UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PAULO HENRIQUE DE SANTANA MIRANDA
DESIDROQUINATO DESIDRATASE II COMO ALVO PARA O
PLANEJAMENTO RACIONAL DE FÁRMACOS CONTRA O Mycobacterium tuberculosis e Helicobacter pylori
Natal - RN 2020
DESIDROQUINATO DESIDRATASE II COMO ALVO PARA O
PLANEJAMENTO RACIONAL DE FÁRMACOS CONTRA O Mycobacterium tuberculosis e Helicobacter pylori
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do título de mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Euzébio Guimarães Barbosa Coorientador: Prof. Dr. Alessandro Kappel Jordão
Natal - RN 2020
Miranda, Paulo Henrique de Santana.
Desidroquinato desidratase II como alvo para o planejamento racional de fármacos contra o Mycobacterium tuberculosis e Helicobacter pylori / Paulo Henrique de Santana Miranda. - 2020. 74f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas)
-Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas. Natal, RN, 2020.
Orientador: Euzébio Guimarães Barbosa. Coorientador: Alessandro Kappel Jordão.
1. Antibacterianos - Dissertação. 2. QSAR - Dissertação. 3. Desidroquinato desidratase II Dissertação. 4. Chiquimato -Dissertação. I. Barbosa, Euzébio Guimarães. II. Jordão, Alessandro Kappel. III. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 615.33
Aos meus pais, Alexandra de Santana e Juvenal Henrique. Meus primeiros e eternos exemplos de inspiração e determinação desse mundo, nos quais demonstraram uma inesgotável fonte de amor, dedicação e apoio nesses vinte e quatro anos da minha vida. Agradeço por não terem medido esforços por me guiarem e apoiarem nas minhas escolhas sem nunca pedir retorno, acreditando na minha capacidade e mostrando o que há de melhor em mim. Amo vocês com o amor mais verdadeiro desse mundo.
Aos meus amigos da graduação, por fazerem do curso de farmácia um ambiente divertido e produtivo. À Ariana Renaly, Aylla Sofia, Bruno Guimarães, Iany Handre, Laelma Ferreira, Letícia Rayssa, Maria Conceição, Osanir Oliveira e a Renata Kelly. Pelos ensinamentos compartilhados, pelas risadas em momentos de desespero e de alegrias, que sempre nos acompanharam e nunca nos abalamos durante essa fase tão complicada que é a graduação.
Aos professores que fizeram parte da minha formação como profissional farmacêutico e que sempre acreditaram na minha capacidade. Em especial, aos professores: Camila Uanne, Cátia Rossi, Elizabeth Santos, João Felipe, Karina Melchuna, Raul Bortolin e a Vanessa Otelo pelos valiosos conselhos, ensinamentos e contribuições dadas para minha nova longa jornada.
Ao Prof. Euzébio Guimarães, que me deu a primeira oportunidade na pesquisa e me ajudou a entender melhor o que eu queria. Recebeu-me de braços abertos em seu laboratório naquele seu jeito de ser. Agradeço por acreditar em mim, pelo tempo que investiu ao me ensinar os tools da Modelagem Molecular, aos puxões de orelhas, pela confiança no meu trabalho e pela amizade construída.
Ao Prof. Alessandro Jordão, pelas oportunidades dadas e por todo conhecimento na área de síntese que vem me transmitindo. Agradeço imensamente por ensinar-me com enorme paciência, das horas que gastou comigo na bancada tanto para que eu aprendesse a operar os equipamentos com total segurança e liberdade. Agradeço por ter aceito ser o meu coorientador nesse trabalho, por todo ensinamento, apoio, amizade e pela confiança depositada.
Aos amigos e colegas do grupo de Pesquisa em Química Farmacêutica Computacional (LabQFC) pela amizade, ajuda, apoio e troca de experiências. Em especial gostaria de agradecer à Pedro Igor, pelos primeiros ensinamentos operacionais no terminal do Linux e pela tão generosa paciência, parceria e amizade, ao aluno de
execuções das simulações de dinâmica molecular. Sou extremamente grato pela Priscilla Suellen, por ter desenvolvido um software para o cálculo dos descritores intermoleculares, no qual foi essencial para o desenvolvimento deste trabalho.
A Estela Mariana por todo seu companheirismo, incentivo, ânimo e principalmente pela paciência que teve e ainda tem comigo. Obrigado por ter feito esse mestrado comigo, ajudando-me muitas vezes nos modelos de QSAR desde muito cedo da manhã até muito tarde da noite, superando todos R² e Q² da vida acadêmica, muitas vezes acreditando mais no meu projeto do que eu mesmo. A RitaYanka pela amizade sincera e por ter as melhores histórias dentro do laboratório, lutamos muito para manter as moléculas alinhadas e finalizar os modelos de QSAR da bendita malária, ô saga! Gostaria de agradecer também à Marcel Verissimo, por partilharmos tantos momentos e nos ajudarmos dentro do laboratório.
Agradeço a EMMSB (Escola de Modelagem Molecular em Sistemas Biológicos) por ter ocasionado a melhor viagem da minha vida durante o mestrado e de ter tido a oportunidade de conhecer os ex-integrantes do LabQFC: Carolina Braz e Edjan Dantas. Ainda agradecer à “bichinho” Sofia Santos pelas músicas cantadas dentro do laboratório, à Natália Medeiros pelo simples fato de ser Natália, à Housemberg Donanvam e a Marina Rangel pelas nossas conversas sobre as oteladas do dia, e aos novos integrantes do LabQFC: Carla Mendonça, Thais Pinheiro, Paloma Karoline, Jéssika Viana e Jheynne Laína.
A galerinha do Laboratório de Sistemas Dispersos (LASid), à Giovanna Galvão, Talita Amorim, Douglas Dourado e especialmente ao Daniel Pereira por ter salvado a minha qualificação com o seu notebook. Sempre estiveram disponíveis para uma pizza há altas horas da noite no laboratório, com bastante conversas, atreladas à risos e choradeiras.
A Luana Carvalho, Renato Dantas e a Valéria Costa, por terem sido os melhores companheiros de disciplinas que alguém poderia ter! Os devaneios sobre a acusação de plágio cometido pelos nossos chernocolegas da pós-graduação nos uniu. A companhia de vocês, fez esses dois anos de mestrado ser mais leve e alegre, devido a verdadeira e inestimável amizade construída a base do deboche.
Gostaria de agradecer também aos amigos que partilharam comigo essa experiência do mestrado, pela parceria nos seminários, trabalhos, amizade e respeito
sempre tão solícitos da secretaria do PPGCF, Fábia e Gibson pela paciência durante todo o tempo do mestrado.
À Capes pelo auxílio financeiro concedido na forma de bolsa de mestrado.
“Um bom jogador não é aquele que vence o jogo só porque tem as melhores cartas na mão. Um bom jogador é aquele que vence o jogo com as cartas que tem.” Jerônimo Santos
tuberculosis e Helicobacter pylori tem demonstrado índices alarmantes em relação a sua incidência e prevalência no Brasil afora. Portanto, há uma necessidade urgente de planejar novos fármacos, seguros e eficientes com o intuito de hostilizar essas infecções. O planejamento de fármacos baseado na estrutura do receptor é uma tecnologia que pode ser empregada neste processo, bastando apenas o conhecimento de um alvo de interesse para doença e ligantes com afinidades variáveis. A desidroquinato desidratase II (DHQase II) é uma enzima que faz parte da rota biossintética dessas bactérias, denominada como a via chiquimato. Essa via é considerada de suma importância para o crescimento desses microrganismos patogênicos. Diante disso, a DHQase II tornou-se um alvo atrativo para o planejamento racional de novos inibidores. O objetivo geral desse trabalho foi o planejamento racional de novos compostos ativos que possam inibir esta enzima. A utilização das técnicas de regressões lineares para desenvolver modelos preditivos de QSAR (2D, 3D, 4D e híbrido) com ótimos parâmetros estatísticos, possibilitou na elaboração de moléculas inéditas sem a real necessidade de execução de teste de atividade biológica in vitro ou in vivo. Os descritores dos respectivos modelos lineares atrelados as análises dos Activity Cliffs, corroboraram na elucidação das interações intermoleculares dos inibidores com o sítio receptor da DHQase II das duas bactérias. Os dados obtidos servem como guia para o planejamento racional de novos antibióticos potentes e altamente seletivos para atuar na inibição enzimática da DHQase II.
tuberculosis and Helicobacter pylori have shown alarming rates regarding its incidence and prevalence in Brazil. Therefore, there is an urgent need to design new, safe and efficient drugs to hostile these infections. Drug structure-based drug planning is a technology that can be employed in this process, with only the knowledge of a target of interest for disease and ligands with varying affinities. Dehydroquinate dehydratase II (DHQase II) is an enzyme that is part of the biosynthetic pathway of these bacteria, called the shikimate pathway. This pathway is considered of paramount importance for the growth of these pathogenic microorganisms. Given this, DHQase II has become an attractive target for rational planning of new inhibitors. The general objective of this work was the rational design of new active compounds that may inhibit this enzyme. The use of linear regression techniques to develop predictive QSAR models (2D, 3D, 4D and Hybrid) with excellent statistical parameters, made possible the elaboration of unpublished molecules without the real need to perform biological activity test in vitro or in vivo. The descriptors of the respective linear models linked to the Activity Cliffs analysis corroborated the elucidation of the intermolecular interactions of the inhibitors with the DHQase II receptor site of the two bacteria. The data obtained serve as a guide for the rational planning of new potent and highly selective antibiotics to act in the enzymatic inhibition of DHQase II.
Figura 1 - Estrutura molecular dos precursores da série de inibidores do DHQase II dos
bacilos H. pylori e M. tuberculosis. ... 18
Figura 2 - Esquematização dos 7 mecanismos enzimáticos da via do chiquimato. ... 19
Figura 3 – Representação figurativa da cepa de Helicobacter pylori ... 22
Figura 4 - Uma metanálise global da prevalência de H. pylori. ... 24
Figura 5 – Estrutura molecular dos respectivos fármacos que são utilizados na terapia tripla convencional para combater o microrganismo H. pylori. ... 25
Figura 6 – Representação figurativa da bactéria M. tuberculosis. ... 26
Figura 7 - Uma metanálise no cenário epidemiológico a nível global de M. tuberculosis. ... 27
Figura 8- Estrutura molecular dos fármacos utilizados para o tratamento da tuberculose. ... 28
Figura 9 - Demonstração de todas as possíveis conformações moleculares de um único composto, através da abordagem multiconformacional independente de receptores. .... 32
Figura 10 - Alinhamento molecular dos inibidores da DHQase II de H. pylori. ... 33
Figura 11 – O ácido 3-desidroquinínico usado como scaffold para construir a biblioteca de inibidores da DHQase II. ... 35
Figura 12 - Gráfico do modelo de QSAR-4D. Os valores previstos (y) vs os inibidores experimentais dos compostos da DHQase II (x) em pKi. O conjunto de treinamento está em vermelho e o conjunto de teste em azul. ... 36
Figura 13 – O gráfico da caixa abaixo no qual refere-se ao Leave-N-out. As estatísticas deste teste foram aplicadas mais de 100 repetições para cada N de amostras que foram deixadas para fora. ... 37
Figura 14 - Gráfico do y-randomization. O modelo real é apresentado longe dos modelos que foram gerados aleatoriamente. ... 37
Figura 15- Os descritores do QSAR-4D e as suas respectivas ocupações espaciais relacionada a um dos compostos mais ativos da série. Os descritores LJ com um vetor positivo são exibidos em azul, os descritores LJ com um vetor negativo são exibidos em amarelo e os descritores HF são exibidos em rosa. ... 38
Figura 16 - Activity Cliff A. No lado esquerdo, a remoção da região destacada da
molécula é representada com os descritores QSAR-4D que parecem estar relacionados com este Activity Cliff. ... 39
Figura 17 – Representação dos Cliffs B e C. Em ambos os Cliffs, a remoção da região
destacada dos compostos no meio resulta em um aumento da atividade inibitória. No lado direito de cada Cliff, um composto é representado com os descritores de QSAR-4D que parecem estar relacionados com a discussão dos respectivos Activity Cliffs. ... 40
Figura 18 – Representação do Cliffs D e E. ... 41 Figura 19 - Os únicos descritores que não foram explicados pela relação
estrutura-atividade (REA) na análise dos Activity Cliffs ... 41
Figura 20 – Estudo do AD-MDI do modelo de QSAR-4D. ... 44 Figura 21 - Ilustração do encaixe molecular do composto B57 no local ativo. ... 45 Figura 22 - Estudo de acoplamento molecular de novos inibidores promissores da
DHQase II de M. tuberculosis ... 46
Figura 23 - Os modelos de QSAR construídos por MLR previram valores de compostos
de inibição (Y) vs inibidores experimentais de pKi DHQase II (X). O conjunto de treinamento está em vermelho e o conjunto de teste em azul. ... 47
Figura 24 – A validação LNO aplicada aos respectivos modelos lineares. ... 48 Figura 25 – O y-randomization dos modelos preditivos. Os modelos reais são exibidos
longe dos modelos gerados com as amostras aleatórias. ... 48
Figura 26 - Estudo de domínio da aplicabilidade nos modelos lineares construídos .... 49 Figura 27 - Interpretação dos descritores moleculares, as esferas amarelas são descritores
HF negativos, o azul é LJ negativo, o verde é HF positivo e o rosa é QQ positivo. ... 50
Figura 28 - De acordo com as análises de relação estrutura atividade associada com as
interpretações intermolecular dos descritores, a região destacada da molécula D resulta em uma diminuição significativa na atividade biológica. ... 51
Figura 29 - De acordo com as análises de relação estrutura atividade associada com as
interpretações intermolecular dos descritores, a região destacada da molécula F resulta em uma diminuição significativa na inibição enzimática da molécula. ... 52
Figura 30 - De acordo com as análises de relação estrutura atividade associada com as
interpretações intermolecular dos descritores, a região destacada da molécula I resulta em uma diminuição significativa na atividade biológica. ... 53
por PLS... 38
Tabela 2 – Os 6 dos 63 compostos mais promissores, nos quais foram projetados com base nos
resultados dos Activity Cliffs, juntamente com a análise dos descritores do modelo de QSAR-4D. ... 42
OMS Organização Mundial de Saúde DHQase II Desidroquinato desidratase II
H. pylori Helicobacter pylori
M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis
PEP Fosfoenolpiruvato
DAHP 3-deoxi-d-arabino-heptulosonato-7-fosfato
DAHPS 3-deoxi-d-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintase
DHQS 3-desidroquinato sintase
DHQ 3-desidroquinato
DHS 3-desidrochiquimato
DHQase Desidroquinato desidratase
NADP+ Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato
S3P Chiquimato-3-fosfato
EPSP 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato
EPSPS 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase
TGI Trato Gastrointestinal
(CO(NH2)2) Ureia
H Isoniazida
S Estreptomicina
Z Pirazinamida
R Rifampicina
QSAR Quantitative Structure-activity Relationship
1D Unidimensional
2D Bidimensional
3D Tridimensional
4D Quarta Dimensional
QQ Eletrostático
HF Hidrofóbico
HB Ligações de Hidrogênio
Å Ångström
OPS Seleção dos Preditores Ordenados
AD-MDI Domínio de Aplicabilidade - Índice de Perturbação do Modelo
LNO Leave-N-out / Leave-One-out
CCC Coeficiente de Correlação de Concordância
MAE Erro Médio Absoluto
RMSE Raiz do Erro Quadrático Médio
MLR Regressão Linear Múltipla
PLS Mínimos Quadrados Parciais
MDI Índice de Perturbação do Modelo
PE Erro de Previsão
R² Coeficiente da Determinação Múltipla
Q² Coeficiente de Correlação da Validação Cruzada
AATS8i Autocorrelação Média de Moreau-Broto do Lag 8 Ponderada Pelo Potencial de Ionização
nHBDon Número de Doadores de Ligações de Hidrogênio
1.1 COMBATE À RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS ...17 1.2 A VIA DO CHIQUIMATO ...19 2 OBJETIVOS ...21 2.1 OBJETIVO GERAL ...21 2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ...21 3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ...22 3.1 HELICOBACTER PYLORI ...22 3.1.1 Aspectos Epidemiológicos ...23
3.1.2 Tratamento Farmacoterapêutico e Resistência aos Tratamentos Convencionais ...24
3.2 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ...25
3.2.1 Aspectos Epidemiológicos ...27
3.2.2 Tratamento Farmacoterapêutico e Resistência aos Tratamentos Convencionais ...28
3.3 FERRAMENTAS COMPUTACIONAIS PARA O DESIGN DE NOVOS FÁRMACOS ...29
4 MATERIAL E METODOS ...31
4.1 BANCO DE DADOS DE INIBIDORES DA DESIDROQUINASE TIPO II ...31
4.2 ESTUDOS DE ACTIVITY CLIFF ...31
4.3 ALINHAMENTO MOLECULAR ...32
4.3.1 Mycobacterium tuberculosis ...32
4.3.2 Helicobacter pylori ...32
4.4 CALCULOS DOS DESCRITORES INTERMOLECULARES ...33
4.4.1 Descritores Bidimensionais (2D) ...33
4.4.2 Descritores Tridimensionais (3D) ...33
4.5 CONSTRUÇÃO E VALIDAÇÃO DOS MODELOS DE QSAR ...34
4.5.1 M. tuberculosis ...34
4.5.2 H. pylori ...34
4.6 DESIGN DE NOVOS INIBIDORES DA DESIDROQUINASE TIPO II DE M. TUBERCULOSIS ...35
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ...36
5.1 M. TUBERCULOSIS ...36
5.1.4 Delineamento de Novos Potenciais Inibidores da DHQase II de M. tuberculosis ...41
5.1.5 Domínio de Aplicabilidade do QSAR-4D ...43
5.1.6 Estudo de Docking Molecular ...44
5.2 H. PYLORI ...46
5.2.1 Check-up Estatísticos das Regressões Lineares ...46
5.2.2 Interpretação dos Descritores Juntamente Com as Análises dos Activity Cliffs ...50
6 CONCLUSÃO ...54 7 CONVITE ...55 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ...56 APÊNDICE A ...66 APÊNDICE B ...71 ANEXOS ...75
1 INTRODUÇÃO
1.1 COMBATE À RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS
Quando o assunto envolve antibióticos/antimicrobianos, não tem como não falar da sua primeira descoberta.O descobrimento da penicilina G pelo escocês Alexander Fleming em 1928 propagandeou uma nova era de tratamento contra doenças infeciosas. A grande descoberta feita pelo bacteriologista não despertou muito interesse na comunidade científica daquela época (LOBANOVSKA; PILLA, 2017). Só em 1939, com a eclosão da segunda guerra mundial e a prevalência das infecções bacterianas, a penicilina G foi produzida com fins terapêuticos em escala industrial pelos pesquisadores Howard Florey e Ernst Boris Chain (DA CUNHA; FONSECA; CALADO, 2019). Tornando o seu uso disponível para a população civil na década de 1940, na mesma década em que os três pesquisadores conquistaram o prêmio Nobel de Medicina por suas descobertas, nas quais foram capazes de diminuir o número de complicações e mortes causadas por enfermidades como a meningite, sífilis, pneumonias dentre outras doenças que não possuíam um tratamento íntegro naquela época (PODOLSKY, 2018; WONG, 2003).
Ao passar dos anos, ocorreu um desenvolvimento no arsenal terapêutico abrangendo-se uma infinidade de armas antimicrobianas. Incluindo-se novos antibióticos β-lactâmicos aprimorados simultaneamente com as novas classes, como os aminoglicosídeos, polipeptídeos, macrolídeos e as tetraciclinas (KARMAKAR; GAITONDE, 2019). Infelizmente, as declarações de que a guerra contra as doenças infeciosas de etiologia bacteriana havia chegado ao fim eram prematuras. O uso excessivo desses antibióticos proporcionaram, inevitavelmente, algumas dessas bactérias classificadas como patogênicas à desenvolverem rigorosamente determinados mecanismos defensivos para escapar da ação letal dos agentes antimicrobianos, ocasionando a sua resistência ao seu respectivo tratamento farmacológico (PETERSON; KAUR, 2018; RATHER et al., 2017).
Diante deste cenário, nos últimos anos a Organização Mundial de Saúde (OMS) tem difundindo determinadas informações por meio de relatórios anuais sobre os principais microrganismos resistentes a antibióticos que afligem toda comunidade médica (ASLAM et al., 2018). Nos respectivos relatórios, bactérias bacilares como Helicobacter pylori (H. pylori) e Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) situam-se categoricamente entre as primeiras posições no ranking das bactérias mais persistentes (HOOI et al., 2017; WHO, 2018). A categorização destas duas bactérias, é enfatizada pelas poucas opções de fármacos nos referentes tratamentos contra esses microrganismos (RIBALDONE et al., 2019; TIBERI et al.,
2018). Atualmente, a maioria dos fármacos que são utilizados como recurso terapêutico para tratar as infecções bacterianas são oriundos de modificações estruturais de classes antimicrobianas já existentes (MANTRAVADI et al., 2019), o que indica uma séria falta na elaboração de novas classes terapêuticas que sejam capazes de hostilizar a crescente ameaça da resistência bacteriana.
Uma nova tática está sendo implementada para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos contra essas bactérias patogênicas, e o alvo desta operação está sendo as respectivas rotas biossintéticas desses microrganismos (BELETE, 2019). A via do chiquimato é uma rota metabólica de suma importância para o desenvolvimento desses microrganismos (AVERESCH; KRÖMER, 2018), vários compostos já foram sintetizados e submetidos a ensaios biológicos para avaliar a sua capacidade de inibir as 7 respectivas enzimas que compõem a via do chiquimato (COGGINS et al., 2003). A síntese desses inibidores foram utilizadas como um estudo de linha de base para investigar detalhadamente os 7 mecanismos enzimáticos da via, principalmente a terceira enzima da via metabólica, sendo o Desidroquinato desidratase II (DHQase II) (TOSCANO et al., 2003, 2005). Entre os inibidores presente na literatura, o composto de origem natural o ácido quínico em sua forma oxidada (ácido 3-desidroquínico) (figura 1) tem contribuído na elaboração de uma série de análogos que possa atuar na via do chiquimato. Devido a sua capacidade promissora de inibir diretamente a enzima DHQase II desses microrganismos, particularmente do H. pylori e M. tuberculosis (BARCO A, BENETTI S, RISI C, MARCHETTI P, 1997; GOHARI et al., 2010; MATSUSHIMA et al., 2008).
Figura 1 - Estrutura molecular dos precursores da série de inibidores do DHQase II dos bacilos H. pylori e M. tuberculosis.
1.2 A VIA DO CHIQUIMATO
A via do chiquimato consiste em 7 reações nas quais são promovidas por diferentes enzimas (figura 2). A respectiva via metabólica é responsável pela biossíntese de alguns aminoácidos aromáticos, vitaminas K e E, folatos e dentre outros compostos (CUI et al., 2019). Encontra-se presente em algumas bactérias, fungos, algas, protozoários, plantas e inexistente em mamíferos, o que inclui os seres humanos (GANLEY; TORO-MORENO; DERBYSHIRE, 2018). Tornando-as referentes enzimas da via do chiquimato, alvos cativantes para o planejamento racional de novos antimicrobianos potentes e altamente seletivo.
Figura 2 - Esquematização dos 7 mecanismos enzimáticos da via do chiquimato.
Fonte: Elaborado pelo autor
A primeira etapa da via do chiquimato, começa com a condensação do fosfoenolpiruvato (PEP) com o eritrose 4-fosfato. No qual são classificados como compostos intermediários no metabolismo de carboidratos, pertencendo respectivamente a via da glicólise
e da pentose-fosfato (CHEUNG; OLIN-SANDOVAL; GRÜNING, 2016; MCKAY et al., 2017). O produto formado pelo processo de condensação é o fosfato (DAHP), decorrido da catalisação pela enzima 3-deoxi-d-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintase (DAHPS) (POTT; OSORIO; VALLARINO, 2019). A segunda reação da via do chiquimato é a eliminação do grupo fosfato do DAHP pela enzima 3-desidroquinato sintase (DHQS), dando origem ao 3-desidroquinato (DHQ) (ZHU et al., 2018).
Em seguida, ocorre o processo de desidratação (eliminação de água (H2O)) proporcionado pela enzima 3-desidroquinato desidratase (DHQase). Concebendo como resultante o 3-desidrochiquimato (DHS) (LIU et al., 2015). O transcurso na desidratação da terceira etapa da via do chiquimato, pode ser realizado por dois tipos de enzimas distintas da DHQase, conhecidas como o DHQase do tipo I e do tipo II (TOHGE et al., 2013). As respectivas enzimas possuem uma similaridade relacionada com o processo de desidratação reversível da molécula por mecanismos completamente distintos (GONZALEZ-BELLO, 2015). Na quarta etapa metabólica, transcorre um reação de redução na molécula DHS pela chiquimato desidrogenase, sendo designada como o chiquimato NADP+ oxidoredutase. Obtendo como produto da reação, o chiquimato (PUNKVANG et al., 2019).
No quinto passo da via do chiquimato, ocorre uma fosforilação no intermediário chiquimato pela ação enzimática da chiquimato quinase. Formando o chiquimato-3-fosfato (S3P) (MEHRA et al., 2016). Na sexta etapa da rota, a formação do 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP), é devido a um processo de condensação do S3P com a entrada da segunda PEP na reação (YAO et al., 2018). A enzima que promove este processo é a 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) (SUTTON et al., 2016). Finalmente, a sétima e última etapa da via do chiquimato é a saída do grupo fosfato da molécula EPSP pela ação enzimática da corismato sintase, ocorrendo a formação do corsimato (BILAL et al., 2018). O qual desempenha um papel na biossíntese de compostos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) que são primordiais para o crescimento de microrganismos patogênicos, especialmente os bacilares, como o H. pylori e M. tuberculosis (PARTHASARATHY et al., 2018).
2 OBJETIVOS
No presente estudo, os objetivos propostos estão subdivididos em objetivo geral e objetivos específicos.
2.1 OBJETIVO GERAL
A implementação dos métodos computacionais delineados no presente trabalho, foram utilizados em estratégias para o planejamento racional e otimização de novos compostos que possam inibir a ação enzimática da DHQase II proporcionando uma grande economia de tempo e recursos financeiros na seleção de candidatos com maiores probabilidades de se tornar um fármaco bacteriostático ou bactericida.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Realizar um estudo de Activity Cliff nas moléculas presentes da literatura;
b) Construir e validar extensivamente os modelos de QSAR para a previsão da atividade inibitória enzimática;
c) Planejar e prever a atividade inibitória teórica de uma série de moléculas planejadas; d) Averiguação das moléculas planejadas em relação a sua acessibilidade sintética.
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 HELICOBACTER PYLORI
Antigamente, os acometidos processos patológicos do trato gastrointestinal (TGI) como a gastrite, úlcera gástrica, duodenite (inflamação do duodeno) e úlcera duodenal eram atribuídos exclusivamente ao desiquilíbrio do suco gástrico estomacal, no qual é constituído por água, ácido clorídrico e enzimas digestivas (KUNA et al., 2019; LU et al., 2010; SUNG et al., 2016). Com o passar dos anos, estudos tem demonstrado que a presença de H. pylori na região estomacal podem estar associado com as respectivas manifestações patológicas que aflige o TGI (KAMOGAWA-SCHIFTER et al., 2018).
O H. pylori é uma bactéria Gram-negativa, espiralada, em forma de bastonete, exibindo múltiplos flagelos na sua estrutura bacilar, permitindo uma alta mobilidade do microrganismo na mucosa estomacal (figura 3) (KRZYŻEK; BIERNAT; GOŚCINIAK, 2018). Outra característica marcante da bactéria, é a sua capacidade de sobreviver em meio ácido estomacal, devido a enzima uréase que a bactéria expressa (VALENZUELA-VALDERRAMA et al., 2019). A urease irá atuar como receptor de íons H+, promovendo um processo de hidrólise na ureia (CO(NH2)2) que se encontra presente no suco gástrico do estômago. Em seguida, ocorre a produção do bicarbonato (HCO3−) e da amônia (NH4+). Deixando o local em que a bactéria habita (na parede estomacal) em um pH de caráter base (AL-THAHAB; AL-AWSI, 2018).
Figura 3 – Representação figurativa da cepa de Helicobacter pylori
Fonte: Adaptado pelo autor, a imagem original pertence à página Fred Hutch. Disponível em: https://www.fredhutch.org/en/news/spotlight/2018/09/hb_blair_molmicrobiol.html
Em relação ao seu meio de transmissão, uma das maneiras da pessoa adquirir o patógeno é por meio iatrogênico. Quando a pessoa submete-se ao exame de endoscopia, o
respectivo tubo endoscópico que irá entrar em contato com a mucosa esofágica e gástrica do paciente, se não estiver devidamente esterilizado, o paciente pode contrair o microrganismo (GONMEI et al., 2019; KOVALEVA et al., 2013). Outra via de transmissão do bacilo, é por meio da ingestão de água e de alimentos contaminados por fezes (KAYALI et al., 2018). As pessoas que são portadoras dessa bactéria geralmente são assintomáticas, e esse tipo de microrganismo é frequentemente adquirido na infância e pode persistir por toda a vida (KAO; SHEU; WU, 2016). A persistência dessa infecção não é bem esclarecida, e a possibilidade de uma eliminação “espontânea” do microrganismo deve ser considerada de acordo com os especialistas da área (LIM et al., 2018).
3.1.1 Aspectos epidemiológicos
Infecções oportunistas de etiologia bacteriana é uma das principais causas de morte em países em desenvolvimento, devido às precárias condições sanitárias e socioeconômicas (PANG et al., 2018). A infecção ocasionada pela bactéria H. pylori, é um exemplo clássico de infecção oportunista, que aflige os respectivos países que encontram-se em desenvolvimento. Estima-se que mais da metade da população mundial esteja infectada pelo microrganismo (AITILA et al., 2019). Apesar da sua alta taxa de incidência e prevalência, uma boa parte da população desconhece o microrganismo e as suas possíveis complicações que ele pode proporcionar ao indivíduo (WAWRO et al., 2019).
De acordo com a revisão sistemática, na qual foi elaborada por HOOI e colaboradores no ano de 2015, em torno de 4,4 bilhões de indivíduos em todo o mundo estavam infectados pelo o microrganismo. No respectivo estudo, ressaltou-se que a prevalência do H. pylori tem declinado em países com altas taxas de industrialização, principalmente os que ficam localizados no mundo ocidental. Enquanto isso, nos países que encontram-se no processo de desenvolvimento e que são recém-industrializados, a prevalência da bactéria é estabilizada (HOOI et al., 2017). Provavelmente, a discrepância abordada entre os países industrializados e os que são recém-industrializados sobre a prevalência da bactéria H. pylori pode estar correlacionados com as condições sanitárias, com o nível de urbanização, aspectos socioeconômicos e o acesso da população à água potável.
Outro estudo publicado de revisão sistemática, dessa vez sendo mais abrangente em relação a prevalência da bactéria a nível mundial teve como ênfase uma metanálise na variação da prevalência do microrganismo entre as regiões continentais, enquadrando-se os seus respectivos países (ZAMANI et al., 2018). Na referente metanálise (figura 4), foi observado
que na região da América do Norte possui uma baixa prevalência de H. pylori. Entretanto, na América Latina incluindo o Caribe e no continente asiático observa-se que há um aumento na conveniente persistência do microrganismo sobre as respectivas regiões. Em relação ao continente africano, nota-se que em alguns países da África apresenta uma taxa alarmante na prevalência do patógeno. Entretanto, no referente continente uma boa parte dos países desconhece sobre o seu real cenário epidemiológico que se encontram com relação a prevalência do H. pylori.
Figura 4 - Uma metanálise global da prevalência de H. pylori.
Fonte: Adaptado pelo autor, a imagem original pertence ao (ZAMANI et al., 2018)
3.1.2 Tratamento farmacoterapêutico e Resistência aos Tratamentos Convencionais
A primeira e única linha de tratamento para combater a infecção cometida pelo H. pylori é constituída por um inibidor da bomba de prótons (omeprazol), associado com dois antibióticos: claritromicina e amoxicilina (figura 5) (YAMAOKA; ANSARI, 2018). O respectivo esquema farmacoterapêutico é protocolizado como terapia tripla convencional. O referente protocolo terapêutico é aderido em alguns países asiáticos, europeus, nos E.U.A (Estados Unidos) e no Brasil (DOS SANTOS; CARVALHO, 2015). Mesmo dispondo de um recurso farmacoterapêutico bem estabelecido pela literatura médica, nos últimos anos, a eficácia da terapia tripla convencional diminuiu significativamente com relação a erradicação de H. pylori (SAFAVI, 2016). A referente perda da eficácia terapêutica é devido à resistência
que o microrganismo aderiu ao fármaco claritromicina (JAKA et al., 2018; SUZUKI et al., 2019) indicando a escassez de novos tratamentos que sejam capazes de hostilizar a ação da bactéria.
Figura 5 – Estrutura molecular dos respectivos fármacos que são utilizados na terapia tripla convencional para
combater o microrganismo H. pylori.
Fonte: Elaborado pelo autor
3.2 MYCOBACTERIUM TUBERCULIS
O Mycobacterium tuberculosis (figura 6) é uma bactéria gram-positiva, aeróbia, sendo caracterizado em forma de bastonete e possui um crescimento bastante lento. (MOON et al., 2017). O M. tuberculosis é considerado o protagonista responsável pelo aparecimento da tuberculose pulmonar. Entretanto ele não é o único microrganismo da espécie que pode ocasionar o aparecimento da tuberculose. Porém, é o mais estudado em relação as outras espécies como o Mycobacterium canetti, Mycobacterium africanum dentre outros (JANKUTE et al., 2017), devido ao simples fato do M. tuberculosis conseguir infectar aproximadamente um terço da população mundial (HOUBEN; DODD, 2016).
Figura 6 – Representação figurativa da bactéria M. tuberculosis.
Fonte: Adaptado pelo autor, a imagem original pertence à página IStock.
Disponível em:
https://www.istockphoto.com/br/fotos/tuberculosis-bacterium?sort=mostpopular&mediatype=photography&phrase=tuberculosis%20bacterium
A tuberculose pulmonar é uma doença considerada infectocontagiosa, e a sua transmissão é propagada essencialmente pelo ar, quando um indivíduo infectocontagioso começa à tossir, espirrar ou falar (MCCREESH; WHITE, 2018). A infecção ocorre quando os bacilos tuberculosos dispersos pelo ar atingem os alvéolos pulmonares do hospedeiro. ao atingir os alvéolos, essa bactéria será fagocitada pelos macrófagos alveolares devido a primeira linha de defesa do sistema imunológico (imunidade inata) (LERNER; BOREL; GUTIERREZ, 2015). Caso ocorra uma falha nos mecanismos de defesa da imunidade inata, a bactéria irá se replicar e disseminar uma ativação dos mecanismos de defesa da imunidade adaptativa, onde se tornará crítica para o controle da infecção (DE MARTINO et al., 2019).
3.2.1 Aspectos Epidemiológicos
De acordo com o estudo elaborado por GLAZIOU e colaboradores, no qual teve como ênfase no real cenário epidemiológico da tuberculose a nível global. O respectivo estudo mostrou que os bacilos de M. tuberculosis são incidentes nas seguintes regiões tropicais e subtropicais da América do Sul, do continente africano, parte do sudeste asiático, no leste Mediterrâneo e do Pacifico ocidental (figura 7). Além da sua incidência, o M. tuberculosis detém uma notavel capacidade de persistir aos tratamentos convencionais com os antibióticos, o que acarreta a prevalência do microrganismo nas respectivas regiões cotinentais do globo.
Figura 7 - Uma metanálise no cenário epidemiológico a nível global de M. tuberculosis.
Fonte: Adaptado pelo autor, a imagem original pertence ao (GLAZIOU; FLOYD; RAVIGLIONE,
2018)
A resistência que o microrganismo adquiriu com relação aos tratamentos convencionais, não é o único fator que contribuem para a sua incidência e prevalência ao redor do mundo. O aumento que vem ocorrendo nas mudanças demográficas nos paises em desenvolvimento, consistem em um exorbitante deslocamento migratório populacional da zona rural para zona urbana, proporcionando um aumento descontrolado em relação ao número de habitantes nas grandes cidades (JOHNSON; LICHTER, 2019; LERCH, 2019). Por sua vez, os grandes centros urbanos não foram capazes de acompanhar o extenso fluxo migratório. Com isso, as necessidades básicas como moradia e o acesso ao saniamento básico passaram a serem negligenciados.
Atualmente, uma boa parte da população que habitam as grandes cidades da América Latina, passaram a chamar as favelas e os cortiços de lares. Além disso, fatores como o deterioramento na saúde pública e com a precaridade das condições socioeconômicas que encontra-se presente nas grandes periferias urbanas, vem contribuindo no aumento de novos casos de transmissão e surtos da tuberculose (JAITMAN, 2015; PRASAD et al., 2015; WOODMAN; HAEUSLER; GRANDJEAN, 2019). De acordo com o boletim epidemiológico emitido pelo Ministério da Saúde, foi observado um aumento significativo no coeficiente de incidência da tuberculose naqueles municipios brasileiros que possuem uma das piores condições sanitárias e socioeconômicas. No ano de 2015, estimava-se que a incidência da tuberculose nos respectivos municipios eram de 52,2 casos/100 mil habitantes, em 2018, o
coeficiente aumentou em torno de 2,7%, passando a ser 53,7 casos/100 mil habitantes (MINISTÉRIO DA SAÚDE; SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2019). 3.2.2 Tratamento Farmacoterapêutico e Resistência aos Tratamentos Convencionais
Na década de 1960, o aparecimento e a prevalência da resistência do bacilo tuberculoso já atingia todo o globo. Dessa forma, surgiu uma necessidade de estabelecer um regime no tratamento farmacoterapêutico para combater a infecção bacteriana (BULE et al., 2017). O respectivo tratamento começou a ser padronizado na mesma década através do uso combinatório da isoniazida (H), estreptomicina (S) e pirazinamida (Z) por 18 meses (regime HSZ) (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2018). O tempo do tratamento ainda continua sendo a principal causa dos pacientes suspender a medicação após apresentar “melhoras” no início da terapia medicamentosa tornando um dos principais fatores que possa contribuir na persistência da infecção (SAHILE; YARED; KABA, 2018). Só nos meados da década de 1970, foi implementado um esquema farmacoterapêutico a curto prazo utilizando a rifampicina (R), isoniazida (H) e pirazinamida (Z) por 6 meses (Regime RHZ) (MURRAY; SCHRAUFNAGEL; HOPEWELL, 2015). O Brasil foi o primeiro país do mundo a implementar o regime terapêutico RHZ no sistema público de saúde, contendo todas as possíveis informações sobre o tratamento e distribuindo de forma gratuita (BASTOS et al., 2017).
Figura 8- Estrutura molecular dos fármacos utilizados para o tratamento da tuberculose.
Desde então, nenhum regimento terapêutico foi desenvolvido para combater a crescente infecção cometida pelo M. tuberculosis. A bactéria conseguiu desenvolver uma notável capacidade de escapar dos efeitos farmacológicos dos tratamentos convencionais, o que indica a necessidade de novos fármacos potentes, altamente seletivos e que sejam capazes de hostilizar a crescente infecção que está sendo acometida pelo M. tuberculosis. Enquanto não surge um tratamento inovador para combater o microrganismo, as políticas públicas vem assumindo o compromisso com as pessoas e com a comunidade internacional, com o propósito de controlar a evolução da tuberculose e reduzir a sua prevalência na população (CENTIS et al., 2017).
3.3 FERRAMENTAS COMPUTACIONAIS PARA O DESIGN DE NOVOS FÁRMACOS Devido à complexidade e as falhas no processo de desenvolvimento de novos fármacos inovadores, a indústria farmacêutica utiliza-se grandemente tecnologias computacionais com o intuito de minimizar consideravelmente o tempo, os recursos financeiros envolvidos e as falhas que possa ocorrer durante o planejamento de novos fármacos (ROY et al., 2017).
O Activity Cliff (penhasco de atividade) é um dos métodos in silico que vem sendo muito aplicado na área da química medicinal. Tem como objetivo de averiguar em um conjunto de moléculas com grande similaridade estrutural sendo ela bidimensional (2D) ou tridimensional (3D) a sua acentuada diferença na atividade biológica (PÉREZ-VILLANUEVA et al., 2015). A análise estrutural em 2D de um par de Activity Cliff, é representada pela presença ou ausência de um determinado grupamento químico. Enquanto na 3D, a respectiva análise é feita por comparação topológica das superfícies eletrônicas das moléculas (BAJORATH, 2017; MAGGIORA et al., 2014).
O docking molecular é um método utilizado para predizer a melhor orientação de ajuste de um ligante (molécula) em uma proteína alvo como a DHQase II, essa abordagem permite uma elucidação das interações intermoleculares entre ligante e proteína alvo. A implementação da dinâmica molecular, têm como propósito de aprimorarem os resultados do docking molecular, uma vez que abordagem por docking é realizada a vácuo, enquanto na dinâmica molecular tem o intuito de mimetizar o mais realista possível o sistema biológico, considerando os seguintes parâmetros: temperatura, volume e pressão (SALMASO; MORO, 2018).
O método Quantitative Structure-activity Relationship (QSAR) têm como o principal objetivo, a construção de modelos matemáticos baseados na hipótese que as variações
da resposta biológica de uma série de compostos estão relacionados com as mudanças nas propriedades estruturais da molécula. Sendo assim, essa técnica permite predizer a atividade biológica de novos compostos através das características estruturais específicas (descritores moleculares) (KAUSAR; FALCAO, 2018).
Os descritores moleculares são classificados de acordo com a dimensionalidade estrutural da molécula (GLADYSZ et al., 2018). Os compostos unidimensionais (1D) são embasados na fórmula molecular e nas seguintes propriedades físico-químicas, como log P, massa molecular, refratividade molar e dentre outros; os descritores bidimensionais (2D) conseguem descrever o número de átomos e de ligações presentes na molécula, índices de conectividade, entre outras propriedades que podem ser descritas de uma molécula na qual esteja representada em 2D; já os descritores que ocupam o espaço tridimensional (3D) conseguem descrever possíveis interações intermoleculares, como por exemplo: o volume de Van der Waals, forças eletrostáticas (lei de Coulomb), potenciais de Lennard-Jones, entre outros (KURODA, 2017). As respectivas informações que estão contidas nos descritores 3D, leva em conta a influência dos confôrmeros, estereoisômeros ou enatiômeros presentes na molécula, ou seja, dependem da conformação molecular do composto (SLIWOSKI et al., 2012). Atualmente nenhum fármaco é elaborado sem passar pelo QSAR.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 BANCO DE DADOS DE INIBIDORES DA DESIDROQUINASE TIPO II
Cerca de 86 inibidores da DHQase II de M. tuberculosis e 57 de H. pylori foram encontrados e selecionados para a realização deste estudo (APÊNDICE A e B) (BLANCO et al., 2014; PAYNE et al., 2007a, 2007b; PAZ et al., 2011; PRAZERES et al., 2007, 2009; SÁNCHEZ-SIXTO et al., 2005; TIZÓN et al., 2011; TRAN et al., 2011). Cada composto teve sua estrutura 3D construída empregando o programa MarvinSketch versão 18.16 (CHEMAXON-LTD, 2013) usando a sua maior microspecie em um pH = 7.40. Após uma cuidadosa inspeção visual, cada composto foi otimizado utilizando o nível da teoria semi-empírica PM7 implementado no MOPAC (JAMES J. P. STEWART, 2016) no implícito modelo de água COSMO (KLAMT; SCHUURMANN, 1993). Os respectivos valores de inibição dos compostos foram mesurados em Ki, aplicou-se a escala micromolar, para que os valores fosse linearizados em pKi. Utilizando a fórmula abaixo: Equação (1).
pKi = -log (Ki) (1)
4.2 ESTUDOS DE ACTIVITY CLIFF
Para investigar a influência das diferenças estruturais na atividade biológica dos inibidores da DHQase II, realizou-se uma análise de Activity Cliff. Para isso, o software Openbabel (O’BOYLE et al., 2011) foi usado para calcular a semelhança estrutural em 2D pelo método de Tanimoto entre cada composto por meio de um Shell script Ad-hoc. As semelhanças tabuladas foram utilizadas para calcular o Structure-Activity Landscape Index(SALI) (GUHA, 2012) de acordo com a equação 2.
𝑆𝐴𝐿𝐼 = |𝐴𝑖−𝐴𝑗|
1.05− 𝑆𝐼𝑀𝑖,𝑗 (2)
O Ai e Aj é o pKi de dois compostos diferentes i e j, o SIM i,j representa a sua semelhança por Tanimoto. Para evitar uma possível divisão por zero, o valor 1,05 foi modificado a partir do trabalho original dos autores. Os dados resultantes foram ajustados para serem utilizados pelo programa Gephi 0.92 (BASTIAN; HEYMANN; JACOMY, 2009) para a sua interpretação. Os valores do SALI foram atribuídos a pesos de arestas. Após filtrar os menores pesos, os Activity Cliffs foram revistos e analisados individualmente.
4.3 ALINHAMENTO MOLECULAR 4.3.1 M. tuberculosis
Depois de várias tentativas frustradas de construir modelos de QSAR 2D e 3D. Com os dados diante em mãos, nós escolhemos usar uma abordagem multiconformacional independente de receptores para construir modelos que provaram ser os mais preditivos. Como meio de construir um modelo QSAR de multiconformacional estocástico, i.e. um QSAR-4D, o espaço conformacional dos compostos foram amostrados usando o algoritmo genético multiobjetivo implementado pelo Ballon (VAINIO; JOHNSON, 2007). Todos as possíveis conformações dos compostos foram alinhadas pela sobreposição dos átomos de carbono presentes nos respectivos núcleos (ácido 3-desidroquinato e no anidroquinato), utilizando como estrutura de referência o composto B57 (APENDICE A). Este composto tem a sua conformação biológica determinada por cristalografia, na qual está depositado no Protein Data Bank (PDB) com o código BZ5 (BERNSTEIN et al., 1978a).
Figura 9 - Demonstração de todas as possíveis conformações moleculares de um único composto, através da
abordagem multiconformacional independente de receptores.
Fonte: Elaborado pelo autor.
4.3.2 H. pylori
O alinhamento molecular dos 57 compostos foi feito utilizando o pharmACOphore (KORB et al., 2010) automatizado por um shell script ad hoc (figura 10). Todos os compostos foram alinhados ao inibidor cristalografado 2WKS do Protein Data Bank (PDB) (BERNSTEIN et al., 1978b). Inicialmente, verificou-se que o alinhamento automático falhou extensivamente
ao produzir conformações satisfatórias. Em seguida, procedimentos cuidadosos de acoplamento manual foram realizados para alinhar todos os ligantes ao local ativo do inibidor. Isso foi revisado minuciosamente porque a qualidade do alinhamento influencia diretamente na qualidade dos modelos.
Figura 10 - Alinhamento molecular dos inibidores da DHQase II de H. pylori.
Fonte: Elaborado pelo autor.
4.4 CÁLCULO DOS DESCRITORES INTERMOLECULARES
4.4.1 Descritores Bidimensionais (2D)
O modelo QSAR-2D foi construído com base nos descritores calculados usando o software PaDEL-Descriptor (YAP, 2011). Os descritores resultantes foram submetidos a um processo de filtragem usando R (R FOUNDATION FOR STATISTICAL COMPUTING., 2018) no R-Studio versão 3.4.4 (TEAM, 2013) para remover descritores com valores ausentes e aqueles com variação nula. O pacote Caret (KUHN, 2008) foi utilizado para remover os descritores altamente correlacionados.
4.4.2 Descritores Tridimensionais (3D)
Os descritores de campo de interação molecular: Lennard-Jones (LJ), eletrostático (QQ), ligações de hidrogênio (HB) e hidrofóbico (HF) foram calculados de acordo com um método da literatura que já está previamente descrito (PATIL et al., 2018). Para o cálculo do processo de descritores de campo de interação molecular, utilizou-se uma grade com resolução de 1 ångström (Å). Os descritores que estavam muito distantes das conformações alinhadas
foram removidos por meio do corte daqueles que apresentavam uma baixa variância (0,02). Além disso, os descritores altamente Inter correlacionados foram removidos (em um nível de 0,98) mantendo apenas aqueles que estavam melhor correlacionados com a variável dependente y (pKi). Após os processos de filtragem, a seleção dos preditores ordenados (OPS) foi usada para selecionar as variáveis mais significativas para construir os respectivos modelos de QSAR através da implementação do pacote QSAR modeling (MARTINS; FERREIRA, 2013).
4.5 CONSTRUÇÃO E VALIDAÇÃO DOS MODELOS DE QSAR
4.5.1 M. tuberculosis
A qualidade do modelo construído foi avaliada principalmente pela sua capacidade de prever bem para o conjunto de dados externos (Qext2 ). O modelo QSAR-4D foi construído para um conjunto de treinamento com 63 compostos (70%) e a validação externa foi feita utilizando um conjunto de teste com 23 compostos (30%). A validação interna também foi completamente feita por leave-N-out (LNO) e y-randomization. Estes testes foram realizados para verificar respectivamente, a robustez do modelo e para detectar se o modelo obtido foi por um acaso. Além disso, o domínio de aplicabilidade - índice de perturbação do modelo (AD-MDI) (YAN et al., 2014) permitiu descobrir a confiabilidade preditiva do modelo construído, no qual foi utilizado para prever os valores em pKi dos novos compostos concebidos. Além disso, várias métricas como Q2F1, Q2F2 e Q2F3 foram incluídas para avaliar a previsão externa, bem como o coeficiente de correlação de concordância (CCC) (CHIRICO; GRAMATICA, 2011). Os erros foram avaliados pelo o erro médio absoluto (MAE) e o raiz do erro quadrático médio (RMSE) para os conjuntos de dados de treinamento e externo. A posição de cada descritor molecular e, consequentemente, a sua importância foi analisada pelo software UCSF Chimera (PETTERSEN et al., 2004).
4.5.2 H. pylori
Para reduzir a dimensionalidade dos dados das variáveis independentes, uma série de processos de filtragem foi aplicada usando a seleção de preditores ordenado (OPS) disponível no software QSAR modeling (MARTINS; FERREIRA, 2013). O método de regressão linear múltipla (MLR) implementado no software NanoBRIDGES (AMBURE et al., 2015) foi utilizado para construir os três modelos de regressão linear (QSAR-2D, QSAR-3D e QSAR híbrido) a partir de um conjunto de variáveis independentes geradas pelo OPS redução de cada uma das matrizes. O conjunto de treinamento contendo 40 moléculas foi utilizado para
desenvolver os três modelos lineares e o conjunto de testes, com 17 moléculas, foi usado para avaliar a capacidade preditiva dos modelos construídos (Qext2 ) atrelado à análise do domínio de aplicabilidade - índice de perturbação do modelo (AD-MDI) (YAN et al., 2014) . A qualidade dos modelos construídos foi avaliada usando parâmetros estatísticos de Q² e R². O Leave-N-out (LNO) e o y-randomization foram utilizados para validação interna dos modelos construídos. O LNO e o y-randomization foram utilizados para analisar a robustez e a presença de correlações aleatórias dos modelos construídos, respectivamente.
4.6 DESIGN DE NOVOS INIBIDORES DA DESIDROQUINASE TIPO II DE M. TUBERCULOSIS
Muitos compostos do scaffold ácido 3-desidroquinato na posição R (figura 11) foram criadas como possíveis inibidores. Uma biblioteca de 23.000 inibidores da DHQase II foi construída substituindo o R por uma biblioteca de fragmentos composta por 1794 compostos presentes na base de dados Enamine GOLDEN FRAGMENT LIBRARY (enamine.net). Estes compostos foram desenvolvidos através da ligação de cada hidrogénio presente nos respectivos fragmentos com o scaffold do ácido 3-desidroquinato. Para filtrar alguns dos compostos gerados, cada composto foi submetido a um acoplamento molecular dentro do bolso de ligação da proteína, com o PDB (ID:4B6Q) usando o software AutodockVINA (TROTT; OLSON, 2010). Os compostos com os valores mais promissores no score foram selecionados posteriormente para uma inspeção visual para qualificar as suas interações com o local de ligação da DHQase II. A fim de aumentar sua acessibilidade sintética, os compostos foram selecionados por sua simplicidade estrutural. Finalmente, o composto dentro dos parâmetros do AD-MDI teve seu possível pKi determinado pelo modelo de QSAR-4D construído.
Figura 11 – O ácido 3-desidroquinínico usado como scaffold para construir a biblioteca de inibidores da DHQase
II.
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 M. TUBERCULOSIS
5.1.1 Análise Estatística do Modelo Estocástico (QSAR-4D)
Uma vez que toda a matriz dos descritores foi calculada, algumas etapas de filtragem foram aplicadas. Os descritores muito distantes e muito próximos dos modelos moleculares alinhados foram removidos como os altamente inter-relacionados. A matriz resultante tinha 3237 descritores. O algoritmo OPS foi aplicado para reduzir ainda mais o número destes descritores. O melhor modelo de QSAR-4D obtido após filtragem tinha 14 descritores, com 5 variáveis latentes usando o método PLS disponível no software QSAR modeling (MARTINS; FERREIRA, 2013), um software que foi projetado especificamente para tratar dados de QSAR, que inclui a seleção de variáveis com método OPS, construção de modelos de regressão por PLS e métodos de validação para o modelo gerado. Uma expressiva capacidade de predição foi identificada no modelo apesar de ter três amostras mal previstas (figura 12), mostrando R² = 0.86, Q² = 0.78 e uma adequada previsão externa de Qext2 = 0.72. Os valores do CCC mostraram-se acima dos 0.85 (0.892) limite recomendado (CHIRICO; GRAMATICA, 2011) (Q2F1 = 0.70, Q2F2 = 0.70, Q2F3 = 0.73, CCC = 0.892, MAEext = 0.36, RMSEext = 0.46, MAE treinamento = 0.37 e RMSE treinamento = 0.49).
Figura 12 - Gráfico do modelo de QSAR-4D. Os valores previstos (y) vs os inibidores experimentais dos
compostos da DHQase II (x) em pKi. O conjunto de treinamento está em vermelho e o conjunto de teste em azul.
Fonte: Elaborado pelo autor. 5.1.2 Validação do Modelo Construído
A robustez do modelo de QSAR-4D foi verificada através do teste LNO. Os resultados apontaram apenas 3 pequenas flutuações no valor de Q²LNO até 20 amostras durante o processo de validação cruzada (figura 13). Em outras palavras, ele pode prever a atividade
biológica dos compostos que resistem à remoção de 20 amostras, o que caracteriza um modelo robusto de acordo com os dados da literatura (VEERASAMY et al., 2011).
Figura 13 – O gráfico da caixa abaixo no qual refere-se ao Leave-N-out. As estatísticas deste teste foram
aplicadas mais de 100 repetições para cada N de amostras que foram deixadas para fora.
Fonte: Elaborado pelo autor.
O teste de y-randomization mostrou que quase todos os valores de R² e Q² computados para uma variável dependente embaralhada se mostraram inferiores a 0.4 e 0.0 respectivamente (figura 14). Neste contexto, é muito provável que o modelo não tenha sido obtido por acaso.
Figura 14 - Gráfico do y-randomization. O modelo real é apresentado longe dos modelos que foram gerados
aleatoriamente.
Fonte: Elaborado pelo autor.
O modelo final tinha no total 14 descritores de interação molecular. Curiosamente, havia apenas duas naturezas diferentes de descritores, hidrofóbico e Lennard-Jones com um sinal vetor de regressão positivo ou negativo (tabela 1). Dentre eles, a maioria foi classificada
como LJ positivo (9), seguida de LJ negativo (3) e, finalmente, descritores hidrofóbicos (2). A interpretação de cada descritor foi baseada em sua posição espacial e suas associações com a bolsa de ligação DHQase II (figura 15).
Figura 15- Os descritores do QSAR-4D e as suas respectivas ocupações espaciais relacionada a um dos
compostos mais ativos da série. Os descritores LJ com um vetor positivo são exibidos em azul, os descritores LJ com um vetor negativo são exibidos em amarelo e os descritores HF são exibidos em rosa.
Fonte: Elaborado pelo autor
Tabela 1 – Dados sobre os descritores de campo de interação molecular do modelo de QSAR-4D por PLS.
Código Coordenadas (X, Y e Z) Descritores Valores da Regressão I 1.529 34.131 76.072 Lennard-Jones 0.7667 II 4.529 40.131 78.072 Lennard-Jones 0.0427 III 6.529 41.131 76.072 Lennard-Jones 0.11422 IV 6.529 39.131 75.072 Lennard-Jones 0.31666 V 8.529 37.131 76.072 Lennard-Jones 0.04099 VI 7.529 37.131 81.072 Lennard-Jones 0.05584 VII 9.529 38.131 78.072 Lennard-Jones 0.05601 VIII 10.529 35.131 79.072 Lennard-Jones 0.13882 IX 11.529 38.131 81.072 Lennard-Jones 0.03341 I 6.529 37.131 79.072 Hidrofóbico -1.02051 II 4.529 38.131 77.072 Hidrofóbico -1.40244 I 6.529 41.131 76.072 Lennard-Jones -0.0398 II 5.529 37.131 77.072 Lennard-Jones -0.02924 III 4.529 39.131 85.072 Lennard-Jones -0.88211
5.1.3 Interpretação dos Descritores Juntamente Com as Análises dos Activity Cliffs
Os Activity Cliffs são originários de pequenas modificações na estrutura química em uma série de compostos que resulta em uma diferença acentuada em suas atividades biológicas (SALDÍVAR-GONZÁLEZ et al., 2017). Este método pode apoiar o desenho de
novos inibidores do DHQase II, uma vez que aponta as regiões críticas que influenciam na potência do inibidor. O uso da métrica SALI em gráficos de rede permite o estabelecimento de algumas relações estrutura-atividade. Os Activity Cliffs também podem ser relacionados com a interpretação dos descritores do modelo QSAR-4D, revelando informações importantes sobre derivados de ácido 3-desidroquínico.
Verificou-se que no Cliff A (figura 16) está relacionado à adição de um grupo alifático no anel anidroquinato, o que causa uma diminuição na atividade biológica. Esse tipo de informação também foi confirmada pela interpretação dos descritores negativos de Lennard-Jones (LJ2- e LJ3-) e pela observação da presença de substituintes alifáticos em ambas as regiões. Os descritores podem apontar uma diminuição significativa da atividade inibitória por esses compostos em comparação com alguns substituintes aromáticos.
Figura 16 - Activity Cliff A. No lado esquerdo, a remoção da região destacada da molécula no meio resulta em
um aumento da atividade biológica. Do lado direito, uma molécula é representada com os descritores QSAR-4D que parecem estar relacionados com este Activity Cliff.
Fonte: Elaborado pelo autor.
Os Cliffs B e C (figura 17) indicam que a presença de grupos polares no anel aromático que são destacados na figura e impactam negativamente na atividade biológica. A presença de grupos volumosos nesta região em particular refletem um aumento significativo de sua atividade inibitória. Portanto, corroborando a presença dos descritores de esferas azuis nesta região que comprovam que esta região é importante para a atividade dos compostos. Estes descritores estão localizados em posições onde grandes grupos com características hidrofóbicas
são favoráveis à atividade biológica, com as discrepâncias abordadas durante a discussão, mais um substituinte hidrofóbico aromático foi adicionado e os substituintes polares foram removidos nesta região para melhorar a atividade biológica.
Figura 17 – Representação dos Cliffs B e C. Em ambos os Cliffs, a remoção da região destacada dos compostos
no meio resulta em um aumento da atividade inibitória. No lado direito de cada Cliff, um composto é representado com os descritores de QSAR-4D que parecem estar relacionados com a discussão dos respectivos
Activity Cliffs.
Fonte: Elaborado pelo autor.
O Cliff D também foi considerado relevante devido à configuração absoluta do cloreto. Neste Cliff, o substituinte de cloreto exibindo uma atividade estereoquímica (R) mostrou uma atividade biológica favorável (figura 18). A discrepância abordada neste Cliff pode ser explicada através de um estudo de dinâmica molecular realizado por Blanco e colaboradores. Neste estudo mostrou que o cloreto em (R) estabelece duas interações extras com os resíduos de aminoácidos adjacentes prolina 11 e leucina 13 (PRO 11 e LEU 13) da enzima (ID PDB: 1H0S) (BERNSTEIN et al., 1978a) durante toda a simulação, juntamente com as energias livres de ligação calculadas dos compostos foi possível explicar a potência inibitória relatada (BLANCO et al., 2014). Finalmente, o Cliff E mostrou que a presença de um grupo sulfona entre os dois anéis aromáticos diminui a atividade biológica (figura 18).
Figura 18 – Representação do Cliffs D e E.
Fonte: Elaborado pelo autor.
Apenas dois descritores não foram explicados pela análise dos Activity Cliffs. O LJ1+ ao lado do anidroquinato refere-se a uma região estérica favorável à sua atividade biológica. Além disso, este descritor pode estar associado a uma aproximação dos resíduos de aminoácidos arginina 112 e arginina 108 (ARG 112 e ARG 108) com os substituintes polares do núcleo de anidroquinato (figura 19). Estes resíduos de aminoácidos podem contribuir para a estabilização do anidroquinato no local de ligação, de acordo com Yao e colaboradores (YAO; ZE-SHENG, 2014). O LJ1- não demonstrou nenhum tipo de interação com os resíduos de aminoácidos adjacentes da proteína, provavelmente este descritor está correlacionado com a interação feita com o local hidratado da proteína (figura 19).
Figura 19 - Os únicos descritores que não foram explicados pela relação estrutura-atividade (REA) na análise
dos Activity Cliffs
Fonte: Elaborado pelo autor.
5.1.4 Delineamento de Novos Potenciais Inibidores da DHQase II de M. tuberculosis
Foram gerados cerca de 23.000 análogos substituindo o substituinte R (figura 11) utilizando a Enamine Golden Fragment Library (enamine.net), seguida de acoplamento
molecular. Estes compostos virtuais foram filtrados utilizando uma pontuação mínima de -8,5 no qual foi gerado pelo o acoplamento molecular, reduzindo o número de análogos para 533 compostos. Os compostos foram inspecionados visualmente para remover compostos que possuem muitos estereocentros, resultando em 186 compostos. Os demais compostos apresentaram alta similaridade estrutural com os compostos já sintetizados e testados para a enzima DHQase II de M. tuberculosis, apresentando grandes substituintes não polares. Entre os 186 compostos, foram selecionados aqueles com acessibilidade sintética, resultando em 63 compostos. Com base nesse resultado, a previsão de pKi foi realizada mostrando 6 dos 63 compostos sendo considerado os mais promissores (tabela 2).
Tabela 2 – Os 6 dos 63 compostos mais promissores, nos quais foram projetados com base nos resultados dos
Activity Cliffs, juntamente com a análise dos descritores do modelo de QSAR-4D.
Código Compostos pKi previsto Score
A 7.63 - 8.5
B 8.69 - 8.5
C 7.30 - 8.5
E 7.86 - 8.8
F 7.74 - 8.6
5.1.5 Domínio de Aplicabilidade do QSAR-4D
O domínio de aplicabilidade do modelo foi avaliado nos compostos virtuais para garantir que as previsões são confiáveis. O domínio da aplicabilidade foi realizado através da análise do erro de previsão (PE) e do índice de perturbação do modelo (MDI). O PE foi calculado com base nos dados dos compostos que foram usados para validar o modelo e o MDI usa os dados dos descritores que foram usados para construir o modelo. No caso do MDI, o composto deve estar dentro do espaço modulado pelo conjunto de treinamento. Se o composto estiver fora do escopo definido, o desempenho do modelo construído usando um novo conjunto de treinamento será diferente. Levando à deterioração do modelo. Assim, a medida denominada índice de perturbação do modelo pode ser calculada entre o conjunto de treinamento modulado para fazer o modelo QSAR com um novo conjunto de treinamento.
Para simplificar a interpretação do AD-MDI do modelo de QSAR-4D, os resultados foram divididos em quatro quadrantes (I, II, III e IV) (figura 20). A amostra que está presente no quadrante I é uma amostra não confiável, que é erroneamente considerada confiável. O quadrante II é um espaço que idealmente deveria estar vazio. Por se tratar de uma área que apresenta alto índice de PE e MDI, sendo caracterizada como amostras não confiáveis. Diferente do quadrante II, as amostras do conjunto de testes presentes no quadrante III são amostras que apresentam um baixo índice em relação ao PE e ao MDI, indicando que as amostras são confiáveis e estão dentro do AD-MDI. Finalmente, no quadrante IV demonstrou que as amostras são confiáveis, mas são consideradas não confiáveis. Como as amostras estão em um espaço que apresenta um baixo índice de PE, no entanto, a mesma região mostra um alto índice de MDI. Diante desta discussão, O modelo linear construído para prever a potência inibitória dos novos inibidores da DHQase II de M. tuberculosis, encontram-se dentro do AD-MDI. Em outras palavras, a predição inibitória dos 6 compostos da tabela 2 são confiáveis.
Figura 20 – Estudo do AD-MDI do modelo de QSAR-4D.
Fonte: Elaborado pelo autor.
5.1.6 Estudo de Docking Molecular
Quando o mecanismo de interação molecular entre receptor e ligante é conhecido, esse tipo de informação não é apenas utilizado para compreender como as vias metabólicas são utilizadas pelo microrganismo, mas também permite o planejamento racional de novos fármacos (GURYANOV; FIORUCCI; TENNIKOVA, 2016). Ao longo das extensas simulações dinâmicas já realizadas em alguns inibidores da DHQase II, principalmente no ligante B57, notou-se que o núcleo anidroquinato, comum a todas as séries, preenche a bolsa hidrofílica no local ativo (GONZALEZ-BELLO, 2015; LENCE et al., 2013; YAO; ZE-SHENG, 2014).
Essa interação é caracterizada pela interação intermolecular com resíduos de aminoácidos, como ASN 75, ILE 102, SER 103, ARG 112 e HIS 81. O número de ligações de hidrogênio que o núcleo anidroquinato forma com os resíduos de aminoácidos contribui para a estabilização do composto em seu sítio ativo (Figura 21). Na mesma figura, o benzotiofeno foi relatado anteriormente como uma região importante no que diz respeito ao desenvolvimento de novos inibidores potentes (LENCE et al., 2013). Esse benzotiofeno está localizado perpendicularmente ao anel ciclohexano com seu átomo de enxofre que está posicionado em direção à bolsa hidrofóbica.
