Microbiologia Clínica

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(1)DOCÊNCIA EM SAÚDE. MICROBIOLOGIA GERAL.

(2) Copyright © Portal Educação 2012 – Portal Educação Todos os direitos reservados R: Sete de setembro, 1686 – Centro – CEP:79002-130 Telematrículas e Teleatendimento: 0800 707 4520 Internacional: +55 (67) 3303-4520. 1. atendimento@portaleducacao.com.br – Campo Grande-MS Endereço Internet: http://www.portaleducacao.com.br. Dados Internacionais de Catalogação na Publicação - Brasil Triagem Organização LTDA ME Bibliotecário responsável: Rodrigo Pereira CRB 1/2167 Portal Educação P842m. MIicrobiologia / Portal Educação. - Campo Grande: Portal Educação, 2012. 130p. : il. Inclui bibliografia ISBN 978-85-8241-073-8 1. Microbiologia. I. Portal Educação. II. Título. CDD 576.

(3) SUMÁRIO. INTRODUÇÃO......................................................................................................................................7 1. QUISITOS. BÁSICOS. PARA. INSTALAÇÃO. E. FUNCIONAMENTO. DE. UM. LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA ...............................................................................................9 2 1.1. BOAS PRÁTICAS DE LABORATÓRIO .................................................................................................9. 1.2. REGRAS PRÁTICAS LABORATORIAIS ..............................................................................................14. 1.3. GENCIAMENTO DAS BOAS PRÁTICAS ..............................................................................................14. 1.4. ROTINA NOS LABORATÓRIOS........................................................................................................17. 1.4.1 DESINFECÇÃO .............................................................................................................................17 1.4.2 ESTERILIZAÇÃO ...........................................................................................................................18 1.5. NORMAS DE SEGURANÇA NOS LABORATÓRIOS ...............................................................................19. 1.5.1 RISCO FÍSICO ...............................................................................................................................20 1.5.2 RISCO QUÍMICO ............................................................................................................................20 1.5.3 RISCO BIOLÓGICO ........................................................................................................................21 1.5.4 RISCO AMBIENTAL........................................................................................................................21 1.5.5 RISCO ERGONÔMICO ....................................................................................................................21 1.5.6 PROTEÇÃO CONTRA INCÊNDIO.......................................................................................................21 1.6. SINALIZAÇÃO DE SEGURANÇA .......................................................................................................22. 2. COLETA DE AMOSTRAS .........................................................................................................23. 3. TRANSPORTE DE PRODUTOS BIOLÓGICOS .......................................................................24. 4. RECEPÇÃO DE AMOSTRAS E OBSERVAÇÕES PRELIMINARES ........................................26.

(4) 4.1. CRITÉRIOS DE REJEIÇÃO DAS AMOSTRAS .........................................................................26. 5. CULTIVO DE MICRO-ORGANISMOS ......................................................................................27. 5.1. PREPARO DO MEIO DE CULTURA .........................................................................................27. 5.2. ISOLAMENTO E OBTENÇÃO DE CULTURA PURA ................................................................27. 6. MICROSCOPIA .........................................................................................................................29. 7. PRINCIPAIS MÉTODOS DE COLORAÇÃO .............................................................................30 3. 8. CONTROLE DE QUALIDADE ...................................................................................................34. 9. BIOSSEGURANÇA ...................................................................................................................35. 10. AS BACTÉRIAS ........................................................................................................................36. 10.1 ESTRUTURA.................................................................................................................................36 10.2 TAXONOMIA: CLASSIFICAÇÃO, NOMENCLATURA E IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS .........................38 10.3 MORFOLOGIA ..............................................................................................................................38 10.4 CRESCIMENTO .............................................................................................................................39 10.5 FISIOLOGIA ..................................................................................................................................40 10.6 COLORAÇÃO ...............................................................................................................................40 10.7 ESPOROS ....................................................................................................................................40 10.8 SOROLOGIA .................................................................................................................................41 10.9 METABOLISMO .............................................................................................................................41 10.10 PATOGENICIDADE ........................................................................................................................41 11. ESTAFILOCOCOS ....................................................................................................................43. 11.1 STAPHYLOCOCCUS AUREUS .........................................................................................................44 11.2 STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS ...................................................................................................45 11.3 STAPHYLOCOCCUS SAPROPHYTICUS .............................................................................................46.

(5) 12. ESTREPTOCOCOS ..................................................................................................................47. 12.1 ESTREPTOCOCOS BETA-HEMOLÍTICOS ..........................................................................................47 12.2 ESTREPTOCOCOS ALFA-HEMOLÍTICOS ..........................................................................................49 12.3 ESTREPTOCOCOS GAMA-HEMOLÍTICOS (NÃO HEMOLÍTICOS) ..........................................................50 13. ENTEROCOCOS.......................................................................................................................51. 14. NEISSERIAS .............................................................................................................................52 4. 15. BACILOS ..................................................................................................................................54. 15.1 GÊNERO CORYNEBACTERIUM.......................................................................................................60 15.2 GÊNERO BACILLUS ......................................................................................................................55 15.3 GÊNERO LISTERIA........................................................................................................................57 15.4 GÊNERO CLOSTRIDIUM .................................................................................................................57 15.5 GÊNERO MYCOBACTERIUM ...........................................................................................................59 15.6 GÊNERO ACTINOMYCES ...............................................................................................................60 15.7 GÊNERO NOCARDIA .....................................................................................................................60 16. ENTEROBACTERIACEAE .......................................................................................................62. 16.1 GÊNERO ESCHERICHIA .................................................................................................................62 16.2 GÊNERO PROTEUS .......................................................................................................................63 16.3 GÊNEROS KLEBISIELA, SERRATIA E ENTEROBACTER .....................................................................63 17. SALMONELA, SHIGELA E PSEUDOMONAS ..........................................................................64. 17.1 GÊNERO SALMONELLA .................................................................................................................64 17.2 GÊNERO SHIGELLA ......................................................................................................................64 17.3 GÊNERO PSEUDOMONAS ..............................................................................................................64 18. BACILOS GRAM NEGATIVOS CURVOS .................................................................................66.

(6) 19. OUTRAS BACTÉRIAS GRAM NEGATIVOS ANAERÓBIOS ...................................................67. 20. BACTÉRIAS ESPIRALADAS ...................................................................................................69. 21. MICOPLASMAS ........................................................................................................................71. 22. RICKETTSIAE ...........................................................................................................................72. 23. CULTURA BACTERIANA .........................................................................................................73. 24. OS VÍRUS .................................................................................................................................83 5. 25. PARVOVÍRUS ..........................................................................................................................87. 26. PAPILOMAVÍRUS .....................................................................................................................88. 27. HERPESVÍRUS .........................................................................................................................89. 28. ADENOVÍRUS ...........................................................................................................................90. 29. HEPADNAVÍRUS ......................................................................................................................91. 30. POXVÍRUS ................................................................................................................................92. 31. PICORNAVÍRUS .......................................................................................................................93. 32. ORTHOMYXOVÍRUS ................................................................................................................94. 33. PARAMYXOVÍRUS ...................................................................................................................95. 34. TOGAVÍRUS .............................................................................................................................96. 35. RETROVÍRUS ...........................................................................................................................97. 36. RHABDOVÍRUS ........................................................................................................................98. 37. ARENAVÍRUS ...........................................................................................................................99. 38. REOVÍRUS ...............................................................................................................................100. 39. CORONAVÍRUS .......................................................................................................................101. 40. PRÍONS (SCRAPIE) .................................................................................................................102. 41. OS FUNGOS ............................................................................................................................103.

(7) 42. ESTUDO VISUAL DOS FUNGOS ............................................................................................113. 43. IDENTIFICAÇÃO E ISOLAMENTOS DOS FUNGOS ...............................................................115. 44. MICOSES SUPERFCIAIS ........................................................................................................116. 45. MICOSES PROFUNDAS..........................................................................................................117. 46. PNEUMOCYSTIS CARINII ...............................................................................................................120. 47. PROTOZOÁRIOS.....................................................................................................................121 6. 48. CONSIDERAÇÕES FINAIS .....................................................................................................125. GLOSSÁRIO ......................................................................................................................................126 REFERÊNCIAS ..................................................................................................................................129.

(8) INTRODUÇÃO. A microbiologia é definida como a biologia dos organismos microscópicos que relaciona os organismos “invisíveis a olho nu”, pelo seu tamanho, com as principais doenças infecciosas do homem e de seus animais domésticos. Os micro-organismos são encontrados em todos os ambientes, incluindo solo, água, ar e participam de todas as funções vitais. Embora não possam existir dúvidas de que bactérias e vírus sejam os patógenos mais numerosos e importantes, o estudo da microbiologia também está ligado à micologia e parasitologia. A relação entre o hospedeiro e o microrganismo pode se estabelecer de diversas maneiras. Essa associação ou simbiose (viver juntos) pode ter uma conotação de benefício ou prejuízo para o hospedeiro. Tentando categorizar especificamente essas associações, os pesquisadores conseguiram, por conveniência, identificar três categorias, que foram nomeadas como: comensalismo (uma espécie utiliza a outra como seu ambiente físico, como, por exemplo, microbiota); mutualismo (as duas espécies se beneficiam, como, por exemplo, as bactérias entéricas de ruminantes); e parasitismo (apenas uma espécie se beneficia trazendo prejuízo ao hospedeiro, como o vírus da raiva). Estamos, agora, diante da oportunidade de ampliar e aprofundar temas considerados essenciais dentro do estudo da microbiologia. Nossa expectativa é a de que os usuários desta apostila de microbiologia geral possam assimilar e alcançar novos níveis de complexidade laboratorial. Não tivemos a pretensão de alcançar o conteúdo e a profundidade dos livros-texto de microbiologia tradicionalmente consultados e que também nos serviram de referência, mas sim incluir apenas uma pequena parte de uma explosiva base de dados que se expande em forma exponencial, concernente ao número e classes de micro-organismos e às propriedades que lhes permite causar doenças. O material apresentado aqui é apenas um “instantâneo” da microbiologia atual, com respeitosa mesura aos avanços científicos dos anos passados e com a visão de que as novas tecnologias descritas neste e nos próximos módulos já revolucionaram as práticas laboratoriais e continuarão a afetar as abordagens atuais e futuras da arte e da ciência da microbiologia.. 7.

(9) O primeiro passo para o conhecimento dos micro-organismos é o mesmo que se deve seguir para conhecer uma pessoa: é necessário saber seu nome. No estudo do mundo dos micro-organismos como agentes de doenças no homem, é primeiramente importante assimilar como as bactérias e outros micro-organismos são denominados, isto é, a ciência da taxonomia.. 8.

(10) 1 REQUISITOS BÁSICOS PARA INSTALAÇÃO E FUNCIONAMENTO DE UM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA. Os requisitos básicos para um laboratório de microbiologia visam elaborar e viabilizar boas práticas, normas para coleta, conservação e transporte de material de interesse clínico. Além de estabelecer e executar rotinas microbiológicas, dentro dos padrões técnico-científicos vigentes, que permitam o isolamento e identificação dos principais agentes infecciosos de importância clínica, por gênero, e, se possível, por espécie. O laboratório ainda precisa determinar a sensibilidade às drogas antimicrobianas, efetuar o controle de qualidade de suas atividades e dos processos de esterilização. E ainda divulgar e implementar normas de biossegurança. Os equipamentos mínimos para funcionamento de um laboratório de microbiologia consistem em: estufa bacteriológica, forno de Pasteur, autoclave, microscópio binocular, centrífuga de baixa rotação, homogeneizador, banho-maria de pequena dimensão, destilador para água, balança para tarar tubos, balança comum com uma ou duas casas decimais, bico de Bunsen, geladeira e capela de fluxo laminar. Além desses equipamentos, o laboratório poderá contar com outros aparelhos, como: microscópio estereoscópico, congelador (-20oC ou -70oC), bomba de vácuo para filtração com membranas, potenciômetro e balança analítica.. 1.1 Boas Práticas de Laboratório. O trabalho laboratorial executado de forma adequada e bem planejado previne a exposição indevida a agentes considerados de risco à saúde e, sem dúvida, evita acidentes. Manipulação de agentes considerados contaminantes é regida por leis federais, estaduais e municipais. A manipulação, armazenamento e transporte de agentes de risco requerem licenças especiais que são controladas por órgãos federais. O Regulamento Técnico de Funcionamento do Laboratório Clínico foi elaborado a partir de trabalho conjunto de técnicos da ANVISA, com o grupo de trabalho instituído pela Portaria nº. 864, de 30 de setembro 2003.. 9.

(11) Esse grupo de trabalho foi composto por técnicos da ANVISA, secretaria de atenção à saúde (SAS/MS), secretaria de vigilância à saúde (SVS/MS), vigilâncias sanitárias estaduais, laboratório de saúde pública, sociedade brasileira de patologia clínica/medicina laboratorial, sociedade brasileira de análises clínicas, provedores de ensaio de proficiência e um consultor técnico com experiência na área. A proposta de Regulamento Técnico elaborado pelo grupo de trabalho foi publicada como consulta pública nº 50 em 6 de agosto de 2004. As sugestões recebidas foram consolidadas pelos técnicos da gerência geral de tecnologia em serviços de saúde (GGTES/ANVISA), pelos componentes do grupo de trabalho juntamente com o consultor. Após discussões, as sugestões pertinentes foram incorporadas ao texto do Regulamento Técnico, sendo produzido o documento final consensual sobre o assunto. Esse Regulamento Técnico, discriminado na resolução da diretoria colegiada - RDC nº. 302, de 13 de outubro de 2005, regulamenta:. “A Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, no uso da atribuição que lhe confere o art.11, inciso IV, do Regulamento da ANVISA aprovado pelo Decreto 3.029, de 16 de abril de 1999, c/c o § 1º do art.111 do Regimento Interno aprovado pela Portaria nº. 593, de 25 de agosto de 2000, republicada no D.O.U. de 22 de dezembro de 2000, em reunião realizada em 10 de outubro de 2005; considerando as disposições constitucionais e a Lei Federal nº. 8080, de 19 de setembro de 1990, que trata das condições para a promoção, proteção e recuperação da saúde, como direito fundamental do ser humano; considerando a necessidade de normalização do funcionamento do Laboratório Clínico e Posto de Coleta Laboratorial; considerando a relevância da qualidade dos exames laboratoriais para apoio ao diagnóstico eficaz, adota a seguinte Resolução da Diretoria Colegiada e eu, Diretor-Presidente substituto, determino a sua publicação”:. Art. 1º Aprovar o Regulamento Técnico para funcionamento dos serviços que realizam atividades laboratoriais, tais como Laboratório Clínico e Posto de Coleta Laboratorial, em anexo. Art. 2º Estabelecer que a construção, reforma ou adaptação na estrutura física do laboratório clínico e posto de coleta laboratorial deve ser precedida de aprovação do projeto junto à. 10.

(12) autoridade sanitária local em conformidade com a RDC/ANVISA nº 50, de 21 de fevereiro de 2002, e RDC/ANVISA nº. 189, de 18 de julho de 2003, suas atualizações ou instrumento legal que venha a substituí-las.. Art. 3º As Secretarias de Saúde Estaduais, Municipais e do Distrito Federal devem implementar os procedimentos para adoção do Regulamento Técnico estabelecido por esta RDC, podendo adotar normas de caráter suplementar com a finalidade de adequá-lo às especificidades locais.. Art. 4º O descumprimento das determinações deste Regulamento Técnico constitui infração de natureza sanitária sujeitando o infrator a processo e penalidades previstas na Lei nº. 6437, de 20 de agosto de 1977, suas atualizações, ou instrumento legal que venha a substituí-la sem prejuízo das responsabilidades penal e civil cabíveis.. Art. 5º Esta Resolução entra em vigor na data de sua publicação.. Há necessidade de que os profissionais sejam previamente conscientizados sobre os riscos, assim como das medidas de controle e proteção adotadas para a manutenção e respeito às normas de segurança. E o cuidado tomado pelos administradores deve ser maior e mais rigoroso para prevenir ou reduzir o risco de desenvolver alguma doença profissional por exposição. A organização das atividades e o respeito às normas de segurança é um aspecto fundamental para segurança de todos os usuários e para a garantia da qualidade e dos resultados precisos. As medidas de controle e proteção laboratorial são divididas em medidas coletivas (descarte e remoção de lixo, extintores de incêndio, lavador de olhos e sinalização), como mostra a Figura 1.. 11.

(13) FIGURA 1 – MATERIAIS RELACIONADOS COM AS MEDIDAS COLETIVAS DE CONTROLE E PROTEÇÃO LABORATORIAL. (A) REMOÇÃO DO LIXO; (B) LAVADOR DE OLHOS; (C) DESCARTE DE MATERIAIS PERFUROCORTANTES; (D) EXTINTOR DE INCÊNDIO. A. B. 12. C. D. FONTE: O autor. E medidas individuais que se referem ao emprego de equipamentos de proteção individual - EPIs (luvas, máscara, avental de manga comprida, pró-pés, óculos de proteção), como são mostradas na Figura 2..

(14) FIGURA 2 – MATERIAIS RELACIONADOS COM AS MEDIDAS INDIVIDUAIS DE CONTROLE E PROTEÇÃO LABORATORIAL: (A) ÓCULOS; (B) MÁSCARA; (C) AVENTAL; (D) LUVAS; (E) PRÓ-PÉS. A B C D. E. D. E FONTE: Do autor. É difícil quantificar o risco no trabalho em laboratórios com relação aos agentes infecciosos. Tem-se por base, porém, que o risco individual aumenta com a frequência e com os níveis de contato com o agente infeccioso. O primeiro cuidado a ser tomado no laboratório que trabalha com espécimes clínicas é com o risco de exposição à infecção. Por outro lado, deve-se considerar que os riscos são influenciados por uma relação variável entre o agente infectante, o hospedeiro e a atividade desempenhada. Fatores aplicáveis ao agente incluem a virulência, a carga infectante, o ciclo e a toxigenicidade. As principais variáveis que influem no risco do hospedeiro são: idade, sexo, etnia, gravidez, uso de antimicrobianos, imunidade (vacinação prévia) e o uso de drogas imunossupressoras. Finalmente, a natureza da atividade laboratorial (por exemplo: diagnóstico,. 13.

(15) produção, pesquisa) pode afetar significativamente o risco pessoal devido ao tipo, quantidade e concentração dos agentes empregados, a manipulação dos agentes e a eficácia primária e secundária dos equipamentos de proteção e práticas de laboratório.. 1.2 REGRAS BÁSICAS DAS BOAS PRÁTICAS LABORATORIAIS. 14 As regras básicas de segurança em laboratório serão descritas na Figura 3, logo a seguir. Estes itens são inegociáveis e devem ser respeitados rigorosamente e sem exceção.. 1.3 Gerenciamento das boas práticas. Uma organização de gerenciamento das boas práticas, ou melhor, a garantia da qualidade dentro do laboratório faz-se necessário para ajudar a manter a ordem minimizando os riscos de contaminação, além de elaborar planos de gerenciamento de rejeitos químicos. Essa organização deve estar ligada à Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), segundo a Lei 8.974 de 05 e janeiro de 1995. A CTNBio regulamenta os procedimentos de segurança por meio de instruções normativas, conforme o grau de periculosidade, bem como estabelece os níveis de concentração e de tratamento dos resíduos, a liberação planejada para o ambiente, transporte, importação, comercialização de organismos geneticamente modificados e intervenções genéticas em humanos e animais. As práticas de biossegurança baseiam-se na necessidade de proteção ao operador, seus auxiliares e a comunidade local contra riscos que possam prejudicar a saúde. Embasado nesses itens, a CTNBio responsabiliza-se por todos os procedimentos institucionais, mediante os quais inspecionará e fornecerá licenças para áreas de nível 1. E as solicitações de licenças para nível 2, 3 e 4 serão encaminhadas pela Comissão Interna de Biossegurança para CTNBio e serão sujeitas às inspeções da CTNBio. As áreas de nível de.

(16) laboratório estão classificadas no sistema de grupo de risco dos micro-organismos e está baseada na potência do micro-organismo de causar doença em seres humanos e contaminar o ambiente. Os micro-organismos dividem-se em grupos quanto à patogenicidade para o homem, a virulência, o modo de transmissão, a endemicidade e a existência de profilaxia e/ou de terapêutica eficazes. Segundo a Resolução no. 1 de 1998 do Conselho Nacional de saúde, Cap. X art. 64, os microrganismos podem, portanto, ser classificados em classes de risco de 1 a 4 por ordem crescente: Classe 1 - onde se classificam os agentes que não apresentam riscos para o manipulador, tampouco para a comunidade (ex.: Escherichia coli, Bacillus subtilis, vírus adenoassociados); Classe 2 – onde se classificam os agentes que apresentam risco moderado para o manipulador, havendo sempre um tratamento preventivo (ex.: Clostridium tetani, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus; Epstein-Barr Vírus - EBV, Herpesvírus; Candida albicans; Plasmodium sp, Schistosoma sp); Classe 3 – onde se classificam os agentes que apresentam risco grave para o manipulador e moderado para a comunidade, sendo as lesões ou sinais clínicos graves e nem sempre há tratamento (ex.: Bacillus anthracis, Brucella sp, Chlamydia psittaci, Mycobacterium tuberculosis; vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, HTLV 1 e 2, HIV, flavivírus; Blastomyces dermatiolis, Histoplasma; Echinococcus sp, Leishmania sp, Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi); Classe 4 - onde se classificam os agentes que apresentam risco grave para o manipulador e para a comunidade; não existe tratamento e os riscos em caso de propagação são bastante graves (ex.: arenavírus, certos arbovírus, vírus da encefalite de St. Louis e Coxiella burnetii).. 15.

(17) FIGURA 3 – BOAS PRÁTICAS EM LABORATÓRIO. 16.

(18) 1.4 A ROTINA NOS LABORATÓRIOS. Agora relacionaremos as rotinas que auxiliam na otimização do serviço dos usuários: a) manter as bancadas sempre limpas e livres de materiais estranhos ao trabalho; b) fazer uma limpeza prévia, com o solvente adequado, ao esvaziar um frasco de reagente antes de colocá-lo para lavagem; c) rotular imediatamente qualquer reagente ou solução preparada utilizando etiquetas adequadas; d) retirar da bancada os materiais, as amostras e os regentes após o término do trabalho; e) jogar papéis e outros materiais dispensáveis que não ofereçam riscos em lixos específicos; f) usar pinças e materiais de tamanho adequado e em perfeito estado de conservação; g) limpar, imediatamente, qualquer derramamento de produtos e reagentes, protegendo-se, se necessário, para fazer essa limpeza; h) tomar as seguintes providências em caso de derramamento de líquidos inflamáveis, produtos tóxicos, biológicos, tóxicos e/ou corrosivos: interromper o trabalho e advertir as pessoas próximas sobre o ocorrido; solicitar ou efetuar a limpeza imediata, verificar e corrigir a causa do problema.. 1.4.1. Desinfecção. A desinfecção é definida como a eliminação parcial dos micro-organismos presentes em um determinado ambiente. Os métodos de desinfecção visam principalmente destruir as formas microbianas patogênicas ao homem por meio da utilização de um agente desinfetante ou antimicrobiano. Os diversos tipos de agentes antimicrobianos podem ser divididos em três grupos: agentes físicos, agentes químicos e agentes quimioterápicos. O grau de eficiência de cada um deles é dependente da concentração ou intensidade, das condições do ambiente e do estado. 17.

(19) das células.. 1.4.2 Esterilização. A esterilização é um processo de eliminação completa de todas as formas vivas de um material ou ambiente. Por meio da esterilização dos meios de cultura e do instrumental usado nos trabalhos, o isolamento e a manutenção das culturas puras de micro-organismos tornaramse possíveis. A esterilização pode ser feita por diferentes processos que emprega métodos físicos (calor, atrito, radiação e filtração) e métodos químicos. Normalmente são utilizadas embalagens para acondicionar os materiais durante a esterilização para evitar contaminação posterior. A eficácia da esterilização é monitorada por meio do emprego de indicadores. A maioria dos protocolos requer treinamento especial para adequada preparação dos instrumentos com remoção de toda matéria orgânica, o correto preenchimento da câmara e operação do ciclo de esterilização dentro de parâmetros estritamente definidos. Os métodos mais utilizados são: calor úmido, que provoca a inativação ou coagulação das proteínas dos micro-organismos (autoclavagem e tindalização) e o calor seco, que provoca a eliminação dos micro-organismos pela oxidação e queima das proteínas (forno de Pasteur e chama). Em microbiologia a autoclavagem é utilizada na esterilização de material usado na preparação de meios de cultura e esterilização em geral. O vapor d’água sob pressão e uma temperatura superior a 1000C destroem os micro-organismos e seus esporos (quando produzidos) em um curto espaço de tempo. A tindalização é um processo de esterilização fracionada para substâncias que não podem ser aquecidas acima de 1000C. O processo consiste em aquecer o material três vezes consecutivas em intervalos de 24 horas. Tanto o forno de Pasteur quanto as esterilizações pela chama são processos que requerem temperaturas elevadas por longos períodos. Outros métodos de esterilização são utilizados, tais como: a) irradiação pela luz ultravioleta (<330 nm de comprimento de onda). Este método é utilizado em câmaras de segurança microbiológica em laboratórios. Ou também pela radiação ionizante, por elétrons do cobalto-60 e ainda por um acelerador linear para a esterilização de. 18.

(20) artigos plásticos descartáveis sensíveis ao calor; b) filtração pela utilização de diferentes tipos de filtros, incluindo asbesto, cerâmica e vidro prensado. Atualmente são mais utilizados os filtros de membrana de nitrocelulose, que são utilizadas para a esterilização de líquidos sensíveis ao calor, incluindo soro e antibióticos; c) substâncias químicas, o gás formaldeído, a formalina líquida, o glutaraldeído e o óxido de etileno, que são esporicidas e viricidas e, por isso, conseguem esterilizar materiais. No entanto, essas substâncias são tóxicas e irritantes e seu uso é restrito. 19 1.5 Normas de Segurança nos Laboratórios. As normas de segurança são embasadas nos perigos e riscos que os usuários podem sofrer durante o trabalho. Os perigos são divididos em risco físico, risco químico, risco biológico, risco ambiental e risco ergonômico. As normas de segurança adotadas para prevenção contra os acidentes laboratoriais são: a) todo perigo e risco devem ser conhecidos pelo manipulador, bem como o respeito das regras gerais de biossegurança e ainda a execução das medidas de proteção individual; b) todo experimento dentro ou fora do expediente que não tiver o acompanhamento do interessado deverá ter uma ficha ao lado com nome, horário de experimentação, reagentes envolvidos e medidas a serem adotadas em casos de acidentes; c) todo experimento que envolver certo grau de periculosidade exigirá a obrigatoriedade da utilização de indumentária adequada (luvas, óculos, máscaras, pinças, aventais, extintores de incêndio); d) todo laboratório ou sala de experimento deverá possuir os seguintes equipamentos: óculos de segurança, máscara contra gases, saco de areia de 5 kg, um cobertor e um chuveiro em funcionamento normal e caixas de primeiros socorros; e) todo e qualquer material que venha a prejudicar ou colocar em perigo a vida ou saúde dos usuários do ambiente, ou que venha causar incômodo, deverá ser discutido ou comunicado ao responsável do laboratório, que sugerirá e/ou autorizará o evento sob certas condições como avisos, precauções e horário que deve ser feito; f) todo manuseio de produtos não deve ser feito sem que se esteja usando o.

(21) equipamento de segurança adequado; não faça improvisações. g) todo e qualquer acidente ou irregularidade deve ser comunicado ao seu superior e à segurança; h) todo e qualquer produto químico não deve ser cheirado e nem ser guardado em lugares impróprios; i) todo produto químico deve ser transportado de maneira segura; j) todo profissional deve ser e deve estar bem informado no que se refere à maneira como a contaminação pode ocorrer, o que implica no conhecimento amplo do microrganismo ou vetor com o qual se trabalha. Os equipamentos de segurança relacionados a seguir devem estar ao alcance de todos os funcionários, como: extintores de incêndio (pó químico e CO 2), chuveiros de emergência, lavador de olhos, aventais e luvas de PVC contra produtos corrosivos, máscaras e óculos de segurança, luvas de amianto ou raspa de couro, máscaras contra gases e máscara contra pó (ex.: sílica, asbesto).. 1.5.1 Risco físico. Consideram-se agentes de riscos físicos equipamentos que geram: ruídos, vibrações, pressões anormais, radiações ionizantes, radiações não ionizantes, ultrassom, materiais cortantes, materiais pontiagudos, calor, frio, chamas, umidade, ultravioleta, infravermelha, raios laser, ondas de rádio, campo elétrico.. 1.5.2 Risco químico. Consideram-se agentes de risco químico as substâncias compostas ou produtos que possam penetrar no organismo pela via respiratória nas formas de poeiras, fumaças (incluindo cigarro), névoas, neblinas, gases e vapores, ou que possam penetrar no organismo por contato ou por absorção através da pele ou ingestão nas formas de substâncias tóxicas, substâncias explosivas, irritantes, oxidantes, corrosivas, voláteis, inflamáveis e cancerígenas.. 20.

(22) 1.5.3 Risco biológico. Consideram-se agentes de risco biológico as bactérias, fungos, parasitos, vírus, entre outros. Os agentes biológicos apresentam um risco real ou potencial para o homem e para o meio ambiente. Por essa razão, é fundamental que se prepare uma estrutura adequada para prevenção dos riscos encontrados nos laboratórios.. 1.5.4 Risco ambiental. Consideram-se agentes de risco ambiental os equipamentos de vidro, instrumentos perfurantes, equipamentos com gás comprimido, equipamentos de trituração, incêndio, explosão, eletricidade.. 1.5.5 Risco ergonômico. Consideram-se agentes de risco ergonômicos os assentos, a altura das bancadas, entre outros que possam provocar lesões por má postura.. 1.5.6 Proteção contra incêndio. As regras básicas em caso de incêndio no laboratório são: a) manter a calma; b) começar o combate imediatamente com os extintores de CO 2 (gás carbônico). Afastar os inflamáveis de perto; c) evacuar o local imediatamente caso a situação fuja ao seu controle; d) ligar o alarme (uma pequena caixa vermelha), quebrando o vidro para acioná-lo; e) evacuar o prédio;. 21.

(23) f) desligar a chave geral de eletricidade; g) ir até o telefone mais próximo e discar para o Corpo de Bombeiros 193; h) dar a exata localização do fogo (ensinar como chegar lá); i) informar a condição de risco do laboratório para que os bombeiros saibam como agir com rapidez e eficiência; j) tapar o frasco com uma rolha, toalha ou vidro de relógio de modo a impedir a entrada de ar quando o fogo irromper em um béquer ou balão de reação; k) levar para o chuveiro quando o fogo atingir a roupa de uma pessoa. Há uma tendência que a pessoa corra, aumentando a combustão. Nesse caso, deve-se derrubá-la e rolála no chão até que o fogo seja exterminado ou embrulhá-la rapidamente em um cobertor. E ainda, pode-se também usar o extintor de CO2, se esse for o meio mais rápido; l) usar extintor de CO2 ou pó químico para apagar o fogo em um laboratório. Nunca utilize água; m) usar extintor de pó químico quando o fogo for em sódio, potássio ou lítio. Pode-se também usar os reagentes carbonato de sódio (Na2CO3) ou cloreto de sódio (NaCl).. 1.6 Sinalização de segurança. FIGURA 4 – SÍMBOLOS PARA SINALIZAÇÃO DE SEGURANÇA. Hidrante. FONTE: Alterado de http://www.fiocruz.br/biosseguranca/Bis/imagem/simbolos.htm (2011). 22.

(24) 2 COLETA DE AMOSTRAS. É possível que a coleta apropriada de uma amostra para cultivo seja a etapa mais importante na confirmação final de que um micro-organismo é responsável pelo processo de enfermidade infecciosa. Assim, todo resultado liberado pelo laboratório de microbiologia é consequência da qualidade da amostra recebida. O material colhido deve ser representativo do processo infeccioso investigado, devendo ser eleito o melhor sítio da lesão, evitando contaminação com as áreas adjacentes. Deve-se estabelecer o momento ótimo para a coleta de amostras com o objetivo de contar com a melhor possibilidade de isolar o micro-organismo em questão. Deve-se obter quantidade suficiente de material para permitir uma completa análise microbiológica. Caso a quantidade seja pequena, priorizar os exames. Portanto, a coleta inadequada pode ocasionar falhas no isolamento do agente etiológico e favorecer o desenvolvimento da flora contaminante, induzindo a um tratamento não apropriado. Quem colhe o material deve ser devidamente treinado e periodicamente reciclado nessa atividade. Deve saber que o material deverá ser destinado o mais brevemente possível ao laboratório. Deve conhecer ou obter instruções sobre conservação e/ou transporte do material caso este não possa ser realizado imediatamente. Algumas considerações são fundamentais na coleta de amostras, como: colher amostras antes da antibioticoterapia (sempre que possível), instruir claramente o paciente sobre o procedimento, observar a assepsia na coleta de todos os materiais clínicos. O pedido do exame deve conter, além da identificação do paciente, dados como idade, doença de base, indicação de antibióticos, data e hora da coleta e as amostras devem ser coletadas em recipientes esterilizados.. 23.

(25) 3 TRANSPORTE DE PRODUTOS BIOLÓGICOS. Os regulamentos sobre o transporte de agentes biológicos são definidos de forma a assegurar proteção ao público e aos trabalhadores da rede de transporte à exposição a qualquer agente que possa estar presente na embalagem. As substâncias infecciosas e materiais orgânicos para diagnóstico precisam estar embalados num recipiente impermeável à água (recipiente primário), dentro do qual se encontra a amostra. Esse recipiente primário deverá estar dentro de um segundo recipiente impermeável, de preferência de metal, contendo quantidade suficiente de material absorvente entre suas paredes. Os recipientes primários e secundários deverão conter uma etiqueta ou rótulo com a identificação da amostra e deverão ser introduzidos em uma embalagem externa de envio que tem a finalidade de proteção contra fatores externos. A embalagem externa deve estar rotulada adequadamente com o símbolo risco biológico e outro rótulo com o endereço da instituição (Figura 5). FIGURA 5 – TÉCNICA APROPRIADA PARA EMBALAR MATERIAIS BIOLOGICAMENTE PERIGOSOS. FONTE: Arquivo pessoal do autor Para evitar possíveis acidentes durante o transporte de amostra biológica dentro dos setores do laboratório, é necessário transportar em recipiente impermeável resistente à queda, e. 24.

(26) o transporte de vidraria deve ser feito com o uso de carrinhos para frascos de grande porte e bandejas para frascos de pequeno porte. O objetivo primário no transporte de amostras para diagnóstico, seja dentro de um hospital ou clínica, ou externamente por correio, para um laboratório de referência distante, consiste em manter a amostra o mais próximo possível de seu estado original (Tabela 1), ou seja, com deterioração mínima, e minimizar os riscos para os transportadores das amostras. As amostras devem estar acondicionadas de forma que resistam às condições ambientais. Se for previsto um atraso prolongado antes que a amostra possa ser processada, é preferível congelar a amostra a 70oC negativos. No entanto, se o período de estocagem for breve, pode ser utilizado um congelador a 20oC negativos. Para a maioria das amostras, pode ser utilizado um meio de manutenção ou transporte, que consiste essencialmente de uma solução tampão isento de carboidratos, peptonas e outros nutrientes e fatores de crescimento formulado para conservar a viabilidade das bactérias durante o transporte sem permitir a multiplicação das mesmas. TABELA 1 – TEMPO CRÍTICO PARA ENTREGA DA AMOSTRA AO LABORATÓRIO E MEIOS DE TRANSPORTE.. FRAS COS E MEIOS DE TRANSPORTE Liquor Imediatamente (não refrigerar) Tubo seco estéril Líquido pleural Imediatamente (não refrigerar) Tubo seco estéril Tubo seco estéril ou meio Swab Imediatamente (não refrigerar) semi- sólido (Stuart, Amies) Meio de transporte Suspeita de apropriado. E vitar o 30 minutos Anaeróbios transporte em seringa com agulha. 30 minutos ou até 12 horas (meio de Meio de transporte Feridas e tecidos transporte) apropriado . Frascos com meios de cultura Hemocultura 30 minutos (não refrigerar) (rotina manual ou automatizada. AMOSTRA. Trato respiratório Trato gastrointestinal Urina Fezes. TEMPO CRÍTICO. 30 minutos 1 hora 1 hora ou refrigerada até 24 horas. Tubo seco estéril Tubo seco estéril Pote estéril. Cary Blair, meio modificado 12 horas se em meio de transporte para transporte de fezes, com pH 8,4. 25.

(27) 4 RECEPÇÃO DE AMOSTRAS E OBSERVAÇÕES PRELIMINARES. Os laboratórios de microbiologia precisam ter uma área específica destinada e reservada à recepção de amostras para cultivo. E o manipulador deve usar os equipamentos de proteção individual apropriado para manipulação da amostra. O processamento das amostras inclui: o ingresso dos dados em um livro de registro e/ou terminal de computador; exame visual e determinação de todos os critérios para aceitação da amostra; e exame microscópico de montagens úmidas ou de esfregaços corados para o diagnóstico presuntivo.. 4.1 Critério de rejeição das amostras. Em todos os laboratórios, devem ser estabelecidos critérios para a rejeição de amostras não adequadas para o cultivo. Devem ser controlados: formulário do pedido, etiqueta da amostra (nome, número de identificação, idade, sexo, domicílio, nome do médico, data, hora), origem da amostra e procedimentos solicitados. A história clínica do paciente também é útil para saber se o exame solicitado é compatível com o diagnóstico. Sempre que uma amostra for rejeitada, a pessoa que o enviou precisa ser comunicada para explicar a natureza do problema. Como regra empírica, deve-se fazer o possível para não recusar amostras de difícil coleta (lavados brônquicos, líquidos cefalorraquidianos, entre outros).. 26.

(28) 5 CULTIVO DE MICRO-ORGANISMOS. O estudo dos micro-organismos, sua identificação e avaliação de suas populações nos diferentes materiais e ambientes requerem seu cultivo nas condições do laboratório.. 27 5.1 Preparo do meio de cultura. Para preparar um meio de cultura, é necessário conhecer as exigências nutricionais dos micro-organismos. São considerados componentes essenciais do meio de cultura: fonte de energia, fonte de carbono, fonte de nitrogênio, fatores de crescimento, fonte de minerais e água. Além dos nutrientes, o meio de cultura deve suprir algumas condições ambientais, como: pH, atmosfera (presença de O2, CO2), pressão osmótica. O meio de cultura pode ser classificado quanto à origem (naturais e artificiais), quanto à composição (complexos e sintéticos), quanto ao estado físico (sólido, semissólido e líquidos) e quanto à finalidade (gerais ou básicos, enriquecidos, seletivos, indicadores ou diferenciais, dosagem, transporte, estocagem ou manutenção).. 5.2 Isolamento e obtenção de cultura pura. A obtenção de culturas puras (ou axênicas) a partir de culturas mistas, também denominadas isolamento, é o primeiro passo para que se possa realizar o diagnóstico dos microorganismos. Essa técnica também é necessária na indústria para a fabricação de antibióticos. O segundo passo consiste na análise do crescimento em meio líquido, caldo nutriente e correlação com as necessidades de oxigênio dos microrganismos presentes. O procedimento mais prático para a obtenção de colônias isoladas consiste na semeadura em superfície, no meio de cultura até o esgotamento do inócuo. Dessa forma, o.

(29) inócuo é diluído progressivamente de modo que se obtêm, ao final, células isoladas que darão origem a colônias puras (Figura 6).. FIGURA 6 – ISOLAMENTO DE COLÔNIAS DE BACTÉRIAS EM MEIO SÓLIDO. 28.

(30) 6 MICROSCOPIA. O microscópio rotineiramente utilizado em laboratórios de microbiologia é o microscópio óptico composto. Seu princípio de funcionamento baseia-se no aumento da imagem por um conjunto de lentes convergentes, associado a uma forte iluminação do campo de observação. Isso fornece uma imagem translúcida dos micro-organismos. Com o passar dos anos, a microscopia sofreu algumas modificações, tanto no microscópio como nas técnicas de preparo das lâminas, como, por exemplo: microscopia de campo escuro, microscopia de luz ultravioleta (fluorescência e imunofluorescência), microscopia de contraste de fase e microscopia eletrônica.. 29.

(31) 7PRINCIPAIS MÉTODOS DE COLORAÇÃO. A perfeita visualização dos micro-organismos e/ou das suas estruturas só é possível se, além da escolha do tipo mais eficiente de microscopia, a preparação estiver adequada. A escolha do tipo de preparação depende da informação desejada e do micro-organismo a ser avaliado. Duas técnicas são empregadas: a fresco (direto e sem coloração) e fixado e corado. De uma maneira geral, as bactérias têm afinidade por um grande número de corantes, principalmente aqueles do grupo dos derivados básicos da anilina (azul de metileno, cristal violeta e fucsina básica). Dentre todos os métodos existentes, aqueles que têm mais importância dentro do laboratório de microbiologia são os métodos de Gram e de Ziehl-Neelsen.  A fresco As preparações desse tipo permitem o exame dos micro-organismos nas condições normais de vida e são perfeitamente utilizadas nas seguintes situações: quando a morfologia fica distorcida devido aos processos de fixação e coloração, durante a verificação da motilidade, durante os processos fisiológicos (divisão celular, produção de esporos) e durante a observação de corpúsculos (vacúolos e material graxo)..  Entre lâmina e lamínula.  Salina Essa técnica pode ser usada para avaliar bactérias cultivadas em meio a líquido e fungos. A técnica consiste em gotejar com o auxilio de uma alça de platina, esterilizada, no centro da lâmina, uma gotícula da cultura a ser investigada. Ou um fragmento da cultura em meio sólido do fungo a ser analisado. Em seguida, cobrir com lamínula e examinar ao microscópio.. 30.

(32)  Hidróxido de potássio Técnica usada para pesquisa de fungos, proveniente de material biológico como muco, restos celulares pelos e unhas. A técnica consiste em colocar uma pequena amostra do material biológico a ser pesquisado no centro da lâmina; suspender o material com uma ou duas gotas de KOH, cobrir com uma lamínula e aguardar 30 minutos ou aquecer ligeiramente a lâmina para acelerar o clareamento. 31  Exame de campo escuro Empregado para observar a motilidade de bactérias dificilmente observadas em microscopia a fresco com salina. A técnica consiste em atritar as bordas da lesão suspeita com um swab ou alça bacteriológica, colher o exudato com a própria alça ou fazer um imprint com a lâmina e cobrir com a lamínula (utilizar uma gota de salina). Realizar a pesquisa rapidamente. Ou, se o material for líquido (urina recém-emitida), centrifugar e examinar o sedimento. A microscopia em campo escuro é realizada colocando-se óleo de imersão.  Tinta da china (nanquim) Esta técnica é empregada para pesquisa de fungos em líquido cefalorraquidiano e outros materiais, permitindo destacar a cápsula desse fungo contra um fundo negro. A técnica consiste em pegar o líquido cefalorraquidiano sedimentado ou uma amostra do meio de cultura líquido e ressuspender em uma gota de tinta da china fazendo um filme bem delgado entre lâmina e lamínula.. FIXADOS E CORADOS. As preparações fixadas e coradas são usadas para verificar as características morfológicas, sendo bastante utilizadas na identificação das bactérias, pois tornam mais fácil a visualização das formas e permitem a verificação do comportamento tintorial do micro-organismo em relação às colorações diferenciais..

(33)  Coloração azul de metileno de loeffler. Técnica utilizada principalmente na avaliação da morfologia de bactérias em esfregaços de líquido cefalorraquidiano, pois os danos causados às células são menores devido ao menor número de manipulações. Essa técnica consiste em colocar o corante sobre o esfregaço previamente fixado deixando-se corar por 3 a 5 minutos. Em seguida, escorre-se o corante, lava-se em água corrente e deixa-se secar para posterior observação ao microscópio. 32  Coloração de wright giemsa Esta técnica é utilizada para corar os elementos celulares em esfregaços sanguíneos para demonstração de micro-organismos intracelulares e também para demonstrar inclusões intracelulares em esfregaços diretos de pele ou mucosas. Essa técnica consiste em colocar o corante sobre o esfregaço previamente fixado deixando-se corar por 3 a 5 minutos. Em seguida, escorre-se o corante, lava-se em água corrente e deixa-se secar para posterior observação ao microscópio..  Coloração de Gram A coloração de Gram, descoberta há pouco mais de 100 anos por Hans Christian Joaquim Gram, é utilizada com muita frequência para o exame microscópico direto de amostras e subcultivos para demonstrar as propriedades tintoriais de todos os tipos de bactérias. As bactérias coradas por essa técnica pertencem a duas categorias distintas: Gram positivas e Gram negativas. A diferença básica entre os dois grupos é resultado da estrutura de suas paredes celulares. A técnica consiste na aplicação de um corante básico, o cristal violeta e uma solução de iodo e iodeto de potássio (lugol) em um esfregaço previamente fixado na chama. A preparação é, então, tratada com um solvente orgânico (álcool ou acetona) com o objetivo de descolorir as células. As bactérias Gram positivas retêm o corante ou o complexo cristal violeta e iodo após a descoloração e aparecem em azul escuro. As bactérias Gram negativas não são capazes de reter o complexo cristal violeta e iodo após a descoloração e são contra coradas com um.

(34) segundo corante (fucsina ou safranina), chamado corante de contraste e adquirem a coloração vermelha..  Coloração de Ziehl-Neelsen Esta técnica é utilizada para corar os bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR). Esses bacilos são assim denominados porque possuem um envoltório céreo que é resistente à coloração. Para o corante penetrar na célula, é necessário calor ou detergente. Uma vez coradas as bactérias álcool-ácido resistentes resistem à descoloração, enquanto outras bactérias descoram com o álcool-ácido. A técnica consiste em corar o esfregaço previamente fixado com carbolfucsina (aquecer três vezes), descorar com álcool-ácido a 3% e contra corar com o azul de metileno.. 33.

(35) 8 CONTROLE DE QUALIDADE. Num sentido estrito, o controle de qualidade consistia em uma avaliação contínua e sistemática do trabalho em andamento para assegurar que o produto final encontrava-se em grau aceitável. Hoje, o controle de qualidade deve continuar como antes, garantindo a qualidade do trabalho realizado. No entanto os diretores e supervisores do laboratório devem compreender que o controle de qualidade é apenas uma das muitas facetas das certificações de qualidade do manejo de risco.. 34.

(36) 9 BIOSSEGURANÇA. Biossegurança pode ser definida como o conjunto de medidas voltadas para a prevenção, minimização ou eliminação de riscos inerentes às atividades de pesquisa, produção, ensino, desenvolvimento tecnológico e prestação de serviços, que podem comprometer a saúde do homem, dos animais, do meio ambiente ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos. A segurança é antes de tudo um direito e uma obrigação individual. A biossegurança laboratorial deve ser sustentada pelos planejamentos prévios das atividades, avaliação dos riscos e adequação das instalações. A utilização de normas de segurança requer atitude, bom senso e boa conduta do profissional. Dessa forma, a prevenção contra acidentes assegura os resultados e a integridade das pessoas, instalações e equipamentos. Em um laboratório, todos fazem parte de uma equipe, e a segurança depende da ação dessa equipe para avaliar os prováveis riscos e determinar as condições de segurança necessárias para o trabalho. Os ambientes voltados à prática de atividades relacionadas à saúde podem não parecer, para muitos, mas também é um local de trabalho que não está livre de acidentes. O profissional de saúde, como também pacientes, visitantes, pessoal de apoio (limpeza e manutenção) e administração estão inseridos num grupo que diariamente está em contato direto com elementos geradores de riscos em potencial, tais como equipamentos e substâncias variadas, utilizadas em processos de limpeza e esterilização. Quando não são orientados devidamente, no tocante à segurança, tornam-se presas fáceis desses elementos, que causam danos aos seus corpos, muitas vezes de forma irreversível.. 35.

(37) 10 AS BACTÉRIAS. As bactérias são cosmopolitas e muitas são de benefício direto ou indireto para o homem. Comparativamente ao grande número de espécies de bactérias de vida livre, existe um pequeno número de espécies que causam doenças. A classificação das bactérias está bem estabelecida e emprega dados fenotípicos e genotípicos. Para a microbiologia, os dados fenotípicos são de maior valor prático e baseia-se na compreensão da estrutura da biologia bacteriana. Devido às suas pequenas dimensões, as bactérias apresentam uma grande relação superfície/volume, possibilitando um íntimo contato da célula com o meio. Isso permite à bactéria concentrar nutrientes rapidamente e difundi-los facilmente pelo seu interior. Essa pequena dimensão ainda permite que a bactéria apresente uma atividade metabólica elevada e grande velocidade de multiplicação.. 10.1 Estrutura. As bactérias são procariotos e possui uma organização celular característica. A informação genética está contida em uma molécula de DNA circular de fita dupla. O cromossomo não se encontra localizado em um núcleo distinto, não há membrana nuclear e o DNA está firmemente enrolado em uma região conhecida como nucleoide. Algumas bactérias apresentam moléculas menores de DNA, também circulares, cujos genes não codificam características essenciais, porém muitas vezes conferem vantagens seletivas à bactéria. Essas moléculas chamadas plasmídeos são capazes de autoduplicação independente da replicação do cromossomo e podem existir em número variável no citoplasma bacteriano. Além das estruturas genéticas, o citoplasma celular contém muitos ribossomos e nenhuma outra organela. Em todas as bactérias, exceto nos micoplasmas, a célula é circundada por uma parede celular complexa, cuja natureza constitui uma característica classificatória importante (Gram positiva e Gram negativa). O principal componente estrutural da parede celular é um. 36.

(38) peptidoglicano (mucopeptideo ou mureína), um polímero misto de açúcares hexoses (Nacetilglicosamina e ácido N-acetilmurâmico), além de aminoácidos que nas bactérias Gram positivas formam uma camada espessa, externa à membrana celular e pode conter ourtras macromoléculas. Já nas bactérias Gram negativas, a camada de peptidoglicano é delgada e superposta por uma membrana externa, ancorada a moléculas lipoproteicas no peptidoglicano. Externamente a essa parede, podem existir cápsula (polissacarídeos), flagelos (filamentos helicoidais longos) e pílis (fimbrias). Essas camadas e estruturas externas possuem papel importante nas relações hospedeiro parasito. A Figura 7 mostra a estrutura geral de uma bactéria.. FIGURA 7 – ESTRUTURA BÁSICA DE UMA BACTÉRIA. FONTE: https://sites.google.com/site/preupsubiologia/celula. As bactérias apresentam a capacidade de realizar transposições, característica que lhes confere resistência a drogas pela possibilidade de recombinações genéticas que podem ocorrer. Esse fenômeno de transposons ou “genes saltadores” é a capacidade que genes ou grupos de genes apresentam em se deslocar de uma região para outra dentro do cromossomo. Essa transposição também pode ocorrer entre o plasmídeo e o hospedeiro.. 37.

(39) 10.2 Taxonomia: classificação, nomenclatura e identificação das bactérias. A identificação de um micro-organismo constitui um dos trabalhos mais importantes executados pelo microbiologista. Ela se faz necessária no diagnóstico de micro-organismos patogênicos e é condição essencial para realização do tratamento adequado. Uma espécie bacteriana requer a observação de um conjunto complexo de características para determinar sua taxonomia. Assim, a classificação/identificação de uma bactéria é analisada pelos seus aspectos de morfologia, de coloração, de motilidade, de crescimento, de presença ou ausência de esporos, de fisiologia, de sorologia, de genética e, eventualmente, de patogenicidade. O Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology constitui a obra de melhor referência oficial da taxonomia bacteriana, contendo a descrição das ordens, famílias, gêneros e espécies das bactérias conhecidas e classificadas. A nomenclatura faz menção ao nome do micro-organismo e as regras obedecem ao International Code of Nomenclature of Bacteria, que consiste em três principais regras: (I) existe apenas um nome correto para um micro-organismo; (II) nomes que induzem erro ou confusão devem ser descartados; e (III) todos os nomes devem ser em latim ou latinizados. O sistema atual identifica cada espécie por dois nomes em latim: o primeiro, em maiúscula, é o gênero, o segundo, em minúscula, é o epíteto específico. Os dois nomes juntos formam o nome da espécie. Os nomes científicos podem vir do nome do cientista que descreveu a espécie, de um nome popular desta, de uma característica que apresente, do lugar onde ocorre e outros. Por convenção internacional, o nome do género e da espécie é impresso em itálico, o dos outros táxons não. Subespécies têm um nome composto por três palavras, onde o primeiro nome refere-se ao gênero, e o segundo nome, à espécie.. 10.3 Morfologia. As bactérias apresentam dimensões variadas medindo desde 0,1 a 0,3 nm até 100 ou 500 nm. E apresentam três formas básicas, esféricas (cocos), ou cilíndricas com ou sem flagelos (bastonetes/bacilos) ou encurvadas (espiraladas/helicoidais) (Figura 8).. 38.

(40) FIGURA 8 – MORFOLOGIA BÁSICA DE VÁRIAS BACTÉRIAS. 39. FONTE: http://www.infoescola.com/wp-content/uploads/2009/08/faecimg_monera5.gif (2012). 10.4 Crescimento. As características que os micro-organismos apresentam ao crescer em meios de cultura são expressões fenotípicas do material genético e, portanto, são úteis na sua identificação. As observações são feitas em culturas de meio sólido e em caldos. São observadas as seguintes características: tamanho, forma, bordo, margem, elevação, pigmentação, brilho, transparência, opacidade, rugosidade, butirosa (amanteigada), viscosa, membranosa e rugosidade..

(41) 10.5 Fisiologia. A utilização de determinados compostos orgânicos e inorgânicos, vias metabólicas utilizadas e seu produtos, depende da presença de uma ou mais enzimas das bactérias. Essas características são importantes na diferenciação das bactérias e são evidenciadas por procedimentos denominados genericamente testes bioquímicos. 40 10.6 Coloração. Em geral, são necessárias colorações biológicas para visualização de bactérias de modo adequado e demonstração dos detalhes finos das estruturas internas. As colorações consistem em preparações aquosas ou orgânicas de corantes ou grupos de corantes que conferem uma variedade de cores aos micro-organismos, tecidos vegetais ou outras substâncias de importância biológica. Em termos amplos, os corantes são denominados ácidos ou básicos, o que não indica necessariamente sua reação de pH em solução, senão que uma parte significativa da molécula é catiônica ou aniônica. De um ponto de vista prático, os corantes básicos tingem estruturas ácidas e os corantes ácidos reagem com substâncias básicas. As colorações mais comumente empregadas são: coloração de Gram, coloração de ácido resistência, colorações fluorescentes, colorações fluorocrômicas para Micobacterias e Wright-Giemsa.. 10.7 Esporos. Os micro-organismos também permanecem infecciosos por períodos mais prolongados no ambiente externo quando estão em condições desfavoráveis. Para isso, alguns gêneros de bactérias produzem esporos que conferem resistência ao ressecamento, inativação pelo calor e agressões químicas, reforçando a resistência ao ambiente..

(42) 10.8 Sorologia. Os testes sorológicos (o estudo da interação antígeno-anticorpo) são usados para o diagnóstico das infecções para identificar micro-organismos. A maior desvantagem do diagnóstico baseado na sorologia é que ele é retrospectivo quando identificados os anticorpos da classe IgG. Agora os anticorpos da classe IgM, quando detectados, podem indicar a fase inicial da infecção.. 10.9 Metabolismo. Todas as bactérias patogênicas são heterotróficas. Elas obtêm energia por meio da oxidação de moléculas orgânicas, e o metabolismo dessas moléculas (carboidratos, lipídeos e proteínas) fornece a energia (adenosina trifosfato - ATP) necessária para as bactérias desenvolverem suas funções vitais. O metabolismo pode ser aeróbio, em que o aceptor final de elétrons é o oxigênio, ou anaeróbio, em que o aceptor final de elétrons é uma molécula inorgânica. As bactérias aeróbias produzem 38 moléculas de ATP a partir de uma molécula de glicose. Enquanto que as bactérias anaeróbias produzem apenas duas moléculas de ATP. O metabolismo anaeróbio, apesar de ser menos eficiente que o metabolismo aeróbio, é realizado em condições onde os substratos estão mais facilmente disponíveis. A exigência pela presença do oxigênio durante o metabolismo pode ser obrigatória ou facultativa, sendo assim alguns organismos conseguem alternar entre a respiração aeróbia e anaeróbia.. 10.10 Patogenicidade. Esse termo refere-se à capacidade de um micro-organismo causar doença. A virulência é o grau de patogenicidade dentro de um grupo ou espécies de micro-organismos. A. 41.

(43) infecção de um hospedeiro por um micro-organismo é a etapa inicial necessária para se iniciar uma doença. A virulência de uma bactéria é determinada pelas estruturas denominadas: adesinas (envolvida com a aderência da bactéria a superfícies do hospedeiro - pílin), agressinas (envolvida com a produção de substâncias protetoras – cápsula), exotoxinas (envolvida com a produção de enzimas proteolíticas protetoras), endotoxinas (envolvida com a produção de lipoplissacarídeos). 42.