
Composição de Fase Móvel Água:ACN / AF 0,1 %: ACN Fase estacionária C18: 50x3 mm, partículas 2,2µm
Concentração 2 ppm (0,002 mg.mL-1) Fluxo (mL.min-1) 0,3 Volume de injeção (µL) 3 Temperatura (°C) 25 Tempo (min) 30 Massa 326
Tabela 4 - Esquema da análise em gradiente da monocrotalina por CL/EM Time (min) Solvente A (água/ácido fórmico 0,1%) Solvente B (metanol/acetonitrila) 1 0 – 3 95 5 2 3 – 20 0 100 3 20 – 25 0 100 4 25 – 26 95 5 5 26 – 30 95 5
Em seguida para uma otimização do método foi realizado o método 7, para esse método a amostra padrão e a amostra estoque foi diluída apenas com ácido fórmico 0,1%, ficando com uma concentração final de 2 ppm (0,002 mg.mL-1), com a mesma concentração da amostras do método 5 e método 6. A fase móvel do método 7 foi composto por AF 0,1% e ACN, nas condições da Tabela 5 e com o gradiente esquematizado na Tabela 6.
Tabela 5 – Condição cromatográfica utilizada na análise no CL/EM, após otimização
PARÂMETROS CONDIÇÕES
Composição de Fase Móvel AF 0,1 %: ACN
Fase estacionária C18: 50x3 mm, partículas 2,2µm Concentração 2 ppm (0,002mg.mL-1) Fluxo (mL.min-1) 0,2 Volume de injeção (µL) 1 Temperatura (°C) 25 Tempo (min) 25 Massa 326
Tabela 6 - Esquema da análise em gradiente da monocrotalina por CL/EM, após otimização Time (min) Solvente A (água/ácido fórmico 0,1%) Solvente B (metanol/acetonitrila) 1 0 – 3 95 5 2 3 – 20 0 100 3 20 – 25 0 100
4.4.2.2 Preparo de fase móvel
Para se analisar a monocrotalina foram utilizadas quatro soluções que foram as seguintes: A água ultrapura, obtida a partir do equipamento de milli- q®; o metanol (MeOH), a acetonitrila (ACN); e Ácido Fórmico 0,1 %.
Todos os solventes utilizados foram grau HPLC, todos eles foram filtrados, inclusive a amostra, em filtro de diâmetro de 0,22 µm para o CLUE, no CL/EM, não é necessário filtrar os solventes, apenas a amostra.
Para o preparo do ácido fórmico 0,1 %, utilizou-se 0,5mL e 499,5 mL de água ultrapura, obtendo então 500 mL dessa solução.
4.4.2.3 Preparo da curva analítica
Para ser realizado a curva analítica foram preparados 6 concentrações diferentes de monocrotalina. A primeira concentração foi de 2 ppm (0,002 mg.mL-1), para ela retirou-se 4 µL da solução estoque, colocado em um microtubo de 2,0 mL e acrescentado 1996 µL de ácido fórmico 0,1%. A segunda concentração foi de 1 ppm (0,001 mg.mL-1), retirou-se 1250 µL da solução de 2 ppm colocou em um microtubo de 1,5 mL e acrescentou 1250 µL de ácido fórmico 0,1 %. Para a terceira concentração foi retirado 625 µL da concentração de 2 ppm para um microtubo de 1,5 mL e adicionou-se 875 µL de ácido fórmico 0,1 %, obtida então a concentração de 0,5 ppm (0,0005 mg.mL-1) no terceiro ponto. A quarta concentração de 0, 25 ppm (0,00025 mg.mL-1) foi
obtida pegando-se 625 µL da concentração de 1 ppm transferindo para um microtubo de 1,5 mL e adicionou 875 µL de ácido fórmico 0,1 %. Na quinta concentração, de 0,1 ppm (0,0001 mg.mL-1), foi retirado 75 µL da solução de 2 ppm e adicionado em um microtubo de 1,5 mL e completado com 1425 µL com ácido fórmico 0,1 %. A sexta concentração é de 0,05 ppm (0,00005 mg.mL-1), para ser preparada utilizado 625 µL da solução de 0,25 ppm e colocada em um microtubo de 1,5 mL e acrescentado 875 µL de ácido fórmico 0,1 %.
4.4.2.4 Preparo do extrato
Para o preparo do extrato, foi utilizado 1 grama de semente de Crotalaria
retusa, essas sementes foram trituradas com grau e pistilo em seguida são
colocados em um recipiente para o armazenamento e acrescentado 10 mL de metanol ficando em maceração por 24 horas, envolvido com papel alumínio e em temperatura ambiente (NEGREIROS NETO, 2016).
Esse extrato ficou em uma concentração de 100000 ppm (100 mg.mL-1). Esse extrato foi diluído para 200 ppm (0,2 mg.mL-1), para isso foi retirado 3 µL do extrato, adicionado em um microtubo de 1,5 mL e acrescentado 1497 µL de ácido fórmico 0,1 %.
5 RESULTADOS
5.1 TG/DTG, DSC e DTA da Monocrotalina
Foram analisados TG e DSC para a monocrotalina nas razões de aquecimento (β) 2,5; 5; 10, 20 e 40 ° C.min-1
e suas respectivas curvas foram obtidas, como pode ser visto na Figura 2 e na Figura 5. Na Tabela 7, estão descritos todos os eventos que foram observados nas curvas TG nas diferentes razões de aquecimento.
Figura 2 – Curvas TG da monocrotalina, nas razões de aquecimento de 2,5 °C.min-1 (vermelho); 5 °C.min-1 (azul); 10 °C.min-1 (verde); 20 °C.min-1 (roxo) e 40 °C.min-1 (cinza).
Fonte: Própria do autor.
Na Tabela 7 pode ser observado, que é no terceiro evento que ocorre a maior termodecomposição da monocrotalina, ou seja, é quando ocorre a maior perda de massa (Δm), observa-se também que quanto maior a razão de aquecimento (β), maior a temperatura para que o evento ocorra.
Ao avaliar a razão de aquecimento de 10°C.min-1 da curva TG, Figura 3, é visto que a primeira etapa ocorre entre as tempeturas de 32 e 100 °C, tendo uma perda de massa de 0,7%, ou seja, uma pequena perda que ocorre provavelmente devido uma dessolvatação, água ou algum solvente retido na amostra de monocrotalina durante o processo de isolamento, enquanto que nas outras etapas tem-se respectivamente perdas de massa de 4,2; 64,7; 21,3 e 3,2 %.
Figura 3 – Curvas de TG/DTG na razão de aquecimento de 10 °C.min-1
Fonte: Própria do autor
A provável reação que ocorre durantes esses eventos que foram observados nas curvas TG pode ser observada na Figura 4, nela se observa até o terceiro evento que é quando ocorre a maior termodecomposição e após esse terceiro evento na análise de TG resta apenas a base nécica na substância inicial, os outros dois eventos de termodecomposição é quando ocorre a degradação desse anel da base nécica.
Figura 4 – Provavel reação de degradação da monocrotalina com o aquecimento.
Fonte: Autor próprio
Tabela 7 – Relação dos eventos térmicos observados nas curvas TG
β (°C.min-1 ) 1° 2° 3° 4° 5° Residuo 2,5 T (°C) 26 – 100 3 100 - 185 4,7 185 - 321 66,8 321 - 443 17,1 443 - 900 3,8 Δm(%) 8,2 % 5,0 T (°C) 25 – 100 0,6 119 - 199 6,0 200 - 280 61,5 281 - 469 19,3 469 - 900 Δm(%) 2,9 9,7 % 10,0 T (°C) 32 – 100 0,7 123 - 204 4,2 203 - 286 64,7 287 - 517 21,3 517 - 900 3,2 Δm(%) 5,9 % 20,0 T (°C) 32 - 100 0,5 124 - 208 2,8 208 - 313 66,1 212 - 595 21,5 595 - 900 3,7 Δm(%) 5,4 % 40,0 T (°C) 33 - 100 0,5 143 - 234 4,8 212 - 342 66,5 341 - 576 19,4 576 - 900 12,5 Δm(%) 100%
Ao analisar as curvas DSC, Figura 5, também é observado que ocorrem cinco eventos, entretanto o primeiro evento não pode ser observado na razão de aquecimento (β) de 2,5 °C.min-1
, nesse evento, ocorre a contração da amostra de monocrotalina, por isso ele é observado nas curvas DSC, essa contração pode ser comprovada quando se observa os resultados da captura de imagens do processo de decomposição, pois nessa temperatura é observado essa contração da amostra. Nesse primeiro evento, ainda pode ser observado que quanto maior a razão de aquecimento melhor de observar esse evento.
Figura 5 – Curvas DSC da monocrotalina, nas razões de aquecimento de 2,5 °C.min-1 (vermelho); 5 °C.min-1 (azul); 10 °C.min-1 (verde); 20 °C.min-1 (roxo) e 40 °C.min-1 (cinza).
Fonte: Própria do autor
Com as curvas DSC pode ser observado no segundo e terceiro evento uma fusão seguida de decomposição, o que pode ser observado quando sobrepõe a curva TG com as DSC na razão de aquecimento de 10 °C.min-1. Analisando a razão de aquecimento de 10 °C.min-1, o primeiro evento apresenta uma Tonset em 133 °C e Tpico em 143 °C, com entalpia (ΔH) de 3,91
J.g-1, sendo esse evento exotérmico, quando comparado com a captura de imagem do processo de decomposição, é observado que esse evento ocorre devido uma contração da monocrotalina, Figura 10 (imagem 4). O segundo evento, na β 10 °C.min-1
, apresenta uma Tonset em 202 °C e Tpico em 204 °C,
com uma entalpia de 28 J.g-1, sendo esse evento endotétmico, é nele que ocorre a fusão. O terceiro evento é seguido do segundo, este é um evento exotérmico que ocorre com uma Tonset em 205 °C e uma Tpico em 208 °C, tendo
uma ΔH 138,83 J.g-1
, ao ser analisado as sobreposições das curvas TG e DSC na β 10 °C.min-1 Figura 7, é observado também que é nesse evento que
acontece a maior decomposição da substância. O quarto é um evento endotérmico ele expõe uma Tonset em 218 °C e o Tpico em 231 °C, tendo um e
ΔH de 66,29 J.g-1
, nesse evento também ocorre termodecomposição da monocrotalina, que pode se observado na Figura 7 que sobrepõe DSC e TG. No quinto e último evento, ele ocorre com uma Tonset em 394 °C e uma Tpico em
404 °C, a ΔH de 109 J.g-1
. Observa-se que esse evento é exotérmico e nele quando analisando a sobreposição das curvas TG e DSC, Figura 7, observa-se que ocorre uma pequena termodecomposição também.
Figura 6 – Curvas DTA e DSC na razão de aquecimento de 10 °C.min-1
Fonte: Própria do autor
Todos esses eventos estão descritos nas Tabelas 7 (eventos de TG) e Tabela 8 (eventos de DSC).
