UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
JOUSIE MICHEL PEREIRA
Papel da via Angiotensina-(1-7) / receptor MAS e das células progenitoras do
endotélio sobre a revascularização pós-isquêmica de membros posteriores de
camundongos
JOUSIE MICHEL PEREIRA
Papel da via Angiotensina-(1-7) / receptor MAS e das células progenitoras do
endotélio sobre a revascularização pós-isquêmica de membros posteriores de
camundongos
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Ciências Biológicas – Fisiologia e Farmacologia
da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas.
Área de concentração: Fisiologia.
Orientador(a): Prof. Dra. Lucíola da Silva
Barcelos
Co-orientador: Prof. Dr. Robson Augusto Souza
dos Santos
Belo Horizonte
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Angiogênese e Células-tronco e no Laboratório de Hipertensão, ambos do Departamento de Biofísica e Fisiologia
(ICB/UFMG) e integrantes do Instituto Nacional de Ciências e Tecnologia em Nano-Biofarmacêutica (INCT NANO-BIOFAR).
Parte da tese foi realizada em período sanduíche no Laboratório de CardiologiaA.G.
Landmesser CBF, do Departamento de Cardiologia do Charité – Universidade de
Medicina de Berlim (Alemanha).
Agradecimentos
Muitas são as pessoas a quem devo agradecer por esta tese estar hoje concluída:
Agradeço à Deus, pilar sobre o qual me sustento e a quem devo todas as minhas vitórias e sucessos.
Agradeço também aos meus pais, Antônio e Rogéria, pelo amor e apoio incondicional e pela fé inabalável no meu sucesso. Sem vocês nada disso seria possível.
Agradeço aos meus familiares e amigos, por toda torcida e pensamentos positivo enquanto corria atrás desse sonho, e por compreenderem e perdoarem minhas ausências constantes.
À minha orientadora, Lucíola, agradeço pelo voto de confiança dado alguns anos atrás, ao me receber em seu grupo de pesquisa, e por compartilhar seu tempo e conhecimentos. Estes foram essenciais para o desenvolvimento do presente trabalho, bem como para aprimorar minhas habilidades como pesquisadora.
Ao meu co-orientador, Robson, meu muito obrigado por todas as contribuições e orientações, não apenas durante meu doutorado, mas durante todas as etapas já concluídas desde o dia em que escolhi a ciência como profissão.
Agradeço também aos colegas e amigos do laboratório de Hipertensão, em
especial aos amigos Marilene, Daisy e José Roberto e toda a turma “Nobreza pura”:
Augusto, Luciana, Gisele, Aline, Cynthia, Ana Paula, Danielle Coutinho e Danielle Passos. Muito obrigado pelo carinho, lições e disponibilidade em ajudar sempre que possível.
Finalmente, gostaria de agradecer à Nicolle Kränkel por me acolher em seu grupo de pesquisa durante o período sanduíche do meu doutorado. Por compartilhar seu conhecimento técnico e me orientar na execução de parte dos experimentos, que tanto enriqueceram este trabalho. Obrigado também aos demais pesquisadores do grupo, pela amizade, carinho, conversas, trocas culturais e por toda ajuda oferecida enquanto enfrentei as burocracias e imprevistos envolvidos no processo de mudança e adaptação à um novo país.
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar.
Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota.”
Madre Teresa de Calcuta
“Feliz é quem persegue o vento por aí.”
RESUMO
Este estudo teve como objetivo avaliar o papel do eixo Ang-(1-7)/receptor MAS na revascularização de membros posteriores isquêmicos de camundongos, bem como sobre funções angiogênicas de células progenitoras do endotélio e sobre a terapia celular. Para isso, camundongos C57BL / 6 selvagens (WT) e deficientes para o receptor MAS (MAS-KO) foram submetidos à oclusão permanente da artéria femoral unilateral (OAF), bem com à terapia com células mononucleares da medula (BM-MNC) ou tratamento oral com Ang-(1-7). A recuperação do fluxo sanguíneo dos membros posteriores foi avaliada por imagem de perfusão por laser Doppler. A mobilização de células progenitoras endoteliais da medula óssea para a corrente sanguínea foi avaliada por citometria de fluxo 3 dias após a OAF. As respostas angiogênica e arteriogênica foram avaliadas por análise histológica dos músculos dos membros posteriores, 14 dias após OAF. Foi avaliada ainda a produção de citocinas pró-angiogênicas por ensaio de ELISA nos músculos isquêmicos. O efeito do tratamento com Ang-(1-7) ou o antagonista do receptor MAS, A779, sobre a sobrevivência, adesão e expressão de moléculas de adesão celular (CAMs) por early outgrouth cells (EOCs), bem como a capacidade de migração e formação de estruturas tipo tubo por células endoteliais humanas, foram avaliados in vitro. Observamos que o receptor MAS é superexpresso nos músculos isquêmicos de camundongos WT após a OAF. A neovascularização induzida por OAF foi significativamente reduzida nos músculos de camundongos MAS-KO, tanto em nível de capilares quanto de arteríolas, o que ocasionou uma menor recuperação na perfusão sanguínea do membro isquêmico de animais MAS-KO. A mobilização de células-tronco com potencial angiogênico da medula óssea para a corrente sanguínea, em resposta a OAF, também foi reduzida nos camundongos MAS-KO, ao mesmo tempo em que ocorre uma menor expressão da
quimiocina CXCL12/SDF-1α na musculatura isquêmica. Curiosamente, assim como o
expressão de CAMs pelas EOCs, bem como inibiu a migração de HAECs e formação de estruturas tipo tubo por HMVECs. O tratamento com Ang-(1-7) estimulou a migração de HMVECs e a adesão de EOCs a uma monocamada células endoteliais, sob hipóxia. A terapia celular com BM-MNC, por outro lado, melhorou a recuperação do fluxo sanguíneo em camundongos WT, mas não em camundogos MAS-KO. Em conclusão, nossos dados sugerem que o eixo Ang-(1-7) / receptor Mas desempenha um papel importante na revascularização pós-isquêmica dos membros posteriores e mobilização de células progenitoras do endotélio, bem como é importante para os efeitos da terapia celular.
Palavras-chave: Ang- (1-7), receptor MAS, neovascularização, isquemia de
Abstract
This study aims to evaluate the role of Ang-(1-7) MAS receptor signaling in the revascularization of ischemic hindlimbs in mice, as well as angiogenic functions of endothelial progenitor cells and of cell therapy. For this, C57BL6/6J WT and MAS knockout (MAS-KO) mice were subjected to unilateral permanent femoral artery occlusion (FAO), as well as to therapy with mononuclear bone marrow cells (BM-MNC) or oral treatment with Ang (1-7). Hindlimb blood flow recovery was evaluated by laser Doppler perfusion imaging (LDPI). The mobilization of endothelial progenitor cells from bone marrow into the blood stream was assessed by flow cytometry 3 days after FAO. The angiogenic and arteriogenic responses were evaluated by histological analysis of muscles collected 14 days after OAF. It was also evaluated the production of pro-angiogenic cytokines in ischemic muscles, by ELISA. The effect of treatment with Ang- (1-7) or MAS receptor antagonist, A779, on survival and adhesion capacities and expression of cell adhesion molecules (CAMs) by early outgrouth cells (EOCs), and on migration and tube-like structures formation by human endothelial cells were evaluated in vitro. We observed that MAS receptor is overexpressed in ischemic muscle of WT mice after FAO. The neovascularization induced by FAO was significantly reduced in the muscles of MAS-KO mice, both in capillary as arterioles levels, which caused a reduced recovery in the blood perfusion of the MAS-KO mice ischemic limb. The mobilization of putative angiogenic stem cells from bone marrow to bloodstream, in response to FAO, was also reduced in MAS-KO mice, together with a smaller
expression of CXCL12 / SDF-1α chemokine in ischemic muscles. Interestingly, as well
as the treatment with the antagonist A779 worsened the recovery of blood flow from WT
mice, also oral treatment with Ang- (1-7) had a deleterious effect. In vitro treatment with
in post-ischemic hindlimb revascularization and endothelial progenitor cells mobilization, and is important for cell therapy effects.
