Atividade do extrato etanólico de própolis verde sobre o
comportamento morfobiológico de Candida albicans
isoladas da mucosa bucal de pacientes HIV positivo e de
pacientes com sorologia desconhecida para o HIV.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública Orientadora: Profa. Dra. Maria de Fátima Costa Pires
São Paulo 2007
Como expressar nas palavras, os gestos que queria fazer, as coisas que gostaria de ver, os belos amanhecer e entardecer e o sombrio morrer... faltam-se falas.
Mas ao expressar o simples fato de escrever, falar, nada existe para preocupar... nada pode deturpar... na essência pelo chorar, no gesto por beijar, comover e alavancar o puro e simples “amar”.
DEDICATÓRIA
À Deus,
pela criação do universo e do homem como reflexo da sua infinita sabedoria e amor. Por prover inteligência ao homem e à ciência instrumento de compreensão deste universo e seus recursos na preservação da vida.
À minha mãe
Maria de Lourdes
pela dedicação e amor incondicional por toda a minha vida em seus cuidados permanentes que me proporcionaram maior disponibilidade de tempo para os estudos.
Ao meu irmão
Reinaldo
À Profa. Dra. Maria de Fátima Costa Pires,
pela acolhida, profissionalismo, paciência e otimismo com que conduziu este delicado processo de aprendizagem e compromisso em tão pouco tempo e pelo desenvolvimento de uma amizade.
AGRADECIMENTOS
. À Secretaria da Saúde e responsáveis pela criação do Programa de Pós Graduação em Ciências e ao Instituto Adolfo Lutz que abriu suas portas para profissionais em busca de pesquisa.
Aos professores e colaboradores do Programa de Pós Graduação, que por meio de seus esforços e trabalho obtivessem sucesso, em especial: À Profa. Dra. Maria de Fátima Costa Pires como Coordenadora desse Programa de Pós Graduação.
À Sra. Emiliana Simões Toledo Corrêa pela eficiência e atenção
dedicada aos alunos em suas dúvidas e questões burocráticas.
Aos alunos Raquel Cristina da Silva e Daniel Silva Abrahão pela cooperação e amizade.
Aos meus amigos que acompanharam este processo, que muitas vezes me manteve ausente dos seus convívios, mas que sempre me apoiaram e ofereceram palavras de incentivo e carinho.
INDICE
RESUMO 8 ABSTRAT 10 LISTA DE ABREVIAÇÕES 12 LISTA DE TABELAS 13 LISTA DE GRÁFICOS 15 LISTA DE QUADROS 16 1. INTRODUÇÃO 17 2.OBJETIVOS 29 3. MATERIAIS e MÉTODOS 32 3.1 Leveduras 33 3.2 Candida albicans 333.3 Identificação das leveduras 33
3.4 Pesquisa de Candida dubliniensis 34
3.5 Produção de Exoenzimas 38
3.6 Morfotipagem 40
3.7 Sensibilidade às toxinas killer 42
3.8 Teste de sensibilidade aos antifúngicos 44
3.9 Produção de exoenzimas e morfotipagem 49
3.10. Considerações Éticas 50
3.11 Controle de qualidade e biossegurança 50
4. RESULTADOS 51
4.1 Candida albicans 52
4.2 Pesquisa de Candida dubliniensis 52
4.3 Morfotipagem 57 4.4 Toxinas Killer 59 4.5 Sensibilidade a antifúngicos 61 5. DISCUSSÃO 72 5.1 Candida albicans 73 5.2 Candida dubliniensis 74 5.3 Fatores de Virulência 77
5.4 Ação de antifúngicos sobre C. albicans 84
5.5 Ação do extrato etanólico de própolis verde sobre C. albicans 87
6. CONCLUSÕES 98
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 101
RESUMO
Este trabalho tem como objetivo estudar o comportamento morfobiológico de
Candida albicans isoladas da mucosa bucal de pacientes HIV positivo
tratados com inibidores de protease (grupo 1, n=55) e de pacientes com sorologia desconhecida para o HIV e periodontite severa (grupo 2, n=5), quanto a produção de exoenzimas (proteinase e fosfolipase), morfotipagem e sensibilidade a toxinas killler utilizando as metodologias de Ruchel et
al.(1982), Price et al.(1982), Polonelli et al. (1983) e Hunter et al. (1989)
respectivamente. Pesquisar amostras presuntivas de Candida dubliniensis entre as amostras de C. albicans, utilizando o meio cromogênico CROMágar®Candida e termotolerância a 42ºC. Avaliar a sensibilidade das amostras ao extrato etanólico de própolis verde a 20% (Eloff, 1998). Determinar e comparar a produção de exoenzimas antes e após contato com extrato etanólico de própolis verde (dose subinibitória), e as características morfológicas de produção de franjas. Avaliar a sensibilidade às drogas antifúngicas: anfotericina B, fluconazol, fluorocitosina, itraconazol, cetoconazol e voriconazol utilizando o E-Test®. Todas as 60 amostras foram confirmadas como C. albicans. Não foram encontradas amostras presuntivas de C. dubliniensis. A produção de proteinase no grupo 1 ocorreu em 49% (27/55) das amostras e no grupo 2, 40% (2/5). A produção de fosfolipase no grupo 1 ocorreu em 32,7% (18/55) e em 3,6% (2/55) observou-se alta produção, no grupo 2 ocorreu em 40% (2/5). Foram identificados 27 morfotipos diferentes nas 60 amostras, sendo o morfotipo 7341, encontrado em 18,3% (11/60). Na sensibilidade a toxinas Killer identificou-se nas 60 amostras 21 biotipos diferentes, sendo o biótipo 811 (15/60) o mais encontrado. Na sensibilidade ao extrato etanólico de própolis verde, no grupo 1 em 55/60 o CIM 50 ficou entre 12,50 mg/ml e 6,25 mg/mL e o CIM 90 foi 50 mg/mL para e no grupo 2 em 5/60 o CIM 50 foi 12,50 mg/mL e o CIM 90 de 25 mg/mL. Em doses subinibitórias ocorreu inibição da atividade enzimática. Em 15/59 amostras ocorreram inibição de franjas, e uma amostra não cresceu nesta condição. Quanto ao teste de sensibilidade às
drogas antifúngicas, de 9 amostras do grupo 1 escolhidas aleatoriamente, os valores variaram, para anfotericina B o MIC 50 foi de 0,047 µg/mL, fluconazol 0,064 µg/mL, fluorocitosina 0,125 µg/mL, itraconazol 0,012 µg/mL, voriconazol 0,016 µg/mL e para cetoconazol 0,002 µg/mL. Nesse estudo pôde-se concluir que a avaliação fenotípica permitiu identificar inúmeros tipos de C. albicans presentes na mucosa bucal dos diferentes grupos estudados, onde 30 a 50% dessas leveduras são produtoras de proteinase e fosfolipase e sensíveis ao extrato etanólico de própolis verde na concentração de 2,5 a 5%. É relevante contribuir com novas opções terapêuticas, eficazes e seguras no controle de condições mórbidas prevalentes.
Palavras-Chave: Candida albicans, exoenzimas, morfotipos sensibilidade a antifúngicos, própolis verde.
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the morphobiological behavior of Candida
albicans isolated of oral mucous membrane from HIV - positive patients treaties with
protease inhibitor (55 samples - group 1) and samples of patients with unknow sorology for HIV and under treatment periodontal (5 samples - group 2), as the exoenzymes (proteinase and fosfolipase) production, morphotyping and sensibility to killler toxins using the methodologies of Ruchel et al.(1982), Price et al.(1982), Polonelli et al. (1983) e Hunter et al. (1989), respectively. To research presumptive samples of Candida dubliniensis between samples of C. albicans, using the cromogênico medium CROMágar®Candida, and growth at 42ºC. For evaluate the sensitivity of sample to ethanolic extract of green propolis to 20%
(Eloff, 1998). After determine and to compare the exoenzymes production before and after contact with ethanolic extract of green propolis (sub-inhibitory concentration) as well as the morphologic characteristics of production of fringes using the morphotyping. The sensibility evaluate to the antifungals as amphotericin B, fluconazole, fluorocytosine, itraconazole, ketoconazol and voriconazole using the E-Test®. All the 60 sample ones had been confirmed as C. albicans. They had not been meeting sample presumptive of C. dubliniensis. The production of secretory proteinase was 49% (27/55) of sample in group 1 and 40% (2/5) in group 2. The production of secretory phospholipase was 32,7% (18/55) of sample in group 1 and in 3,6% (2/55) was observed hight production this exoenzyme, in group 2 was 40% (2/5). Was identified 27 differents morphotypes in the 60 samples of C. albicans, being morphotype 7341 observed in 18,3% (11/60). In sensitivity for killer toxins, we got 21 differents biotypes between the 60 samples being the biotype 811 observed in 15/60. In sensitivity to ethanolic extract of green propolis in group 1 55/60 was 12,50 mg/mL<CIM 50<6,25mg/mL and of 50mg/mL to CIM 90 and in group 2 5/60 the CIM 50 was 12,50 mg/mL and CIM 90 to 25 mg/mL. In doses that leave to growth of isolated of C. albicans, have been inhibition the enzymatic activity. In 15/59 the fringes was absent, one sample not grow in this condition. In test of sensitivity to antifungals drugs, in 9 isolated (group1) selected casually, the values was several, to amphotericin B the MIC 50 was 0,047 µg/mL, to fluconazole 0,064 µg/mL, fluorocitosyne 0,125 µg/mL, itraconazole 0,012 µg/mL, voriconazole 0,016 µg/mL and to ketoconazole 0,002 µg/mL. In this study we could conclude, with evaluation morphobiological was possible identify many kinds of C. albicans in oral
mucous membrane in differents groups of patients estudied, about 30 to 50% this yeasts are produce of enzymes secretory of proteinases and phospholipases and are sensitive to ethanolic extract of green propolis in concentrate of 2,5 to 5%. Is important for help with news options of treatments, efficacious and safe in control of predominate deseases.
Key words: Candida albicans exoenzimas, morfotipos sensibilidade a antifúngicos.
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária Aids : Síndrome da Imunodeficiência Adquirida CIM : Concentração Inibitória Mínima
CFM : Concentração Fungicida Mínima HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana Pz : Atividade enzimática
MIC: Concentração Inibitória Mínima mg : Miligramas
mL : Mililitros
MS: Ministério da Saúde
SNVS Sistema Nacional de Vigilância Sanitária UFC: Unidade Formadora de Colônia
µg: Micrograma µL: Microlitro
LISTA DE TABELAS
Tabela I. Interpretação dos valores de concetração inibitória mínima
(CIM) dos antifúngicos de acordo com o documento M27-A2 (NCCLS, 2002).
Tabela II. Distribuição das amostras de C. albicans e C. dubliniensis dos
grupos 1 e 2 de acordo com a coloração apresentada no meio CHROMágar®
Candida e termotolerância a 42º C.
Tabela III índice de atividade enzimática (proteinase e fosfolipase) de
amostras de C. albicans do grupo 1.
Tabela IV. índice de atividade enzimática (proteinase e fosfolipase) de
amostras de C. albicans do grupo 2.
Tabela V. Média, desvio padrão, mediana, máxima e mínima atividade
enzimática de proteinase por amostras de C. albicans dos grupos 1 e 2.
Tabela VI - Média, desvio padrão, mediana, máxima e mínima atividade
enzimática de fosfolipase por amostras de C. albicans dos grupos 1 e 2.
Tabela VII. Morfotipos de C. albicans do grupo 1 de acordo com códigos
propostos por Hunter et al (1989).
Tabela VIII. Morfotipos de C. albicans do grupo 2 de acordo com códigos
propostos por Hunter et al (1989).
Tabela IX. Distribuição das amostras de C. albicans do grupo 1 de acordo
Tabela X. Distribuição das amostras de C. albicans do grupo 2 de acordo
com o biotipo “killer”.
Tabela XI. Morfotipos de C. albicans do grupo 1 antes e depois da ação do
extrato etílico de própolis verde.
Tabela XII. Morfotipos de C. albicans do grupo 2 antes e depois da ação do
extrato etílico de própolis verde.
Tabela XIII. Valores de CIM de amostras de C. albicans do grupo 1 às
drogas antifúngicas utilizando o método de E-Test®
Tabela XIV. Sensibilidade apresentada por amostras de C. albicans do
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1- Porcentagem de índices de produção de proteinase (índices 1 e
2) por amostras de C. albicans dos grupos 1 e 2.
Gráfico 2- Porcentagem de índices de produção de fosfolipase (índices 1, 2
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Coloração apresentada por diferentes espécies de leveduras
do gênero Candida semeadas em meio cromogênico CHROMágar®
Candida.
Quadro 2 - Modelo de tipificação de morfotipos de C. albicans.
Quadro 3 - Amostras padrões “killer” fornecidas pela Universidade de Parma
(Itália).
Quadro 4- Codificação dos isolados de C. albicans segundo Polonelli et al
(1983).
Quadro 5 - Perfil de crescimento de C. albicans e C. dubliniensis a 37ºC e
42°C.
Quadro 6. Atividade anti-C. albicans do extrato etanólico de própolis verde
frente as amostras de C. albicans do grupo 1.
Quadro 7. Atividade anti-C. albicans do extrato de própolis verde frente as
O gênero Candida possui distribuição universal sendo classificado como fungo imperfeito, Divisão Deuteromycota, subdivisão Deuteromycotina, Classe Blastomycetes e Família Cryptococcaceae (Kurtzman e Fell, 1998; Lacaz et al., 2002). Estão descritas mais de 200 espécies, sendo 18 dessas consideradas patogênicas (Colombo e Guimarães, 2003; Naglik et al., 2004; López et al., 2005). Fazem parte da microbiota normal da pele, trato gastrintestinal, trato geniturinário, secreções brônquicas e cavidade bucal do homem (Lacaz et al., 2002).
Esse gênero assume particular importância pelo grande número de pacientes com o sistema imunológico comprometido, incluindo a imunossupressão que muitos procedimentos iatrogênicos produzem (Guilhermetti et al., 2004), como os facilitados pela radioterapia (Afonso, 2003) e hormonioterapia (Rex et al., 2002).
Candida albicans ainda é a espécie mais isolada nas infecções por Candida e considerada a mais patogênica desse gênero (Yokoyama et al.,
2000; Moreira, 2005; Menezes et al., 2006; Matsumoto, 2006).
É um agente etiológico freqüente na infecção oportunista de pacientes portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e na maioria desses pacientes, a infecção por esta levedura é decorrente principalmente do reservatório endógeno (Lacaz et al., 2002).
Pacientes HIV positivos sofrem pelo menos um episódio de candidíase durante o curso da doença, que tipicamente envolve a cavidade bucal (Samaranayake, 1992; Trabulsi, 1999, Lacaz et al., 2002; Cavassani et al., 2002; Colombo e Guimarães, 2003; Naglik et al., 2004; Masuoka, 2004; Ccahuana-Vasques et al., 2007; Wingeter et al., 2007)
A patogenicidade de C. albicans está associada com a capacidade de adesão, a produção de exoenzimas proteinases e fosfolipases e as variações fenotípicas switching, (Pires et al., 2001; Sugita et al., 2002; Colombo e Guimarães, 2003; Repentigny et al., 2004; Naglik et
al., 2004; Menezes et al., 2006; Wingeter et al., 2007). Nenhum desses
fatores parece ser responsável individualmente pela patogenicidade, há uma combinação de diferentes fatores que atuam em determinadas fases da infecção (Cutler, 1991; Odds, 1994; Pires et al., 2001).
A proteinase promove a hidrólise de albumina, queratina, colágeno, hemoglobina, imunoglobulinas, principalmente proteínas da matriz extracelular; sendo excretada in vivo durante o processo de adesão, colonização e invasão do microrganismo ao tecido do hospedeiro (Rüchel, 1982; Negi et al., 1984; Hattori et al., 1984; Bektec et al., 2001; Matsumoto et al., 2002; Naglik et al., 2003; Ruiz et al., 2005).
A codificação e a produção dessa enzima consistem de uma família de 10 genes denominados “secreted aspartyl proteinase” (SAP) de peso molecular entre 42 e 45 Kda, com ação em pH ácido de 3.5 – 4,0 (Naglik et al., 1999; Hube e Naglik, 2001; Naglik et al., 2003). Naglik at al, (1999) analisaram a expressão in vivo dos diferentes SAP na saliva de pacientes e verificaram que SAP 1 e 3 foram observadas somente em pacientes com candidíase bucal enquanto SAP 4, SAP 5 e SAP 6 foram detectados em pacientes com candidíase em outros sítios anatômicos.
A fosfolipase está relacionada ao metabolismo de fosfolipídios, que são os maiores componentes da membrana celular (Ibraihm et al., 1995). Quando atravessa a membrana fosfolipídica e digere esses componentes, ocorre a lise das células e danos à membrana celular do hospedeiro.
Fosfolipase, grupo heterogênio de enzimas com atividade na faixa de pH 3,6 a 4,7, sendo o ótimo pH 4,0, possue a capacidade de hidrolisar um
éster específico do glicofosfolipídio presente na membrana das células hospedeiras, favorecendo a penetração da levedura na mucosa. São encontradas na superfície da levedura e na extremidade do tubo germinativo (Price et al., 1982; Lane e Garcia, 1991; Mitrovic et al., 1995; Shimizu et al., 1996).
Foram descritos quatro tipos de fosfolipases, denominadas fosfolipase A, B, C e D (Sugita et al., 2002). A alta produção de fosfolipase por C.
albicans, está relacionada a um alto grau de patogenicidade (Lane e Garcia,
1991; Mitrovic et al., 1995; Shimizu et al., 1996).
Toxinas killer são compostos glicoprotéicos de baixo peso molecular, que atuam formando poros na membrana citoplasmática de fungos, alterando assim a permeabilidade celular. A formação de poros também resulta na morte de leveduras sensíveis (Bendová, 1986).
Leveduras “killer” são imunes à ação das suas próprias toxinas, mas podem ser sensíveis às proteínas “killer” produzidas por outros organismos. Polonelli et al (1983) selecionaram entre 54 leveduras, 9 pertencentes aos gêneros Pichia e Hansenula, produtoras de toxinas “killer” e preconizaram um método de biotipagem de espécies de Candida, denominado sistema “killer” codificado por 3 dígitos, baseado na sensibilidade de uma cepa às toxinas produzidas.
A tipagem de isolados de C. albicans pela determinação de sua sensibilidade a um painel de toxinas “killer” permite a determinação de um significante número de tipos sensíveis, para diferenciar isolados de uma mesma espécie de levedura (Pires et al., 1996; Silva, 1999; Lusvarghi, 2002, Matsumoto et al., 2002; Ruiz et al., 2005).
A morfotipagem baseia-se nas diferenças de produção, tamanho e textura de franjas marginais e da superfície das colônias, obtidas pela semeadura de isolados no meio ágar extrato de malte, obtendo um código
com 4 dígitos (Hunter e Fraser, 1989). Hunter e Fraser (1989), sugerem que este sistema pode correlacionar um morfotipo distinto com a capacidade de virulência, onde franjas descontínuas estão presentes geralmente em isolados de infecções sistêmicas fatais.
Candida dubliniensis é uma espécie que vem sendo descrita nos
últimos 10 anos e fenotipicamente semelhante a C. albicans. C. dubliniensis foi identificada pela primeira vez por Sullivan et al. (1995). Pode ser isolada de vários sítios anatômicos, mas tem sido encontrada com freqüência na cavidade bucal de pacientes portadores do vírus HIV (Bachmann e Patterson, 2002; Mcculloug et al., 2004).
Segundo Moretti (2007), os avanços na terapêutica e técnicas invasivas para diagnóstico, fez com que muitos pacientes se submetessem a procedimentos invasivos, antibióticos de amplo espectro e outros fatores de risco predisponentes para a aquisição de infecções severas. Além disso, mudanças na quimioterapia antineoplásica têm causado imunossupressão profunda com aumento do tempo de hospitalização, facilitando a ocorrência de infecções fúngicas nestes pacientes.
Além das dificuldades citadas, as infecções sistêmicas por Candida sp nestes pacientes podem apresentar curso rápido e muitas vezes fatal. Leveduras do gênero Candida têm sido consideradas entre os principais agentes causadores de infecções sistêmicas de origem hospitalar, em torno de 80% das infecções fúngicas documentadas em hospitais terciários (Colombo e Guimarães, 2003; Moretti, 2007).
A candidíase, em indivíduos infectados pelo HIV, vem exigindo freqüentemente terapia contínua de manutenção ou preventiva. O uso freqüente de terapia antifúngica nesses pacientes que apresentam constantes recidivas de candidíase bucal ou esofágica é o fator que
provavelmente influencia na ocorrência de resistência a diferentes drogas (Dupont, 1994).
Greenspan (1992) relata que nos pacientes com AIDS, os antimicóticos mais utilizados são a nistatina, anfotericina B e fluconazol.
A partir dos anos 90, os triazóis fluconazol, itraconazol e mais recentemente o voriconazol têm sido as drogas de maior biodisponibilidade e atividade; outros novos derivados como posaconazol e ravuconazol aguardam aprovação para uso (Martinez, 2006). Nos últimos quinze anos, têm sido desenvolvidas as formulações lipídicas de anfotericina B e a caspofungina do grupo das equinocandinas (Letscher-Bru, 2003; Martinez, 2006).
No entanto, têm sido observadas limitações quanto à toxicidade, interações com outras drogas e desenvolvimento de resistência pelos isolados de Candida sp (Nucci e Colombo, 2002; Pfaller et al., 2004; Alves et al., 2006). Outro aspecto a ser observado refere-se à emergência de leveduras menos comuns, que pode ocorrer pela seleção de espécies resistentes aos antifúngicos como fluconazol. O uso profilático prolongado de fluconazol em pacientes transplantados de medula óssea foi associado com maior ocorrência de infecções por fungos filamentosos (Marr et al., 2000 apud Moretti, 2007).
Wingard et al. (1991) e Pfaller et al. (2004) relatam que espécies de
Candida não albicans como a Candida glabrata e Candida krusei têm sido
freqüentemente citadas.
Patel et al. (2006), sugerem uma relação entre a prevalência de leveduras e efeito dos antifúngicos, com a hipótese de que a população de leveduras residentes na cavidade bucal de pacientes infectados pelo HIV, seja estável e ocupe um nicho específico e com o tratamento o nível dessas
leveduras decline, mas seja restaurado para níveis originais após a descontinuidade do tratamento.
Os poliênicos, representados pela anfotericina B e nistatina, têm espectro de ação contra fungos dimórficos. Têm como alvo a membrana citoplasmática, especialmente aquela contendo ergosterol. Podem ser fungistáticos (dependendo da dose), se apenas alterarem a permeabilidade com repercussão na nutrição do fungo, ou fungicidas, se formam poros na membrana, levando a um escoamento do conteúdo intracelular do fungo e conseqüente morte. O maior número de publicações evidenciando o fenômeno da resistência de fungos aos poliênicos refere-se ao gênero
Candida, sendo as espécies não albicans, as mais envolvidas. Acredita-se
que a redução de ergosterol presente nas membranas do fungo dificultaria a ligação do poliênico (Robbers,1997; Alves, 2003).
Os azóis são representados por fluconazol, cetoconazol, itraconazol, voriconazol. O sítio de ação dos azóis é a membrana citoplasmática com alteração das enzimas localizadas nessa região, com descontrole na síntese de quitina, além das alterações nas enzimas citocromo oxidase, peroxidase e catalase.Tem sido observada a resistência ao fluconazol nas espécies de
C. albicans de pacientes submetidos a tratamentos prolongados. Nos
pacientes com sindrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) e candidíase orofaríngea, 9 a 11 % dos isolados evidenciam resistência a este composto triazólico (Wingard et al., 1991).
Alves et al. (2006), comparando o itraconazol e fluorocitosina com
anfotericina B, observou in vitro, 100% de sensibilidade a anfotericina B nos isolados de Candida sp de pacientes com AIDS e candidíase orofaríngea, incluindo os isolados resistentes ao fluconazol.
Convém lembrar que nas falhas terapêuticas, para caracterizar uma amostra como resistente é fundamental o conhecimento de questões como:
o estado imunológico do paciente, os níveis séricos ideais do antifúngico, interações medicamentosas e outros agentes infecciosos associados que não Candida sp (Bugni, 2003).
Existe um consenso entre os pesquisadores em sugerir diagnóstico de lesões bucais por meio da microscopia e cultura e subsequente teste de sensibilidade a antifúngicos, que facilitariam a escolha do tratamento e talvez a minimização de casos de resistência (Wingard et al., 1991; Pfaller et al., 2004).
Ravuconazol, também conhecido como ER-30346, é um triazol com amplo espectro e atividade contra Candida sp, Cryptococcus neoformans,
Aspergillus fumigatus e dermatófitos (Fung et al., 1998; Diekema et al.,
1999). Fung et al (1998) demonstraram que ravuconazol foi de duas a quatro vezes mais ativo do que itraconazol contra isolados de Candida sp porém, já mostrou resistência cruzada com fluconazol (Pfaller et al., 2004).
Novos antifúngicos vêm sendo desenvolvidos com novos compostos, mais ativos e melhor tolerados, como alguns membros da família dos triazóis ou formulações lipídicas de anfotericina B, com baixa nefrotoxicidade, porém discretamente mais hepatotóxicos e de alto custo em relação às drogas convencionais (Aperis et al., 2006; Wagner et al., 2006).
C. albicans vem apresentando uma crescente resistência aos
medicamentos existentes no mercado. Existe urgência na descoberta de novos fármacos devido às resistências atuais (Giordani,1999; Alves, 2003; Freitas, 2003).
A partir do séc XIX o homem começa a isolar princípios ativos das plantas medicinais, tendo como marco a descoberta da quinina, da casca da
Cinchona pelos cientistas franceses J.B. Caventou e J. B. Pelletier. Antes da
plantas superiores e são utilizadas até hoje como a quinina, a morfina e codeína do látex da papoula, digoxina das folhas da Digitalis, atropina e hioscina de espécies de Solanacea. A era dos antibióticos aparece após a segunda guerra a partir de produtos naturais isolados das espécies de
Penicillum, Cephalosporium e Streptomyces. Surge neste período a
reserpina produto de espécies de Rauwolfia, a vincristina e vinblastina da
Catharanthus roseus (Phillipson, 2001).
Na medicina popular, a própolis tem sido utilizada de forma empírica como medicamento natural há mais de 5.000 anos (Quiroga et al, 2005).
Própolis é uma substância resinosa, elaborada pelas abelhas a partir da coleta de exsudados das plantas que rodeiam as colméias, estes são adicionados às secreções salivares e ceras produzidas pelas abelhas (Marcucci 1995; Nogueira-Neto 1997). É utilizada na vedação e reparação mecânica, higienização dos alvéolos antes da postura da rainha e na mumificação de corpos estranhos ao enxame que não possam ser removidos, evitando assim uma possível infecção dentro da colméia (Gebara, 2002; Sawaya, 2002).
A composição da própolis é bastante variável devido a fatores como: a planta de escolha, o local da planta onde a resina foi coletada, da espécie da abelha e da sazonalidade (Nogueira-Neto 1997; Bankova et al 2000; Salatino et al., 2005). Mais de 300 constituintes já foram identificados e/ou caracterizados em diferentes amostras de própolis (Burdock, 1998).
Abelhas pertencem a ordem dos Himenópteros (formigas, abelhas e vespas). Podem ser reunidas na superfamília Apoidea, que por sua vez é constituída por diversas famílias: Apinae, Meliponinae, Bombinae e Euglossinae. Entre os apíneos a única espécie que vive no Brasil é a Apes
Abelhas Apis mellifera são freqüentemente citadas e melhor estudadas na literatura, são abelhas de origem européia, que foram introduzidas no Brasil no período colonial para fins de apicultura e atualmente é a mais abundante. Contudo, possuímos uma fauna de abelhas nativa rica e diversa, como as abelhas da família Meliponinae, muitas das quais diferentemente das Apis mellifera, utlizam solo na constituição da geoprópolis (Nogueira-Neto, 1997; Santos, 2002).
O emprego da própolis como antimicrobiano já era descrito pelos: assírios, gregos, romanos, íncas e egípcios, estes últimos embalsamavam os mortos com própolis. Entre os árabes a própolis era utilizada como cicatrizante, antisséptico e desinfetante. Os íncas a utilizavam como anti-pirético. No século 17, em Londres, a própolis foi oficialmente catalogada como droga. Entre os séculos 17 e 20, a própolis foi adquirindo popularidade na Europa devido sua atividade antibacteriana (Castaldo e Capasso, 2002; Pereira et al., 2002; Quiroga et al., 2005).
De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), a própolis é um produto natural, de características físicas resinosas e composição variável, coletada de várias espécies vegetais e que sofre adição de secreções da abelha, sendo classificada como um medicamento opoterápico (RDC nº 132/2003).
Comercialmente encontramos a própolis em várias preparações farmacêuticas e cosméticas, tais como: tinturas, extratos, pomadas, pastilhas, cápsulas, ungüentos, cremes faciais, pastas de dente, soluções para bochecho, spray bucal e para a garganta, desodorantes, sabonetes,
shampoos, loções e soluções (Kotel’nikov et al., 1989, Manara et al.,1999).
Análises da composição da própolis têm demonstrado que a origem da própolis européia são exsudados de Populus nigra. Porém em regiões
tropicais, as abelhas utilizam outros recursos para a produção da própolis (Bankova et al 2000).
Park et al (2002) estudaram própolis de diferentes regiões do Brasil utilizando o extrato da própolis e a planta de origem. Por meio de técnicas de cromatografia e espectometria, estes autores confirmaram que o principal recurso da própolis brasileira é a resina de Baccharis dracunculifolia.
Também conhecida popularmente como “alecrim do campo”, a
Baccharis dracunculifolia é a fonte da própolis verde (Bankova et al., 1995;
Kumazawa et al., 2003). Alecrim é utilizado na medicina tradicional e pertence a familia Asteraceae, amplamente distribuída em ecossistemas abertos principalmente no sudeste e sul do Brasil, difundindo-se pelo Uruguai, Argentina, Paraguai e Bolivia (Espírito-Santo et al., 2003).
Recentemente, o mesmo grupo que confirmou a origem da própolis verde, estudou outra própolis brasileira, produzida a partir de resinas de
Dalbergia ecastophyllum, coletadas nos manguezais dos estados da
Paraíba, Alagoas, Sergipe e Bahia, identificadas como fonte da própolis vermelha (Daugsch et al., 2007).
Existem poucos trabalhos sobre a composição química (Marcucci e Bankova, 1999; Park et al., 2002; Salatino et al., 2005; Fukuda, 2006) e a atividade antimicrobiana da própolis verde (Ota et al., 2001; Martins et al., 2002; Sawaya, 2002; Santos et al., 2005; Ayres et al., 2007; Coelho et al., 2007).
D’auria et al. (2003) relataram a ação da própolis sobre switching, de fosfolipase e aderência de C. albicans.
O efeito do extrato de própolis verde sobre leveduras ainda é pouco estudado. Santos et al. (2005) sugerem o tratamento de candidíase bucal com própolis verde, porém não avaliam seu efeito sobre os fatores de virulência.
É relevante contribuir com novas opções terapêuticas, eficazes e seguras no controle de condições mórbidas prevalentes, bem como estimular a construção de instrumentos que evidenciem a efetividade dessas opções e a eficiência destas iniciativas sobre a saúde pública. A pesquisa de novos antifúngicos e com menores efeitos adversos, é bem vinda (Dialo, 2001; Freitas, 2003; Alves, 2003).
2.OBJETIVO
Considerando que C. albicans é a espécie mais isolada nas infecções por Candida e a mais patogênica desse gênero, que vem apresentando uma porcentagem crescente de resistência aos medicamentos existentes no mercado, têm-se como objetivos:
¾ Caracterizar amostras de C. albicans da mucosa bucal de pacientes HIV positivos, tratados com inibidores de protease e de
pacientes com sorologia desconhecida para o HIV em tratamento periodontal. Pesquisar amostras presuntivas de C. dubliniensis, entre as amostras de C.albicans, utilizando provas fenotípicas. ¾ Determinar e comparar os fatores de virulência entre as amostras
de C. albicans quanto à produção de exoenzimas (proteinase e fosfolipase).
¾ Determinar e comparar os fenótipos das amostras de C. albicans por meio da morfotipagem e sensibilidade às toxinas “killer”.
¾ Avaliar a sensibilidade ao extrato etanólico de própolis verde de amostras de C. albicans.
¾ Determinar e comparar a produção de exoenzimas (proteinase e fosfolipase) em amostras de C. albicans, antes e após contato com o extrato etanólico de própolis verde.
¾ Utilizando a técnica de morfotipagem, comparar as características fenotípicas (franjas) de amostras de C. albicans, antes e após contato com o extrato etanólico de própolis verde.
¾ Avaliar a sensibilidade de amostras de C. albicans da mucosa bucal de pacientes HIV positivos, tratados com inibidores de protease às drogas antifúngicas: anfotericina B, fluconazol, fluorocitosina, itraconazol, cetoconazol e voriconazol.
¾ Avaliar a sensibilidade de amostras de C. albicans da mucosa bucal de pacientes HIV positivos, tratados com inibidores de protease ao extrato etanólico de própolis verde e às drogas antifúngicas, anfotericina B, fluconazol, fluorocitosina, itraconazol, cetoconazol e voriconazol.
3.1 Leveduras
Amostra de C. albicans (ICB 12A) e C. dubliniensis (ATCC 777) foram obtidas da Micoteca do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, as quais tem mostrado resultados reprodutíveis nos testes de laboratório. São mantidas liofilizadas em freezer a - 80°C e em óleo mineral (meio ágar Sabouraud-glicose).
3.2 Candida albicans
Neste estudo foram selecionadas 60 amostras de C. albicans; sendo 55 amostras isoladas da mucosa bucal de pacientes portadores do vírus HIV tratados com inibidores de protease e procedentes da Casa da AIDS em São Paulo e 5 amostras de pacientes com sorologia desconhecida para o HIV em tratamento periodontal, procedentes de uma clínica odontológica na Região de Campinas, SP. Todas mantidas em ágar Sabouraud-glicose (DIFCO) em estufa a 37ºC.
3.3 Identificação das leveduras
As leveduras foram reidentificadas utilizando-se as provas de
pesquisa de tubo germinativo (teste de Reynolds e Braude, 1956), cultivo em lâmina, testes para assimilação de fontes de carbono e nitrogênio e teste de fermentação de açúcares descritos em Kreger-van Rij (1984) e Kurtzman & Fell (1998) de acordo com protocolo da Seção de Micologia do Departamento de Microbiologia do ICB-USP (anexo 2).
3.3.1 Pesquisa de tubos germinativos (Teste de Reynolds-Braude, 1956).
Culturas de leveduras com 24 horas de crescimento em ágar Sabouraud dextrose (Difco) - acrescido de 200µg/mL cloranfenicol, foram semeadas em tubos de ensaio contendo 1mL de soro fetal bovino (Gibco) e incubadas a 37ºC por até 3 horas. A formação de tubo germinativo foi observada a cada hora por até 3 horas no microscópio ótico.
3.3.2 Microcultivo em lâmina (Kreger-Van Rij, 1984)
Meio de cultura ágar “Corn-meal” acrescido de tween 80
Ágar “ Corn-meal” (Difco) 17,0g
Tween 80 (BBL) 2,8 g
Água destilada 1000 mL
O meio foi esterilizado em autoclave a 120°C por 15 minutos. E no momento do uso, alíquotas de 3 mL foram distribuídas em lâminas de microscopia. As leveduras cultivadas anteriormente em ágar Sabouraud-dextrose (Difco) por 24 a 48 horas foram semeadas em estrias nesta lâmina, e recoberta com lamínula estéril. Essa preparação foi colocada em câmara úmida por até 5 dias, mantida a 25°C, para verificação da produção de filamentação e de clamidoconídios, sendo as leituras realizadas diariamente.
3.3.3 Teste para fermentação de açúcares (Zimograma) Kreger-Van Rij, (1984).
Meio Básico
Extrato de levedura (Difco) 5,0 g
Peptona (Difco) 7,5 g
O meio foi esterilizado em autoclave a 120°C por 15 minutos e distribuído em tubos de ensaio em alíquotas de 6 mL contendo tubos de Durhan invertidos.
Açúcares empregados a 2%: dextrose, maltose, sacarose e lactose.
Cada açúcar foi distribuído em tubos de ensaio contendo tubos de Durhan invertidos e o meio básico. Em seguida foram inoculados com 0,1mL da suspensão da levedura, com turvação correspondente à escala 3 de MacFarland e incubados a 37º C por 72 hs.
3.3.4 Teste para assimilação de carbono e de nitrogênio (Kreger-Van Rij, 1984).
Meio para a prova de assimilação de carbono (Meio C)
Sulfato de amônio (Merck) 5,0g
Fosfato de potássio monobásico (Merck) 1,0 g
Sulfato de Magnésio 7 H2O (Merck) 0,5 g
Ágar (Difco) 20,0 g
Água destilada 1000 mL
Meio para a prova de assimilação de Nitrogênio (Meio N)
Dextrose (Synth) 20,0 g
Fosfato de potássio monobásico (Merck) 1,0 g
Sulfato de Magnésio 7 H2O (Merck) 0,5 g
Ágar (Difco) 20,0 g
Os meios foram esterilizados a 120°C por 15 minutos e distribuídos com assepsia em tubos de ensaio estéreis.
Açúcares empregados (Difco) a 2%: dextrose, maltose, galactose,
sacarose, rafinose, celobiose, eritritol, manitol, ribitol, ramnose, melibiose, trealose, dulcitol e inositol.
Fontes de nitrogênio: peptona e nitrato de potássio.
Para a realização dos testes de assimilação de carbono ou de nitrogênio foi preparado 2 mL de suspensão de levedura, com turvação correspondente à escala 3 de MacFarland, vertidas em placas de Petri e em seguida adicionados 20 mL de meio básico (Meio N ou C), fundido e resfriado a 50°C. Após solidificação do meio básico colocou-se em pontos eqüidistantes do meio C, a fonte de carbono, e do meio N, as fontes de nitrogênio, incubando-se a 25°C por 96 horas. A assimilação foi verificada pela formação de halos opacos ao redor da fonte.
3.4 Pesquisa de Candida dubliniensis
3.4.1 Meio cromogênico CHROMágar Candida®, (Probac do Brasil®
São Paulo).
Para a detecção presuntiva de C. dubliniensis foram utilizadas placas
com meio cromogênico — CHROMágar Candida® (Probac do Brasil®). Cada
amostra de levedura mantida em meio Sabouraud a 37ºC, foi semeada em pontos distantes no meio cromogênico e após 48 horas de incubação a 37ºC, foi possível a identificação presuntiva de C. dubliniensis, conforme
Quadro 1. O crescimento foi comparado com cepas padrão de C.
dubliniensis (ATCC 777) e C. albicans (ICB 12A).
Quadro 1: Coloração apresentada por diferentes espécies de leveduras do gênero Candida semeadas em meio cromogênico CHROMágar® Candida.
3.4.2 Termotolerância (Sullivan e Coleman 1998)
As leveduras foram semeadas, em duplicata, em tubos de ensaio contendo o meio Ágar Sabouraud-Dextrose acrescido de cloranfenicol; incubadas a 37ºC e 42ºC nos períodos de 48 e 72 horas.O crescimento foi comparado com cepas padrão de Candida dubliniensis (ATCC 777) e
Candida albicans (ICB 12A). A tabela 2 mostra o crescimento a 42°C de C. albicans e C. dubliniensis.
Quadro 2: Perfil de crescimento de C. albicans e C. dubliniensis a 37ºC e 42°C.
Levedura Temperatura 37ºC 42°C
Candida albicans Crescimento Crescimento
Candida dubliniensis Crescimento Ausência de crescimento Levedura Coloração típica da colônia
Candida albicans Verde clara
Candida dubliniensis Verde escura
Candida tropicalis Azul-acinzentado
Candida krusei Rosa
3.5 Produção de Exoenzimas
3.5.1 Proteinase (Ruchel et al, 1982)
Meio Base
Ágar 18,0 g
Água destilada 900,0 mL
Este meio foi autoclavado a 120°C por 15 mim .
Meio de albumina
Yeast carbon base 11,7 g
Albumina bovina fração V 2,0 g
Protovit 2,5 g
Ägua destilada 1000mL
Este meio foi esterilizado por filtração de membranas de Milipore de 0,22µm. O meio básico esterilizado foi resfriado a 50°C, adicionando-se o meio de albumina e em seguida a mistura foi distribuída em placas de Petri, em volume de 20mL. Após a solidificação da mistura foram semeados quatro isolados de leveduras por placa com alça de platina. As placas foram incubadas a 37°C por quatro dias. A presença de enzima foi detectada pela formação de halo opaco de precipitação ao redor da colônia de levedura. A atividade enzimática foi medida de acordo com a técnica de Price et al, (1982), através da razão entre o diâmetro da colônia (dc) e o diâmetro da colônia mais a zona de precipitação (dcp). Os resultados de Pz foram considerados da seguinte forma:
Índice 1 - Pz =1,0 = Ausência de atividade enzimática Índice 2 - 1,0 > Pz ≥ 0,64 = Atividade enzimática positiva Índice 3 - Pz < 0,64 = Atividade fortemente positiva
3.5.2. Fosfolipase (Price et al, 1982)
Meio emulsão do ovo
Gema de ovo 80,0 g
Solução fisiológica 80,0 mL
Os ovos foram deixados em álcool a 70% durante uma hora para serem desinfetados. Em seguida as gemas foram separadas e colocadas em um recipiente estéril contendo pérolas de vidros, pesadas e adicionadas a solução salina a 0,9%, agitando-se em vortex. Meio de base Peptona 10,0 g Glicose 20,0 g Cloreto de sódio 57,3 g Cloreto de cálcio 0,55 g Ágar 20,0 g Água destilada 1000mL
O meio foi autoclavado a 120°C por 15mim. Ao ágar resfriado a 50°C foi adicionada uma emulsão de ovo. Volume de 20mL foi distribuído em placas de Petri e em cada uma delas foram semeados 4 isolados de Candida albicans. Estas placas foram incubadas a 37°C por 4 dias. A leitura deste teste foi realizada da mesma forma que para a proteínase, conforme descrito no item anterior.
3.6 Morfotipagem (Phongpaichit et al, 1987 e Hunter at al, 1989).
Ágar extrato de malte
Ágar extrato de malte 60,0 g
Ágar 20,0g
Água destilada 1000mL
O meio foi esterilizado a 120ºC por 20 minutos e distribuído em placas de Petri (20 mL em cada placa). Suspensões de leveduras de
C. albicans com 48 horas de cultivo em ágar Sabouraud dextrose a 25
0C, foram transferidas para tubos com salina, com turvação
correspondente ao tubo no 3 da escala de McFarland, utilizadas como inóculo. Com o auxílio de “swabs” estéreis, as suspensões de Candida
albicans foram inoculadas (3 a 4 amostras diferentes de leveduras por
placa) na superfície do ágar extrato de malte, e, em seguida, incubadas a 25 oC por 10 dias. Os resultados foram avaliados segundo os aspectos macromorfológicos da franja e superfície das colônias de tal modo que resulte em um biótipo composto por quatro dígitos, de acordo com o modelo de tipificação de Hunter et al (1989).
Quadro 3: Modelo de tipificação de morfotipos de C. albicans.
Fonte: Hunter et al, (1989).
Ordem dos dígitos Valor
1º Franja – distribuição * Ausente 0
Descontínua (>20% da margem) 1 Descontínua (21 a 50% da margem) 2 Descontínua (51 a 90% da margem) 3 Contínua, somente na periferia ou fios conspícuos em leques
5
Contínuas com filamentos paralelos 7
2º Franja – comprimento* Ausente 0
Igual ou menor do que 2mm 2
De 3 a 5 mm 3
Igual ou maior do que 6 mm 5
3º Franja - Textura Ausente 0
Muito grosseira 1
Grosseira 2
Intermediária 3
Fina 4
4º Superfície – Topografia Lisa 0
Nodular 1
Escavada 2
Crateriforme 4 Crateriforme com dobras e pregas 5
Dobras ou pegras 6
3.7 Sensibilidade às toxinas killer (Polonelli et al., 1983)
Ágar Sabourand modificado
Glicose (Synthy)...20,0 g Peptona (Difco)...10,0 g Azul de metileno (Merck)... 30,0 mg Ágar (Difco)... 20,0 g
Ácido cítrico (Merck)...19,2 g Fosfato de potássio dibásico (Reagen)...34,8 g Água destilada...1000mL
Os isolados de C. albicans a serem estudados e as linhagens de toxinas “killer” foram cultivadas em ágar Sabouraud - dextrose modificado, mas sem adição de azul de metileno e incubados à 25ºC por 48 horas. As leveduras foram suspensas em 1 mL de água destilada estéril, obtendo-se turvação correspondente a escala 0,5 de McFarland e misturadas em placas de Petri com 20 mL de ágar Sabouraud modificado contendo azul de metileno. Após solidificação da mistura, foram semeadas as cepas padrão com alça de platina na superfície do meio.
Quadro 4. Amostras padrões “killer” fornecidas pela Universidade Parma (ItáIia).
cepas padrão coleção original
denominação do Profº Polonelli
Hansenula sp Stumm-1034 K1
Pichia sp Stumm-1035 K2
Hansenula anomala Um-Milano K3
Hansenula anomala CBS-5759 K4
Hansenula anomala Aheam-UN866 K5
Hansenula californica Aheam-WC40 K6 Hansenula canadensis Aheam-WC41 K7
Hansenula dimennae Aheam-C44 K8
Hansenula mrakii K9
A leitura foi realizada 72 horas após incubação à 25ºC. Foram considerados sensíveis (+), os cultivos que apresentaram o halo incolor e/ou zona de inibição com colônias azuis ao redor das cepas padrão, e como resistentes, os cultivos que apresentaram crescimento ao redor dessa cepa.
Os resultados de sensibilidade às toxinas “killer” foram designados pelo esquema proposto por Polonelli et al., (1983), composto por 3 dígitos, sendo que cada um representa combinação dos resultados obtidos pelo conjunto de 3 cepas padrão. O quadro abaixo representa o esquema da codificação do sistema “killer”.
Quadro 5: Codificação dos isolados de C. albicans segundo Polonelli et al,
(1983).
* Exemplo: código 511, marcado para exemplifica
Atividade do 1º triplet Atividade do 2º triplet Atividade do 3º triplet
k1 K2 k3 código k4 k5 k6 código k7 k8 k9 código
+ + + 1 + + + 1* + + + 1* + + - 2 + + - 2 + + - 2 + - + 3 + - + 3 + - + 3 - + + 4 - + + 4 - + + 4 + - - 5* + - - 5 + - - 5 - + - 6 - + - 6 - + - 6 - - + 7 - - + 7 - - + 7 - - - 8 - - - 8 - - - 8
3.8 Teste de sensibilidade aos antifúngicos
3.8.1 Método de Eloff (1998), modificado por Polachini (2004)
Para pesquisa da sensibilidade ao extrato etanólico de própolis verde.
Concentração do extrato etanólico de própolis verde
Foi utilizado o extrato etanólico de própolis verde na concentração de 20%, fornecido pela empresa Apis Flora. Empresa do ramo farmacêutico, localizada na cidade de Ribeirão Preto-S.P, com certificação de qualidade ISO 9002, Immetro e RVA (The Dutch Council Acreditation).
Preparação da suspensão de C. albicans para os ensaios de atividade anti-Candida.
Amostras de C. albicans foram cultivadas em ágar
Sabouraud-glicose (DIFCO), a 37° C. A suspensão foi preparada a partir de uma cultura de 24 horas, em salina, com turbidez equivalente à escala 0,5 de Mc Farland, concentração equivalente a 1-5 x 106 UFC/mL (Pfaller et al, 1988). A 1 mL desta suspensão foi acrescentada 9 mL do meio de cultivo RPMI-1640 (Gibco BRL,Grand Island, NY,USA – anexo III) ajustando-se a suspensão final para 0,5-2,5 x 105 UFC /mL.
Ensaio in vitro da atividade anti-Candida (Eloff, 1998).
Para os ensaios da atividade anti C. albicans foi utilizada a metodologia de Eloff (1998), modificada por Polachini (2004). Estes foram realizados em placas de microdiluição, de fundo chato, com 96
poços e capacidade de 300 µL. Em cada poço foi colocado 100 µL do meio RPMI–1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), com exceção na linha A (controle das amostras), que recebeu 150 µL. Na linha A, foram acrescentados 50 µL do extrato de própolis verde a ser testado. Na linha B, 100 µL do mesmo extrato foi homogeneizado e diluído em série na base 2 iniciando-se com 200mg/mL de própolis até a linha H, de modo a obter uma concentração decrescente dos extratos (Srivastaka, 1959). Na seqüência foram adicionados (com exceção da linha A), 100 µL da suspensão da levedura a ser testada. Também foram utilizados poços para os controles (meio RPMI, etanol a 56ºGL, extrato etanólico de própolis verde com a suspensão de leveduras e Miconazol mais a suspensão de leveduras) As placas foram seladas e incubadas a 37 °C por 24 horas.
Controles
Foram utilizados os seguintes controles:
1. controle negativo: extrato etanólico de própolis verde a 20% 2. controle negativo: meio RPMI puro
3.controle negativo: miconazol (20mg/mL) mais a suspensão de
leveduras.
4. controle positivo: meio RPMI mais a suspensão de leveduras. 5. controle positivo: etanol a 56ºGL mais a suspensão de leveduras.
Leitura dos testes de sensibilidade
Neste estudo não se utilizou o evidenciador de crescimento, cloreto de trifeniltetrazóliom, conforme preconizado por Eloff (1998), pelo fato dos extratos serem naturalmente coloridos e poderem neste
caso interferir na leitura. O crescimento fúngico foi observado macroscopicamente, por meio de turvação e /ou formação de residuos.
A avaliação do crescimento de C. albicans foi realizada 24 horas após a incubação. A concentração inibitória mínima (CIM) foi confirmada em cultura no meio de ágar Sabouraud-glicose (DIFCO). O CIM foi considerado a menor concentração do produto opoterápico que impediu o crescimento visível de C. albicans.
Também pode se expressar em termos de concentração fungicida mínima, considerada como a menor concentração da droga capaz de matar o fungo após 24 horas (Cury,1998).
Os resultados de concentrações inibitórias mínimas (CIM) obtidos foram analisados segundo:
Variação dos valores de CIM
¾ CIM-50 que representa a concentração da droga inibitória mínima de crescimento. Espera-se inibição de 50% das amostras a serem testadas.
¾ CIM-90 que representa a concentração da droga inibitória mínima de crescimento. Espera-se inibição de 90% das amostras a serem testadas.
Teste da atividade fungicida do extrato etanólico de própolis verde
A avaliação da atividade fungicida do extrato etanólico de própolis verde foi realizada em ágar Sabouraud-glicose (DIFCO). Foram coletados 5 µL de amostras de cada diluição realizada em placa para semeá-los em placas de ágar Sabouraud-glicose (DIFCO), mantendo-as a 37ºC por 24 horas. Após este período, foram observados o crescimento e a ausência de crescimento de cada colônia, o que permitiu confirmar a ação fungicida do extrato etanólico da própolis verde.
3.8.2 MétodoE-Test® – Kit Comercial (AB-Biodisk, Solna, Suécia)
Para pesquisar a sensibilidade aos antifúngicos sintéticos utlizamos
fitas E-Test® com as seguintes drogas anfotericina B, fluconazol,
flurociotosina, itraconazol, cetoconazol e voriconazol.
Meios de cultivo
O meio RPMI–ágar (20,8g de RPMI-ágar-1640 (Gibco) e 1000 mL de água deionizada) foi ajustada para pH 7,0 com tampão fosfato para os testes com derivados azólicos e com MOPS para anfotericina B. Após esterilização por filtração, o meio foi distribuído em tubos, em volume de 25 mL.
Ágar dextrose
Ágar bacteriológico (Difco)...15g Glicose (Synth)...20g Água deionizada...500 mL
Este meio foi esterilizado em autoclave a 120ºC durante 15 minutos e guardado em volume de 25 mL a 4ºC até o momento do uso.
Fitas E-Test®
As fitas foram adquiridas pela AB BIODISK, cada qual contendo gradiente de concentrações correspondendo a 0,016 a 256 µg/mL para fluconazol e de 0,002 a 32 µg/mL para cetoconazol, itraconazol e anfotericina B, sendo este gradiente identificado no verso da tira. As tiras de E-Test® foram armazenadas em freezer -20ºC até serem utilizadas.
Preparo do inóculo
As leveduras isoladas foram cultivadas em ágar Sabouraud dextrose (Difco) por 24 horas a 35ºC e subcultivadas por duas vezes para assegurar sua pureza e viabilidade. A suspensão foi preparada em 5 mL de água deionizada esterilizada e a densidade celular foi ajustada em um espectofotômetro para uma transmitância de 85% em comprimento de onda de 530 nm.
Determinação da concentração inibitória mínima
Os frascos contendo 25 mL de ágar dextrose foram fundidos, resfriados a 50ºC e adicionados de 25 mL do meio de ágar RPMI-1640. A mistura homogeneizada contendo 50 mL, foi vertida em placa de Petri esterilizada (15 mm×15 mm), e após solidificação do meio as placas foram estocadas a 4ºC. Antes da inoculação as placas de ágar RPMI-1640 e as fitas de Etest foram mantidas por 30 minutos a temperatura ambiente. Um volume de 0,6 mL, referente a cada inóculo foi distribuído homogeneamente com o auxílio de “swab” sobre a superfície do ágar e as placas deixadas a temperatura ambiente por 15 minutos para completa absorção da suspensão pelo ágar. Decorrido este tempo, as fitas de E-Test®foram cuidadosamente colocadas sobre a superfície do ágar. As placas foram mantidas a 35ºC durante 24 horas.
Controles
Para este teste foi utilizado como controle de sensibilidade
Leitura e interpretação do teste
Depois da incubação, foram realizadas as leituras da CIM, em 24 horas, através do ponto de intersecção entre a fita e a zona do crescimento da levedura foi inibida. A interpretação dos resultados foi baseada nos valores de CIM preconizados pelo NCCLS (documento M27-A2).
Tabela 1. Interpretação dos valores de concetração inibitória mínima (CIM) dos antifúngicos de acordo com o documento M27-A2 (NCCLS, 2002).
Concentração inibitória Mínima(µg/mL)
Antifúngico Sensível Intermediário (I) ou Resistente (S) Sensível dose-dependente (R) (SDD)
Fluconazol ≤ 8.0 16-32 ≥ 64,0
Itraconazol ≤ 0,125 0,25-0,5 ≥ 1
5 Fluorocitosina ≤ 4 8-16 ≥ 32
* não existem valores definidos para Anfotericina B pelo NCCLS, apenas sugere CIMs acima de 1µg/mL.
* Para Voriconazol foram classificados CIMs ≤1µg/mL como (S) e acima de 4µg/mL (R) de acordo com (CLSI 2006-M27-S2 suplemento).
* Para Cetoconazol o NCCLS não especifica valores de (S) e (R) apenas indica que os CIMs variam de 0,03-16µg/mL.
3.9 Produção de exoenzimas e morfotipagem
Nas doses subinibitórias das concentração do extrato etanólico de própolis verde foi avaliada a atividade na produção de proteinase e fosfolipase e morfotipos utilizando os procedimentos do item 3.5 e 3.6. Foi utilizado como controle às amostras de leveduras sem ação do extrato etanólico de própolis verde.
3.10. Considerações Éticas
Este trabalho segue as recomendações da Resolução MS 196/96 (anexo 1).
3.11 Controle de qualidade e biossegurança
Todas as condutas laboratoriais seguiram criteriosamente as normas de biossegurança (Zanon,1990; Oda, 1995; Oda &Ávila, 1998).
4.1 Candida albicans
Todas as 60 amostras selecionadas foram reidentificadas como C.
albicans, sendo 55 amostras isoladas da mucosa bucal de pacientes
portadores do vírus HIV tratados com inibidores de protease e 5 isolados de pacientes com sorologia desconhecida para o HIV em tratamento periodontal:
Grupo 1: 55 amostras isoladas da mucosa bucal de pacientes portadores
do vírus HIV tratados com inibidores de protease
Grupo 2: 5 amostras de pacientes com sorologia desconhecida para o
HIV em tratamento periodontal.
4.2Pesquisa de C. dubliniensis
Todas as amostras foram submetidas ao teste de diferenciação de C.
dubliniensis em CHROMágar® Candida. Das 60 amostras estudadas 86,7%
(52/60) apresentaram coloração verde clara e 13,3% (8/60) apresentaram coloração verde escuro. Todos as 60 amostras cresceram a temperatura de 42ºC (Tabela II).
Presuntivamente para considerarmos uma levedura como C.
dubliniensis, esta deve apresentar coloração verde escuro no CHROMágar®
Candida e ser sensível à 42ºC. Nenhuma amostra foi presuntivamente
considerada como C. dubliniensis apesar de 13.3% (8/60) apresentarem
Tabela II: Distribuição das amostras de C. albicans e C. dubliniensis dos grupos 1 e 2 de acordo com a coloração apresentada no meio CHROMágar® Candida, e termotolerância a 42º C.
Coloração das colônias em meio CHROMágarTM Termotolerância a 42ºC Grupos* C. albicans (verde claro) Isolados presuntivos de C. dubliniensis (verde escuro) Isolados presuntivos de C. dubliniensis (Sensível) C. albicans (Resistente) 1 85,5% (47/55) 14,5% (8/55) 0 100% (55/55) 2 100% (5/5) 0 0 100% (5/5) Total 86,7% (52/60) 13,3% (8/60) 0 100% (60/60)
*Grupo 1: amostras isoladas da mucosa bucal de pacientes portadores do vírus HIV tratados com inibidores de protease
Grupo 2: amostras de pacientes com sorologia desconhecida para o HIV em tratamento periodontal.
4.2 Produção de exoenzima
4.2.1 Proteinase
Das 60 amostras de C. albicans, 52% (31/60), não produziram proteinase e 48% (29/60) produziram esta enzima.
No grupo 1, 51% (28/55) amostras de C. albicans não apresentaram atividade enzimática (índice 1) e 49% (27/55) produziram proteinase (índice 2), neste grupo a ausência e produção de proteinase foram equilibradas. No grupo 2, 60% (3/5) não apresentaram atividade enzimática enquanto 40% (2/5) produziram a enzima (gráfico 1 e tabelas III e IV).
Na tabela V, observa se entre os grupos 1 e 2 pequena diferença entre as médias de produção de proteinase.
Tabela V- média, desvio padrão, mediana, máxima e mínima atividade enzimática de proteinase por amostras de C. albicans dos grupos 1 e 2.
Características
entre Grupos* Grupo 1 (n=55) Grupo 2 (n=5)
µ ± dp 0,90** ± 0,12 0,94± 0,09
Mediana 0,80 1,00
Max. – Min. 0,65 -1,00 0,80 – 1,00
Total: 60 amostras
*Grupo 1: amostras isoladas da mucosa bucal de pacientes portadores do vírus HIV tratados com inibidores de protease
Grupo 2: amostras de pacientes com sorologia desconhecida para o HIV em tratamento periodontal. **Atividade enzimática :
índice 1 - Pz =1,0 = Ausência de atividade enzimática índice 2 - 1,0 < Pz ≥ 0,64 = Atividade enzimática positiva ìndice 3 - Pz < 0,64 = Atividade fortemente positiva.
60% 51% 49% 40% 0% 20% 40% 60% 80% 100% grupo 1 grupo 2 Índice 1 Índice 2
Gráfico 1- Freqüência de índices de produção de proteinase (índices 1 e 2) por amostras de C. albicans dos grupos 1 e 2.
4.2.2 Fosfolipase
Na produção de fosfolipase, observamos entre as 60 amostras de C.
albicans, que 33.3% (20/60) produziram fosfolipases, 63,3% (38/60) não
produziram essa enzima e 3,3% (2/60) apresentaram atividade enzimática fortemente positiva.
Para cada grupo estudado tem-se respectivamente: no grupo 1, 32,7% (18/55) dos isolados de C. albicans produziram fosfolipase (índice 2), enquanto 63,6% (35/55) não produziram (índice 1). No grupo 2, a produção e ausência de ativiade enzimática foram 40% (2/5) produziram fosfolipase enquanto 60% (3/5) não produziram a enzima. (gráfico 2). Destaque para alta produção de fosfolipase observada em 3,6% (2/55) amostras do grupo 1 (gráfico 2 e tabelas III e IV).
Na Tabela VI, não se observam diferenças quanto a média e desvio padrão, da produção de fosfolipase. Diferenças foram observadas quanto a mediana, e máxima entre os grupos 1 e 2, provavelmente devido ás diferenças no número de amostras de cada grupo.
Tabela VI - média, desvio padrão, mediana, máxima e mínima atividade enzimática de fosfolipase por amostras de C. albicans isoladas dos grupos 1 e 2.
Características
entre Grupos* Grupo 1 (n=55) Grupo 2 (n=5)
µ ± dp 0,93** ± 0,11 0,92± 0,11
Mediana 1,00 0,87
Max. – Min. 0,42 -1,00 0,75 – 1,00
Total: 60 amostras
*Grupo 1: amostras isoladas da mucosa bucal de pacientes portadores do vírus HIV tratados com inibidores de protease
Grupo 2: amostras de pacientes com sorologia desconhecida para o HIV em tratamento periodontal. ** Atividade enzimática :
Índice 1 - Pz =1,0 = Ausência de atividade enzimática Índice 2 - 1,0 < Pz ≥ 0,64 = Atividade enzimática positiva Índice 3 - Pz < 0,64 = Atividade fortemente positiva
60% 63,6% 40% 33% 3,6% 0% 20% 40% 60% 80% 100% grupo 1 grupo 2 índice 1 índice 2 índice 3
Gráfico 2- Freqüência de índices de produção de fosfolipase (índices 1, 2 e 3) por amostras de C. albicans dos grupos 1 e 2.
*Grupo 1 amostras isoladas da mucosa bucal de pacientes portadores do vírus HIV tratados com inibidores de protease
Grupo 2: amostras de pacientes com sorologia desconhecida para o HIV em tratamento periodontal. ** Atividade enzimática :
Índice 1 - Pz =1,0 = Ausência de atividade enzimática Índice 2 - 1,0 < Pz ≥ 0,64 = Atividade enzimática positiva Índice 3 - Pz < 0,64 = Atividade fortemente positiva.
4. 3 Morfotipagem
A morfotipagem nos permitiu identificar 27 morfotipos diferentes de colônias de C. albicans, entre eles o morfotipo 7341 com 18,3% (11/60) amostras. Esse morfotipo caracteriza franjas contínuas ao redor da colônia, com filamentos paralelos medindo de 3 a 5mm, de textura fina e superfície da colônia nodular.
O morfotipo 7241 em 15% (9/60) das amostras caracteriza franjas contínuas ao redor da colônia com filamentos paralelos; igual ou menor que 2mm, de textura fina e superfície da colônia nodular. Dez por cento (10%) ou (6/60) amostras, apresentaram o morfotipo 7331 que caracteriza franjas continuas com filamentos paralelos de 3 a 5mm, de textura intermediária e superfície da colônia nodular.
O morfotipo 7346 esteve presente em 8,3% (5/60) das amostras que apresentam como característica filamentos paralelos de 3 a 5mm, textura fina e superfície da colônia com dobras e pregas.
Em 5% (3/60) amostras apresentaram o morfotipo 7238 que caracteriza franjas contínuas com filamentos paralelos; igual ou menor que 2mm, de textura intermediária e superfície da colônia com pêlos.
Os morfotipos 7336, 5321, 7338 e 7231 aparecem cada um em 3,33% (2/60) cada, das amostras e caracterizam respectivamente franja contínua com filamentos paralelos, de 3 a 5mm, textura intermediária, com dobras e pregas na superfície da colônia;franja contínua somente na periferia ou fios conspícuos em leque, de 3 a 5mm, de textura grosseira e superfície da colônia nodular; franja contínua com filamentos paralelos, 3 a 5mm, de textura intermediária, com pêlos na superfície da colônia e franja contínua, com filamentos paralelos; igual ou menor que 2mm, de textura intermediária e superfície da colônia nodular.
Os morfotipos 5346, 5236, 2236, 7246, 5231, 7228, 5335, 7531, 7328, 7248, 7546, 7236, 5338, 1046, 1245, 7348, 5222 e 7240 aparecem apenas em uma amostra cada e representam um total de 30% (18/60).
Observando os morfotipos em relação aos 2 grupos de amostras de
C. albicans estudadas, tem-se no grupo 1, (26/55) diferentes morfotipos,
sendo que o morfotipo 7341, presente em 18,2% (10/55) das amostras, o morfotipo 7241 em 16,4% (9/55) amostras, o morfotipo 7331 em 11% (6/55) amostras, o morfotipo 7238 em 5,5% (3/55) amostras, os morfotipos 7231 e 7338 em 7,3% (2/55) cada das amostras e os demais morfotipos 5346, 5231, 5236, 7228, 5335, 7531, 7328, 7248, 7546, 1245, 2236, 7348, 7236, 5338, 7336, 1046, 7246 e 5222 presentes em um isolado cada, representando um total de 32,7% (18/55) das amostras (tabela VII).
Tabela VII. Morfotipos de amostras de C. albicans isoladas da mucosa bucal de pacientes HIV positivo (grupo 1), de acordo com códigos propostos por Hunter et al (1989).
AMOSTRAS MORFOTIPAGEM AMOSTRAS MORFOTIPAGEM
1 5 3 4 6 29 7 3 4 8 2 7 3 4 1 30 7 2 3 1 3 7 3 4 6 31 7 3 4 1 4 5 3 2 1 32 7 3 4 6 5 5 2 3 1 33 7 2 3 8 6 5 2 3 6 34 7 3 4 6 7 7 2 4 1 35 7 2 3 6 8 7 2 2 8 36 5 3 3 8 9 5 3 3 5 37 7 2 4 1 10 7 2 4 1 38 7 2 3 8 11 7 3 3 1 39 7 2 4 1 12 7 5 3 1 40 7 3 3 1 13 7 3 2 8 41 7 3 3 1 14 7 3 4 1 42 7 3 4 1 15 7 2 3 8 43 7 3 4 1 16 7 2 4 1 44 7 3 3 6 17 7 2 4 1 45 1 0 4 6 18 7 2 4 8 46 7 2 4 6 19 7 3 4 1 47 7 3 3 1 20 7 5 4 6 48 7 3 4 1 21 7 3 4 6 49 7 3 3 1 22 7 3 4 1 50 7 3 3 8 23 7 3 4 1 51 7 2 4 1 24 7 3 4 1 52 5 2 2 2 25 1 2 4 5 53 7 2 4 1 26 7 2 3 1 54 7 3 3 8 27 7 3 3 1 55 7 2 4 1 28 2 2 3 6 Total 55
No Grupo 2, observamos 5 morfotipos diferentes entre os isolados de
C. albicans, sendo os dígitos (7 e 3) também o mais observado neste grupo
e os morfotipos 7341, 7346, 5321, e 7336 já citado acima e o morfotipo 7240 que só apareceu neste grupo (tabela VIII).
Tabela VIII. Morfotipos de amostras de C. albicans isoladas da mucosa bucal de pacientes com sorologia desconhecida para o HIV (grupo 2), de acordo com códigos propostos por Hunter et al (1989).
4.4 Toxinas “killer”
O perfil de sensibilidade às toxinas “killer” apresentado pelas 60 amostras de C. albicans, segundo o painel de Polonelli et al, (1983), foi representado por 20 biotipos diferentes. Dentre estes, o biotipo 811 apareceu em (15/60) amostras e representa resistência destas amostras às toxinas K1, K2 e K3.
O biotipo 888 apareceu em (8/60) das amostras e significa resistência todas às 9 toxinas. O biotipo 511 apareceu em (8/60) amostras e representa resistência às toxinas K2 e K3.
O biotipo 813 apareceu em (4/60) das amostras e significa resistência às toxinas K1, K2, K3 e K9. Os biótipos 887, 812 e 711 aparecem cada um em (3/60) amostras e significam respectivamente, sensibilidade apenas à toxina K9, resistência às toxinas K1 e K2e resistência às toxinas K1 e K2.
AMOSTRAS MORFOTIPAGEM 56 7 2 4 0 57 7 3 4 1 58 7 3 4 6 59 5 3 2 1 60 7 3 3 6 Total 5
