AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE HEMORRÁGICA DE EXTRATOS FRACIONADOS DOS FRUTOS DE Solanum lycocarpum
Cinara Carla Pereira1, Munique Gomes Manfrin2, Antônio Carlos Severo Menezes3, Mirian Machado Mendes4, Veridiana de Melo Rodrigues Ávila4
1 Bolsista PVIC / UEG 2 Bolsista PVIC/ UEG
3 Pesquisador Coordenador de Pesquisa / UEG
4 Laboratório de Química de Proteínas e Produtos Naturais / UFU
Resumo
Várias plantas vem sendo motivo de grandes estudos, isso ocorre porque a obtenção de seus extratos pode proporcionar a descoberta de novos fármacos que sejam biologicamente ativos e, inibidores de diferentes classes de enzimas. A espécie do cerrado brasileiro Solanum lycocarpum foi utilizada para avaliar a atividade hemorrágica da peçonha de Bothrops sauloensis. Os ensaios foram realizados “in vivo” , utilizando-se camundongos Swiss machos (18-22g). Observou-se que as frações de extratos injetadas no dorso dos camundongos foram capazes de inibir significativamente a atividade hemorrágica da peçonha analisada.
Palavras-chave: peçonha, extratos vegetais, atividade hemorrágica
1. Introdução
As plantas são uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número de fármacos(ANDRADE, 2003).
Observa-se no entanto que o uso potencial de plantas como fonte de novas drogas ainda é pouco explorado, e que apenas há poucos anos atrás é que se tem visto ressurgir o interesse em utilizar as plantas como uma fonte de novos agentes terapêuticos (ANDRADE, 2003).
O gênero Solanum possui mais de 1.700 espécies sendo bem representado na América tropical, incluindo o Brasil . Solanum lycocarpum Conhecida como lobeira ou fruta-do-lobo, é uma Solanaceae de porte arbustivo amplamente distribuída em todo o cerrado brasileiro. A Solanum lycocarpum tem sido estudada, visto que apresenta compostos com atividades biológicas ativas, sendo desta forma alvo de estudos para a inibição de algumas enzimas presentes nos venenos de serpentes, como por exemplo as metaloproteases (BARRETO, 2006. Apud ELIAS, 2003). (Fig.1)
Figura1. frutos de Solanum lycocarpum
Fonte: http://www.pirenopolis.tur.br/portal/index.php?id=mostragal&idgal=50 (acesso em 19/09/07) Devido aos vários efeitos patológicos graves e muitas vezes letais, os venenos de serpentes há muito tempo vêm intrigando os cientistas ( COMINETTI, 2004 ).
Atualmente mais de duzentas espécies de serpentes venenosas já foram identificadas. Elas estão classificadas em quatro principais famílias: Hydrophiidae, Elapidae, Viparidae e Crotalidae (COMINETTI, 2004).
Extratos vegetais constituem uma excelente fonte alternativa de novos agentes antiofídicos. Em muitos países, extratos vegetais têm sido tradicionalmente usados no tratamento contra envenenamentos de serpentes, porém é necessário resultados científicos para comprovar as atividades farmacológicas dos constituintes das plantas (SILVA et al. 2005).
Visto que vários extratos vegetais apresentam excelentes atividades antivenenos, o objetivo deste trabalho é avaliar a atividade hemorrágica da peçonha bruta de Bothrops sauloensis combinada ou não com as frações dos extratos SLFrM (Solanum fruto metanol), SLFrMAc (Solanum fruto metanol-acetona), SLFrMM (Solanum fruto metanol- metanol) e SLFrME (Solanum fruto metanol-éter).
2. Material e Métodos
2.1. Coleta do Material vegetal
Os frutos de Solanum lycocarpum foram coletados no mês de outubro de 2006, no campus da Universidade Estadual de Goiás (UEG) em Anápolis, Goiás, Brasil e identificados pela Profa Dra Mirley Luciene dos Santos . As exsicatas do material vegetal foram depositadas no herbário do departamento de Ciências Biológicas da UEG.
2.2Obtenção dos Extratos
Coletou-se 2000g de frutos, os quais foram posteriormente macerados e submetidos a extrações exaustivas com metanol a frio. Em seguida o solvente foi evaporado à pressão reduzida, em um evaporador rotativo, resultando em um resíduo viscoso escuro, denominado extrato bruto metanólico. Retirou-se uma pequena parcela do extrato bruto, o qual foi denominado SLFrM (Solanum fruto metanol).
O extrato bruto metanólico restante, foi fracionado em cromatografia em coluna utilizando-se celulose microcristalina D como fase estacionária. Para o fracionamento foram utilizados solventes em ordem crescente de polaridade: acetona, metanol e éter etílico, obtendo-se desta forma extratos fracionados: SLFrMAc (Solanum fruto metanol-acetona), SLFrMM (Solanum fruto metanol- metanol) e SLFrME (Solanum fruto metanol-éter).
2.3. Extratos vegetais e controle da atividade hemorrágica in vivo
Foram pesados 100µg de cada extrato utilizado (SLFrME, SLFrMAc, SLFrMM e SLFrM) dos frutos de Solanum . Os mesmos foram solubilizados em 1µL de solução salina (PBS).
Para avaliação da atividade hemorrágica foram feitas soluções de cada fração de extrato, utilizando nas mesmas, peçonha bruta de Bothrops sauloensis. As soluções foram preparadas de acordo com a seqüência: peçonha- fração de extrato-solução salina, nas proporções de 2 : 10
(peçonha bruta/ extrato vegetal) e 2 : 50 (peçonha bruta/ extrato vegetal), os volumes foram completados com PBS ( solução salina) para 50 µL.
Utilizou-se para a realização dos ensaios biológicos, camundongos Swiss machos (18-22g) fornecidos pelo Instituto Valle do Brasil e mantidos no LEA (Laboratório de Experimentação Animal) da Universidade Federal de Uberlândia sob condições de temperatura e umidades controladas (22± 1ºC e 60± 5%, respectivamente) e com dieta “ad libitum”.
A atividade hemorrágica foi realizada segundo NIKAI et al. (1984) com algumas modificações. Foram utilizados camundongos machos, que receberam no dorso previamente depilado injeções intradérmicas de 2DMH (Dose mínima hemorrágica) da peçonha bruta combinada ou não com as frações do extrato. Após 3 horas de inoculação, os animais foram sacrificados e suas peles retiradas. Os resultados foram mensurados pela medida dos halos formados nas peles dos animais.
3. Resultados e Discussão
Extratos de plantas constituem uma importante fonte de compostos que apresentam diversas atividades farmacológicas. Em muitos países, extratos de plantas têm sido utilizados no tratamento contra envenenamento de peçonhas (SILVA et al. 2005). Vários estudos podem confirmar os efeitos biológicos atribuídos às plantas e também demonstram a melhor forma para sua utilização. Plantas medicinais são usadas
na cultura popular para neutralizar muito dos efeitos induzidos por venenos de serpentes. Nos últimos anos tem-se intensificado a busca por princípios ativos que sejam capazes de neutralizar os efeitos provocados pelas peçonhas de serpentes. Esse campo de investigação tem-se tornado extremamente importante na comunidade científica (MENDES, 2007).
A peçonha de serpentes contém muitas enzimas proteolíticas, as quais degradam uma enorme variedade de substratos naturais, como por exemplo a caseína, o fibrinogênio, entre outros. Toxinas hemorrágicas são entre outras enzimas, as responsáveis pela degradação da matriz extracelular ou pelas alterações na coagulação do sangue e, desta forma necessitam de um íon de metal divalente para que sua atividade seja eficiente (BIONDO et al. 2003).
As frações dos extratos SLFrME (1a e 1b), SLFrMAc (2a e 2b), SLFrMM (3a e 3b) , e SLFrM (4a e 4b), inibiram significativamente a atividade hemorrágica da peçonha de Bothrops sauloensis nas frações “a” de proporções 2 : 10 (v/v (µL), peçonha/ extrato vegetal) e frações “b” de proporções 2 : 50 (v/v (µL) , peçonha/ extrato vegetal). (Fig. 2).
Veneno bruto 1A 1B
2A 2B 3A
Figura 2: Efeito hemorrágico de SLFrME (1a e 1b), SLFrMAc (2a e 2b), SLFrMM (3a e 3b) , e
SLFrM (4a e 4b) in vivo sobre camundongos Swiss machos. Os camundongos receberam no dorso previamente depilado injeções intradérmicas de 2DMH (Dose mínima hemorrágica) da peçonha bruta combinada ou não com as frações d o extrato. Após 3 horas de inoculação, os animais foram sacrificados e suas peles retiradas. Os resultados foram mensurados pela medida dos halos formados nas peles dos animais.
A avaliação da atividade hemorrágica foi feita, comparando-se as medidas dos halos da peçonha bruta formados nas peles dos animais, com as medidas dos halos dos extratos vegetais combinados com a peçonha, também formados nas peles dos animais . Para a realização das medidas, utilizou-se o paquímetro - digimess (0-150mm). Observa-se que as frações 2a e 4b, inibiram totalmente a atividade hemorrágica da peçonha. A fração 1b também apresentou uma excelente inibição, sendo então estas três frações (1b, 2a e 4b) consideradas dentre as frações analisadas, como sendo as melhores inibidoras da peçonha bruta de Bothrops sauloensis. As demais frações apresentaram inibição significativa, e observa-se que com o aumenta da concentração do extrato, tem-se contem-seqüentemente um aumenta na inibição da peçonha, comprovando a eficácia das frações dos extratos analisados. A porcentagem (%) de inibição é representada no gráfico da figura 3. 0 20 40 60 80 100 120 1a 1b 2a 2b 3a 3b 4a 4b Extratos vegetais % de inibição
Figura 3: Efeito hemorrágico de SLFrME (1a e 1b), SLFrMAc (2a e 2b), SLFrMM (3a e 3b) , e
SLFrM (4a e 4b) in vivo sobre camundongos Swiss machos. Os dados mostram a porcentagem (%) de inibição dos extratos vegetais sobre a peçonha bruta.
A inibição da atividade hemorrágica induzida por peçonhas de serpentes , sugere que ocorre interação do extrato Solanum lycocarpum com metaloproteases presente na peçonha. Essa interação neutraliza os efeitos provocados pelas metaloproteases.
Vários trabalhos têm explorado os extratos vegetais, demonstrando sua capacidade de inibir a atividade hemorrágica. A interação entre os componentes do extrato com metaloproteases envolve o sítio catalítico das enzimas ou os íons de metais essenciais (MAIORANO et al. 2005). A função de certos componentes inorgânicos, tais como o zinco, cobre, ferro e cobalto, está relacionada a mecanismos catalíticos de certos componentes enzimáticos presentes no veneno, tais como as metaloproteases
(COMINETTI, 2004 ). A formação de complexos dos componentes dos extratos com os componentes inorgânicos presentes nas metaloproteases, promovem a atividade inibitória sobre a hemorragia, visto que os íons são importantes na atividade catalítica de enzimas (BIONDO et al. 2003). Com os resultados analisados na figura 3, pode-se dizer que o extrato Solanum lycocarpum, possui compostos que se mostraram eficientes na formação de complexos com as metaloproteases presentes nas peçonhas de Bothrops sauloensis, e dessa forma, inibiram significativamente a sua função hemorrágica.
Referências Bibliográficas
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