Análises de parâmetros espermáticos após descongelação

Após descongelação percebeu-se que, com o aumento das concentrações do glicerol, também aumentava as médias de vigor e de motilidade, no qual os melhores resultados estavam nas concentrações de 3%, 5% e 7%. Demonstrando que, no geral, após descongelação, altas concentrações de glicerol favorecem a manutenção dessas características quando comparadas com as análises durante a curva.

O DMSO a 3% obteve a menor média de vigor (1,2) diferindo estatisticamente de todos os grupos. Estes dados corroboram com o trabalho de KIM (2011), no qual demonstrou que o DMSO a 5% não possui efeito benéfico ao sêmen suíno em comparação ao glicerol 3%. A concentração de 5% de glicerol apresentou melhor resultado de vigor espermático (2,3),

70 porém, não diferiu das demais concentrações de glicerol, com exceção da concentração mais baixa (0,5%).

Na porcentagem de células móveis, o DMSO a 3% também obteve a menor média, diferindo estatisticamente dos demais grupos. Entre as concentrações de glicerol, a menor média foi observada nas amostras conservadas a 0,5% (13%), diferindo das concentrações de 3% e 5%. A maior porcentagem de motilidade foi observada na concentração de 3% a qual apresentou diferença estatística de todos os grupos, incluindo do DMSO (tabela 3). Moraes e colaboradores (1998) compararam a eficácia do etileno glicol em diferentes concentrações com o glicerol durante a criopreservação do sêmen de ovinos e também observaram que as médias de motilidade inicial e final do glicerol eram superiores as médias das concentrações testadas de etileno glicol. Estudo feito por Cardoso e colaboradores (2000) demonstrou a importância do glicerol durante a criopreservação de sêmen. Estes autores compararam a eficácia de um diluente sem o crioprotetor (água de coco) e do mesmo diluente com o crioprotetor (água de coco + glicerol + gema de ovo). O diluente a base de água de coco sozinho não foi eficaz na preservação da qualidade espermática. Relataram ainda que, provavelmente, o glicerol teve uma maior participação na atividade crioprotetora, visto que, somente após a sua incorporação ao sêmen, foi evidenciada diferença significativa de vigor e motilidade entre os grupos.

Tabela 3: Vigor e motilidade espermática do espermatozoide suíno após descongelação em diferentes concentrações de glicerol e DMSO a 3%. Tratamentos Pós-descongelação Vigor Motilidade DMSO(3%) 1,2±0,8a 7±8,9b G0,5% 1,7±1b 13±12,9c G1% 1,8±0,9bc 15±13,6ce G3% 2±0,4c 38±21,08d G5% 2,3±0,7c 21±16,6e G7% 2±0,7bc 21±18,1ce

a, b, c, d, e, letras diferentes na mesma coluna diferenças significativas (p<0,05).

A tabela 4 apresenta os resultados médios da análise de funcionabilidade de membrana celular, nos quais as concentrações das extremidades (baixas e altas) não protegeram a membrana plasmática de maneira tão eficiente como as concentrações

71 intermediárias, DMSO e glicerol a 3% e 1% de glicerol. As concentrações de 0,5%, 5% e 7% de glicerol não diferiram entre si, mas diferiram da concentração de 3% de glicerol que obteve a maior média. Esta concentração, por sua vez, não diferiu das concentrações de 1% de glicerol e 3% de DMSO, sendo estas as concentrações que obtiveram melhores resultados de resistência osmótica. Porém, não foi observada diferença estatística entre o DMSO e a menor concentração de glicerol, 0,5%.

Neste estudo, comparando-se as diferentes concentrações de glicerol, os melhores resultados foram observados nas concentrações mais baixas. O glicerol é um constituinte normal presente nas membranas celulares e em todos os óleos e gorduras animal e vegetal, na qual todas as células são capazes de metaboliza-lo. Em baixas concentrações, dependendo também do tipo celular, esta substância, ou a sua forma comercial, glicerina, não possui informações toxicológicas em bancos de dados reconhecidos internacionalmente. Contudo, já foi relatado que o glicerol em altas concentrações, pode afetar eventos físicos no citoplasma, como a organização citoplasmática através da alteração na polimerização da tubulina e aumento da viscosidade. Podendo alterar a permeabilidade e estabilidade da bicamada lipídica diretamente de modo prejudicial no glicocálix e nas proteínas de membrana, formando ligações não covalentes com as mesmas (HAMMERSTEDT e GRAHAM, 1992).

Tabela 4: Resistência osmótica do espermatozoide suíno após descongelação, em diferentes concentrações de glicerol e DMSO a 3%. Tratamentos Hipomóstico DMSO(3%) 35,21 ± 5,92abc Gly0,5% 33,64 ± 4,81ad Gly1% 35,57 ± 3,78bc Gly3% 36,94 ± 4,70c Gly5% 33,02 ± 4,25d Gly7% 32,77 ± 4,15d

a, b, c, d letras diferentes na mesma coluna diferenças significativas (p<0,05). Ao contrário dos demais parâmetros as maiores médias de porcentagem de células vivas foram observadas nas maiores concentração, 5% e 7% de glicerol (58,1 e 56,8, respectivamente), diferindo estatisticamente dos demais grupos. A menor concentração, 0,5% de glicerol, obteve porcentagem de vitalidade de 43,6, a menor média dentre os tratamentos. O DMSO não diferiu do glicerol na mesma concentração (49,2 e 49,5, respectivamente).

72 Tabela 5: Porcentagem de espermatozoides vivos (vitalidade) no

ejaculado do varrão após descongelação, em diferentes concentrações de glicerol e DMSO a 3%.

Tratamentos Vitalidade DMSO(3%) 49,2 ± 4,9a Gly0,5% 43,6 ± 3,9b Gly1% 54,7 ± 3,8c Gly3% 49,5 ± 9,9a Gly5% 58,1 ± 6,7d Gly7% 56,8 ± 5,6d

a, b, c, d, letras diferentes na mesma coluna diferenças significativas (p<0,05). Houve diferença estatística entre todos os tratamentos dos quais o melhor resultado observado foi na concentração de 3% de glicerol (75) e a menor média de acrossomas intactos foi vista na concentração de 7% (38,2). O DMSO a 3% obteve média de 51,4, segunda menor média de acrossomas íntegros.

Quando comparado o DMSO a 3% (51,4±7,5) e o glicerol na mesma concentração, foi observada diferença significativa na qual a média de acrossoma intacto foi maior na concentração de 3% de glicerol (75±10,3). Porém, em grandes concentrações de glicerol, 7% (38,2±6,8), a média de acrossoma íntegro foi significativamente menor do que a concentração de 3% de DMSO. A toxicidade do glicerol limita a concentração em que este pode ser utilizado antes do resfriamento e, portanto, limita a eficácia da ação crioprotetora (FAHY, 1986). Além do fato de que os agentes crioprotetores podem ter uma ação direta na produção de crioinjúrias, como, por exemplo, alterando a polaridade do meio extracelular lesando as membranas. A origem dessas alterações ainda permanece incertas, mas algumas evidências sugerem que ocorre alterações no reordenamento lipídico desde o resfriamento até o reaquecimento, desorganizando as associações lipoproteicas, as quais são indispensáveis para o seu funcionamento (ARNOLD et al., 1983). As demais concentrações de glicerol, 0,5%, 1%, 3% e 5%, obtiveram médias significativamente superiores ao DMSO 3%. Comparando os extremos, a menor concentração de glicerol (0,5%) com a maior (7%), observou-se que a concentração de 0,5% obteve maior porcentagem de acrossomas intactos do que a concentração de 7%. A concentração de glicerol utilizada para criopreservação de espermatozoides é limitada devida a sua toxicidade, a qual depende da taxa de resfriamento, velocidade de congelação, composição do diluente e método de adição do glicerol (FAHY,

73 1986; WOELDERS 1997). Já foi relatada a sua relação com alterações nos microtúbulos do citoesqueleto (PARKS, 1992) e a indução acelerada da reação acrossomal (SLAVIK, 1987).

Tabela 6: Porcentagem de espermatozoides com acrossoma íntegro no ejaculado do varrão após descongelação, em diferentes concentrações de glicerol e DMSO a 3%.

Tratamentos Acrossoma DMSO(3%) 51,4 ± 7,5a Gly0,5% 54,1 ± 7,7b Gly1% 66,5 ± 4,9c Gly3% 75 ± 10,3d Gly5% 58,4 ± 4,7e Gly7% 38,2± 6,8f

a, b, c, d, e,f letras diferentes na mesma coluna diferenças significativas (p<0,05).

4. CONCLUSÃO

Este estudo demonstrou que o DMSO a 3% não possui benefícios na criopreservação de sêmen suíno em comparação ao glicerol. Sendo este, em baixas concentrações, ainda a melhor opção de crioprotetor na espécie suína.

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76 9 CONCLUSÕES

1) Tanto a frutose como a glicose obtiveram resultados semelhantes durante a criopreservação de sêmen suíno, podendo haver então a substituição da glicose (açúcar padrão) pela frutose sem acarretar queda de resultados pós-descongelação.

2) O LPD, após descongelação, não mostrou bons resultados quanto a motilidade e vigor, sendo o BTS a melhor opção de diluente para criopreservação de sêmen suíno.

3) Quando comparado ao DMSO, o glicerol demosntrou melhores resultados sendo ainda a melhor opção de crioprotetor na criopreservação de espermatozoide na espécie suína.

4) A nova curva de abaixamento de temperatura obteve bons resultados de vigor e motilidade espermática podendo ser utilizada para criopreservação de sêmen suíno.

77 10 PERSPECTIVAS

A congelação de espermatozoides suíno vem sendo vista como uma solução para a principal limitação da inseminação artificial, o curto período de armazenamento das doses resfriadas. Porém, apesar de existirem técnicas de congelação de sêmen, o seu emprego comercial ainda não foi viabilizado. A busca por novos protocolos de congelação é de grande importância para a cadeia suinícola, já que tem como finalidade aumentar a longevidade das doses inseminantes. Assim, se faz necessário o desenvolvimento de técnicas e soluções que permitam a utilização do sêmen congelado, sem queda dos resultados de fertilidade espermática com bons resultados zootécnicos. Ainda se faz necessário outros estudos complementares incluindo ensaios in vivo, com avaliação de taxas de fertilidade e parição, número de leitões nascidos dentre outros parâmetros que validem os resultados obtidos a partir da nova técnica de criopreservação.

78 11 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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