Estrutura genética das populações de abelhas africanizadas (Apis mellifera L.) do Brasil determinada por meio de polimorfismos do DNA mitocondrial.

(1)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO

“ESTRUTURA GENÉTICA DAS POPULAÇÕES DE ABELHAS

AFRICANIZADAS (Apis mellifera L.) DO BRASIL E URUGUAI DETERMINADA POR MEIO DE POLIMORFISMOS DO DNA MITOCONDRIAL”

THAÍS COLLET

(2)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO

“ESTRUTURA GENÉTICA DAS POPULAÇÕES DE ABELHAS

AFRICANIZADAS (Apis mellifera L.) DO BRASIL E URUGUAI DETERMINADA POR MEIO DE POLIMORFISMOS DO DNA MITOCONDRIAL”

THAÍS COLLET

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Evolução do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de São Carlos, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética e Evolução, área de concentração: Genética e Evolução.

(3)

Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária da UFSCar

C698eg

Collet, Thaís.

Estrutura genética das populações de abelhas

africanizadas (Apis mellifera L.) do Brasil determinada por meio de polimorfismos do DNA mitocondrial / Thaís Collet. -- São Carlos : UFSCar, 2004.

66 p.

Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São Carlos, 2004.

1. Genética de populações. 2. Abelha - africanizada. 3. Apis mellifera. 4. DNA mitocondrial. I. Título.

(4)

Orientador

(5)

“Mas tu ó servo meu, não temas porque eu sou contigo; não te assombres

porque eu sou o teu Deus; te tomo pela tua mão direita, te fortaleço, te ajudo

e te sustento com a minha destra fiel”.

Isaías 41: 10 e 13

Todo o meu agradecimento Àquele que nos tem fortalecido.

(6)

Agradecimentos

Muitas pessoas tiveram participações fundamentais na realização deste trabalho, estando direta ou indiretamente envolvidas nele, ou realizando os papéis que fazem toda a diferença na minha vida: o de família e o de amigos.

Portanto, deixo aqui os meus agradecimentos a algumas dessas pessoas:

Aos meus pais, Nelita e Martim, e aos meus irmãos André, Ulisses e Rodrigo, que são a melhor base e referência da minha formação pessoal, por me proporcionarem todas as oportunidades para a formação profissional.

Ao professor Dr. Marco Antonio Del Lama, pela presença sempre constante no desenvolvimento deste trabalho, demonstrando orientação com segurança, além dos melhores exemplos de princípios que um aluno em formação pode obter de um orientador.

Aos amigos do Laboratório de Genética Evolutiva de Himenópteros: Isabel, Daniele, Mariana, Margarita e Otávio, por fazerem do laboratório um ambiente tão agradável e por se revelarem não apenas colegas de trabalho, mas sim amigos.

Ao Rogério Oliveira Souza, que de forma amiga me ensinou todas as técnicas desde o começo do trabalho, além de ajudar na análise e discussão dos resultados, e ao Carlos Prada Quiroga, pelo grande companheirismo, ajuda e incentivos durante a realização do trabalho.

(7)

À professora Dra. Maria Cristina Arias, por me receber em seu laboratório no Instituto de Biociências da USP e pelas valiosas discussões a respeito dos resultados. Agradeço também a todo o pessoal do seu laboratório por terem me recebido tão bem durante o período que permaneci junto deles.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Genética e Evolução, com alguns dos quais, por meio das disciplinas cursadas, muito aprendi.

Aos funcionários e amigos, tanto do Departamento de Genética e Evolução quanto da Pós-Graduação, pela convivência tão saudável.

Aos apicultores ou pesquisadores do Brasil e demais países, pela maneira cordial que nos forneceram as amostras de abelhas analisadas neste trabalho.

Às professoras Dras. Maria Claudia C. R. Takasusuki e Sandra A. O. Collet pela grande amizade e incentivos para que eu realizasse o Mestrado.

A todas as pessoas que conheci nesse período em São Carlos, principalmente algumas cujos nomes eu não poderia deixar de lembrar: Priscila, Elisângela, Milena, Marcilene, Patrícia, Lídia, Franciéli, Tatiana, Joel, Sônia, Nelson, Martha, Rogério, Larissa, Leu, Marcos, Liana, Júnior e Fernando. Estas são algumas das pessoas as quais considero muito valiosas, estando junto de mim todos os dias ou em cidades distantes e até mesmo em outro país, todas são muito importantes na minha vida.

À Luciana Oliveira Souza e à Noêmia Mie Orii pela forma acolhedora com que me receberam em São Paulo.

(8)

i

Índice

LISTA DE FIGURAS ... iii

LISTA DE TABELAS ... iv

RESUMO GERAL ... v

ABSTRACT... vii

1. Introdução Geral ... 1

1.1 Origem e Evolução de Apis mellifera ... 1

1.2 O processo de africanização... 3

1.3 Estudos populacionais realizados com as subespécies de Apis mellifera ... 7

1.3.1 Morfometria ... 7

1.3.2 Alozimas ... 8

1.3.3 Polimorfismos do DNA nuclear ... 9

1.3.4 Padrões do DNA mitocondrial ... 11

2. Justificativa e Objetivos ... 15

3. Referências Bibliográficas ... 17

4. Padrões de PCR-RFLP da região 16S do DNA mitocondrial diferenciam ramos evolutivos de Apis mellifera... 23

4.1. Resumo ... 24

4.2. Introdução ... 25

4.3. Material e Métodos ... 28

4.3.1 Amostras e extração de DNA ... 28

4.3.2. Amplificação por PCR e digestão com endonucleases ... 28

(9)

ii

4.3.3. Clonagem e seqüenciamento do DNA ... 30

4.4. Resultados ... 31

4.5. Discussão ... 37

4.6. Referências Bibliográficas ... 40

5. Estrutura genética das populações de abelhas africanizadas (Apis mellifera L.) do Brasil determinada por meio do polimorfismo da região tRNAleu_COII do DNA mitocondrial ... 43

5.1. Resumo ... 44

5.2. Introdução ... 45

5.3. Material e Métodos ... 47

5.3.1. Amostras e extração de DNA ... 47

5.3.2. Amplificação por PCR e digestão com endonuclease ... 47

5.3.3. Clonagem e seqüenciamento do DNA ... 47

5.4. Resultados ... 49

5.5. Discussão ... 57

5.6. Referências Bibliográficas ... 62

(10)

iii

LISTA DE FIGURAS

Padrões de PCR-RFLP da região 16S do DNA mitocondrial diferenciam ramos evolutivos de Apis mellifera

FIGURA 1. Padrões de amplificação e restrição das subespécies analisadas para a região 16S ... 32

FIGURA 2. Sítios de variação do fragmento 16S ... 33

FIGURA 3. Padrões da digestão dupla comEco RI e Vsp I ... 36

Estrutura genética das populações de abelhas africanizadas (Apis mellifera

L.) do Brasil determinada por meio do polimorfismo da região tRNAleu_COII do DNA mitocondrial

FIGURA 1. Mitótipos observados a partir da digestão com Dra I para a região intergênica tRNAleu_COII ... 52

FIGURA 2. Mapas de restrição e comprimento dos fragmentos em pares

de base ... 53

FIGURA 3. Seqüências P e Q da região tRNAleu-COII ... 54

(11)

iv

LISTA DE TABELAS

Padrões de PCR-RFLP da região 16S do DNA mitocondrial diferenciam ramos evolutivos de Apis mellifera

TABELA 1. Número de colônias de Apis mellifera e seus respectivos países de coleta ... 29

TABELA 2. Padrões discordantes observados nos diferentes marcadores

utilizados na identificação das subespécies ... 34

Estrutura genética das populações de abelhas africanizadas (Apis mellifera

L.) do Brasil determinada por meio do polimorfismo da região tRNAleu_COII do DNA mitocondrial

(12)

v

RESUMO GERAL

Os ramos evolutivos dentro dos quais as subespécies de Apis mellifera são classificadas estão originalmente distribuídos nos continentes africano (ramos A e Y), europeu (ramos M e C) e asiático (ramo O). Essa distribuição vem sendo progressivamente alterada devido às introduções de subespécies em várias outras regiões do mundo, ocasionadas principalmente por atividades apícolas. Dessa forma, a genética de populações vem ganhando um amplo campo de estudos relacionados às mudanças na composição das populações já estabelecidas e das recém introduzidas. A introdução das abelhas africanas no continente americano, que resultou no processo conhecido como africanização, se tornou um dos eventos mais estudados, dentre aqueles relacionados às introduções de Apis mellifera.

Uma das primeiras abordagens nos estudos que envolvem introduções de subespécies é a caracterização das diferentes linhagens que contribuem para a formação das populações. Nesse sentido, são descritos neste trabalho os diferentes padrões de restrição obtidos a partir de um fragmento da região 16S do DNA mitocondrial que, em relação às metodologias utilizadas até então, permitem uma melhor diferenciação das subespécies pertencentes aos ramos evolutivos A, M e C.

(13)

vi

freqüentes foram os africanos A1 e A4, provavelmente introduzidos no Brasil via

(14)

vii

ABSTRACT

The Apis mellifera subspecies are classified into evolutionary branches originally distributed in the African (branches A and Y), European (branches C and M) and Asian (branch O) continents. This distribution has been changing due to the subspecies introductions to other countries, mainly occurred by beekeeping activities. Therefore, population genetics studies on the already established and newly introduced populations have increased. The introduction of the African honeybee in American continent, known as Africanization, became one of the most studied events related to Apis mellifera introductions.

The characterization of different lineages that contribute to hybrid populations is the first approach of the studies related to subspecies introductions. In this way, we describe the restriction patterns obtained from a 16S region fragment of the mitochondrial DNA. These patterns enables the differentiation among races from the three evolutionary branches using only one region of the mitochondrial genome, without the requirement of amplification of other regions.

The determination of the racial composition of the hybrid product of

(15)

Introdução Geral 1

1. Introdução Geral

1.1. Origem e Evolução de Apis mellifera

Evidências fósseis são escassas, mas as abelhas provavelmente evoluíram

juntamente às fanerógamas no período Cretáceo (cerca de 146 a 74 milhões de

anos atrás). Alguns autores, como Gauld e Bolton (1996), sugerem que regiões de

clima tropical, como a África, seriam os possíveis locais de origem do gênero Apis.

Porém, os primeiros registros fósseis do gênero foram descobertos na Alemanha e

datam do Eoceno, ou seja, por volta de 50 milhões de anos atrás. De acordo com

Milner (1996), esse fato pode ser explicado por registros que apontam um clima

tropical para a Europa naquela época, e conforme o clima se tornava frio, as

abelhas, que ainda não teriam desenvolvido o controle da temperatura do ninho,

migraram para regiões tropicais.

Dois atributos foram essenciais para a evolução e biologia das abelhas: o

comportamento de agrupar-se e a habilidade de controlar a temperatura do ninho.

Estas características permitiram a regulação da temperatura interna da colônia

independentemente da temperatura externa. Dessa forma, o gênero Apis foi capaz

de colonizar uma ampla variedade de ambientes, desde os tropicais até os

temperados. A subfamília Meliponinae, por exemplo, que não apresenta essa

capacidade de regulação da temperatura do ninho, está restrita às regiões

tropicais (Milner, 1996).

A grande capacidade de Apis mellifera colonizar diferentes ambientes, da

mesma forma que as demais espécies do gênero Apis, levou essa abelha a

enfrentar muitas condições ecológicas diferentes. Este fato, associado ao

isolamento geográfico de algumas populações, permitiu a evolução de numerosas

subespécies adaptadas aos seus ambientes específicos.

Em 1978, Ruttner et al. agruparam as diferentes subespécies de A.

mellifera por meio da análise multivariada de caracteres morfométricos e estes

(16)

Atualmente são reconhecidos cinco ramos evolutivos que agrupam as 26

subespécies de A. mellifera descritas. A seguir são apresentados os ramos

juntamente com a distribuição original de cada um deles.

1) Ramo A: Característico das subespécies africanas A. m. adansonii, A. m.

capensis, A. m. intermissa, A. m. lamarckii, A. m. litorea, A. m. major, A. m.

monticola, A. m. sahariensis, A. m. scutellata, A. m. siciliana e A. m. unicolor.

2) Ramo M: Característico das seguintes subespécies localizadas na Europa

Ocidental: A. m. iberiensis e A. m. mellifera.

3) Ramo C: Compreende as subespécies A. m. carnica, A. m. cecropia, A. m.

macedonica, A. m. ligustica e A. m. sicula, que ocupam o leste europeu e norte do

Mediterrâneo.

4) Ramo O: Agrupa as subespécies do Oriente Médio A. m. adami, A. m.

anatoliaca, A. m. armeniaca, A. m. caucasica, A. m. cypria, A. m. meda e A. m.

syriaca.

5) Ramo Y: Este ramo compreende apenas a subespécie A. m. yemenitica,

localizada na região africana da Etiópia.

A distribuição original dos ramos evolutivos de Apis mellifera tem sido

progressivamente alterada devido às sucessivas introduções realizadas por

apicultores, de forma que, atualmente, as abelhas pertencentes às diferentes

linhagens podem ser encontradas em várias partes do mundo. De acordo com

Schneider et al. (2004), o transporte em larga escala de populações de A. mellifera

deu início a uma “mistura” de linhagens anteriormente distribuídas de forma

alopátrica. Dessa forma, vêm se tornando comum ao longo dos anos as

investigações que visam diferenciar as linhagens de abelhas envolvidas nas

introduções, a fim de compreender as mudanças na composição genética das

populações residentes e introduzidas, como resultado do transporte para

diferentes áreas.

Estudos dessa natureza foram realizados com as populações da ilha de

(17)

população relativamente uniforme, mas, de acordo com as freqüências de três

alelos de um loco MDH, recentes importações da subespécie ligustica têm

aumentado a variabilidade genética na região (Cornuet, 1979).

Oldroyd et al. (1995), estudaram processosde hibridização entre mellifera e

ligustica na Tasmânia (Austrália), introduzidas respectivamente em 1831 e 1884, e

observaram que o fluxo gênico entre as subespécies ocorria na costa, mas era

restrito nas regiões montanhosas mais frias, onde populações ferais de mellifera

eram predominantes, provavelmente devido ao fitness reduzido dos híbridos

mellifera/ligustica nas regiões frias.

Nas ilhas Baleares, foram observados haplótipos pertencentes à linhagem

M, resultado de importações de rainhas da Península Ibérica, o que demonstra

substituições de rainhas nativas (De la Rúa et al., 2001).

No entanto, o impacto mais marcante resultante da introdução de diferentes

subespécies de Apis mellifera em uma área ocorreu nas Américas e será discutido

no tópico a seguir.

1.2. O Processo de Africanização

O processo de expansão das abelhas africanas Apis mellifera scutellata

pelo continente americano é denominado de Africanização e teve início no Brasil

em 1956. De acordo com Kerr (1967), estas abelhas foram trazidas da África

(região de Tanganica e África do Sul) ao Brasil pelo próprio autor com o objetivo

de realizar o melhoramento e posterior distribuição de rainhas selecionadas aos

apicultores. O objetivo era aumentar a produção nacional de mel, uma vez que

dados da literatura internacional apontavam a subespécie A. m. scutellata como

grande produtora (Gonçalves, 1998).

Em 1957 ocorreu o escape acidental de 26 rainhas que se encontravam em

quarentena em apiário próximo a Rio Claro (SP), iniciando as enxameações

dessas rainhas e o cruzamento na natureza com as subespécies européias

(18)

Na América do Sul, as primeiras introduções ocorreram por meio dos

colonizadores espanhóis e portugueses, provavelmente com A. m. mellifera e A.

m. iberica. No Brasil, por volta do século XIX, imigrantes alemães e italianos

começaram a introduzir A. m. mellifera e A. m. ligustica respectivamente. Mais

recentemente, atividades apícolas comerciais em toda a América têm importado A.

m. ligustica.

Portanto, a abelha resultante do cruzamento entre as subespécies

européias já existentes com a africana é um polihíbrido que, de acordo com

Gonçalves (1998), por volta de 1974 recebeu a denominação “africanizada” devido

à dominância das características das abelhas africanas sobre as demais

européias.

Os enxames africanizados se expandiram pela América a uma velocidade

de cerca de 480 km/ano (Taylor, 1985), de forma que atualmente são encontrados

em grande parte do continente, incluindo várias áreas dos EUA (Kunzmann et al.,

2002). A colonização das Américas se deu, inclusive, com a substituição dos

enxames europeus preexistentes pela abelha africanizada. Alguns fatores, muitas

vezes combinados, são responsáveis por permitir essa expansão, bem como a

preservação das características africanas, seja nas colônias ferais ou nas

mantidas em apiários. A seguir, são descritos alguns desses fatores.

- Taxa de crescimento da colônia e enxameagem: As colônias africanas apresentam uma taxa de crescimento mais acelerada quando comparadas

com as européias, que se deve à maior habilidade na coleta de pólen e sua

rápida conversão às crias (Page et al., 2000). Com isso, a densidade das

colônias africanas é rapidamente aumentada, resultando na produção de um

enxame com maior capacidade de dispersão, que abandona as colônias e dá

início à enxameagem.

- Invasão das colônias européias pelas africanas: Neste caso, enxames africanos invadem colônias européias, substituem as rainhas e causam a

(19)

ocorre permanece pouco entendido, porém, de acordo com Danka et al.

(1992), fatores relacionados a feromônios dos enxames invasores, ausência

de rainha nas colônias invadidas ou ainda uma colônia debilitada, podem estar

envolvidos.

- Linhagens africanas se sobrepõem durante a substituição de rainhas: Quando abelhas africanas invadem uma nova área, as rainhas se acasalam

com zangões africanos e europeus, resultando numa colônia com operárias de

origem africana e européia. Pelo fato das rainhas que emergem primeiro

eliminarem aquelas que ainda permanecem nas células, as de origem africana

possuem uma vantagem competitiva, já que estas se desenvolvem mais

rápido e emergem antes das rainhas européias, possuindo mais

oportunidades de eliminá-las (DeGrandi-Hoffman et al., 1998).

- Vantagens adaptativas da abelha africana em ambientes neotropicais: Rinderer (1988) destaca que as abelhas africanas possuem vantagens em

relação às européias, tanto com relação à colonização quanto na capacidade

de sobreviver nos ambientes tropicais e subtropicais do continente americano.

O comportamento higiênico mais acentuado diante de doenças ou parasitas,

como o ácaro Varroa jacobsoni (responsável por atacar as crias), torna as

africanizadas mais tolerantes que a européias. Outras características, como

um forrageamento mais eficiente nas áreas tropicais, maior capacidade

defensiva diante de inimigos naturais ou a flexibilidade na escolha dos locais

de nidificação, contribuem para o estabelecimento bem sucedido desta abelha

na América.

Com relação aos impactos causados pela expansão das abelhas

africanizadas pelo continente, temia-se inicialmente que a entrada dessas abelhas

em novas áreas seria tanto perigosa para a população devido à sua

agressividade, quanto desvantajosa para os apicultores e a indústria de

polinização. No começo da década de 80, o Departamento de Agricultura dos EUA

(20)

anual de 19 milhões de dólares em atividades agrícolas que dependiam da

polinização por abelhas, além de um prejuízo ainda maior para a apicultura

(McDowell, 1984).

Porém, é possível que tais impactos sejam menores do que se imaginava

inicialmente (Schneider et al., 2004) pois a baixa taxa de dispersão das abelhas

africanizadas nos climas temperados americanos, juntamente com políticas de

controle por parte do governo, podem ter amenizado essas estimativas. Na

América do Sul, essas abelhas se mostraram superiores às européias na

polinização de certas culturas, e, por apresentarem maior resistência a doenças,

além de reduzida susceptibilidade a alguns pesticidas, têm sido incorporadas em

práticas agrícolas.

No Brasil, desde a década de 60, grupos de pesquisa vêm se

estabelecendo em programas de cruzamentos entre abelhas africanizadas e

européias com o objetivo de diluir os genes africanos, já que essas abelhas são

caracterizadas por um acentuado comportamento defensivo. O objetivo inicial de

introduzir as abelhas africanas no Brasil, ou seja, o incremento na produção

nacional de mel, foi alcançado, conforme constatado por Kerr (1967) com dados

que apontavam as abelhas africanas produzindo duas vezes mais que as italianas

e quatro vezes mais que as alemãs. Em 2001, o país produziu em torno de 22 mil

toneladas de mel, destacando-se em sexto lugar na produção mundial.

(www.cnptia.embrapa.br/sistemasdeprodução). O uso das abelhas africanizadas

na apicultura comercial vem sendo cada vez mais freqüente, havendo inclusive

apicultores no Brasil e outros países americanos que preferem estas abelhas

devido à sua alta produtividade (Gonçalves, 1998).

Apis mellifera scutellata é um excelente modelo animal para estudos de

fatores que influenciam o estabelecimento bem sucedido de espécies em novos

ambientes (Schneider et al., 2004). A colonização da maior parte do hemisfério

ocidental em menos de 50 anos por uma única subespécie é uma das mais

(21)

Dessa forma, a expansão da abelha africanizada por novos ambientes e

seu cruzamento com as demais subespécies têm possibilitado a realização de

vários estudos que visam diferenciar entre as subespécies, investigar o grau de

hibridização entre as abelhas européias existentes e as africanas introduzidas

posteriormente, bem como os mecanismos envolvidos no estabelecimento dessas

novas populações.

1.3. Estudos populacionais realizados com as subespécies de Apis mellifera

Vários trabalhos têm relatado estudos populacionais realizados com as

subespécies de Apis mellifera em praticamente todos os continentes. Em tais

análises, destaca-se a utilização de morfometria, alozimas, polimorfismos do DNA

nuclear e os padrões do DNA mitocondrial. A seguir, serão relatados alguns

trabalhos que se utilizaram desses marcadores para analisar populações de A.

mellifera e o seu emprego nas questões que envolvem as abelhas africanizadas

das Américas.

1.3.1. Morfometria

As subespécies de abelhas têm sido diferenciadas por meio de análises

morfométricas desde o início do século XX (Ruttner, 1988). Alpatov (1929, 1948)

introduziu medidas biométricas de partes do corpo das abelhas, como cor e

venação das asas, dando início às primeiras classificações.

Em 1978, Ruttner et al. utilizaram dados de morfometria para sugerir que A.

mellifera evoluiu em três principais ramos ou linhagens evolutivas (M, C e A),

classificando as subespécies descritas até então dentro desses ramos.

Atualmente, aproximadamente 40 caracteres morfométricos das abelhas podem

ser utilizados em análises multivariadas. A utilização desses caracteres é possível

devido aos padrões de variação morfológica encontrados em A. mellifera,

(22)

De acordo com Diniz-Filho (1994), os valores médios da asa anterior, por

exemplo, podem ser utilizados na diferenciação dos grupos de A. mellifera e na

estimativa de variação entre populações, pois esta característica apresenta

elevada herdabilidade e está altamente relacionada a gradientes morfológicos.

Abelhas africanizadas da América do Sul foram estudadas por Buco et al.

(1987) utilizando 25 caracteres morfológicos. Os autores constataram que essas

abelhas apresentavam tanto origem da linhagem parental européia quanto da

africana.

Colônias africanizadas do México foram analisadas por meio de três

métodos morfométricos (Guzman-Novoa et al., 1994). De acordo com os autores,

os métodos discriminam corretamente as amostras africanas e européias,

indicando que menos de 45% dos híbridos eram africanizados.

Lobo (1995) utilizou dados de morfometria das asas em seus estudos com

abelhas africanizadas da Costa Rica e observou uma origem predominantemente

africana em todas as localidades. O autor comparou a população africanizada da

Costa Rica com grupos de referência, como abelhas européias, africanizadas do

Brasil e européias existentes na Costa Rica antes do processo de africanização. O

comprimento e a largura das asas das abelhas costarriquenhas foram, em média,

menores quando comparadas com as européias, sendo mais similares ao padrão

africanizado utilizado como referência.

Dados obtidos com medidas da asa anterior e posterior de populações de

abelhas africanizadas do Brasil demonstraram uma grande semelhança dessas

abelhas com as africanas. Esta semelhança aumenta nas abelhas que ocupam as

regiões mais próximas ao Equador (Rotta, 1999).

1.3.2. Alozimas

Numerosos estudos têm sido realizados empregando-se alozimas para

estimar níveis de variabilidade genética em populações, além de ajudar a resolver

(23)

mellifera, alguns locos polimórficos, como MDH1, PGM, HK1, EST-3 e ADH,

apresentam os maiores níveis de polimorfismo, sendo muito utilizados em estudos

de parentesco entre grupos de populações dessa espécie (Lobo, 1995).

Vários autores destacam os locos MDH1 e HK1 na diferenciação de

populações européias e africanizadas (Lobo et al., 1989; Del Lama et al., 1988,

1990, 2004; Rotta, 1999). Tal fato de deve às diferentes freqüências para três

alelos de MDH1 apresentadas pelas três principais subespécies envolvidas no

processo de africanização, A. m. scutellata, A. m. mellifera e A. m. ligustica. A. m.

mellifera exibe altas freqüências do alelo Mdh180 , enquanto as africanas possuem

o alelo Mdh1100 praticamente fixado e A. m. ligustica apresenta grandes

proporções de Mdh165 (Sheppard e Berlocher, 1984; Badino et al., 1984) . Com

relação HK1, Del Lama et al. (1988) demonstraram que o alelo Hk1100 está

presente nas abelhas européias e Hk187 é característico das abelhas africanas.

Resultados obtidos com amostras de abelhas africanizadas da América do

Sul e Central demonstram uma grande contribuição das abelhas africanas na

formação das populações africanizadas, com uma composição de genes europeus

cuja freqüência varia de acordo com a região geográfica (Lobo et al., 1989; Del

Lama et al. 1990; Lobo e Krieger, 1992; Rotta, 1999; Diniz et al., 2003). Os

trabalhos apontam a predominância de genes africanos e, com relação aos

europeus, a maioria da contribuição se deve aos pertencentes a Apis mellifera

mellifera.

1.3.3. Polimorfismos do DNA nuclear

Muitas seqüências do genoma nuclear constituem uma fonte rica de

marcadores genéticos devido ao alto grau de variabilidade que possuem. Dessa

forma, esses marcadores vêm proporcionando avanços nos estudos de genética

de populações, além de muitos genes nucleares serem utilizados para inferências

(24)

Além dos polimorfismos gerados pelos tamanhos dos fragmentos de

restrição (RFLP) do DNA nuclear, os microsatélites também são considerados

efetivos em avaliações de variabilidade genética. Estes últimos marcadores

constituem seqüências curtas de nucleotídeos, repetidas em tandem e bastante

variáveis (Parker et al., 1998). Os marcadores nucleares constituem bons

indicadores da composição genética das abelhas e, de acordo com McMichael e

Hall (1996), comparando-se com a variabilidade morfométrica e bioquímica

(alozimas), são mais abundantes e não requerem expressão gênica para sua

detecção.

Estudos empregando RFLPs e microsatélites têm sido desenvolvidos no

sentido de elucidar a composição genética das populações de abelhas

africanizadas das américas. Contribuindo para isso, marcadores característicos de

abelhas européias e africanas vêm sendo identificados (Hall, 1986, 1990;

McMichael e Hall, 1996; Hall e McMichael, 2001).

Nas colônias ferais americanas africanizadas, os marcadores nucleares

característicos de abelhas do leste europeu (A. m. ligustica) foram observados

com baixas freqüências, indicando haver limitada introgressão paternal de

colônias européias manejadas nas populações ferais africanizadas (Hall, 1990).

Entretanto, como as freqüências de alelos africanos de outros locos foram

menores nas populações ferais americanas em relação a populações sul africanas

(Hall, 1992; 1998), provavelmente estaria havendo maiores níveis de hibridização

africana-européia do que o observado no estudo anterior.

Uma introgressão paternal a partir de abelhas do oeste europeu (A. m.

mellifera) estaria ocorrendo nas populações africanizadas, uma vez que Hall e

McMichael (2001) demonstraram que embora os alelos do leste europeu

estivessem praticamente ausentes em relação aos africanizados, havia de 26 a

31% de freqüência dos alelos característicos de A. m. mellifera.

De acordo com Suazo e Hall (2002) e Suazo et al. (2002), as freqüências

dos alelos africanos nas populações da América Central e do Sul aumenta do

(25)

aquelas estabelecidas a mais tempo. Estes autores também demonstraram

freqüências mais elevadas de alelos pertencentes a A. m. mellifera em relação aos

de A. m. ligustica.

Clarke et al. (2002), utilizando dados de microsatélites, descreveram que a

maioria das colônias mexicanas e venezuelanas por eles estudadas era híbrida

africana/A. m. mellifera.

1.3.4. Padrões do DNA mitocondrial

O DNA mitocondrial apresenta algumas características que tornam esta

molécula uma ferramenta bastante utilizada em estudos de filogenia, de relações

evolutivas entre espécies ou análises populacionais, como introduções de

populações e modos de dispersão.

Dentre as características que tornam o DNA mitocondrial um marcador

atrativo estão a herança uniparental (geralmente materna e sem recombinação),

as altas taxas evolutivas quando comparado ao genoma nuclear (provavelmente

devido a uma baixa eficiência do sistema de reparo na mitocôndria), a grande

quantidade, o que facilita seu isolamento, além de uma estrutura de organização

relativamente simples, constituindo-se de moléculas de fita dupla, compactas, com

um tamanho que em A. mellifera varia de 16 a 17 kb (Crozier e Crozier, 1993),

com poucas regiões intergênicas e sem íntrons.

Dados obtidos por meio da análise do DNA mitocondrial têm trazido

importantes esclarecimentos para os estudos com A. mellifera, contribuindo, por

exemplo, para o entendimento da evolução de suas subespécies. Algumas

endonucleases utilizadas em regiões específicas do DNA mitocondrial produzem

fragmentos capazes de distinguir entre as linhagens dessa espécie.

Crozier et al. (1991) relataram que a amplificação de um fragmento do gene

citocromo b e sua digestão com Bgl II era capaz de discriminar as abelhas da

(26)

Amplificando três fragmentos de diferentes regiões (subunidade ribossomal 16S,

citocromo oxidase I e região intergênica COI-COII) e digerindo-os com enzimas de

restrição específicas, Hall e Smith (1991) distinguiram diferentes padrões, os quais

foram atribuídos aos ramos A, M e C.

Em 1993, Garnery et al. descreveram uma metodologia que requer a

digestão do fragmento tRNA leu_ COII com a endonuclease Dra I. Esta técnica se

tornou amplamente utilizada em trabalhos sobre biogeografia e introgressões de

A. mellifera, seja na Europa (Garnery et al., 1995; Franck et al., 1998, 2000a;

Palmer et al., 2000), Ilhas Canárias (De la Rúa et al., 1998, 2001, 2002), África

(Moritz et al., 1994; Hepburn et al., 2000; Franck et al., 2001) ou Oriente Médio

(Franck et al., 2000b). A ampla utilização dessa metodologia se deve à

diferenciação de diversos haplótipos pertencentes aos ramos evolutivos, de

acordo com a distribuição geográfica das subespécies. Dessa forma, segundo

Garnery et al. (1993), cada ramo evolutivo possui uma variante de comprimento

característica para seqüências denominadas de P0 (ramo A), P (ramo M) ou

ausência de P (ramo C). A combinação das variantes P com até três repetições de

seqüências Q (P0Q, P0QQ, P0QQQ, PQ, PQQ, PQQQ e Q) é que caracteriza os

diferentes haplótipos dentro de cada ramo.

Os polimorfismos observados com os marcadores de DNA mitocondrial têm

se mostrado efetivos não somente nos estudos com populações africanas ou

européias, mas também nos trabalhos com as abelhas africanizadas do continente

americano.

De acordo com Smith et al. (1989), 97% das colônias de abelhas

africanizadas do Brasil, Venezuela, Honduras e México foram classificadas como

possuindo DNA mitocondrial africano. Hall e Muralidharan (1989) e Hall e Smith

(1991), sugerem, por meio de resultados obtidos com Bgl II (citb), uma origem via

A. m. scutellata para as abelhas africanizadas, tendo os enxames africanos

(27)

Sheppard et al. (1991), estudando abelhas coletadas no estado de São

Paulo, descreveram que o mtDNA possuía forte influência da subespécie

scutellata.

Na Costa Rica, Lobo (1995) estudou a composição genética de populações

de A.mellifera, analisando os sítios de restrição para Eco RI (16S) e Hinc II (COI).

O autor verificou que os padrões do DNA mitocondrial não indicavam origem

européia das abelhas, dados que contrastavam com os alelos característicos de

populações européias, observados com o marcador bioquímico MDH.

Colônias provenientes do México e Honduras apresentaram mtDNA

africano, porém com uma freqüência de 26 a 31% de alelos de DNA nuclear

europeu (Hall e McMichael, 2001). Segundo os autores, estes resultados sugerem

que as rainhas descendentes das africanas introduzidas no Brasil se acasalaram

com zangões europeus, permitindo a incorporação de marcadores neutros que

têm sido mantidos na população africanizada em expansão.

No Brasil, as abelhas africanizadas analisadas por Rotta (1999)

apresentaram padrões predominantemente africanos, de acordo com os

fragmentos originados pela endonuclease Bgl II para o loco citb, a despeito dos

resultados obtidos com as alozimas que indicaram uma freqüência de mais de

20% de alelos europeus nas abelhas brasileiras de certas áreas.

A utilização dos padrões gerados para o fragmento da região tRNA leu_ COII

tem sido observada em trabalhos realizados não somente com subespécies da

Europa, África ou Oriente Médio, como também têm contribuído com os estudos

que envolvem o processo de africanização na América.

Amostras de abelhas africanizadas da Costa Rica (Segura, 2000),

Venezuela (Clarke et al., 2001) e México (Clarke et al., 2001; Franck et al., 2001)

apresentaram uma predominância dos padrões A1 e A4 para a região tRNA leu_

COII. Tais padrões são característicos de populações de abelhas africanas.

Padrões característicos das subespécies européias ou mesmo outros padrões

(28)

Embora mitótipos africanos sejam predominantes nas populações

africanizadas, Diniz et al. (2003) relataram a presença de um padrão denominado

“português” quando analisaram colônias provenientes do Brasil e Uruguai. Tal

denominação se deve ao fato de haver evidências que apontam Portugal como

possível origem desse padrão. Da mesma forma, Sheppard et al. (1991) já haviam

descrito o mesmo padrão em amostras de abelhas da Argentina.

Amostras de colônias africanizadas da Argentina também apresentaram

resultados com a região tRNA leu_ COII que levaram Sheppard et al. (1999) a

concluir que mais de 25% do DNA mitocondrial africanizado daquele país possuía

origem diferente de A.m. scutellata.

Analisando amostras brasileiras e uruguaias, Ferreira (2002) sugeriu que

seria possível esclarecer a verdadeira origem das abelhas africanizadas por meio

da região tRNA leu_ COII. A autora se baseou nos polimorfismos gerados pela

enzima Dra I para inferir uma possível origem diferente de A.m. scutellata para as

(29)

Justificativa e Objetivos 15

2. Justificativa e Objetivos

De acordo com o exposto na introdução desse trabalho, a despeito dos

resultados obtidos a respeito do processo de africanização utilizando as diferentes

abordagens metodológicas, é possível verificar que alguns pontos ainda exigem

maior atenção:

1. Pelo fato de que os padrões Bgl II diferenciam somente entre a linhagem

européia e africana, uma possível origem mais diversa das colônias africanizadas

não pode ser detectada com este marcador. Portanto, os resultados obtidos por

meio de Bgl II não contribuíram para a caracterização de possíveis linhagens

diferentes na formação das populações africanizadas. Polimorfismos gerados por

outras regiões do DNA mitocondrial de abelhas africanizadas da América sugerem

uma herança mitocondrial mais diversa para essas populações. Portanto, a

análise dos padrões gerados por Dra I na região tRNA leu_ COII podem auxiliar no

esclarecimento da origem mitocondrial das abelhas africanizadas, devido ao

grande número de padrões relacionados às diferentes subespécies pertencentes

aos ramos A, M e C envolvidos no processo de africanização.

2. Resultados gerados pelos polimorfismos nucleares (morfometria,

alozimas e DNA nuclear) apontam uma significativa contribuição de genes

europeus na formação das populações africanizadas. Por outro lado, o DNA

mitocondrial dessas populações tem se mostrado composto quase que

exclusivamente da linhagem africana. Portanto, essa assimetria que

aparentemente existe entre os marcadores nucleares e mitocondriais merece ser

confirmada a partir dos resultados obtidos de um marcador mitocondrial mais

informativo.

Dessa forma, o trabalho entitulado “Estrutura genética das populações de

(30)

Justificativa e Objetivos 16

polimorfismo da região tRNAleu_COII do DNA mitocondrial” tem como objetivo

apresentar os padrões mitocondriais obtidos com a endonuclease Dra I na região

intergênica tRNAleu_COII de amostras do Brasil e Uruguai. Será discutida a relação

desses padrões com a origem européia ou africana das populações de Apis

mellifera das Américas e o quanto esses padrões são informativos para a

compreensão dos processos que levaram à formação dessas populações. A

contribuição desse marcador para o entendimento da provável assimetria entre os

resultados obtidos com marcadores nucleares e mitocondriais também é

abordada.

Durante o desenvolvimento do trabalho proposto, foi possível estabelecer o

uso de nova metodologia, tanto para os estudos das abelhas africanizadas das

Américas como para as demais introduções ocorridas mundialmente. Portanto, o

trabalho “Padrões de PCR-RFLP da região 16S do DNA mitocondrial diferenciam

ramos evolutivos de Apis mellifera” apresenta os resultados obtidos a partir desta

região mitocondrial, que permite identificação mais rápida, barata e segura das

subespécies pertencentes aos três ramos evolutivos de A. mellifera mais

(31)

Referências Bibliográficas 17

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(37)

4. Região 16S 23

4.

Padrões de PCR-RFLP da região 16S do DNA mitocondrial diferenciam

ramos evolutivos de Apis mellifera

Thaís Colleta, Maria Cristina Ariasb, Marco Antonio Del Lamaa

a _{Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São}

Carlos, SP, Brasil

b _{Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São}

Paulo, SP, Brasil

Palavras-chave: Apis mellifera / linhagens evolutivas / diferenciação / DNA mitocondrial /

(38)

4.1. Resumo 16S 24

4.1. Resumo

Análises de padrões de restrição das regiões do DNA mitocondrial podem ser

utilizadas para classificar as subespécies de Apis mellifera nos ramos evolutivos

M, C ou A, propostos por Ruttner et al. (1978) com dados de morfometria. Neste

trabalho, são descritos diferentes padrões de restrição do mtDNA 16S para A. m.

mellifera, A. m. ligustica e A. m. scutellata. Embora distintos padrões tenham sido

obtidos com Eco RI, Alu I, Hinc II and Taq I, a diferenciação mais evidente entre os

três haplótipos foi obtida com Dra I e Vsp. Análises das seqüência nucleotídica do

fragmento do gene 16S revelou 10 sítios de substituição de base (1,35%) entre as

três subespécies, além de duas inserções em A. m. scutellata. A identificação

molecular de subespécies de origem européia tem se baseado no padrão de

restrição do gene mitocondrial CO I com a enzima Hinc II. Entretanto, foram

observados alguns resultados inconsistentes na utilização deste método,

(39)

4.2. Introdução 16S 25

4.2. Introdução

De acordo com evidências filogeográficas e morfométricas, Ruttner et al.

(1978) agruparam as subespécies de Apis mellifera em três linhagens ou ramos

evolutivos: M (Europa Ocidental), C (leste europeu) e A (África). A distribuição

original dos ramos tem sido progressivamente alterada devido às sucessivas

introduções realizadas por apicultores, de forma que, atualmente, as abelhas

pertencentes a essas linhagens podem ser encontradas em várias partes do

mundo. O transporte em larga escala de populações de A. mellifera deu início a

uma “mistura” de linhagens. A compreensão das mudanças na composição

genética das populações residentes, como resultado de introduções em diferentes

áreas geográficas, requer o uso de ferramentas que diferenciam as várias

linhagens de A. mellifera.

A composição genética de populações introduzidas tem sido investigada ao

longo dos últimos 25 anos. Estudos desta natureza foram realizados com as

populações da ilha de Guadalupe (Cornuet, 1979), da Argentina (Sheppard et al.,

1991), da Tasmânia, na Austrália (Oldroyd et al.,1995), nas ilhas Baleares (de la

Rua et al., 2001), Yucatan, no México (Clarke et al., 2001), sul do Brasil e Uruguai

(Diniz et al., 2003), Peru (Quezada-Euán et al., 2003) e Chile (Del Lama et al.,

2004), entre outros. O exemplo mais marcante resultante da introdução de

diferentes subespécies de Apis mellifera em uma área ocorreu na América do Sul.

O evento chave deste processo ocorreu na década de 50, quando a subespécie

africana A. m. scutellata foi introduzida no Brasil com o objetivo de melhorar a

produção de mel no país (Kerr, 1967). Após o escape de algumas rainhas

africanas em 1957 de um apiário onde se encontravam em quarentena, rainhas

africanas iniciaram um processo de intercruzamento com subespécies européias

residentes, iniciando assim o processo de africanização das abelhas

sul-americanas e, posteriormente, da América Central e do Norte. Atualmente,

abelhas Africanizadas são encontradas em grande parte do continente americano,

(40)

populações têm sido realizados para investigar o grau de hibridização entre

abelhas européias e africanas em diferentes regiões (Lobo et al., 1989; Rinderer et

al., 1991;Sheppard et al., 1991; Hall e McMichael, 2001).

A necessidade de caracterizar geneticamente as populações e identificar a

origem materna das colônias levou ao desenvolvimento de métodos capazes de

realizar tal caracterização. Dentre os métodos propostos, os marcadores

mitocondriais têm sido bastante utilizados, pois têm se mostrado efetivos na

diferenciação de populações envolvidas em processos de hibridização (Hall e

Smith, 1991; Garnery et al., 1993).

A metodologia mais utilizada atualmente na identificação da origem materna

das colônias que constituem as populações africanizadas consiste na amplificação

do gene para citocromo B (citB), seguida da restrição com Bgl II. Este teste

determina o padrão europeu (mellifera ou ligustica/carnica) caso um sítio de

restrição esteja presente ou o padrão Africano (scutellata) na ausência deste sítio

(Crozier et al., 1991). Na presença do padrão europeu, o protocolo segue com a

amplificação dos genes CO I e Ls rRNA e a digestão com Hinc II e Eco RI,

respectivamente (Hall e Smith, 1991). O sítio Hinc II para COI caracteriza o

haplótipo mellifera, característico das populações da Europa Ocidental, enquanto

o sítio Eco RI para Ls rRNA constitui o padrão das populações do leste europeu

(ligustica, carnica e caucasica).

Embora os atuais métodos permitam a distinção entre estas subespécies,

fica evidente as vantagens de novos protocolos que minimizem o tempo e os

custos para se obter tal diferenciação. Neste trabalho, nós descrevemos os

padrões de amplificação e restrição da região 16S do DNA mitocondrial em

amostras de Apis mellifera mellifera, Apis mellifera ligustica e abelhas

Africanizadas (Apis mellifera scutellata). Foi observada a ocorrência de ligeiras

diferenças na mobilidade eletroforética do fragmento amplificado em cada

subespécie. Estas diferenças podem ser mais facilmente visualizadas com o uso

de diferentes endonucleases, produzindo padrões de restrição distintos entre

(41)

identificação entre raças dos três ramos evolutivos propostos por Ruttner et al.

(1978) empregando uma única região do genoma mitocondrial, eliminando a

necessidade de amplificação de outras regiões. Análises comparativas entre o

método aqui proposto e os procedimentos anteriores (Crozier et al., 1991; Hall e

Smith, 1991) demonstraram que o novo método evita certas inconsistências que o

(42)

4.3. Material e Métodos 16S 28

4.3. Material e Métodos

4.3.1. Amostras e Extração de DNA

Foi amostrado um total de 290 colônias, sendo 39 de A. m. mellifera, 86 de

A. m. ligustica e 165 de abelhas africanizadas (AHB). Uma operária foi analisada

para cada colônia e as localidades de coleta estão descritas na Tabela I. As

abelhas, coletadas de colônias ferais ou apiários, foram mantidas a –200 C. O

DNA total foi extraído do tórax de cada indivíduo, de acordo com o método

fenol-clorofórmio descrito por Sheppard e McPheron (1991).

4.3.2. Amplificação por PCR e Digestão com Endonucleases

As regiões do DNA mitocondrial amplificadas e seus respectivos primers

(Crozier et al., 1991; Hall & Smith, 1991) foram: 485 pb do gene citocromo b (Cit b)

(F: 5’ – TAT GTA CTA CCA TGA GGA CAA ATA TC – 3’ e R: 5’ – ATT ACA CCT

CCT AAT TTA TTA GGA AT – 3’), 1044 pb do gene citocromo oxidase I (COI) (F:

5’- TTA AGA TCC CCA GGA TCA TG – 3’ e R: 5’- TGC AAA TAC TGC ACC TAT

TG – 3’) e parte do gene 16S compreendido entre os primers F: 5’ – TTT TGT

ACC TTT TGT ATC AGG GTT G – 3’ e R: 5’ – CTA TAG GGT CTT ATC GTC CC

– 3’. A PCR foi realizada num volume total de 25µl, contendo tampão de reação

10x, 250µM de cada dNTP, 2,5mM de MgCl2, 1µM dos primers F e R, 1µl de DNA,

1 U de Taq Polymerase (Promega) e 16µl de água esterilizada. A amplificação por

PCR para Cit b e 16S foi realizada da seguinte forma: 900 C por 1 min, 540 C por

45s e 620 C por 2 min. A reações para COI foram submetidas a uma denaturação

inicial de 3 min a 940 C seguida por 3 ciclos de 940 C por 1 min, 500 C por 2 min,

720 C por 3 min; 35 ciclos de 940 C por 1 min seguido por 2 min a 500 C, 1,5 min a

720 C e uma extensão final de 5 min a 720 C. Depois da amplificação, 2 µl dos

produtos de PCR foram submetidos a eletroforese em géis de poliacrilamida 8% e

(43)

Tabela I. Número de colônias de Apis mellifera e seus respectivos países de coleta. As subespécies foram determinadas de acordo com os padrões do mtDNA.

N: número de colônias e n: número de localidades amostradas.

País N (n) Padrões Observados

mellifera ligustica africano

Brasil 60 (31) 60

Chile 36 (27) 17 19

Colômbia 82 (24) 23 59

Espanha 5 (5) 3 2

EUA 13 (1) 13

Itália 46 (3) 18 27 1

Uruguai 48 (6) 1 4 43

(44)

restrição: Eco RI, Alu I, Hinc II, Taq I, Vsp I e Dra I para o fragmento 16S; Bgl II

para Cit b e Hinc IIpara COI. As reações de digestão foram mantidas a 370 C por

4h (exceto para Taq I que necessita de 600 C por 4h). Os fragmentos de restrição

foram separados em géis de poliacrilamida 10%.

Análises de restrição das regiões mitocondriais citocromo b (citb) e COI

foram realizadas para a caracterização molecular comparativa das amostras de

abelhas. Portanto, esta caracterização prévia se deu como um controle para o

padrão da linhagem africana (ausência do sítio Bgl II na região cit b) e para a

diferenciação dentro das subespécies européias (apenas A. m. mellifera possui o

sítio Hinc II na região COI).

Uma digestão dupla foi feita com as enzimas de restrição Eco RI e Vsp I

para as subespécies de A. mellifera a fim de se obter uma diferenciação mais

acentuada entre as três linhagens evolutivas.

4.3.3. Clonagem e Seqüenciamento do DNA

Fragmentos de PCR da região 16S, representando os três padrões de

restrição obtidos, foram clonados utilizando o kit de clonagem T-Easy (Promega) e

utilizados para transformar células competentes DH-5α de E. coli. Os clones

positivos foram selecionados e os vetores recombinantes recuperados e

seqüenciados de acordo com protocolos sugeridos pela Applied Biosystem

(www.appliedbiosystems.com). O seqüenciador automático ABI-3100 (Applied

Biosystems) foi utilizado para seqüenciar as amostras. Dois clones de cada

padrão foram seqüenciados a partir de ambas as direções. Os dados de

seqüência foram analisados por alinhamento múltiplo com o auxílio do programa

(45)

4.4. Resultados 16S 31

4.4. Resultados

As duas subespécies européias e a africanizada apresentaram diferentes

padrões de restrição para a região 16S. Os padrões de Eco RI, Alu I, Hinc II, Taq I,

Vsp Ie Dra I foram característicos para cada subespécie e para as africanizadas.

(Figura 1). Entre os 290 indivíduos analisados, não observou-se variação para os

padrões de amplificação e restrição dentro de cada subespécie.

O tamanho total do fragmento amplificado variou de acordo com a origem

do mtDNA, sendo de 740 pb em A. m. ligustica e A. m. mellifera e 742 em A. m.

scutellata.

Comparações por alinhamento múltiplo das seqüências de DNA revelaram

substituições nucleotídicas em 10 sítios (1,35%), sendo oito transições (1 A↔G e

7 C↔T) e duas transversões (1 A↔T e 1 C↔A) (Figura 2). Além disso, A. m.

scutellata apresentou duas inserções (T e A) nas posições 390 e 391,

respectivamente.

Algumas substituições de base ou inserções ocorreram em sítios de

restrição. O sítio Vsp I na posição 391 foi perdido em A. m. scutellata, devido às

duas inserções. Foi observado também a perda de um sítio Dra I na posição 477

de A. m. ligustica, ocasionado por uma substituição.

A origem racial identificada por Vsp I, Dra I e Eco RI (região 16S) foi

comparada com aquela que se utiliza dos padrões de Bgl II (Cit b) e Hinc II (COI).

Para a maioria das amostras, as duas abordagens moleculares estavam de

acordo. Entretanto, algumas exceções foram observadas com o sítio Hinc II no

gene COI. Por exemplo, duas colônias (que corresponde a 5,55%) do Chile foram

identificadas como mellifera de acordo com Hinc II (COI), mas apresentaram

padrão ligustica por Vsp I, Dra I e Eco RI(16S). Um resultado discordante também

foi obtido em 13% (ou seja, seis colônias) das amostras italianas. Além disso, uma

colônia da Itália (C5) foi tipada com o padrão africano de acordo com Vsp I, Dra Ie

Eco RI (16S) e Bgl II (Cit b), mas o padrão Hinc II (COI) foi característico de

(46)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

A

B

L M S L M S L M S L M S L M S L M S

Hinc _II Vsp _I Alu _II Taq _I Eco _RI

L L M M SS Dra _I

315 pb

215 pb

116 pb 100 pb 92 pb

53 pb 48 pb 4.4. Resultados 16S 32

Figura 1. Padrões de amplificação e restrição do fragmento da região 16S do DNA

mitocondrial de Apis mellifera em géis de poliacrilamida 10% corados com prata. As

enzimas de restrição utilizadas e seus respectivos padrões estão indicados acima. L:

A. m. ligustica, M: A. m. mellifera e S: A. m. scutellata. A: Linhas 10 e 11correspondem aos marcadores de peso molecular de 50pb e 25 pb respectivamente. Linhas 18, 19 e

20 representam os fragmentos amplificados. B: Padrões de restrição obtidos com Dra I

(47)

13770 13811 13961 13990 14018 14025 14159 14182 14190 14352 14383 14405

A. m. ligustica* T A A C C C A C T C T C

A. m. ligustica . . . T G . . .

A. m. mellifera C T G A . T . T C T C T

A. m. scutellata C . G . T T . T C . . T

Figura 2. Sítios de variação do fragmento 16S. Os números correspondem às posições nucleotídicas de A. m. ligustica

(*) publicada por Crozier e Crozier (1993). As posições 14025 e 14159 representam diferenças entre as seqüências

descritas neste trabalho e as de Crozier e Crozier (1993). Os pontos indicam identidade nucleotídica. As abelhas

africanizadas (padrão scutellata) apresentaram duas inserções nas posições 14097 e 14098 (respectivamente 390 e

(48)