Técnica bacteriológica elementar

Pharmaceutic!) de t . " classe, alumno praticante do Laboratório Nobre, preparador interino da Escola de Pharmacia do Porto e pharmaceutic praticante no Laboratório chimico municipal do Porto

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<3ccfíniea

Bacteriológica

elementar

Dissertação inaugural

APRESENTADA Á

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Outubro "Í903

Escola Medico-Cirurgica do Porto

—g|© C o r p o c a t l i e d . r a t i c o Lentes cathedraticos 2 a 4.» ò'.a 6.» 8.' 9.' 10.' II.' 12a Lí.a 14." lo.» Cadeira—Anatomia descripti-va geral Cadeira—Physiologia . . Cadeira—Hi storia natural dos medicamentos e materia me-dica

Cadeira —Pathologia externa e therapeutica externa . Cadeira—Medicina operatória Cadeira—Partos, doença das mulheres de parto e dos re-cem-nascidos

Cadeira—Pathologia interna e therapeutica interna Cadeira—Clinica medica Cadeira—Clinica cirúrgica . Cadeira — Anatomia pàtholo-gica

Cadeira — Medicina legal. Cadeira—Pathologia geral, semeiologia e historia medica Cadeira—Hygiene

Cadeira—Hystologia normal. Cadeira—Anatomia topogra-graphica

Luiz de Freitas Viegas Antonio Placido da Costa Illydio Ayres Pereira do Valle Antonio J. de Moraes Caldas Clemente J. dos Santos Pinto Cândido A. Corrêa de Pinho José Dias d'Almeida Antonio d'Azevedo Maia Roberto B. do Hosario Frias Augusto H. d'Almeida Brandão Maximiano A. d'Oliveira Lemos Alberto Pereira Pinto d'Aguiar João Lopes da S. Martins Junior José A. Mendes de Magalhães Carlos Alberto de Lima

Lentes jubilados

Secção medica . Secção cirúrgica

Secção medica . Secção cirúrgica

José d'Andrade Grainaxo $ Pedro Augusto Dias \ Dr. Agostinho A. do Souto Lentes substitutos

S Vaga Vaga S Vaga

) Antonio J. de Sousa Junior

Lente demonstrador

dissertação e enunciadas nas proposições.

Jï

Nereis proximo reali= zados cs vossos sonhos.

Torturas, sacrificiss . .. ©jcala, que breve vos possa alii vi ar.

4o

meu extremoso

I R M Ã O

I

_{©SE P l l E l}

Sú/ds fonae . . . mas òempi ao meti ia a o.

Á MEMORIA

DA

d.e aseievi T i o

I LUIZ JOSÉ JOAQUIM SOARES

Cónego da Sé de Lamego

111."10 Ex."» S n r .

t. Alberto Fmlra P. d'Àffolu

Professor immaculado. Amigo inegualavel . . .

Que dizer m a i s ? T . . . Obrigado por tudo.

ofõtuno (St-fves

z/Co$ze-(Reproduccão do retrato a óleo existente na Sala dos Conselhos da Escola Medico-Ci-rúrgica do Porto)

Tenho a plena consciência de que empreguei todos os meus esforços e toda a minha actividade em ^elar os interes-ses d'esta instituição.

Para elucidação transcrevemos a seguinte nota do relatório de 1898 publicado pelo seu digno Di-rector o 111.1"0 e Ex.mo Snr. Dr. Aguiar:

«A designação de Laboratório Nobre é uma justa home-nagem á memoria do benemérito Bruno Alves Nobre, falle-cido em u de julho de 1891; na pratica d'um levantado pensamento de philantropia, deixou no seu testamento á

Escola Medico-cirurgica do Porto o importante iegado de

80 contos de reis, com a obrigação da dita Escola custear

com doze mil reis mensaes a educação, até completa for-matura, de doze pensionistas pobres.

«O regulamento elaborado por accordo entre a Escola Medica e a testamentária do illustre doador, para a pratica e execução do legado, estatue no art. 12.0 12.0 que «as

so-bras annuaes que houver do rendimento do legado Nobre serão empregadas em beneficio do ensino da Escola

Medico-cirurgica do Porto, e pelo modo que esta entender mais conveniente.»

Foi tendo em vista a utilidade e elevação do ensino que a Escola julgou conveniente acceitar o accordo com a Mesa da Misericórdia, para a creação d'um Laboratório d'analyses que prestasse ao Hospital de Santo Antonio os serviços que as suas numerosas clinicas reclamassem, mas ainda forne-cesse trabalho, ás différentes cadeiras da Escola. Em um officio de 5 de agosto de 1895, dirigido pelo então Director da Escola, o ex."'0 snr. Conselheiro Wenceslau de Lima, ao

ex."1" snr. Vice-provedor em exercício, Dr. Gomes Teixeira,

transmittem-se as bases do accordo, tomadas sobre o as-sumpto pelo concelho escolar, e exprime-se á Mesa da Mi-sericórdia, o desejo de que ao novo estabelecimento se dê o nome do benemérito Alves Nobre.

Coroados de bom êxito todas as negociações, a Escola tomou conta do Laboratório a 22 de janeiro de 1897, pro-cedendo-se desde logo, como dizemos, á sua completa ins-tallação».

N o m e a d o pelo Conselho da Escola Medico-cirurgica por proposta do seu Director, depois de u m a curta a p r e n d i z a g e m de 3 m e z e s , A l u m n o pra-ticante, c o m vencimento, fazemos p a r t e do pes-soal do L a b o r a t ó r i o d'esde janeiro de 1900.

Prof. Antonio Joaquim de Sooza Junior

AO

S Á B I O

cxarii^xco

O £x.m 0 pNR,

Conselheiro Ferreira da Silva

Tributo de admiração peio sen elevado

talento-Ao

. Ill.m o e Bx.">° S n r .

QÁ consideração que tenho por V, E%.* não pode egualar a amizade que dedica a meu Pae.

JLo m e u

de m e u s P a e s

UNJ1L LOURENÇO Ï1ÏIBAB1

e sua ïx.n , a ^amifiû:

&is suas cãs foram por mim sempre veneradas. S O B R E V I V E N T E S DA EXTTNCrM

^4M®®â®fê© i® B®®»®!®,

Qi _ïanctdca v:le art &7i/ua Qyùtaa

jío

Álvaro de Souza

E x ,

E s p o s a c filrjiQ^a

fllaig umct ppovû d'omi^odc.

,^_ JÍO M E U A M I G O

Braz de Ai me ida

'

Parentes

todos os rgeus

^n^igos

J Ï iodos os meus

Condiscípulo^

meus contemporain

E ESPECIALMENTE

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Dr. Carlos de Lomosi

i li©E MlEiitttt itllÉ®

J L K T O K I O Q U E R R A

E

C a r d o s o T a v a r e s

Tenho em subida consideração os serviços que prestastes ao La-boratório Nobre.

Laboratório Nobre

<Jjiniz cy^a ti eia

cfTexncinda L^catiec cia (^ctt-ma

Ho Barbosa da "Morgue,,

Ho Oliveira do "ftobrz,, Ho Gunha ç ao Hntonio do "Bomfirrç,,

DIGNÍSSIMO PRESIDENTE

11:114 Î I 1 S I

éiïr0 e &mo Sr.i

Entre os vários assumptos que nos éram suggeridos pelo expediente das diversas sec-ções do Laboratório Nobre escolhemos para rematar o nosso curso medico-cirurgico o de

«Technica bacteriológica elementar».

O nosso trabalho, que constitue uma parte do que tencionávamos fazer e que uma serie de circumstancias nos obrigou a apresental-o tão reduzidamente, exige, depois de refundido, a historia natural das bactérias pathogenicas e a sua applicação á clinica.

Tal como se apresenta é d'uma utilidade muito limitada.

Continua-lo-hemos? éra esse o nosso em-penho. Não o promettemos... a nossa situa-ção está ainda muito longe de ser definida.

Lacunas, é certo encontrarem-se ; deficiên-cias, n'este arrazoado não faltarão.

São erros próprios d'um inexperiente. Comtudo se não servir de estimulo a que outras pennas mais eruditas explanem o as-sumpto com proficiência bem superior á nossa, sirva ao menos, e é esse o nosso desejado fim, de guia aos alumnos que se entregam

gia.

A estes, para supprir as deficiências e pre-encher as lacunas, offerecemos no Laborató-rio Nobre, se nos fôr permittido, o que é de esperar vistos o espirito extremamente franco do seu Director o Ill.mo e Ex mo Snr. Dr. Alberto

d'Aguiar e o denodado empenho que o Conse-lho escolar tém em tornar cada vez mais o ensino não só profícuo como ainda variado, todo o nosso concurso; dispomo-nos ao seu serviço tanto quanto permittirem as forças ao nosso alcance e animados sempre da melhor boa-vontade.

Dividimos o nosso trabalho em três par-tes: a primeira, diz respeito ao material de bacteriologia e aos principaes productos pa-thologicos sobre que geralmente incide a ana-lyse; a segunda, é consagrada á technica do diagnostico e isolamento das bactérias; e final-mente, a terceira, trata dos diversos processos de esterilisação, da preparação de corantes e dos meios de cultura.

PRIMERA PARTE

CAPITULO I

Material de bacteriologia

Ha uma grande variedade de instrumen-tos usados em bacteriologia a maioria dos quaes são d'uma utilidade por vezes contestá-vel ou pelo menos d'uma applicação muito restricta.

Mencionaremos apenas aquelles que são absolutamente indispensáveis e d'um uso cor-rente no Laboratório Nobre, taes como : tubos de ensaio, placas de Petri, balões de Erlen-meyer, balões de fundo chato, pipettas Pas-teur, crystallisadores e os instrumentos desti-nados á colheita dos productos pathologicos para analyse.

TUBOS DE ENSAIO

Estes tubos são perfeitamente idênticos em tamanho e forma aos usados em chimica mas de paredes mais espessas.

Não conveem os tubos cuja extremidade aberta é circumscripta por bordos revirados,

não só porque se inutilizam com facilidade pela flammejação durante os diversos tempos da technica do exame cultural, como ainda esses bordos, fazendo uma saliência mais ou menos cortante, difficultam a applicação de capuzes, rompendo­os por vezes.

PLACAS DE PÈTRI

A placa de Pétri (fig. i), é constituída essencialmente por duas laminas de vidro circu­ lares, com bordos na peripheria muito baixos de io centímetros de diâmetro pouco mais ou

p ^ i i " r3' .■;íil,iiiriiiiiiiitri£ai»i»íii"É««i-iiniiii^' •" " '

Fig. í

menos e dispostas de maneira que uma d'ellas, de diâmetro maior, envolve a outra por com­ pleto.

A inferior, a envolvida, deve ser lisa e pla­ na quanto possivel para que a camada do meio de cultura tenha a mesma espessura em toda ella.

BALÕES DE ERLENMEYER

Designam­se com este nome frascos de vidro (fig. 2), de paredes delgadas cuja forma é a d'um cone truncado de base circular, se­ guindo­se á sua secção um pequeno collo cy­ lindrico de bordos revirados.

37

A sua capacidade varia entre 100 centí-metros cúbicos e dous litros.

Destinam-se no Laboratório Nobre á pre-paração dos diversos meios de cultura.

BALÕES DE FUNDO CHATO

Estes balões (fig. 3), teem a forma d'uma esphera em que um dos pólos é achatado ser-vindo de base e o outro termina n'um collo cylindrico e curto.

Fig. 2 Fig. 3

Teem os mesmos usos e capacidade dos de Erlenmeyer e raras vezes, assim como es-tes, são empregados para as culturas.

PIPETTAS PASTEUR

As pipettas Pasteur (fig. 4), são constituí-das por dous tubos de vidro ligados entre si por uma dilatação em forma de esphera ou de pêra com a capacidade de 100 a i5o cen-tímetros cúbicos ; um d'elles tem na sua parte

média um estrangulamento e o outro é pro-gressivamente afilado terminando em bico.

Com este apparelho distri-buem-se os diversos meios de cultura, principalmente o soro, nos tubos de ensaio ou em pe-quenos balões de fundo chato e de Erlenmeyer.

CRYSTALLISADORES

Fig. 4

São caixas de vidro (fig. 5), cuja forma é semilhante á das placas Petri com a variante de serem muito maiores e de pare-des mais elevadas, estando estas em relação com a capacidade que geralmente é de i a 2 litros. Servem quasi que exclusivamente á colheita de sangue nos mata-douros para preparação do soro.

*

Todos estes instrumentos de-vem ser lavados com agua ; dei-xam-se seccar com o tempo ou collocam-se na estufa até á completa seccura.

Em seguida são preparados da maneira que vamos indicar.

Os tubos de ensaio, os balões de Erlen-meyer e os de fundo chato são obturados com rolhas de algodão.

Tomam-se pequenas porções de algodão hydrophilo em pasta, dá-se-lhes a forma

con-3o

veniente por meio dos dedos e introduzem-se nas aberturas imprimindo-se-lhes leves movi-mentos de rotação em sentido contrario aos

Fig. 5

dados ao intrumento ou então colloca-se (fig. 6) o fragmento da pasta de dimensão variável, segundo o diâmetro, e deprime-se o algodão,

Fig. 6

fazendo-o entrar, com uma vareta de vidro ou mesmo com o dedo.

A pipetta Pasteur c acondicionada do se-guinte modo : introduz-se um pouco de algodão não muito apertado por meio d'um arame ou d'uma vareta de vidro fina até ao estrangula-mento sobre o qual repousa ; a extremidade affilada penetra no interior d'um tubo de en-saio (fig. 4) e ahi permanecerá até ao seu em-prego segura por algodão collocado na aber-tura do tubo.

As placas Petri são embrulhadas em papel de filtro Chardin ou em qualquer outro, mas um tanto poroso.

Finalmente os crystallisadores podem tam-bém ser embrulhados em papel, mas o mais próprio é encher o espaço entre a tampa e o recipiente (fig. 5), com tiras de pasta de algo-dão hydrophilo.

Assim preparados são esterelisados no au-toclave a 120o durante um quarto d'hora.

Como estes apparelhos estão constante-mente em uso, contendo sempre productos sépticos ou substancias liquidas, solidas e coa-guladas que serviram á vegetação bacteriana devem ser, antes de os lavar, esterelisados no autoclave á mesma temperatura mas por mui-to mais tempo. Depois são abandonados em re-cipientes grandes (celhas ou baldes de madeira) cheio de agua acidulada por acido chlorhydri-co durante alguns dias, passados os quaes se lavam e preparam como acima indicamos.

Este modo de preparação não pôde ser applicado aos tubos ou balões que serviram ás culturas em soro.

Depois da esterilisação são cheios ou mer-gulhados por egual tempo em soluções de

4'

soda cáustica para facilitar a extracção do coagulo de albumina.

Os instrumentos utilisados para a colheita e cultura dos productos destinados á analyse bacteriológica, são: fios de platina, pipettas, seringas, zaragatoas e laminas simples ou excavadas.

FIOS DE PLATINA

Estes instrumentos (fig. 7), formados de fio de platina iridiada e montados em cabo de vidro são de 3 formas

principaes: agulha, ansa e

espátula. Nos laboratórios f Ç estão permanentemente

as-sentes em supportes forma-dos por um parallelipipedo de madeira, tendo n'uma das suas faces uma serie de orifícios em que penetram os cabos do vidro.

Nunca se deve servir d'es-tes instrumentos sem serem primeiro levados ao rubro, assim como nunca se devem depois de servidos collocar no supporte sem serem de

novo levados ao rubro. Fis- 7

Estes instrumentos que

nos laboratórios de bacteriologia são d'um uso quotidiano teem em clinica um uso mais limi-tado ; prestam-se principalmente á colheita de exsudatos, suppurações limitadas (collo do

utero, urethra), ou qualquer outro producto pathologico em pequeníssimas quantidades.

Preparam-se facilmente: corta-se uma va-reta de vidro com o comprimento de dous ou três decimetros, aquece-se fortemente uma das extremidades, mantendo a vareta em mo-vimento rápido de rotação e assim que o vi-dro esteja sufficientemente molle introduz-se com uma pinça o fio de platina cerca de meio centimetro; continua-se a aquecer e com o mesmo movimento, até que a extremi-dade tenha sensivelmente a espessura egual ao da vareta.

Serve-se d'esté instrumento em posição egual á d'uma penna d'escrever, isto é, seguro entre os dedos indicador, medio e pollegar.

O fio de platina direito serve para na occasiâo d'emprego dar-se a forma mais ade-quada ao fim que se deseja, quando não haja á disposição todas as suas variedades. Assim: uma leve torsão ou curva em annel dada á sua extremidade constitue a ansa; a espá-tula é a sua extremidade achatada por uma serie de pancadas.

PJPETTAS

As pipettas são destinadas a recolher pro-ductos líquidos ou semi-liquidos (serosidade, sangue, pus) mas em maior quantidade, pres-tando-se sobretudo para depois de fechadas fazerem-se ulteriormente as preparações e cul-turas.

Preparam-se na occasiâo do emprego já esterilisadas e aptas para o uso, do seguinte

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modo : i.° colloca-se um pouco de algodão nas extremidades d\im tubo de vidro (com-primento 3 decimetros e de 3 a 4 millimetros de calibre); 2.0 aquecel-o egualmente por todo

o comprimento até que o algodão tenha uma côr levemente escura; arrefecer; 3.° aquecer fortemente a parta media imprimindo ao tubo movimentos rápidos de rotação até que o vi-dro amolleça bem ; 4.0 affastar vagarosa e

fir-memente sempre na direcção do tubo as duas extremidades e manter n'esta situação durante segundos fora da chamma ; passado este tempo que serviu a esfriar o vidro e impedir deforma-ções aquece-se a parte média até á fusão, de modo que as pipettas separando-se, fecham ao mesmo tempo ; ou então quebra-se a par-te allongada fechando-se as extremidades li-bres á lâmpada.

Podem-se ter já de ante-mão preparadas muitas pipettas mas não esterilisadas.

Na occasião do emprego collocam-se as rolhas de algodão nas extremidades livres e cada pipetta é introduzida nos tubos de ensaio ficando o corpo da pipetta entalado entre as paredes do tubo por meio do algodão.

São assim esterilisadas no autoclave, e a 120o durante quinze minutos.

Quando temos á disposição tubos de ensaio mas muito mais largos que os vulga-res, cada tubo pôde conter umas poucas de pipettas que se acondicionam e esterilisam como se fosse só uma. Conservam-se estas pipettas em tubos de ensaio, seguras com al-godão.

haja probabilidades de inquinação, esterili-sam-se de novo no autoclave e seccam-se na estufa.

Para se usar da pipetta faz-se sempre o seguinte:

i.° Segura-se o corpo da pipetta com a polpa dos dedos indicador, medio e pollegar da mão direita ;

2." Quebra-se a extremidade com uma pinça flammejada ;

3.° Flammeja-se a extremidade ; 4.0 Aspira-se a substancia ;

5.° Tapa-se o orifício superior com o dedo indicador;

6.° Fecha-se a extremidade á lâmpada.

Quando se querem fazer pre-parações e culturas por meio d'esta' pipetta, seguem-se os três primei-ros tempos deixando sahir o li-quido naturalmente ou auxilia-se a expulsão da substancia, so-prando.

SERINGAS

As seringas teem o mesmo fim que as pipettas mas são ordina-F'g- 8 riamente destinadas ás puncções

(abcessos não abertos, bubões, der-rames, liquido cephalo-rachidiano, etc.) As se-ringas esterilisam-se em caixas proprias que as acompanham por meio da agua em ebulli-ção ou no autoclave envolvidas em algodão ou em papel de filtro Chardin ; a agulha é

4*

flammejada na occasião do emprego ou é es-terilisada também no autoclave, mas colloca-da n'um tubo de ensaio que tenha agua com um pouco de carbonato de soda sufficiente para a mergulhar.

Pode-se esterilisar no autoclave a serin-ga já com a agulha, introduzindo-a n'um tubo de ensaio (fig. 8), de maneira que a sua ar-madura metallica envolvida em algodão fique

X

Fig. 9

um pouco de fora e segura por elle ás pare-des do tubo.

Estes instrumentos se bem que muito com-modos não deixam de causar muitas arrelias a quem d'elles se serve. Os defeitos principaes residem nos êmbolos que se alteram durante

a esterilisação. Para obviar a estes incon-venientes tem-se proposto os seguintes mode-los : seringas inteiramente metallicas de em-bolo macisso mas teem o inconveniente de se não vêr o aspecto do liquido e serem de dif-ficil limpeza ; as seringas todas de vidro, corpo e embolo, são muito frágeis e caras. Entre to-das affigura-se-nos que o modelo de Inghilleri ('fig. g), é o mais adequado; tem um duplo fim — seringa e pipetta — e é inteiramente de vidro.

Compõe-se de dois corpos separados por uma parte mais estreita C, e que é cheia de

al-godão.

Um d'elles B, é graduado e termina por uma parte muito estreita á qual se adapta a agulha; o outro A, é a parte aspiradora onde se move o embolo.

Esterilisa-se no autoclave sem embolo como qualquer apparelho de vidro e na occa-sião do emprego introduz-se o embolo que por não ter de estar em contacto com os lí-quidos sépticos não necessita esterilisação.

Um apparelho simples e muito usado no Laboratório Nobre, consiste n'um tubo de vi-dro munido n'uma das extremidades com uma rolha de algodão e á outra, um pouco estrei-tada pela chamma, adapta-se perfeitamente uma agulha de platina por intermédio d'um pequeno tubo de borracha.

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ZARAGATOA

A zaragatoa é destinada a recolher produ-ctos em cavidades naturaes (muco nasal, pha-ryngeo e falsas membranas).

CompÕe-se d'uraa pelota de algodão segu-ra a uma haste flexível (tal como barba de ba-leia ou junco) ou no caso de necessidade, á ex-tremidade d'ura arame ou vareta por meio de voltas de fio. Esterilisam-se no autoclave a

120° acondicionando uma ou mais zaragatoas

em tubos de ensaio cuja abertura é tapada com algodão.

Vão-se tirando uma a uma conforme as exigências do serviço e depois de recolhido o producto, introduzem-se isoladamente em tu-bos de ensaio esterilisados.

LAMINAS DE LYMPHA

Para a investigação pelo exame directo do agente da blenorrhagia costuma-se recolher o pus em laminas de lympha.

São duas placas de vidro (fig. 10), do mes-mo tamanho: uma serve de tampa; a outra mais espessa tem no meio uma pequena es-cavação onde se lança a gotta do pús.

Esterilisam-se por flammejação sendo de-pois juxtapostas e seguras por dois elásticos em cruz.

CAPITULO II

Colheita aseptica dos productos pathologicos

_ Os productos mórbidos que se destinam á^ investigação bacteriológica durante a vida são os seguintes:

Pús, suecos de adenites e de bubões, san-gue, derrames, exsudâtes, serosidades das phlyctenas, expectoração, urina, leite, liquido cephalo-rachidiano, etc.

PÚS

O pús pôde ser recolhido durante os cura-tivos e as operações por meio de pipettas.

Quando se trata d'um abcesso superficial eberto, serve-se da seringa para a puneção ou da pipetta a qual penetra no abcesso depois d'uma pequena abertura feita pelo bisturi com todas as precauções d'asepsia.

E' muito commodo o uso das laminas de lympha para pequenas quantidades de pús quando só se faz o exame directo immediato do produeto colhido.

Em geral estes productos são em grande quantidade e por consequência não haverá

receio de que a colheita não chegue para to-das as operações bacteriológicas.

No caso porém de ser muito reduzida, po-de-se diluil-a no laboratório n'um liquido es-terilisado, nutritivo ou não, já de antemão contido n'um pequeno tubo de ensaio.

ADENITES E BUBÕES

O sueco mais ou menos purulento é obti-do pela puneção exploraobti-dora com um obti-dos mo-delos de seringas que expozemos, feita com as precauções necessárias usadas em medicina operatória.

Quasi sempre se obtém tão pequena quan-tidade de produeto que é de toda a conve-niência, depois de depositar uma ou duas got-tas n'uma lamina destinada para o exame directo, lançar o restante sueco n'uma peque-na porção de caldo, lavando repetidas vezes a seringa com elle.

No caso que tenham de ser operados será mais próprio usar da pipetta.

SANGUE

E' tirado geralmente da polpa dos dedos,

se a quantidade de sangue necessária para a analyse não tiver de ser muito elevada.

Lava-se o dedo com agua, e em seguida com sublimado e alcool; cobre-se com algo-dão embebido no mesmo antiseptico e pre-viamente espremido.

Prompta a pipetta segura-se entre os den-tes, com a extremidade já partida e flammejada.

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Com a lanceia esterilisada em recipiente apropriado ou flammejada na occasião, faz-se uma picada ou pequena abertura e imme-diatamente applica-se a pipetta, aspirando o sangue que vae correndo fechando-se em se-guida á lâmpada.

Como o sangue se coagula rapidamente é conveniente fazerem-se as preparações e as culturas á beira do doente. Para

se evitar o apparato, o que é sempre preferível, costuma-se apoz a aspiração do sangue em quantidade suficiente, lançal-o n'um tubo de caldo, ou então, acabar de encher a pipetta com este meio nutritivo e fechal-a á lâmpada.

DERRAMES

As paracenthéses explorado-ras thoracica e abdominal, são operações usadas pelos analys-tas para esanalys-tas espécies de pro-ductos.

Quando o liquido extrahido seja limpido convém sempre obtel-o em maior quantidade com o fim de o sedimentar,

quer naturalmente, quer por centrifugação. Pôde obter-se maior quantidade por uma série de aspirações feitas pela seringa, despe-jando as porções extrahidas em tubos de en-saio esterilisados ou então servindo-se do tro-cate.

Para isso esterilisa-se primeiro o trocate com o mandril nas condições eguaes ao da esterilisação da seringa, isto é, envolvido em algodão, ou papel de filtro Chardin (fig. 1i), ou flammejado na occasião do emprego.

Depois de introduzido o trocate na região escolhida é retirado o mandril. Deixa-se cor-rer por alguns segundos o liquido e em se-guida approxima-se da cânula um tubo de ensaio de grandes dimensões ou um frasco de Erlenmeyer ou qualquer outro desde que elle esteja esterilisado.

EXSUDATOS

Os exsudatos pharyngeo, muco nasal, fal-sas membranas, são recolhidos em zaragatoas percorrendo as anfractuosidades da cavidade Com attrito ou leves fricções e em seguida in-troduzida a zaragatoa no mesmo ou em outro tubo de ensaio esterilisado.

Pôde succéder que com o tempo as amos-tras fiquem seccas o que torna diffkil depois o exame. Convém que este seja feito o mais rapidamente possivel ou que a zaragatoa se embeba de uma pequena porção de liquido estéril existente em um outro tubo de ensaio.

SEROSIDADES DAS PHLYCTENAS

Recolhem-se estas serosidades por meio de pipettas ; se são em quantidade tal que nem cheguem para encher a parte delgada da pi-petta contando já com a porção que se inuti-lisa ao fechar-se á lâmpada, servir-se-ha dos

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fios de platina com a condição de se fazerem as culturas e as preparações in loco, ou são esgotadas para um tubo contendo pequenas porções de caldo.

CORRIMENTOS

Os corrimentos provém de trajectos fistu-losos anormaes ou de cavidades e aberturas normaes.

D'um modo geral esses trajectos devem ser lavados e desinfectados resguardando-se durante 24 horas o seu orifício ou abertura de sahida com um penso húmido, tampão de algodão ou gaze hydrophila esterilisados.

Decorrido este tempo e retirado o penso, auxilia-se o escoamento todas as vezes que fôr possivel, pela pressão manual; regeitam-se as primeiras porções e aspiram-se as ultimas com uma pipetta adequada ao trajecto fistu-loso ou ao local do corrimento.

EXPECTORAÇÃO

A expectoração não necessita ser recolhida com todas as precauções de asepsia que de resto seria impossível de realisar, bastando apenas que o doente expectore para um frasco rolhado de bocca larga esterilisado.

Tratando-se apenas de exame directo po-demo-nos servir da expectoração contida na escarradeira onde vulgarmente se junta um li-quido antiseptico.

Para as culturas e inoculações desnecessá-rio é dizer que não convém de maneira

algu-ma a addição de qualquer antiseptico por mí-nimas que sejam as dozes.

URINAS

Egualmente a urina se se destina apenas ás investigações mais communs (Gonococ-cos e Bacillo de Koch) pelo exame directo, es-cusado é obtel-a com rigor aseptico absoluto, basta que os recipientes sejam lavados e des-, infectados pelo sublimado.

Para recolher a urina asepticamente des-infecta-se bem o meato, lava-se a uretra por meio de seringa de injecção com agua bórica e recolhe-se directamente com a sonda a não querer regeitar as primeiras porções da micção e só aproveitar as ultimas.

A sonda esterilisada está em communica-ção com um recipiente de bocca estreita ou frasco de Erlenmeyer resguardado de inqui-nação pelo dispositivo seguinte : a extremida-de exterior da sonda é introduzida no reci-piente e segura contra as paredes d'esté pela rolha de algodão. Depois de cessar o escoa-mento afasta-se o frasco tendo o cuidado de segurar o algodão para que não saia.

LIQUIDO CEPHALO-RACHIDIANO

Este liquido deve ser extrahido á maneira de qualquer outro derrame com todos os cui-dados antisepticos por puncção lombar tendo apenas o cuidado de usar de seringa com agulha de platina muito mais longa que as vulgares.

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Não alludimos á technica da puncção co-mo não trataco-mos da das paracentheses pois que tal assumpto é mais do domínio operató-rio.

*

* *

Muitos d'estes productos podem ser ex-trahidos do cadaver.

A technica da colheita é mais simplificada não só porque o material é mais simples mas também porque o accesso dos productos é mais franco.

A pipetta tem aqui vantagens incontestá-veis e por isso é necessário um numero rela-tivamente grande para se recolher o sangue do coração, baço, fígado, urina, oademas, der-rames, etc.

Qualquer órgão sobre o qual se deseje fa-zer a pesquiza bacteriológica é cauterisado em um ponto da sua superficie pela extremidade bem aquecida d'uma vareta de vidro ou me-tallica. A pipetta penetra no meio da parte cauterisada, aspira-se ao mesmo tempo que se lhe dão movimentos lateraes, circulares e de vae-vem.

As pipettas são fechadas á lâmpada ge-ralmente depois de se ter servido de algumas gottas destinadas a preparações para o exame directo.

O uso da pipetta faz-se como indica a te-chnica atraz. enunciada.

SEGUNDA PARTE

CAPITULO I Diagnostico bacteriológico

Colhidos os productos segundo os precei-tos que deixamos exposprecei-tos, procede-se á sua analyse bacteriológica usando dos três metho-dos basillares :

Exame directo Exame cultural Inoculações.

EXAME DIRECTO

O exame directo consiste em ver ao mi-croscópio as preparações feitas com o

produ-cto a analysar.

Com elle consegue-se estudar a forma, di-mensões, disposições intra ou extra-cellular, os agrupamentos e os caracteres e reacção de coloração dos micróbios pathogenicos que se pesquizam.

Material necessário :

pipettas—Banco-suppor-58

te de vidro — Laminas — Lamellas—Pissete com agua.

Corantes em frascos­pipettas (Fig. 12). —

Azul de Roux — Violeta de gencia­ na phenico — Lugol forte — Fuchsi­ na de Zihel — Fuchsina de Ziel a V10.

Descórantes—Alcool­acetona em

frasco conta­gottas ■— Alcool a 70o—■

Acido sulfúrico Vi­

As operações capitães a effectuar são : fixação e coloração.

FIXAÇÃO

Fig. 12 A fixação é uma operação ba­ cteriológica que tem por fim segurar á lamina uma pequena parte do produeto a

analysar.

E' precedida da colheita, estendedura e seccagem da substancia.

i.° Colheita. — Se se trata d'uma cultura, seguir a technica indicada adeante servin­ do­se da pipetta ou ansa de platina para os produetos liquidos; do fio de platina para os sólidos.

Nas urinas limpidas apparecem de ordi­ nário, flocos nos quaes se faz muitas vez.es a pesquiza do gonococco. Estes flocos diffi­ ceis de pescar com o fio de platina são extrahidos por meio de pipettas muito fi­ nas. Tapado o orifício superior com o dedo in­ dicador introduz­se a pipetta na urina e quan­ do o floco esteja em contacto com a extre­ midade abre­se e fecha­se rapidamente de maneira que a urina ao entrar na pipetta

arrasta o floco e a pressão é o sufficieníe para o fixar.

2.° Deposição e estendedura do producto

na lamina. — No caso do producto ser sólido

ou liquido muito concentrado addicionar uma gotta d'agua por meio da ansa ou pissete, dis-sociar, misturar e espalhar em grande super-ficie.

Esta parte varia conforme o producto. Assim as polpas de órgãos, escarros e pus quando em grande quantidade estendem-se em superficie larga, friccionando duas laminas uma contra a outra, uma série de vezes até que se^ obtenha uma camada uniforme.

—E difficil e por vezes muito demorado o obter-se uma pequena porção de escarro. Cos-tuma separar-se por meio da espátula mais es-pessa e rigida que a vulgar, ou fazer o seguinte : depois que a ansa ou a espátula foi levada ao rubro é introduzida rapidamente no escarro; ha uma coagulação parcial da albumina que provoca a sua adherencia á platina. Repete-se esta operação tantas vezes quantas as laminas que se quer empregar.

—Tratando-se de pús que se destina á pes-quiza do gonococco de Neisser convém para não destruir a sua disposição intra-cellular es-tendel-a suavemente com o fio de platina.

— Se os productos a analysar são líquidos deixam-se depositar naturalmente ou centrifu-gam-se. Com uma pequena pipetta extrahe-se o sedimento, deposita-se e estende-se com ella na lamina.

— As falsas membranas são estendidas com a propria zaragatoa.

6o

— O sangue (uma pequena gotta) é depo-sitado na parte média da lamina; uma outra, assente por um dos seus bordos sobre aquella e formando um angulo diedro agudo, percorre n'esta posição a superfície da primeira esten-dendo-o em camada delgada.

3.° Seccar. — Secca-se a preparação na-turalmente por exposição ao ar ou na estufa, ou para maior rapidez da evaporação aque-cendo-a brandamente á chamma.

4.0 Fixação —Faz-se passar rapidamente

o lado da lamina opposto ao da preparação trez ou quatro vezes sobre a chamma tendo o cuidado de não aquecer demasiadamente.

—Nas urinas ha a notar o seguinte : antes que as preparações sejam coradas., ou melhor, depois das preparações fixas, devem ser lava-das com um fio d'agua corrente para eliminar as substancias solúveis.

COLORAÇÃO Coloração simples

Depois de fixar a preparação :

1,° Deitar algumas gottas de azul de Roux.

2.0 Deixar actuar o corante durante cinco

minutos a frio ou mais rapidamente a calor brando até ao desprendimento de vapores.

3.° Esgotar o excesso de corante e lavar com agua corrente.

4.0 Seccar a quente e para mais rapidez

da evaporação absorver o excesso da agua com o papel de filtro.

COLORAÇÃO DUPLA Methodo de Gram-Niçolle

Depois de fixa a preparação na lamina: i.° E corada pelo violeta de genciana phenico a frio durante dez minutos.

2." Esgota-se o excesso de corante. 3.° Trata-se por lugol forte, esgota-se; faz-se o mesmo tratamento por três vezes.

4.0 Sem lavar, descorar pelo

alcool-ace-tona até que este não saia sensivelmente co-rado.

5.° Lavar bem com agua corrente. 6.° Tratar por alguns segundos pela fu-chsina de Zihel a V10.

7.0 Esgotar o excesso de corante e lavar

com agua corrente. 8.° Seccar.

Pôde muitas vezes succéder que a quanti • dade de producto seja tão pequena que mal chegue para as colorações simples e methodo de Gram.

Far-se-ha n'este caso as duas espécies de coloração com os corantes do methodo de Gram. Faz-se a coloração simples seguindo-se a technica já indicada mas em logar do azul de Roux empregar-se-ha o violetta de gen-ciana phenico.

Depois de lavar e sem seccar cobre-se com uma lamella, enxugando a agua em excesso com um panno fino ou papel de filtro.

62

o resultado da coloração simples, retira-se a lamella, lança-se de novo o violeta de gen-ciana phenico cuja acção deve ser curta e seguir-se-ha por completo a technica do me-thodo de Gram a partir do 2." tempo.

As preparações executadas por este me-thodo com culturas impuras ou com produ-ctos pathologicos polybacterianos mostram quasi sempre ao exame microscópico umas bactérias coradas de violeta escuro e outras de vermelho.

As que são coradas de violeta, côr primi-tiva, são bactérias que tomam o Gram, que fixam o Gram; as que se apresentam coradas de vermelho são as que não tomam o Gram.

Bactérias que tomam o Gram, isto é, que são coradas de violeta escuro :

Coe cos. — Estrepto e estaphylococcos pyogeneos, tetrageno e pneumococco.

BACIIXOS. — Do carbúnculo, tétano, lepra,

tuberculose e diphteria, pyocyaneo e vibrião séptico.

Bactérias que não tomam o Gram, isto é, coradas de vermelho :

Gonococco, bacillos coli, typhico, do mor-mo, da influenza, do cancro molle e pneumo-bacillo.

Methodo de Zihel-Nelsen

Depois de fixa a preparação :

i.° Deixar actuar durante dez minutos a frio a fuchsina de Zihel concentrada ou a quente até ao desprendimento de vapores ten-do o cuidaten-do de estender com o fio de platina o corante sobre aquellas partes da preparação que se vão seccando.

2.° Esgotar o excesso de corante e lavar com agua corrente até que esta não seja sen-sivelmente corada de vermelho.

3.° Descorar parcialmente pefo alcool a 70o mergulhando e agitando a

lami-na lami-na cuvetta que o contém (fig. 13). âJ 4." Mergulhar a lamina no aci- H do sulfúrico a 1/i contido n'outra cu- |fi|

vetta, lavar; repetir esta operação ™ tantas vezes quantas as necessárias

para que a preparação assente sobre Flg' IJ

um fundo branco, esteja incolor ou corada le-vemente de róseo.

5.° Lavar bem com agua corrente para a eliminação total do acido sulfúrico.

6.° Seccar.

Quando se deseje obter o fundo da prepa-ração corado para se examinar as bactérias que acompanham as acidophilas, isto é, que se acham coradas de vermelho, antes de sec-car (6.° tempo), a preparação, trata-se pelo azul de Roux ou azul de Lõeffler, durante se-gundos e em seguida lava-se.

64

para a coloração e pesquiza do bacillo da tu-berculose, em qualquer producto, e apresen-ta-se-nos corado de vermelho rutilante.

Nos escarros escolhem-se sempre as par-tes mais purulentas, os grumulos amarellados ou na sua falta qualquer porção viscosa.

A pesquiza do bacillo de Koch nos escar-ros é por vezes improfícua apezar de se ter todas as probabilidades da sua existência.

Este resultado é devido a que os bacillos são em pequeno numero e ainda a que se co-lheu uma parte de escarro que os não con-tém.

Para obviar a estes inconvenientes proce-der-se-ha á homogenisação dos escarros pelo methodo de Biedert o qual consiste no se-guinte: a uma porção do escarro junta-se o dobro de agua e algumas gottas de lexivia de soda; aquece-se até á ebullição addicionando agua pouco a pouco para substituir a que se evapora.

Deixa-se repousar naturalmente ou obtem-se por centrifugação demorada o obtem-sedimento o qual, recolhido por uma pipetta, serve unica-mente para exame directo.

A pesquiza do bacillo de Koch na urina faz-se egualmente sempre no sedimento cen-trifugado.

As laminas com as preparações do sedi-mento fixas, lavadas e seccas são cuidadosa-mente tratadas umas poucas de vezes com ether e só depois é que são coradas.

O bacillo do smegma também resiste á descoloração pelo acido sulfúrico a Vi mas o prévio tratamento pelo ether dissolvendo o

inducto gorduroso que o envolve faz perder-lhe a propriedade de resistir á descoloração pelos ácidos.

O bacillo da lepra também conserva a co-loração vermelha em face dos ácidos mas pela sua morphologia, e disposição intracellular para quem está habituado, não é fácil confun-dir-se com o bacillo de Koch.

Muitas vezes no exame directo e fazendo parte d'elle desejamos saber se uma bacteria é ou não dotada de modilidade.

Deve-se para esta espécie de investigação ter em' vista a seguinte technica :

N'uma lamina bem limpa deita-se uma gotta de agua se a bacteria está em meio só-lido, e n'ella dissocia-se a partícula séptica obtida segundo a technica da colheita de sub-stancia a semear. Em seguida tomando uma lamella bem limpa e desengordurada colloca-se sobre a gotta, do seguinte modo : A lamella segura pela pinça Cornet (Fig. 14), ou

pe-Fig. 14

las polpas dos dedos sobre dois dos seus ân-gulos é appoiada por um dos lados sobre a lamina e próxima da gotta. Inclina-se sobre ella e deixa-se assentar pelo seu próprio peso.

A platina do microscópio para esta es-pécie de exame deve estar perfeitamente

GG

sontal sem o que a acção da gravidade faz mover o liquido interposto entre a lamina e a lamella e conjunctamente as bactérias ahi con-tidas.

Quando a cultura é liquida toma-se uma gotta por meio da ansa de platina ou por meio da pipetta e deposita-se na lamina não sendo necessária a addição de agua.

Deve-se notar que é um pouco difficil fo-car a preparação e só com paciência depois de algum tempo se consegue vêr as bacté-rias com o microscópio illuminado lateral-mente e a uma luz fraca.

Este exame também pôde ser feito com bactérias levemente coradas mas é preciso que os corantes não contenham antiseptico.

No Laboratório Nobre prepara-se e usa-se sempre o azul de Roux em soluções aquosas e não como a verdadeira formula que é um soluto alcoólico.

Colloca-se na lamina não a gotta d'agua mas uma gotta de azul de Roux bastante di-luído (i de azul para 10 de agua) e n'ella faz-se a dissociação da particula cultural.

No caso de cultura em caldo addiciona-se á gotta d'esté uma de azul de Roux diluido.

EXAME CULTURAL

Este exame faz-se quer se trate de bacté-rias aeróbias quer anaeróbias em tubos e pla-cas.

A meza de trabalho deve ter o seguinte material :

Bun-zen ou lâmpada de alcool ; supporte com os fios de platina recto, ansa e espátula ; provetta com sublimado para receber as pipettas inuti-lisadas; cuvetta com sublimado. A' direita: cestas (fig. 15), contendo tubos de

Gelatina direita \ Gélose inclinada I Simples Caldo \ ou Soro liquido ou sólido l composto

Batata ] Estes tubos devem já estar munidos d'uma

etiqueta na extremidade superior. Nos tubos de cultura de meios sólidos inclinados a eti-queta é collocada em frente á superficie ex-posta.

A' esquerda: cesta para receber os tubos cultivados; tinteiro ou lapis.

CULTURA DOS AERÓBIOS

Cultura em tubos

Technica geral — A cultura comprehende

duas operações : A colheita da substancia a semear e semeadura.

COLHEITA

i.° Tomar e esterilisar o fio de platina como in-dica a technica que já des-crevemos.

2.° Segurar a cultura com a mão esquerda.

68

movimento de rotação á rolha, entalada entre o dedo minimo e a palma da mão direita para destruir qualquer adherencia entre a rolha e o vidro.

4.0 Flammejar rapidamente e com um

mo-vimento de rotação a rolha e as proximidades do tubo ; soprar se o algodão começa a arder. 5 ° Collocar o tubo de cultura na posição o mais proximamente horisontal, seguro entre os dedos indicador, medio e pollegar da mes-ma mão (posição idêntica á d'umes-ma penna de escrever).

6.° Destapar o tubo segurando a rolha como indica o 3.° tempo.

7.0 Introduzir o fio de platina no tubo.

8.° Tomar uma pequena particula. 9.0 Retirar o fio de platina.

10." Collocar a rolha com leves movi-mentos de torsão.

II.° Flammejar como no 4.0 tempo.

i2.° Pousal-o na cesta primitiva. SEMEADURA

Sem largar o fio de platina da sua posição primitiva (i.° tempo) tomar o tubo de cultura a semear e segue-se a technica indicada para os 2.0 3.°, 4.0, 5.°, 6.°e7.° tempos da colheita.

8.° Semear.

Seguir exactamente a technica dos 9.0, io.°

e 11.° tempos.

i2.° Esterilisar ao rubro o fio de platina e flammejar as proximidades do cabo.

i3.° Collocar o fio no seu supporte pró-prio.

14.0 Escrever na etiqueta as necessárias

indicações inclusive a data. CULTURA EM CALDO

Seguir todos os tempos da technica geral mas observando o seguinte:

No 5.° tempo da semeadura ter o tubo em posição inclinada de tal maneira que o liquido não molhe a rolha. O fio de platina é intro-duzido na massa liquida e depositada a partí-cula com movimentos sacudidos.

Quando se deseje obter a cultura em véu deposita-se cautelosamente a particula á su-perficie do liquido ou então é deposta na pa-rede do tubo muito proximamente ao liquido e um leve movimento de inclinação, impri-mido a este, arrastará a particula quando o tubo tomar a posição vertical.

Servindo-se da pipetta seguir-se-ha a mes-ma technica, deixando cahir a gotta natural-mente ou com o auxilio do sopro.

CULTURA EM GELATINA

A cultura em gelatina faz-se em picada ou em estria.

Cultura em picada

Seguir todos os tempos da technica geral excepto no 5.° da semeadura no qual o tubo está em posição nitidamente horisontal.

O fio de platina recto é de exclusivo em-prego para esta espécie de cultura:

7o

Penetra (8.° tempo) no centro, horisontal e perpendicularmente á superficie da gelatina com um só movimento rápido de vaevem.

Podem fazer-se picadas em gelatina incli-nada principalmente para aquellas bactérias que não a liquefazem, o que é de grande commodidade para se observar o desenvolvi-mento superficial da colónia.

Technica. — A extremidade do fio de

pla-tina é dobrada em angulo recto.

Segue-se a technica geral; fazem-se uma série de picadas sem retirar o fio, na superfi-cie a principiar do fundo do tubo.

Convém trabalhar com a gelatina um pouco rapidamente porque a temperatura da mão é sufficiente para a fundir.

A cultura

em estria

emprega-se só para as bactérias não liquefa-cientes e a technica é perfeitamente egual á da gélose.

CULTURA EM GELOSE

A cultura em gélose faz-se de variadas ma-neiras mas a mais ordinariamente empregada é a cultura

em estria

Seguindo-se a technica geral no 5.° tempo da sementeira dá-se ao tubo de cultura uma

posição de maneira que a superficie da gélose fique perfeitamente horisontal. (fig 16).

No 8.° tempo da semeadura, introduzido o fio de platina no tubo, este a principiar do fundo, deve fazer brandamente pelo seu próprio peso um sulco longitudinal em linha recta per-feitamente ao meio da superficie da gélose.

Modalidades da cultura em gélose

A—Com o fio de platina podem fazer-se no mesmo meio diversas estrias parallelas sem tocar de novo o fio na substancia a semear.

Fig. 16

E' uma modalidade usada muitas vezes para o isolamento de bactérias.

B — Em logar da estria ser rectilínea, pó-de-se descrevel-a em linha quebrada (zig-zag) dando ao fio movimentos próprios.

C — Deposita-se a particula n'um ponto qualquer da superficie da gélose, geralmente na parte média. Inclina-se o tubo de maneira que o liquido de condensação accumulado no fundo, envolvendo- a, a espalhe por toda a su-perficie com o auxilio de movimentos de ba-lancé dados ao tubo.

72

D — Introduzir a substancia no interior da gelea, isto é, enterral-a.

E — Faz-se a sementeira no liquido de condensação como se praticasse a cultura em caldo e percorre-se com aquelle liquido toda a superficie da gélose.

F-—Pôde espalhar-se a substancia quando ella seja facilmente dissociavel passeando o fio de platina em todas as direcções sobre a superficie.

G — A cultura em picada na gélose direita raras vezes se emprega. Aproveita-se para a conservação por muito tempo da vitalidade das bactérias, e chamada por isso cultura de

resistência.

Todas estas variedades de cultura em gélose effectuam-se ordinariamente com os fios de platina.

Quando se serve da pipetta fazem-se com ella as variedades B, C, D, E, F ; da seringa executa-se a variedade C e algumas vezes a D ; e por ultimo cultiva-se o bacillo da diphte-ria, friccionando a superficie da gélose com a zaragatoa portadora de fragmentos de fal-sas membranas.

CULTORA EM BATATA

Segue-se a technica como se se tratasse de cultivar as bactérias em gélose, deposi-tando, espalhando á superficie ou introduzindo na sua massa a substancia a semear.

Serve-se para esta cultura geralmente do fio de platina ou da pipetta; raras vezes a seringa ou a zaragatoa.

CULTURA EM SORO SOLIDIFICADO

A cultura no soro solidificado, simples ou composto, é perfeitamente idêntica á da gélose quer na sua forma especial (estria) quer nas suas variedades, podendo egualmente lançar-mos mão de qualquer dos instrumentos pró-prios para as sementeiras.

Para a conservação do pneumococco viru-lento, bacteria difficil de vegetar nos meios or-dinários, procede-se á sua

CULTURA NO OVO do modo que passamos a expor:

i.° Vasculeja-se fortemente para ficar bem homogénea a sua massa.

2.° Cauterisa-se e perfura-se um dos seus pólos com a extremidade bem quente dJuma

fina vareta de vidro.

3.° Cobre-se o orifício com um pouco de algodão fiammejado e colloca-se o ovo por momentos n'um gobelet.

4.0 Toma-se a particula a semear com o fio

de platina ou pipetta segundo as regras esta-belecidas.

5.° Introduz-se no ovo, facilitando a sua deposição com movimentos sacudidos e reti-ra-se o fio.

6.° Tapa-se o orifício com uma pequenís-sima porção de algodão fiammejado.

7.0 Deita-se sobre elle algumas gottas de

parafina fundida. 8." Etiqueta-se.

74

Cultura em placas

A cultura em placas tem por fim :

i.° Observar os caracteres por vezes im-portantes que as colónias microbianas apre-sentam durante o desenvolvimento.

2.° A purificação d'uma cultura impura pela separação das espécies que a contami-nam.

3.° Isolamento dos diversos micróbios existentes em qualquer producto — agua, ar, pús, fezes, etc.

Esta cultura pôde effectuar-se nos dois meios sólidos : gelatina ou gélose e ainda cada um d'elles pôde ser estendido em superficie plana ou em superficie enrolada.

GELATINA

As bactérias são incorporadas á massa da gelatina.—Funda-se no seguinte principio:

Se se cultiva uma particula séptica uni-bacte-riana em gelatina previamente liquida, de ma-neira que os micróbios sejam uniformemente repartidos no meio e que este se faça solidifi-car em camada delgada, cada micróbio dará uma colónia, vegetando á superficie completa-mente separada das outras podendo-se, então, transportal-a para os meios de cultara usuaes;

Superficie plana

A gelatina é estendida nas placas de Pe-tri (fig. i).

Technica. — São 6 os tempos da

opera-ção : os 3 primeiros são feitos no próprio tubo de gelatina que deve estar de antemão prepa-rado e estéril.

Os 2 seguintes (4.0 e 5.°) exigem os

reci-pientes perfeitamente esterilisados. Para o ul-timo suppõe-se já devidamente preparados os meios de cultura.

i.° Fusão da gelatina.

A temperatura para a liquefacção da gela-tina não deve ir muito além do seu ponto de fusão (18 a 22o). A mão para quem está

habi-tuado é uma boa pedra de toque.

2.0 Incorporação d'uma pequena

quanti-dade do producto a analysar á gelatina. A pipetta ou fio de platina com o producto, segura entre os dedos pollegar, indicador e médio, tirada a rolha de algodão com os dois últimos dedos, penetra na massa fundida fa-zendo-se uns leves movimentos sacudidos.

Retirar a pipetta ou fio e collocar a rolha. 3.° Agitação para bem diffundir os ger-mens em toda a massa. Não deve ser forte mas sim o sufficiente para a perfeita mistura, evitando-se sempre a formação de bolhas.

Como se tem de proceder á agitação du-rante um certo tempo succède por vezes e quasi sempre no inverno solidificar a gelatina o que se evita mergulhando o tubo em agua quente approximadamente a 24o.

4.0 Tresvasar a gelatina para as placas

de Petri previamente quentes e que já devem estar despojadas dos envolucros de papel que serviram para a sua esterilisação. Este tempo deve ser feito o mais rapidamente possivel e a

76

tampa levantada o estrictamente necessário para se evitar que os germens existentes no ar não inquinem as placas.

5." Estender a gelatina em camada del-gada o que se obtém por uma série de movi-mentos horisontaes ou por outros que o ope-rador julgue bons na occasião.

6." Passagem das colónias para os meios de cultura.

Os tubos não são completamente esgota-dos ; uma pequena porção de gelatina fica sem-pre adhérente ás suas paredes.

Depois de servidos serão collocados ao lado das placas correspondentes para se exa-minar qualquer colónia bacteriana que por acaso se desenvolva na gelatina restante.

Superficie enrolada

Executa-se esta variedade de cultura, em placas por meio dos tubos de Esmarch.

Como no Laboratório Nobre é raro o seu uso não o incluímos no material descripto no principio do nosso trabalho.

E' um tubo de ensaio (fig. 17) cuja aber-tura tem um diâmetro inferior ao calibre, po-dendo perfeitamente comparar-se a um frasco de vidro cylindrico, em que o corpo é muito allongado em relação ao gargalo que é muito curto.

Este instrumento tem a vantagem de supprimir uma das causas de inquinação nas placas de Petri, — a passagem para estas da gelatina exposta ao ar — pois que todas as

operações se effectuam no próprio tubo; mas teem também o inconveniente de que a por-ção de gelatina liquefeita por

qual-quer bacteria liquefaciente em logar de ser localisada, como nas placas Petri, corre ao longo das paredes perdendo-se um dos caracteres úteis para o diagnostico.

De resto esta espécie de cultu-ra dá bons resultados pacultu-ra as bacté-rias que não possuem a propriedade de liquefazer a gelatina.

Technica. — i.° O tubo de

Es-march contém uma pequena quanti-dade de gelatina a sufficiente para cobrir o fundo.

2.° Funde-se a gelatina a 24o

approximadamente a banho-maria.

3.° Semeia-se a substancia seguindo a technica relativa á cultura em caldo.

4.0 Dar ao .tubo, em posição horisontal,

movimentos rápidos de rotação entre os dedos debaixo d'uma corrente d'agua ou enrolal-o ao longo d'uma superficie plana como a da meza de trabalho.

Á superficie e no interior da gelatina, plana ou enrolada, vão apparecendo as coló-nias distanciadas uma das outras de maneira que se pôde acompanhar o seu desenvolvi-mento e o seu aspecto a olho nú ou a um fraco augmento.

Do mesmo modo apparecem bolores, ge-ralmente de inquinação, cuja exhuberancia vegetativa difficulta o exame das colónias

po-78

dendo encobril-as completamente; podem-se destruir pelo calor com uma vareta de vidro aquecido n'uma extremidade.

Estas placas teem de ser examinadas dia a dia, contadas as suas colónias e para não haver confusão marca-se com tinta ou com lapis de escrever em vidro as colónias já vistas.

Como o desenvolvimento é diverso para cada micróbio, no caso de producto polybacte-riano, succède por vezes escapar á vista ou tomar como impureza do vidro, quando já é muito o tempo decorrido, pequenas ponctua-ções que pela inspecção mais cuidadosa se re-conhecem ser colónias bacterianas cujo des-envolvimento se acha suspenso.

A passagem d'uma colónia para qualquer dos meios culturaes—-caldo, gelatina ou gé-lose — realisa-se tocando n'ella com a extre-midade do fio de platina. E' necessário haver o cuidado de que a abertura feita pelo levan-tamento da tampa, segura com a mão esquer-da, não seja muito larga para evitar ao má-ximo a inquinação pelo ar, mas o sufnciente para deixar livre o movimento do fio de pla-tina.

GELOSE

As bactérias são depostas á superficie do meio nutritivo.

Superficie plana

Para a cultura em placas de gélose é ne-cessário primeiro que tudo ter preparada a camada a semear.

Funde-se a gélose conservada nos balões de Erlenmeyer ; distribue-se pelas placas Petri. Esterilisam-se a 1200 durante 15 minutos

no autoclave e retiram-se ainda quentes. São seguidamente collocadas sobre uma grossa placa de vidro cuja horisontalidade é verifi-cada pelo nivel de bolha d'ar, para que não fique a descoberto qualquer parte do seu fundo.

Depois de assim preparadas procede-se á sementeira a qual pôde ser feita de différentes maneiras e idênticas ás variedades de cultura em gélose inclinada.

Se a substancia é sólida utilizar-nos-hemos quasi sempre do fio de platina ; levanta-se um pouco a tampa com a mão esquerda, dese-nham-se com elle em uma só vez, isto é, sem retirar o fio de platina, umas poucas de estrias parallelas e horisontaes seguidas de outras

tan-tas transversaes.

Se a substancia é sólida mas facilmente dissociavel (cultura molle, materia purulenta) em logar de se effectuarem as estrias, deposi-ta-se uma pequena porção da substancia com o fio de platina ou com a pipetta, se esta a contém, na parte central da gélose. Com o li-quido de condensação que sempre existe nos meios de base gélose, tentar-se-ha distribuir e espalhar por toda a superficie a substancia dando á placa movimentos conjugados, late-raes e horisontaes.

Esta technica é egualmente empregada em todos os casos em que se trabalhe com os pro-ductos liquidos.

differen-8o

tes meios de cultura faz-se d'uma maneira per-feitamente idêntica ás da gelatina.

Muitas vezes os próprios tubos de gélose inclinada servem para o isolamento das bacté-rias. Executam-se na superficie da gélose com fio de platina duas ou três estrias e com o mesmo fio mas sem de novo tocar no produ-cto séptico, fazem-se outras tantas estrias n'um novo tubo ; repete-se esta technica sobre um numero qualquer de tubos de gélose até que o fio á vista pareça perfeitamente isempto da substancia.

Superficie enrolada

Enrola-se a gélose como a gelatina. Não entramos em detalhes sobre a technica porque como se viu pelo decorrer da leitura que o que temos dito sobre os différentes mo-dos de cultura é sufficiente para a sementeira n'esta espécie de placas enroladas e apenas nos adeantaremos a frizar que os tubos de Esmarch realizam uma vantagem que ha pouco escapou-nos referir sobre a placa de Petri — o evitar que os meios nutritivos pela applica-ção de capuzes sequem rapidamente.

CULTURA DOS ANAERÓBIOS

A cultura dos anaeróbios faz-se exacta-mente como a dos aeróbios em tubos e placas.

A technica é perfeitamente a mesma com a differença que se deve sempre attender a que o ar não esteja em contacto com a cul-tura e que a sua acção seja muito pouco de-morada durante os preparativos.

aspi-rando, até ao vacuo, o ar ou substituindo este por um gaz inerte.

O acido carbónico e o gaz de illuminação não convéem porque são mais ou menos an-tisepticos.

O gaz empregado quasi sempre é o hy-drogenio.

Para se cultivar estas bactérias

no vacuo costuma-se tapar com uma (] rolha de borracha, atravessada por

um orifício, o tubo de cultura já se-meado (caldo, gelatina ou gélose) (fig. 18).

Introduzir-se no orifício da rolha um tubo de vidro com dous estran-gulamentos (A e B) e entre elles col-loca-se um pouco de algodão.

A extremidade livre do tubo com-munica por meio de tubos de bor-racha de paredes grossas com a ma-china pneumática ou com o appare-lho muito usado nos laboratórios e de grande commodidade — a trompa aspiradora de vidro (fig. 19).

Adapta-se esta directamente á torneira d'agua interpondo-se entre a trompa e o recipiente a fazer o vacuo um frasco de segurança de duas tubuladuras, as quaes não de- Í vem ultrapassar muito a rolha.

Depois que se tenha conseguido

o vacuo, reconhecido pelo manome- Fig- [8

tro ou pelo som agudo, continuo, persistente, que a trompa fornece quando a agua a atra-vessa sem interposição da minima bolha d'ar,

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fecha-se á lâmpada o estrangulamento supe-rior do tubo. Fica intesupe-riormente uma pelota de algodão destinada a filtrar o ar ao partir-se o tubo para nos utilizarmos da cultura.

Quando se deseje que a cultura esteja em contacto permanente com o hydrogenio, serve-se dos mes-mos tubos tapados com rolhas de borracha, atravessadas por dois orifícios, nos quaes se in-troduzem dois tubos curvos em angulo recto, munidos no seu interior d'um pouco de al-godão e destinados: um, a dar entrada ao gaz e o outro á sa-hida.

O tubo de entrada ultra-passa pouco a rolha mas o de sahida c mais longo chegando quasi á superficie do caldo ou ao fundo do tubo se se cultiva nos meios inclinados.

Fig. 19 O apparelho (fig. 20), para a producção de gaz hydrogenio compõe-se de dous frascos (A e B) ligados entre si na sua parte inferior por um tubo (f) de vidro.

Um dos frascos contém acido sulfúrico diluido, e o outro rolhado e com torneira, con-tém fragmentos de zinco, assentes sobre uma camada de varetas de vidro, e algumas .gottas de chloreto de platina.

Põe-se este apparelho cm communicação com o tubo de cultura tendo em vista sempre as precauções necessárias para o uso do hydro-genio, isto é, verificada a expulsão do ar pelo

som agudo quando se approxima da chamma e se inflamma um tubo de ensaio vulgar cheio d'esté gaz. Depois de se ter deixado passar uma certa quantidade de hydrogenio, obtu-ra-se com a vareta, o tubo de sahida que é munido de uma rolha de borracha atravessa-da por um orifício, e aperta-se com a pinça de mola ou de parafuso a entrada do hydro-genio, na parte mais próxima do tubo.

(Fig. 20)

Podemos applicar o hydrogenio para cada tubo em separado ou para uma serie d'elles desde que se tenham em communicação uns com os outros no que não haverá inconve-niente de inquinação, pois o gaz é filtrado em cada uma das tubuladuras pelas rolhas de al-godão.

O emprego d'estas culturas ao abrigo do ar pelo vacuo ou em presença do gaz inerte, exige sempre antes da sementeira a ebullição prévia dos meios para se expulsar o ar dissol-vido.

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■ ■

-Quando são muitos os tubos de cultura a semear é desnecessário executarem­se estas différentes operações para cada um em sepa­ rado o que é bastante trabalhoso. São semea­ dos como se se tratasse de aeróbios e as cul­ turas são dispostas convenientemente em ap­ parelhos de vidro nos quaes se faz o vacuo ou se substitue o ar pelo hydrogenio.

Fig. 21

O apparelho mais usado é o de Novy (fig. 21). Consta de dois reservatórios cylin­ dricos de vidro, A e B, que se adaptam perfeita e hermeticamente pelos seus bordos revirados, com o auxilio de substancias gor­ durosas. O superior é munido d'uraa rolha es­ merilada e atravessada por duas tubuladuras de vidro que se fecham por uma torneira commuai.

Introduzem-se os tubos semeados ou as placas no reservatório inferior sobre uma camada de algodão e applica-se o superior com um pouco de esforço e movimentos ho-risontaes e circulares, depois de se ter por meio do sebo lubrificado bem os bordos. Em seguida procede-se á extracção ou substitui-ção do ar como se se tratasse d'um tubo de cultura.

Mas um bom processo de cultivar anae-róbios é na maioria das vezes empregado no laboratório e muito simples : para a cultura em caldo ferve-se o meio nutritivo, addiciona-se um pouco de azeite esterilisado o qual pela sua menor densidade sobrenada á sua super-ficie, separando perfeitamente a cultura da acção do ar.

A sementeira faz-se impropriamente por picada vertical, atravessando a camada do azeite ou melhor dá-se ao tubo uma leve inclina-ção para a picada ser feita proximamente á parede superior do tubo onde a camada d'azeite é consideravelmente menos espessa.

Para a cultura em gelatina ou gélose, a substancia nutritiva enche pouco mais dos dois terços do tubo.

Antes do emprego são fervidos para a completa expulsão do ar em dissolução e em seguida addiciona-se azeite esterilisado ou qualquer outro óleo até que a sua camada attinja um ou dous centimetros.

Depois de completamente arrefecidos e so-lidificados os meios, inclinam-se de tal ma-neira que o azeite deixe a descoberto o cen-tro da superficie da gelatina ou gélose.

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A sementeira faz-se por picada profunda servindo-se para isso de fios de platina não flexiveis e longos ou de pipettas em que a parte afilada seja comprida.

Nas culturas em gélose pode-se supprimir o emprego do azeite.

Depois de feita a picada aquece-ra se circularmente a parte superior da [J] H gelea n'uma extensão de i a 2

cen-tímetros até que ella funda. A solidi-ficação d'esta camada destroe qual-quer solução de continuidade entre a cultura e o ar ambiente.

Os anaeróbios podem cultivar-se completamente ao abrigo do ar em pipettas (fig. 22) cujo corpo é estran-gulado em B e C.

Os meios nutritivos são fervidos ; faz-se n'elles a sementeira a uma temperatura muito próxima da da solidificação, se se quer cultivar em meios sólidos; aquece-se levemente toda a pipetta e aspira-se até mui perto do estrangulamento B; o meio

já semeado; fecha-se á lâmpada a extremidade livre e o estrangula-mento B.

Até aqui temos exposto a cultura dos anaeróbios em que o ar é sup-primido ou substituído pelo hydro-Fig. 22 génio ou se acha separado da cultu-ra por uma camada isoladocultu-ra, e por ultimo as

culturas em recipientes fechados á lâmpada. Mas também se cultivam ao contacto do ar cujo oxygenio é absorvido :

i.° Por substancias oxydaveis addiciona-das ao meio da cultura. As substancias empre-gadas são a glucose na proporção de 2 °/0 e o

sulfo-indigato de soda no de 1 para 1000. A côr escura que o meio tem vae desappare-cendo com os progressos da vegetação mi-crobiana.

2.0 A substancia oxydavel não faz parte

do meio. Uma solução alcalina de acido pyro-galhico (1 gramma de acido pyropyro-galhico em

10 centimetros cúbicos de potassa cáustica a 10 °/o) enche até ao meio um tubo de ensaio de dimensões grandes o qual deve ser fechado hermeticamente por uma rolha de borracha. Colloca-se o tubo de cultura no seu interior sobre um supporte de vidro para garantir que o soluto não molhe a rolha de algodão. E' necessário de vez em quando agital-o para renovação da superficie absorvente do oxy-genio.

3.° O oxygenio pôde ser esgotado pela cultura d'uma bacteria aerobia ; esta desenvol-ve-se á superficie e a anaeróbia na parte mais profunda do meio de cultura e tanto mais profundamente quanto mais o oxygenio lhe for toxico.

Para as culturas em placas de Pétri é de uso corrente e indispensável o apparelho de Novy ou qualquer outro que se improvise substituindo-o perfeitamente; por exemplo, a campanula de vacuo.