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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
LUDYMILA FURTADO CANTANHÊDE
DESENVOLVIMENTO DE UMA NOVA TÉCNICA DE
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN SUÍNO
FORTALEZA 2013
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LUDYMILA FURTADO CANTANHÊDE
DESENVOLVIMENTO DE UMA NOVA TÉCNICA DE
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN SUÍNO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Toniolli
FORTALEZA 2013
3 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho Bibliotecário (a) Leila Cavalcante Sátiro – CRB-3 / 544
C229d Cantanhêde,Ludymila Furtado.
Desenvolvimento de uma nova técnica de criopreservação de sêmen suíno/Ludymila Furtado Cantanhêde.— 2013.
CD-ROM 81f. : il. (algumas color.) ; 4 ¾ pol.
“CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slin (19 x 14 cm x 7 mm)”.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária, Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2013.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientação: Prof. Dr. Ricardo Toniolli.
1. Conservação. 2. Diluente. 3. Crioprotetor. I. Título.
CDD: 633
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Ao meu amado e precioso pai, Nonato Cantanhêde, que sempre será fonte de todas as minhas iniciativas. Por ter “sonhado o meu sonho” e ter feito deste o seu. Por desempenhar tão bem o papel de pai e mãe, por ter aceitado a minha partida, por ter ficado sozinho, pelo esforço, atenção e cuidados dedicados a mim mesmo estando fisicamente distante. Obrigada por diminuir a minha solidão com suas ligações diárias e por ter se tornado muito mais que um pai, meu melhor amigo. Dedico aos nossos sonhos essa vitória!
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AGRADECIMENTOS
A Deus, por mais uma vez, ter me colocado em uma prova e me mostrado que eu nada seria sem Seu sustento. Por sempre estar comigo, por me dar forças para enfrentar minhas limitações, meus medos e por iluminar o meu caminho para o término de mais uma etapa da minha vida.
À Universidade Estadual do Ceará, ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias e a todos os professores e funcionários que a compõem pela atenção e contribuição ao longo deste estudo e por permitir a aquisição de novos conhecimentos.
A CAPES e à FUNCAP pelo apoio financeiro.
À minha maravilhosa família, por sempre vibrar com cada pequena conquista minha e por sempre fazer jus ao significado de ser uma família de verdade, mesmo quando estamos distantes fisicamente. Vocês são a maior riqueza da minha vida, vocês são o meu apoio!
À minha tia Acássia e aos meus primos, Antônio Júnior Furtado e Isaías Furtado, que o mestrado concedeu-me a oportunidade de conhecer, obrigada pela acolhida e ajuda quando mais precisei.
Ao meu anjo, Maria de Fátima Diniz Furtado Cantanhêde (in memorian), por ter sido a melhor mãe do mundo e por ser o meu exemplo para que eu nunca canse da busca de ser um ser humano melhor. Por nunca ter me abandonado e por estar sempre dentro de mim.
Ao meu querido orientador e amigo, Dr. Ricardo Toniolli, pela atenção e paciência mesmo antes de me conhecer. Por ter me recebido com carinho, pelo apoio constante durante toda esta etapa da minha vida, pelos conselhos, conversas e conhecimentos oferecidos. Por ter acreditado no meu potencial e por ser compreensivo. Obrigada por todo o tempo a mim dedicado!
À Dra. Maria Gorete e ao Prof. Dr. Raimundo, pela gentileza, apoio e amizade durante os momentos críticos de avaliação.
A todo o meu querido Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen, obrigada por me receberem de braços abertos e por compartilharem seus conhecimentos comigo. À Rocilda, Jocemar, Daianny, Tatyane, Aline, Jonseli, Lina, Ivan, Thallys, Iury, Eduardo, Renata e Cristina, eu não poderia ter escolhido um laboratório melhor. Obrigada por fazerem esta caminhada menos solitária!
À toda minha turma de mestrado, obrigada pelas alegrias e angústias compartilhadas. Em especial à minha cabrita amiga, Talita Câmara, pela verdadeira amizade que construímos. Nunca esquecerei o seu ombro amigo e lhe carregarei para sempre no coração.
7 Aos maninhos que ganhei aqui no Ceará, Maurício Neto e Rosivaldo Júnior, obrigada pela amizade, pelas ajudas prestadas e pelo companheirismo.
Aos meus amigos de uma vida inteira, obrigada por entenderem a minha ausência e pela felicidade sempre demonstrada a cada regresso. Em especial à Adryelle Moreira e Clara Varão por compartilharem comigo a saudade que vem com a distância física e por sempre me fazerem sentir que sou importante em suas vidas. Obrigada pelas conversas sérias e bestas, engraçadas e tristes, mesmo por telefone, muitas salvavam o meu dia!
Enfim, a todos que contribuíram direta ou indiretamente para este trabalho. O meu eterno muito obrigada!
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“posso, tudo posso, Naquele que me fortalece!”
9 RESUMO
Vários são os fatores que podem influenciar a qualidade espermática, tanto durante o processo de criopreservação, como também nos resultados após descongelação. Dentre eles: o crioprotetor, a concentração ideal desse crioprotetor, o tipo de diluente e a curva de abaixamento de temperatura. Tendo em vista a importância desses fatores para o sucesso da criopreservação, este trabalho teve como objetivo testar uma nova técnica de criopreservação de sêmen de varrões. Foram coletadas 48 amostras de ejaculados de sete varrões do Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen da FAVET/UECE. As amostras foram analisadas quanto a: motilidade, vigor, vitalidade, teste de resistência osmótica e morfologia. Este trabalho foi dividido em duas etapas, nas quais: Etapa I-Foram analisados os açúcares glicose e frutose e os diluentes BTS (Beltsville Thawing Solution) e LPD (leite em pó desnatado), originando quatro tratamentos: BTS G; BTS F; LPD G; LPD F. Em todos os tratamentos foram utilizados os crioprotetores gema de ovo e glicerol a 3% para criopreservação do sêmen. Na etapa II: Foram analisadas diferentes concentrações de glicerol (0,5%; 1%; 3%, 5% e 7%) e comparadas a um crioprotetor alternativo, o Dimetilsulfóxido (DMSO) a 3%. Nesta etapa também foi utilizada a gema de ovo, como crioprotetor extracelular, e BTS adicionado de frutose. Todas as amostras foram mantidas em botijão de nitrogênio líquido a -196 °C entre 48 e 96 horas e descongeladas para análise final. Para análise estatística de motilidade e vigor foi utilizado o teste não paramétrico de Mann Whitney, os demais parâmetros, pós-descongelação, foram analisados através do teste T-Student (p<0,05). Durante a curva de resfriamento não foi observada diferença estatística de vigor e motilidade entre BTS e LPD. Após descongelação observou-se queda de vigor e motilidade em ambos os diluentes, com o BTS apresentando melhores resultados de vigor (2,1±0,55) e de motilidade (38±21,8) do que o LPD. A diferença encontrada entre os açúcares não foi estatisticamente significativa (p>0,05). A vitalidade espermática foi significativamente maior no tratamento com LPD G (71,7%), apresentando também diferença estatística na porcentagem de acrossoma intacto, com melhor resultado no tratamento BTS G. Na análise de vigor e motilidade dos crioprotetores, pós-descongelação, as maiores médias foram observadas nas concentrações de glicerol. A maior média de porcentagem de células móveis, porcentagem de células vivas e acrossoma intacto foram observadas na concentração de 3% de glicerol. Estes resultados sugerem que o BTS e o glicerol ainda são as melhores opções de diluentes para criopreservação de espermatozoides da espécie suína.
10 ABSTRACT
There are several factors that can influence sperm quality both during the cryopreservation process , as well as the results after thawing . Among them: the cryoprotectant , cryoprotectant that the optimal concentration , the type of solvent and the curve of decreasing temperature . Given the importance of these factors for the success of cryopreservation , this study aimed to test a new technique for cryopreservation of semen from boars . We collected 48 samples from seven boars ejaculated Laboratory of Swine Breeding and Technology of Semen Favet / UECE . The samples were analyzed for : motility , vigor , vitality , endurance test osmotic and morphology . This study was divided into two stages , in which : Step I- We analyzed the sugars glucose and fructose and thinner BTS ( Beltsville Thawing Solution ) and SMP ( skimmed milk powder ) , yielding four treatments : G BTS , BTS F ; LPD G; LPD F. All treatments were used cryoprotectants egg yolk and glycerol 3 % for sperm cryopreservation . In Step II : We analyzed different concentrations of glycerol ( 0.5 %, 1% , 3% , 5% and 7%) and compared to an alternative cryoprotectants , dimethylsulfoxide ( DMSO) at 3%. This step was also used egg yolk as extracellular cryoprotectant and BTS added fructose. All samples were kept in liquid nitrogen cylinder at -196 ° C between 48 and 96 hours and thawed for final analysis. For statistical analysis of motility and force was used the nonparametric Mann- Whitney test , the other parameters , after thawing , were analyzed using the chi- square test (p < 0,05 ) . During the cooling curve was not a statistical difference of force and motility between BTS and LPD . After thawing we observed a decrease of vigor and motility in both thinner, with better results showing the BTS force of ( 2.1 ± 0.55) and motility ( 21.8 ± 38 ) than the SMP . The difference between the sugars was not statistically significant ( p > .05 ) . The vitality of sperm was significantly higher in the treatment with LPD G ( 71.7 % ) , also presenting statistical difference in the percentage of acrosome intact with better treatment outcomes BTS G. In the analysis of vigor and motility of cryoprotectants after thawing , the highest means were observed at concentrations of glycerol . The highest average percentage of motile cells , percentage of live cells and intact acrosome were observed at the concentration of 3 % glycerol . There was no statistical difference between treatments when the osmotic resistance . These results suggest that the BTS and glycerol are still the best options diluents for cryopreservation of sperm swine.
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LISTA DE TABELAS
Capítulo 2
Tabela 1 Analysis of spermatic vigour in boar semen at different points, during the cooling curve, using extenders and sugars.
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Tabela 2 Analysis of boar sperm motility at different points during the cooling curve, using different extenders and sugars.
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Tabela 3 Analysis of spermatic vigour and percentage of motile cells to swine, using different exetnders and sugars after thawing.
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Tabela 4 Analysis of boar semen osmotic resistance, using different extenders and sugars after thawing.
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Tabela 5
Tabela 6
Analysis of the percentage of live swine sperm (vitality), using different extenders and sugars after thawing.
Analysis of the percentage of swine sperm with acrosome integrity, using different extenders and sugars after thawing.
56
56
Capítulo 3
Tabela 1 Análise de vigor espermático do sêmen suíno após a adição das diferentes concentrações de glicerol e DMSO a 3% durante a curva de resfriamento.
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Tabela 2 Análise da motilidade espermática do sêmen suíno após a adição das diferentes concentrações de glicerol e DMSO a 3% durante a curva de resfriamento
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Tabela 3 Vigor e motilidade espermática do espermatozoide suíno após descongelação em diferentes concentrações de glicerol e DMSO a 3%.
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Tabela 4 Resistência osmótica do espermatozoide suíno após descongelação, em diferentes concentrações de glicerol e DMSO a 3%.
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Tabela 5
Tabela 6
Porcentagem de espermatozoides vivos (vitalidade) no ejaculado do varrão após descongelação, em diferentes concentrações de glicerol e DMSO a 3%.
Porcentagem de espermatozoides com acrossoma íntegro no ejaculado do varrão após descongelação, em diferentes concentrações de glicerol e DMSO a 3%.
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12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACP - Água de coco em pó
BTS - Beltsville Thawing Solution DMSO - Dimetilsulfóxido
EG - Etilenoglicol
FAVET - Faculdade de Veterinária IA - Inseminação Artificial
LDL - Lipoproteína de baixa densidade LPD - Leite em pó desnatado
13 SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 16
2.1. CARACTERÍSTICAS DO EJACULADO SUÍNO 16
2.2. CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN SUÍNO 17
2.3. CRIOPROTETORES 19 2.3.1 CRIOPROTETORES INTRACELULARES 20 I. GLIEROL II. DIMETILSULFÓXIDO 20 20 2.3.2 CRIOPROTETORES EXTRACELULARES I. GEMA DE OVO II. AÇÚCARES
III. LEITE EM PÓ DESNATADO
21 21 21 22 2.4. LIMITAÇÕES NA CONSERVAÇÃO 22 3 JUSTIFICATIVA 24 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA 26 5 OBJETIVOS 28 5.1. Objetivo Geral 28 5.2. Objetivos Específicos 28
6 CAPITULO 1 - Aspectos Gerais da Criopreservação de Sêmen Suíno. 28 7 CAPITULO 2 - Avaliação de diferentes açúcares e diluentes durante a
curva de resfriamento na criopreservação do sêmen suíno.
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8 CAPITULO 3 - Avaliação de diferentes concentrações de glicerol e do DMSO a 3% visando a criopreservação do sêmen do varrão
14
11 CONCLUSÕES 75
12 PERSPECTIVAS 76
15 1 INTRODUÇÃO
O resfriamento e a congelação são as duas formas de conservação seminal amplamente difundida em diferentes espécies domésticas. A redução da temperatura tem sido um método utilizado para prolongar a viabilidade dos espermatozoides, devido a seu efeito de desaceleração dos processos metabólicos celulares (ALMOND et al., 1994). Isso ocorre em virtude da característica da membrana espermática, que quanto menor for a temperatura do meio, menor será a mobilidade de seus lipídios na dupla membrana, os quais se solidificam, impedindo seu movimento e também o movimento das proteínas, mantendo desta forma a estrutura da membrana celular (SÁNCHEZ, 2003).
Os diluentes proporcionam um meio favorável para sobrevivência do espermatozoide in vitro, facilita a sua divisão em doses inseminantes por aumentar o volume total do ejaculado (DERIVAUX, 1980). A composição dos diluentes é um dos fatores que afeta a proporção de espermatozoides vivos após a descongelação (WATSON, 1995). A maioria dos diluentes apresenta a gema de ovo como substância básica, uma vez que a fosfatidilcolina e lipoproteínas da gema, bem como a caseína nos diluentes a base de leite, protegem as células espermáticas contra o choque térmico (MIES FILHO et al., 1982; DAS, 1995) e evitam a perda de fosfolipídios da membrana.
Processos como refrigeração e congelação são essenciais para os programas de inseminação artificial, porém, apesar dos seus benefícios para a conservação seminal, eles podem também provocar danos irreversíveis à célula espermática em virtude do choque térmico, que leva a uma redução da motilidade, resultando em inchaço na membrana acrossomal, aumento da permeabilidade da membrana plasmática (FERNÁNDEZ-SANTOS et al., 2006), rompimento da integridade destas membranas, interferindo na capacidade fecundante e na sua sobrevivência.
O DMSO tem sido utilizado com sucesso para criopreservação de gametas e embriões. Por ser um álcool dipolar, o DMSO é capaz de interagir ou combinar-se com ácidos nucléicos, carboidratos, lipídeos, proteínas e muitas drogas sem alterar de forma irreversível a configuração das moléculas (SOJKA et al., 1990). Essa substância é considerada relativamente atóxica (WUSTEMAN et al., 2008) e é encontrada em diversas espécies vegetais e animais, incluindo o homem. Uma elevada capacidade higroscópica decorre da sua intensa afinidade pelo hidrogênio e extrema capacidade de penetração e difusão com capacidade citoprotetora (KOTERBA et al. 1990) superior ao do glicerol (BRAYTON, 1986). Visto que o sucesso da criopreservação depende de diferentes parâmetros, que variam de espécie para espécie, e que o processo ideal de criopreservação não foi totalmente
16 elucidado por pesquisadores da área, apesar de ser bastante utilizado para conservação de tecidos e células, este trabalho teve como objetivo testar uma nova técnica de criopreservação de sêmen suíno a partir da análise de uma nova curva de resfriamento e comparação de crioprotetores e diluentes alternativos.
17 2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Características do ejaculado suíno
As características do ejaculado suíno podem variar com a idade do animal, estação do ano, intervalo entre coletas, estado nutricional e raça. Porém de uma maneira geral o suíno, dentre os mamíferos, é o que produz maior volume de sêmen por ejaculado, com valores médios em animais adultos que oscilam entre 150 a 500 mL. O ejaculado do suíno é constituído de três porções: a primeira é a chamada fase pobre de espermatozoides, a fase intermediária é a mais rica em células espermáticas e a última porção forma o tampão vaginal e é constituída de material gelatinoso, que para a inseminação se separa do restante da amostra por filtrado, com gaze ou algodão (CAVALCANTI, 1998).
O processamento de sêmen tem por finalidade principal produzir doses inseminantes de alta qualidade. Para tanto, se faz necessário o maior cuidado possível para a obtenção de bons resultados em um programa de inseminação artificial (CORRÊA et al.,2001). Mostrando a importância do controle e da avaliação seminal.
A avaliação do ejaculado é dividida em duas etapas: macroscópicas (análise de volume, aspecto, cor e odor) e microscópicas (concentração, vigor, motilidade e morfologia). A análise da concentração é definida como sendo o número de células espermáticas presentes em um ejaculado, por sua unidade de volume. Esta medida pode ser determinada através do espectofotômetro, espermiodensímetro ou câmara de Neubauer. O método mais preciso é o que utiliza o espectofotômetro, um aparelho que mede a concentração através da densidade ótica, permitindo uma análise prática, rápida e precisa (CORRÊA et al., 2001).
Vigor e motilidade são análises subjetivas. O vigor representa a força do movimento do espermatozoide, podendo ser classificado com uma nota de 0 a 5, onde 0 representa a ausência de movimento progressivo com deslocamento de cauda lateral fraco e inexpressivo, e 5 representa um movimento vigoroso e veloz dos espermatozoides. Apesar desta análise subjetiva, seguindo-se as características pré-determinadas pela tabela de análise de vigor espermático (TONIOLLI, 1996), os resultados obtidos para esta característica, por pessoas bem treinadas, são bastante homogêneos. Já a motilidade consiste em estimar o percentual de células vivas com movimentos progressivos (BORTOLOZZO et al., 2005).
A análise morfológica permite a determinação da frequência de cada uma das anormalidades espermáticas e do percentual total de alterações na amostra de sêmen. Um alto percentual de defeitos pode representar alterações durante a espermatogênese ou no trânsito e maturação no epidídimo, ou mesmo, manipulação inadequada do ejaculado (RODRIGUEZ-MARTÍNEZ e ERIKSSON, 2000).
18 O sêmen suíno, dentre outras espécies de mamíferos é o mais sensível às flutuações de temperatura (CORRÊA et al., 2001), sendo sua faixa ideal para a manutenção das doses inseminantes situada entre 15 e 18 °C. Temperaturas abaixo de 15 °C são causa de choque térmico, que resulta em perda irreversível da motilidade espermática e lesões nas estruturas celulares. Temperaturas acima dos 18 °C, por outro lado, são negativas por não reduzirem de forma eficiente o metabolismo dos espermatozoides e facilitam a multiplicação de bactérias, que agem negativamente sobre a qualidade do sêmen (SCHEID, 2003). As pesquisas nos últimos anos têm como objetivo melhorar os resultados da utilização de amostras de sêmen congelado em comparação as de sêmen fresco. Estudos relacionados com avaliação e efeito e de diferentes crioprotetores, diluentes, curvas e abaixamento de temperatura de congelação e descongelação, diferentes tipos de envases tem como objetivo amenizar as crioinjúrias sofridas pelo espermatozoide (ANTUNES, 2007).
2.2 Criopreservação do sêmen suíno
A palavra “criobiologia” tem origem do termo grego “kruos”, frio, e quer dizer “estudo da vida a temperaturas extremamente baixas”. A técnica de criopreservação é uma maneira de solucionar problemas relacionados com o armazenamento de espermatozoides, ovócitos, embriões e tecidos, a qual visa diminuir o metabolismo celular isto é, as células são mantidas em estado de quiescência, sendo assim possível a sua conservação por tempo indeterminado. Por volta de 1776, Lazzaro Spallanzani descreveu os efeitos da criopreservação no sêmen humano. Em 1866 Mantegazza observou motilidade dos espermatozoides após a congelação e no século XX grupos de pesquisadores testaram diferentes meios de congelação como o álcool resfriado por gelo seco (-79 °C), nitrogênio líquido (-196 °C) e hélio (-296 °C). Porém o primeiro sucesso desta técnica foi mencionado por WHITTINGHAM (1971), utilizando embriões de camundongos.
A criobiologia passou a ter papel essencial no desenvolvimento das técnicas de reprodução assistida, pois exerce papel essencial na manutenção da fertilidade (HOVATTA, 2003). A criopreservação do sêmen está sendo cada vez mais utilizada e tem como principal objetivo manter a integridade estrutural e a viabilidade celular após submeter essas células a baixas temperaturas por tempo indeterminado. Esse processo produz danos celulares conhecidos como crioinjúrias, que afetam a qualidade estrutural e funcional dos espermatozoides (OETTLE et al., 1992). A criopreservação age diretamente na membrana plasmática do espermatozoide, nas interações entre seus componentes pela influência das diversas etapas de resfriamento, congelação e descongelação (PARKS e GRAHAM, 1992). A origem dessas alterações ainda permanecem incertas, mas algumas evidências sugerem que
19 ocorre alterações no reordenamento lipídico desde o resfriamento até o reaquecimento, desorganizando as associações lipoproteicas, as quais são indispensáveis para o seu funcionamento.
O processamento de congelação de sêmen suíno é um método demorado e complexo, sendo em média necessárias de 7 – 9 horas, desde a coleta até o final da congelação. As amostras são submetidas a várias etapas e curvas de resfriamento objetivando a manutenção da viabilidade espermática pós-descongelação (BORTOLOZZO et al., 2005). São variados os protocolos utilizados para criopreservação de sêmen suíno, variando desde o crioprotetor utilizado, velocidade no abaixamento de temperatura, tipos de embalagens utilizadas para conservação e métodos de descongelação.
Durante a criopreservação a primeira mudança nos espermatozoides é a transição de fase dos lipídios presente na sua membrana decorrente da diminuição da temperatura, passando de uma fase fluida para uma fase em gel, afetando sua movimentação lateral e formando um arranjo hexagonal regular. Por sua variada composição, cada grupo de fosfolipídios possui uma faixa de temperatura de transição restrita, podendo ocorrer uma separação lateral e a formação de locais ocupados somente por lipídios. As proteínas ficam excluídas desses agrupamentos hexagonais gelificados, permanecendo em locais onde os lipídios ainda permanecem em seu estado fluido (WATSON, 1996). Desta forma, a função das proteínas de membranas necessárias para o transporte de íons e integridade da membrana pode ser afetada (WOELDERS, 1997). Na espécie suína, do total de lipídios, 75% são fosfolipídios e 24% colesterol no qual o pico de temperatura de transição é de 24°C. Watson (1996) relata que a mudança de fase dos lipídios está concentrada entre 15°C e 5°C isto é, neste intervalo os espermatozoides suínos estão sendo submetidos aos efeitos da transição de fase lipídica, mas esta transição ainda pode estar incompleta a 0°C.
Em todas as técnicas e métodos de criopreservação ocorre a adição de substâncias chamadas de crioprotetores, que possui como principal objetivo proteger células ou tecidos de danos ocasionados pela baixa temperatura a que são submetidos. Os diluentes de congelação, além dos crioprotetores internos e externos como: glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), gema de ovo e leite desnatado, precisam de substancias que sejam fonte de energia para os espermatozoides, como: lactose, frutose ou glicose e antibióticos para prevenir a proliferação de bactérias. Os crioprotetores são divididos em duas categorias: intracelulares ou permeáveis (como dimetilsulfóxido, propanodiol, glicerol, etilenoglicol, etc) e extracelulares ou não permeáveis (como trealose, glicose, sacarose, polivinilpirrolidona). Ambos são utilizados
20 separadamente ou associados para diferentes tipos de diluentes de congelação em protocolos de criopreservação (IM et al., 1997; YOUNG et al., 1998).
2.3 Crioprotetores
O princípio do processo de criopreservação reside na remoção do máximo possível de água das células antes de se proceder a sua congelação. Se esta desidratação não ocorrer, cristais de gelo se formam lesando severamente a estrutura intracelular. No entanto, a remoção demasiada de água das células também pode ser deletéria. Estudiosos relatam que o mecanismo de ação dos crioprotetores baseia-se também na promoção do abaixamento do ponto de solidificação da solução na congelação. Isto é benéfico por várias razões, mas principalmente porque promove um maior tempo para a desidratação da célula, diminuindo a formação de cristais de gelo intracelulares (SEIDEL Jr., 1986). Uma segunda função dos crioprotetores é a sua interação com a membrana celular, exercendo ação estabilizadora durante as mudanças de um estado relativamente líquido para um estado sólido e, talvez até mais importante, na volta para o estado líquido durante a descongelação.
Por outro lado, os agentes crioprotetores podem ter uma ação direta na produção de crioinjúrias, como, por exemplo, alterando a polaridade do meio extracelular lesando as membranas. A origem dessas alterações ainda permanece incerta, mas algumas evidências sugerem que ocorram alterações no reordenamento lipídico desde o resfriamento até o reaquecimento, desorganizando as associações lipoproteicas, as quais são indispensáveis para o seu funcionamento (ARNOLD et al., 1983).
Os crioprotetores, em geral, são classificados como intracelulares ou permeáveis, e extracelulares ou impermeáveis (MARIA, 2005). O crioprotetor intracelular age retirando a água da célula por diferença osmótica e diminuindo sua temperatura de congelação e a formação de cristais de gelo. Os crioprotetores extracelulares são substâncias de alto peso molecular e por isso não atravessam a membrana plasmática (AMANN e PICKETT, 1987). Atuam sobre a superfície da célula, estabilizando sua membrana, reparando e diminuindo os possíveis danos causados pelo processo de congelação (CAROLSFELD e HARVEY, 1999).
Os crioprotetores internos combinados aos externos promovem uma proteção mais completa ao espermatozoide, atuando ao nível da membrana celular (LEUNG e JAMIESON, 1991). Estes agentes químicos devem possuir como propriedades uma baixa toxicidade para as células e alta solubilidade em água. A escolha do diluente deve considerar as condições específicas em que a inseminação artificial ocorre particularmente o tempo que decorre entre o processamento e a utilização das doses, ou seja, se o sêmen se destina ao uso imediato ou armazenamento durante alguns dias (BORTOLOZZO et al., 2005).
21 2.3.1 Crioprotetores Intracelulares
I. Glicerol
O glicerol é um crioprotetor permeável na membrana plasmática que visa a proteção do espermatozoide à formação de cristais de gelo durante o processo de congelação, reduzindo os dados da membrana celular (PURDY, 2005). Foi o primeiro crioprotetor a ser utilizado para congelação de espermatozoides (POLGE et al., 1949). Porém, as concentrações de glicerol utilizadas podem interferir na capacidade de fecundação destas células, principalmente por apresentar certo grau de toxicidade às células (CURRY, 2000; PURDY, 2005). Outras substâncias como: etilenoglicol, açúcares, polímeros, proteínas anticongelantes, têm sido testadas, mas apresentam resultados inferiores em comparação aos obtidos com o glicerol (SALAMON e MAXWELL, 2000).
O glicerol é quimicamente considerado um álcool que contém três grupos funcionais de hidroxilas que podem aceitar um hidrogênio da molécula de água em seis sítios diferentes. Seu efeito crioprotetor esta relacionado com a capacidade de se ligar com a água e à baixas dissociações em sais, diminuindo a osmolaridade do meio de congelação. Além de ter facilidade em atravessar a membrana celular, mantendo a osmolaridade interna e externa. A concentração de glicerol utilizada para criopreservação se espermatozoides é limitada devida a sua toxicidade, a qual depende da taxa de resfriamento, velocidade de congelação, composição do diluente e método de adição do glicerol (FAHY, 1986; WOELDERS 1997). Já foi relatada a sua relação com alterações nos microtúbulos do citoesqueleto e a indução acelerada da reação acrossomal (SLAVIK, 1987).
II. Dimetilsulfóxido
Como crioprotetor, o DMSO foi utilizado pela primeira vez na criopreservação de sêmen de touro e hemácias humanas e bovinas, por Lovelock e Bishop (1959). Desde então, a ação crioprotetora dessa substância quimica vem se destacando e tem sido largamente utilizada na criopreservação de folículos ovarianos (DEMEESTERE et al., 2006; KIM et al., 2010), oócitos (MAHMOUD et al., 2010; TAN et al., 2009) e embriões (KUMAR et al., 2010).
A elevada capacidade higroscópica decorre da sua intensa afinidade pelo hidrogênio, formando pontes mais fortes que às formadas entre moléculas de água e extrema capacidade de penetração e difusão. Possui capacidade citoprotetora (KOTERBA et al. 1990) considerada superior ao do glicerol para preservar eritrócitos e espermatozoides (BRAYTON, 1986).
Por ser um álcool dipolar, ele é capaz de interagir ou combinar-se com ácidos nucléicos, carboidratos, lipídeos, proteínas e muitas drogas sem alterar de forma irreversível a
22 configuração das moléculas (SOJKA et al., 1990). Essa substância é considerada relativamente atóxica (WUSTEMAN et al., 2008) e interage com as membranas, atravessando-as rapidamente por meio de difusão.
2.3.2 Crioprotetores Extracelulares I. Gema de ovo
A gema de ovo está presente em quase todos os diluentes devido a fosfatidilcolina e lipoproteínas da gema que protegem as células espermáticas contra o choque térmico (MIES FILHO et al., 1982; DAS, 1995). Autores relatam que a LDL, lipoproteína de baixa densidade presente na gema de ovo, pode-se agregar à membrana plasmática durante o processo de congelação, evitando a perda de fosfolipídios da membrana e diminuindo crioinjúrias (GRAHAM e FOOTE, 1987).
A gema do ovo apresenta a seguinte composição: 49,0% de umidade e 51,0% de sólidos totais, sendo que, destes, 30,9% são lipídeos totais (BARRETO et al., 2006). Todavia, a gema de ovo não é inteiramente definida, sendo um composto biológico que contém proteínas, vitaminas, fosfolipídeos, glicose, componentes bactericidas e antioxidantes.
Nos últimos anos, têm sido frequentes os relatos contra o uso da gema de ovo por sua composição ser bastante variável, uma vez que é um composto de origem animal e que pode ter diferentes composições de acordo com as práticas de manejo alimentar utilizadas na criação das aves. Além disso, a gema de ovo aumenta o risco de contaminação microbiana e, assim, permite subsequente produção de endotoxina, o que pode reduzir a capacidade de fertilização dos espermatozoides (AIRES et al., 2003).
Algumas substâncias vêm sendo estudadas para substituição deste crioprotetor não penetrante, como lecitinas de soja (HIWASA et al., 2009), tendo como objetivo preparar meios quimicamente definidos, o que não seria possível com o uso da gema de ovo (HOUPALATHI et al., 2007).
II. Açúcares
O açúcar tem como principal função ser a fonte de energia dos espermatozoides através de glicólises e fosforilação oxidativa nas mitocôndrias para apoiar a motilidade e movimentação espermática. Além disso, os componentes hidroxilas das moléculas de açúcar tem a característica de proteger as células de crioinjúrias causadas pela conservação à baixas temperaturas pelo fato de capturarem sais como o NaCl em um meio viscoso ou mesmo em uma fase cristalizada (PONGLOWHAPAN et al, 2004).
Dentre os açúcares utilizados nos meios diluidores para criopreservação de sêmen estão os açúcares simples, como a frutose e a glicose, e os açúcares não penetrantes na célula,
23 como lactose, rafinose e trealose (SQUIRES et al., 2004). Muitos pesquisadores têm estudado o efeito de diferentes açúcares na composição do diluidor de sêmen e seus efeitos sobre a qualidade dos espermatozoides criopreservados. A utilização do açúcar na composição do crioprotetor deve levar em consideração sua propriedade química e funcionalidade. O açúcar mantém a pressão osmótica dos diluentes por desidratação celular, diminuindo a formação de cristais de gelo dentro dos espermatozoides (PURDY, 2006), interage com membranas de fosfolipídios ocorrendo estabilização de membranas (AISEN et al, 2002;. HINCHA et al., 2006), reorganizando-a e, a partir disto, aumentando a capacidade de sobrevivência dos espermatozoides submetidos ao processo de criopreservação (BUCAK et al., 2007).
III. Leite em pó desnatado (LPD)
O leite desnatado é um excelente meio conservador para os espermatozoides, quando estocados a baixas temperaturas (4ºC). É de uso prático e efetivo na proteção do espermatozoide durante o período de conservação, inclusive preservando melhor a motilidade espermática do que outros diluentes, tanto na sua forma líquida, quanto pós-descongelação (KULAKSIZ et al., 2012). Da mesma forma que a gema de ovo, as caseínas do leite diminuem as ligações das proteínas do plasma aos espermatozoides, reduzindo a perda de lipídios da membrana celular e aumentando a proteção espermática durante o processo de criopreservação (BERGERON et al., 2007).
Segundo Foote (1974) e Memon e Ott (1981), a presença das lipoproteínas e lecitinas do leite promovem a proteção da célula espermática contra o choque térmico, quando adicionadas ao sêmen antes do resfriamento. Inclusive, há relatos sobre o efeito crioprotetor do leite desnatado, também conferindo uma melhor proteção à célula espermática pós-descongelação (JULIANI e HENRY, 2008).
2.4 Limitações na Conservação
O uso de sêmen congelado, amplamente estendido em algumas espécies, é ainda limitada em suínos. Além disso, a redução na taxa de parto, redução de 10 a 20%, e tamanho da leitegada, 1 a 2 leitões por leitegada, é menor em comparação a amostras resfriadas (BORTOLOZZO et al., 2005). Tem sido sugerido que a diminuição na fertilidade está associada com alterações moleculares na membrana plasmática da cabeça do espermatozoide e produção de espécies reativas de oxigênio, que conduzem a instabilidade da membrana após o descongelamento (BREININGER et al., 2005). Também foi demonstrado que a criopreservação induz a desestabilização na estrutura da cromatina em espermatozoides suínos (FRASER e STRZEZEK, 2007), podendo favorecer a quebra do material genético.
24 O sêmen suíno é considerado um dos mais sensíveis a choques térmicos, mudanças bruscas de temperaturas, apresentando maior segregação de partículas durante o processo de congelação (DE LEEUW et al., 1990). Alguns autores explicam essa sensibilidade através da baixa relação colesterol/lipídeos do sêmen do varrão em comparação ao ejaculado de outros animais. A presença do colesterol é importante na membrana plasmática, pois interfere no comportamento dos lipídios durante as mudanças de fase (fluidez de membrana) (DE LEEUW et al., 1990). Além disso, Parks e Graham (1992) relataram alta proporção de proteínas/fosfolipídios na membrana do espermatozoide suíno, possuindo ponto de fusão relativamente alto.
Ao serem congelados os espermatozoides sofrem algumas mudanças fisicoquímicas devido às crioinjúrias a que são submetidos. Podem ocorrer modificações no citoesqueleto, alterações na arquitetura das mitocôndrias, quebra da assimetria da membrana, alterando a sua permeabilidade e condensação da cromatina (WATSON, 1995). Esses efeitos afetam a integridade funcional da célula espermática, isto é atrapalham o processo de fertilização (WATSON, 1996).
O sêmen suíno também está mais suscetível ao estresse osmótico, em comparação ao sêmen humano, por exemplo, devido às mudanças de volume durante o processo de congelação (WATSON, 1995). A curva de temperatura, tanto da congelação quanto da descongelação de sêmen suíno, também é essencial para preservar a integridade dessas células. Uma vez que, uma congelação muito rápida ou uma descongelação muito lenta, favorecem a formação de cristais de gelo intra e extracelular respectivamente.
Os atuais meios de conservação representam a soma de conhecimentos de diferentes grupos de pesquisa, que se aprofundaram nas necessidades das células espermáticas e nas suas condições de conservação por refrigeração (SÁNCHEZ, 2003). Apesar disso, ainda é desconhecido o diluente e a temperatura ideal capaz de oferecer maior longevidade aos espermatozoides suínos.
25 3 JUSTIFICATIVA
A estocagem de sêmen por um longo período permitindo o seu posterior uso representa uma importante ferramenta para criadores que desejam preservar o potencial genético de seus reprodutores. Além disso, a conservação do sêmen permite o transporte de material genético e a preservação de genes de alto valor comercial mesmo após a morte do animal. Para permitir uma sobrevivência prolongada in vitro da célula espermática, é necessário reduzir sua atividade metabólica através da adição de elementos químicos (CORRÊA et al., 2001).
A utilização de sêmen suíno congelado na inseminação artificial (IA) é restrito à formação de bancos de sêmen de raças com alto valor genético, ou que se encontram em extinção ou risco sanitário e exportação entre países. A utilização de uma técnica no setor comercial depende da otimização das condições de congelação bem como da técnica de IA. Um dos grandes desafios para a criobiologia reprodutiva é desenvolver um método eficiente de criopreservação de células e tecidos. Várias técnicas têm sido testadas com diferentes tipos e concentrações de crioprotetores, temperatura de exposição aos crioprotetores, curvas de resfriamento, estabilizadores do citoesqueleto, protocolos de descongelação e remoção dos crioprotetores (BORTOLOZZO et al., 2005).
Apesar de todos os efeitos benéficos dos crioprotetores, existem duas razões para justificar as falhas na ação dessas substâncias químicas: sua toxicidade limita a concentração em que este pode ser utilizado antes do resfriamento e, portanto, limita a eficácia da ação crioprotetora (FAHY, 1986). Muitos estudos foram realizados em busca de um crioprotetor ideal, mas, apesar do espermatozoide suíno ser mais sensível ao glicerol do que o espermatozoide bovino (FISER, 1991), ainda não se encontrou um crioprotetor que substitua o glicerol. Em geral são utilizadas baixas concentrações desta substância na criopreservação de sêmen suíno em comparação as demais espécies devido a seus efeitos tóxicos e prejudiciais às células espermáticas.
O crioprotetor ideal deve possuir um baixo peso molecular, boa solubilidade em água e mínima toxicidade aos espermatozoides. Assim, algumas substâncias classificadas como crioprotetores intracelulares têm sido utilizadas como uma alternativa para os diluidores de congelação de sêmen, como os crioagentes do grupo dos alcoóis – etanol, etilenoglicol, metanol, polietilenoglicol e propilenoglicol – e as amidas, incluindo a acetamida, formamida, lactamida e dimetilsulfóxido, além de outras (SNOECK, 2003).
As amidas, incluindo o DMSO, possuem várias vantagens crioprotetoras em comparação ao glicerol: como alta permeabilidade na membrana, reduzindo a possibilidade de
26 dano celular causado por estresse osmótico (BALL e VO, 2001); seu baixo peso molecular, propriedade esta que provavelmente permite a esses compostos ligar-se de maneira mais eficiente que o glicerol as moléculas de água (KAROW, 2001; BALL e VO, 2001).
Mesmo utilizando-se curvas de resfriamento e aquecimento ditas como ótimas, ainda não existem técnicas de criopreservação celular que permitam cem por cento de sobrevivência celular após os processos de congelação/descongelação. Dessa forma, faz-se necessário o desenvolvimento de técnicas e soluções que permitam a utilização do sêmen suíno congelado com melhores resultados de fertilidade. Estudos adicionais envolvendo crioprotetores, diferentes curvas de abaixamento de temperatura e diluentes alternativos são de extrema importância para a melhora do processo de criopreservação de sêmen suíno, principalmente se acompanhadas de vantagens econômicas que viabilizem seu emprego na cadeia produtiva suinícola.
27 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
A nova técnica será eficiente para criopreservação de sêmen suíno, mantendo a qualidade espermática após descongelação.
28 5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver uma nova técnica de congelação para sêmen suíno.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Testar uma nova curva de abaixamento de temperatura para crioproservação; b) Avaliar o leite em pó desnatado (LPD) como diluente alternativo;
c) Comparar dois açúcares, frutose e glicose, no diluente;
d) Testar diferentes concentrações de glicerol (0,5%; 1%; 3%; 5% e 7%) no diluente de congelação;
e) Avaliar o dimetilsulfóxido (DMSO) como crioprotetor alternativo; f) Comparar os crioprotetores permeáveis DMSO e Glicerol a 3%; g) Avaliar a qualidade e viabilidade espermática após descongelação.
29 6 CAPÍTULO 1
Aspectos gerais da criopreservação de sêmen suíno General aspects of boar semen cryopreservation
30 ASPECTOS GERAIS DA CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN SUÍNO
(General aspects of boar semen cryopreservation)
Ludymila Furtado CANTANHÊDE1, Daianny Barboza GUIMARÃES1, Tatyane Bandeira BARROS1, Aline Viana DIAS1, Ivan Bezerra QUEVEDO Filho2,
Lina Raquel Santos ARAÚJO2, Ricardo TONIOLLI3
1
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias – FAVET/UECE; 2Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen (LabSuis)/UECE; 3Orientador, LabSuis – FAVET/UECE, Av. Paranjana, 1700 – Campus Itaperi, Fortaleza-Ce, CEP: 60.740-000,
email: toniolli@roadnet.com.br
RESUMO
A utilização de sêmen congelado para inseminações artificiais já vem sendo estudada a mais de 30 anos e os avanços nesta área se devem principalmente às pesquisas dos diferentes fatores que influenciam a conservação do sêmen e fertilidade de um ejaculado. O protocolo ideal de criopreservação não foi totalmente elucidado por pesquisadores da área, apesar de ser bastante utilizado para conservação de tecidos e de células, como os espermatozoides. Isto se deve ao fato de que o sucesso da criopreservação depende de diferentes parâmetros, entre eles a utilização de crioprotetores bem como uma concentração adequada, o que varia de espécie para espécie. Vários estudos foram feitos para se obter uma melhor congelação de sêmen suíno, com o objetivo de diminuir os índices de crioinjúrias causados pelo abaixamento de temperatura. Apesar de ainda existirem muitos problemas no processo de criopreservação de sêmen do varrão, alguns autores relatam que, o uso do sêmen congelado, superará o do sêmen resfriado por ser um procedimento que permite preservar células por longos períodos de tempo. Este trabalho teve como objetivo relatar os principais problemas ligados à congelação de sêmene os avanços da técnica através de um levantamento geral acerca dos principais aspectos ligados à criopreservação com ênfase na espécie suína.
PALAVRAS-CHAVE: Conservação, crioprotetores, sêmen, varrão.
ABSTRACT
The use of frozen semen for artificial insemination has been studied for over 30 years and the advances in this area are mainly due to research the different factors that influence the semen retention and fertility of an ejaculate. The optimal protocol for cryopreservation has not been fully elucidated by researchers in the field, even though it is often used for preservation of tissues and cells such as sperm cells. This is due to the fact that the success of
31 cryopreservation depends on different parameters, among them the use of cryoprotectants as well as a suitable concentration, which differ between species. Several studies were made seeking a better freezing of boar semen, also, aiming to reduce the rates of freezing damages caused by the lowering of temperature. Although there are still many problems in the process of cryopreservation of boar semen, some authors report that the use of frozen semen, outrank the cooled semen, due to a procedure that preserves cells for long periods of time. This study aimed to report the main problems associated with freezing semen, and technique advances through a general survey about the main aspects of cryopreservation with emphasis on swine. KEY-WORDS: Conservation, cryoprotectant, sperm, boar.
INTRODUÇÃO
Para que seja possível uma boa conservação espermática durante períodos prolongados, é necessário que a integridade celular seja preservada, bem como se reduzir a atividade metabólica. Adicionalmente, uma curva ideal de abaixamento de temperatura e a diluição do sêmen em meios adequados são cuidados a serem tomados (Sánchez, 2003). O resfriamento e a congelação são duas formas de conservação seminal. Através da redução da temperatura prolonga-se a viabilidade dos espermatozoides, devido à desaceleração dos processos metabólicos celulares (Almond et al., 1994).
A utilização de sêmen congelado para inseminações artificiais (IA) já vem sendo estudada a mais de 30 anos, com os primeiros resultados em suínos nos anos 70. Os avanços nesta área se devem às pesquisas de diferentes fatores que influenciam na fertilidade como envase do sêmen, diferentes diluentes, curva de resfriamento, descongelação e diferentes crioprotetores (Edashige et al., 2007).
A criopreservação é definida como a manutenção de células em temperatura criogênica (-196 ºC), com a diminuição ou interrupção de reações químicas, processos biológicos e físicos, intra e extracelulares (Bakhach, 2009). Dentre seus benefícios encontra-se a conencontra-servação e utilização por longos períodos reduzindo riscos e custos com a aquisição e transportes de reprodutores, além da rápida difusão genética e formação de bancos de sêmen de alto valor genético. Diante da importância deste processo, o presente trabalho apresenta um levantamento geral acerca dos principais aspectos ligados à criopreservação de sêmen com ênfase na espécie suína.
DESENVOLVIMENTO
32 Uma maneira de solucionar problemas relacionados ao armazenamento de espermatozoides, ovócitos e embriões é a utilização de técnicas de criopreservação, que visam diminuir o metabolismo celular, sendo assim possível a sua conservação por tempo indeterminado. O primeiro sucesso desta técnica foi mencionado por Whittingham (1971), utilizando embriões de camundongos. Com o surgimento dos bancos de sêmen e o avanço de tecnologias na reprodução assistida, o processo de criopreservação tornou-se essencial. Por isso, um dos grandes desafios para a criobiologia é desenvolver um método eficiente de criopreservação de células e tecidos (Pyles, 2013).
Na criopreservação faz-se uma remoção de água das células antes de sua congelação. Se esta desidratação não ocorrer, cristais de gelo se formam lesando a estrutura intracelular. O mecanismo de ação dos crioprotetores baseia-se no abaixamento do ponto de solidificação da solução a ser congelada, permitindo um maior tempo para a desidratação da célula e diminuindo a formação de cristais de gelo intracelulares. Os crioprotetores interagem com a membrana celular, exercendo ação estabilizadora durante as mudanças de estado físico do meio de conservação (Seidel Jr., 1986).
Mesmo com curvas de resfriamento e aquecimento ditas ótimas, ainda não existem técnicas de criopreservação que permitam cem por cento de sobrevivência celular. Apesar de todos os efeitos benéficos dos crioprotetores, sua toxicidade limita a concentração utilizada e portanto limita sua eficácia de proteção (Fahy, 1986). Podem também ter uma ação direta na produção de crioinjúrias com origem ainda incertas, com algumas evidências de ocorrem alterações no reordenamento lipídico e desorganizando as associações lipoproteicas, indispensáveis para o seu bom funcionamento (Arnold et al., 1983).
2. CRIOPROTETORES
Os agentes crioprotetores são essenciais em praticamente todos os sistemas biológicos (Fahy, 1986) e visam aumentar a sobrevivência das células durante e após a criopreservação (Amann & Picket, 1987). Diversos estudos têm procurado encontrar um crioprotetor ideal, porém a concentração utilizada varia com a espécie animal e o grau de sensibilidade celular. O crioprotetor ideal deve possuir um baixo peso molecular, boa solubilidade em água e mínima toxicidade aos espermatozoides
Em todas as técnicas de congelação ocorre a adição de substâncias crioprotetoras, que protegem as células ou tecidos dos danos ocasionados pela baixa temperatura e que são classificadas em duas categorias: intracelulares ou permeáveis e extracelulares ou não permeáveis (Maria, 2005), utilizados juntos ou separados, em diferentes protocolos de criopreservação (Young et al., 1998).
33 Os crioprotetores intracelulares agem retirando a água da célula por diferença osmótica, diminuindo sua temperatura de congelação e a formação de cristais de gelo. Os extracelulares são substâncias de alto peso molecular por isso não atravessam a membrana plasmática. Atuam sobre a superfície da célula, estabilizando sua membrana, reparando e diminuindo os possíveis danos causados pelo processo de congelação (Carolsfeld & Harvey, 1999). A combinação dos dois permite uma proteção mais completa do espermatozoide (Leung & Jamieson, 1991).
2.1 CRIOPROTETORES INTRACELULARES 2.1.1 ETILENOGLICOL (EG)
Ele possui baixo peso molecular, o que permite uma rápida entrada e saída do meio intracelular durante o período de equilíbrio e rehidratação. O EG é menos tóxico do que outros crioprotetores (Cetin & Bastan, 2006), sendo utilizado em diversos protocolos para a criopreservação de ovócitos e embriões em várias espécies (Voelkel & Hu, 1992).
2.1.2 GLICEROL
O glicerol é um crioprotetor permeável à membrana e protege o espermatozoide da formação de cristais de gelo durante a congelação, reduzindo os dados da membrana celular (Purdy, 2005). Foi o primeiro crioprotetor a ser utilizado na congelação de espermatozoides (Polge et al., 1949). Porém, as concentrações utilizadas podem interferir na capacidade de fecundação, por apresentar certo grau de toxicidade (Purdy, 2005).
O glicerol tem a função de aumentar o volume de canais de solventes descongelados e diluir as concentrações de sais durante o resfriamento (Squires et al., 1999). É largamente utilizado para a congelação de sêmen caprino, cuja concentração usada em diferentes estudos varia de 3% a 9% (Leboeuf et al., 2000). Entretanto, sua presença está relacionada com a queda da fertilidade do sêmen congelado em eqüinos (Squires et al., 1999).
O glicerol é considerado um álcool com três grupos funcionais de hidroxilas que recebem um hidrogênio da molécula de água em seis sítios diferentes. Seu efeito crioprotetor está relacionado com a capacidade de se ligar com a água, diminuindo a osmolaridade do meio de congelação, tendo facilidade em atravessar a membrana celular e manter a osmolaridade interna e externa. A concentração utilizada é limitada devido sua toxicidade, que depende da taxa de resfriamento, da velocidade de congelação, da composição do diluente e do método de adição (Fahy, 1986; Woelders 1997). Promove alterações nos microtúbulos e a induz uma rápida reação acrossomal (Slavik, 1987).
34 Em 1867, o químico Alexander Saytzeff sintetizou o dimetilsulfóxido (DMSO), descrevendo sua notável capacidade solvente (Stone, 1993). Como crioprotetor, o DMSO foi utilizado pela primeira vez na criopreservação de sêmen de touro (Lovelock e Bishop, 1959). Desde então, esta ação vem se destacando e tem sido largamente utilizada na criopreservação de folículos ovarianos (Kim et al., 2010), oócitos (Mahmound et al., 2010) e embriões (Kumar et al., 2010).
Uma elevada capacidade higroscópica decorre da sua intensa afinidade pelo hidrogênio e extrema capacidade de penetração e difusão. Sua toxicidade é reconhecidamente baixa (Brayton, 1986: Stone, 1993) com capacidade citoprotetora (Koterba et al. 1990) superior ao do glicerol (Brayton, 1986).
As amidas, incluindo o DMSO, devido a seu baixo peso molecular (glicerol = 92g/mol; metilformamida = 59g/mol e dimetilformamida = 73g/mol), possuem alta permeabilidade na membrana, penetrando com maior rapidez e reduzindo a possibilidade de dano celular por estresse osmótico (Ball e Vo, 2001). Seu efeito crioprotetor pode ser atribuído a sua habilidade de permear a membrana da célula, permitindo uma mais eficiente ligação às moléculas de água (Ball e Vo, 2001; Karow, 2001).
O DMSO tem sido utilizado com sucesso na criopreservação de gametas e embriões por ser um álcool dipolar, sendo capaz de interagir ou combinar-se com ácidos nucléicos, carboidratos, lipídeos e proteínas sem alterar de forma irreversível a configuração das moléculas (Sojka et al., 1990). Essa substância é considerada relativamente atóxica (Wusteman et al., 2008). O DMSO atravessa rapidamente as membranas por difusão. Recentemente, estudos com injeção intraoocitária de RNA através do canal proteico aquaporina-3, em oócitos de rã, foi demonstrado pela primeira vez o transporte de DMSO por este canal, mesmo em condições de baixo gradiente de concentração (Yamaji et al., 2006). 2.2 CRIOPROTETORES EXTRACELULARES
2.2.1 GEMA DE OVO
A composição dos diluentes é um dos fatores que afeta a proporção de células vivas após a descongelação. A maioria possui a gema de ovo, uma vez que a fosfatidilcolina e a lipoproteínas da gema, bem como a caseína nos diluentes a base de leite, tem uma ação protetora sobre as células espermáticas contra o choque térmico. A LDL, uma lipoproteína de baixa densidade presente na gema de ovo, pode agregar-se à membrana plasmática durante o processo de congelação, evitando a perda de fosfolipídios da membrana e diminuindo as crioinjúrias (Das, 1995).
35 O uso da gema de ovo pode aumentar o risco de contaminação microbiana, o que pode reduzir a capacidade de fertilização dos espermatozoides (AIRES et al., 2003). Em algumas espécies, como carneiro (Waston & Martin, 1975), cabra (Aboagla & Terada, 2004) e búfalo (Kumar et al., 1993), pode reduzir a viabilidade e a integridade do acrossoma. Toniolli et al. (2009) compararam a ação crioprotetora da gema de ovo in natura e da em pó, sem resultados significativos nos parâmetros analisados, sendo que a melhor condição sanitária da gema de ovo em pó pode minimizar os efeitos deletérios da contaminação do diluente do sêmen.
A gema do ovo apresenta 49% de umidade e 51% de sólidos totais, sendo destes, 31% são lipídeos totais (Barreto et al., 2006), entretanto, ela não é definida como um composto biológico que contém proteínas, vitaminas, fosfolipídeos, glicose, componentes bactericidas e antioxidantes (Houpalathi et al., 2007). Outras substâncias veem sendo estudadas para substituição deste crioprotetor, como as lecitinas de soja (Hiwasa et al., 2009), com o objetivo de preparar meios quimicamente definidos (Houpalathi et al., 2007).
2.2.2 AÇÚCARES
Sua utilização como crioprotetor deve levar em consideração sua propriedade química e funcionalidade. O açúcar mantém a pressão osmótica dos diluentes por desidratação celular, diminuindo a formação de cristais de gelo intracelular (Purdy, 2006); interage com os fosfolipídios ocorrendo estabilização de membranas (Hincha et al., 2006), reorganiza e aumenta da capacidade de sobrevivência espermática (Bucak et al., 2007), sendo utilizado como fonte de energia através de glicólises e fosforilação oxidativa nas mitocôndrias visando a movimentação espermática (Ponglowhapan et al., 2004).
Dentre os açúcares utilizados nos meios diluentes para criopreservação de sêmen estão os simples, como a frutose e a glicose, e os não penetrantes na célula, como lactose, rafinose e trealose. Dissacarídeos, como a trealose e a sacarose, interagem com os grupos polares, promovendo a estabilização da membrana espermática (Dalimata & Graham, 1997).
2.2.3 LEITE EM PÓ DESNATADO (LPD)
O leite desnatado é um excelente meio conservador para os espermatozoides, em baixas temperaturas, de uso prático, inclusive preservando melhor a motilidade espermática do que outros diluentes (Kulaksiz et al., 2012). Segundo Memon e OTT (1981), as lipoproteínas e lecitinas do leite promovem a proteção da célula espermática contra o choque térmico quando adicionadas antes do resfriamento. Inclusive, há relatos sobre o efeito crioprotetor do leite desnatado (Juliani & Henry, 2008).
As caseínas do leite diminuem as ligações das proteínas do plasma aos espermatozoides, reduzindo a perda de lipídios da membrana celular e aumentando a proteção
36 durante o processo de criopreservação. Por outro lado, o efeito protetor do leite sobre a célula espermática envolve proteínas ao invés de lipídeos (Bergeron et al., 2007).
2.2.4 ÁGUA DE COCO EM PÓ (ACP)
Vários estudos de conservação espermática têm sido realizados utilizando a ACP como diluente em diferentes espécies. Ela é uma solução estéril, ligeiramente ácida, contendo proteínas, sais, açúcares, vitaminas, fatores de crescimento e pouco fosfolipídios (Laguna, 1996). Sua relação custo/benefício é favorável aos programas de IA, podendo ser utilizada sob diferentes apresentações, e após a correção da osmolaridade e do pH, se apresentar como um diluente eficiente para o sêmen de diferentes espécies (Salgueiro, et al., 2002; Barbosa et al., 2007).
Ela é um diluente alternativo de baixo custo, fácil preparo e padronizada, oriunda de fruto tipicamente tropical (Cardoso et al., 2005). O ACP, após a sua ressuspensão, apresenta características bioquímicas muito similares às da água de coco in natura (Salgueiro et al., 2002), sendo facilmente armazenada e enviada para regiões onde o fruto não é encontrado (Cardoso et al., 2005).
A eficiência do ACP, foi comprovada no sêmen de cães quando comparado ao diluente padrão TRIS, sendo ambos eficazes para uso na criopreservação (Silva et al., 2005). Testada em sêmen de gatos domésticos, mostrou-se eficiente na manutenção da qualidade espermática, com motilidade e vigor superiores a 70% e 3,5, respectivamente (Silva et al., 2007). Na espécie suína, o ACP também apresentou bons resultados quando comparado ao diluente BTS, mantendo uma melhor motilidade espermática aos 30, 60, 90 e 120 minutos de incubação (Toniolli et al., 1996; Toniolli et al., 1998).
3. CARACTERÍSTICAS E CONGELAÇÃO DO EJACULADO SUÍNO
O ejaculado suíno pode variar com a idade do animal, estação do ano, intervalo entre coletas, estado nutricional e raça. O varrão é o o maior produtor de volume de sêmen por ejaculado, com médias entre 150 a 500 mL. Seu ejaculado é constituído de três porções: a fase pobre de espermatozoides; fase intermediária, a mais rica em células espermáticas e a última fase que forma o tampão vaginal, constituída de material gelatinoso (Cavalcanti, 1998).
A congelação de sêmen suíno é um método demorado e complexo, sendo necessárias de 7 a 9 horas, da coleta à congelação propriamente dita. As amostras são submetidas a uma curva de resfriamento visando a manutenção da viabilidade espermática pós-descongelação. São inúmeros os protocolos utilizados para criopreservação de sêmen suíno, variando desde o crioprotetor, a velocidade no abaixamento de temperatura, os tipos de embalagens para conservação e os métodos de descongelação (Bortolozzo et al., 2005).
37 Desde a década de 70, vários estudos foram realizados para melhorar as técnicas de conservação de sêmen suíno. Os resultados de fertilidade com sêmen congelado ainda são inferiores aos obtidos com o sêmen refrigerado (Ruvalcaba et al., 2003). Apesar da baixa produtividade do sêmen congelado, as perspectivas para o uso desta técnica parecem promissoras, devido aos avanços de novas tecnologias e o aprimoramento de equipamentos de congelação do sêmen (Wolders & Ten Napel, 2005).
O sêmen suíno é o mais sensível às flutuações de temperatura (Corrêa et al., 2001). Temperaturas abaixo de 15 °C são causas de choque térmico, com perda irreversível da motilidade e lesões nas estruturas celulares. Temperaturas acima dos 18 °C, não reduzem de forma eficiente o metabolismo espermático e facilitam a multiplicação de bactérias (Scheid, 2003). Estudos relacionados com avaliação e efeito de diferentes crioprotetores, diluentes, curvas de abaixamento de temperatura, diferentes tipos de envases tem como objetivo amenizar as crioinjúrias sofridas pelo espermatozoide (Antunes, 2007).
Durante a criopreservação a primeira mudança é a transição de fase dos lipídios de membrana, que varia de acordo com o tipo e passa de fluida para gel, afetando sua movimentação lateral e formando um arranjo hexagonal regular, podendo ocorrer uma separação lateral e a formação de locais ocupados somente por lipídios. As proteínas ficam excluídas desses agrupamentos hexagonais, permanecendo em locais onde os lipídios ainda permanecem em seu estado fluido e suas funções necessárias ao transporte de íons e integridade da membrana podem ser afetadas (Woelders, 1997). A mudança de fase dos lipídios está concentrada entre 15 e 5 °C, intervalo onde o espermatozoide suíno está submetidos aos efeitos da transição de fase lipídica (Watson, 2000).
4. LIMITAÇÕES NA CONSERVAÇÃO DO SÊMEN SUÍNO
Na suinocultura a utilização de doses congeladas na IA ainda possui custos elevados, com um menor número de doses de sêmen obtidas por ejaculado e uma grande variação da congelabilidade entre diferentes reprodutores suínos (Bortolozzo et al., 2005).
O uso de sêmen congelado, é ainda limitada em suínos, com uma diminuição de fertilidade associada à alterações moleculares na membrana acrossomal, produção de espécies reativas ao oxigênio, instabilidade da membrana após o descongelação (Breininger et al., 2005) e uma desestabilização na estrutura da cromatina em espermatozoides (FRASER & Strzezek, 2007).
Ao serem congelados os espermatozoides sofrem mudanças fisicoquímicas devido às crioinjúrias, podendo ocorrer modificações no citoesqueleto, alterações na arquitetura das
38 mitocôndrias, quebra da assimetria da membrana e condensação da cromatina (Watson, 1995).
Apesar da separação lateral de lipídios da membrana com a diminuição de temperatura, ele é um processo reversível com o aumento da mesma, mas seu funcionamento pode ser alterado de forma irreversível. Perda de cátions e enzimas, redução da atividade enzimática, aumento da permeabilidade e perturbação no processo de difusão, são algumas das alterações decorrentes da separação de fases (De Leeuw et al., 1990).
O sêmen suíno é um dos mais sensíveis ao choque térmico, com maior segregação de partículas durante o processo de congelação (De Leeuw et al., 1990). Essa sensibilidade pode ser explicada pela baixa relação colesterol/lipídeos do sêmen. A presença do colesterol é importante na membrana, pois interfere no comportamento dos lipídios durante as mudanças de fase (De Leeuw et al., 1990), com uma alta proporção de proteínas/fosfolipídios na membrana espermática e ponto de fusão relativamente alto (Parks & Graham, 1992).
O espermatozoide do varrão também é mais suscetível ao estresse osmótico, devido às mudanças de volume durante a congelação (Watson, 1995). A curva de temperatura (congelação e descongelação) é essencial para preservar a integridade dessas células. Uma vez que, a congelação muito rápida ou uma descongelação muito lenta, favorecem a formação de cristais de gelo intra e extracelular, respectivamente.
Os atuais meios de conservação representam os conhecimentos de diferentes grupos de pesquisa, sobre as necessidades da célula espermática e sua conservação por refrigeração (Sánchez, 2003). Apesar disso, ainda é desconhecido o diluente e a temperatura ideal capaz de oferecer maior longevidade aos espermatozoides suínos.
CONCLUSÃO
O aumento do volume de produção e consumo nacional de carne suína nos últimos anos acarretou na necessidade de animais com elevada eficiência reprodutiva. A IA, apesar de ter vantagens em relação à monta natural, ainda possui fatores limitantes à sua otimização. É essencial para a lucratividade do setor suinícola a prática de procedimentos corretos de conservação de sêmen, melhoria nos resultados e diminuição dos investimentos e custos.
A criobiologia vem conquistando o seu espaço há algum tempo em diferentes áreas e principalmente na reprodução, por permitir a conservação de células para diferentes finalidades. A criopreservação de espermatozoides vem sendo empregada na IA há trinta anos, permitindo maior tempo de conservação para seu uso posterior. Para tal processo utilizam-se os chamados crioprotetores, tendo como função principal proteger as células de danos que influenciam na sua funcionalidade. Apesar desta técnica já ser estudada há bastante
