INFLUÊNCIA DO LEVAMISOL NA RESPOSTA IMUNE HUMORAL ANTI-RÁBICA EM BOVINOS

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PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL

INFLUÊNCIA DO LEVAMISOL NA RESPOSTA IMUNE HUMORAL ANTI-RÁBICA EM BOVINOS

LUCIANE NERIS CAZELLA

Presidente Prudente – SP 2009

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PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL

Dissertação apresentada a Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação, Universidade do Oeste Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal. -Área de Concentração:

Fisiopatologia Animal.

Orientador: Prof. Dr. Paulo Eduardo Pardo

Presidente Prudente – SP 2009

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636.085 27 C386i

Cazella, Luciane Neris.

Influência do levamisol na resposta imune humoral anti-rábica em bovinos / Luciane Neris Cazella. – – Presidente Prudente: [s. n.], 2009.

37 f. : il.

Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) –

Universidade do Oeste Paulista, UNOESTE. Presidente Prudente, 2008.

Bibliografia

1. Levamisol. 2. Vacina. 3. Bovinos. I. Título.

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Dissertação apresentada a Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação, Universidade do Oeste Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.

Presidente Prudente, 02 de fevereiro de 2009.

BANCA EXAMINADORA

____________________________________

Prof. Dr. Paulo Eduardo Pardo

Universidade do Oeste Paulista – Unoeste ____________________________________

Prof. Dr. Luís Carlos Vianna

Universidade do Oeste Paulista – Unoeste ____________________________________

Prof. Dr. Avelino Albas

Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios – APTA Presidente Prudente

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DEDICATÓRIA

A Deus, pela oportunidade.

Ao Adair e à Tereza, pelo privilégio de tê-los como pais, por todo amor, incentivo, sinceridade, desprendimento, paciência, otimismo e sabedoria.

Ao meu grande irmão Cláudio e suas jóias raras Luci, Ana Claudia e Luana, pela alegria, fé e fortaleza inabalável estendida generosamente.

Minha eterna gratidão, pois sem vocês a vida não faria sentido!

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AGRADECIMENTO ESPECIAL

Ao Professor Doutor Paulo Eduardo Pardo, a quem sou muito grata pela orientação, confiança e exemplo de profissionalismo.

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AGRADECIMENTOS

Aos docentes do Curso de Mestrado em Ciência Animal da Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE, pelos preciosos ensinamentos: Profª. Drª. Caliê Castilho; Prof.

Dr. Izidoro Francisco Sartor; Profa. Dra. Renata Navarro Cassu; Profª. Drª. Rosa Barilli Nogueira; Prof. Dr. Sérgio do Nascimento Kronka; Profa. Drª. Silvia Franco Andrade; Prof. Dr. Vamilton Alvares Santarém.

Aos funcionários da UNOESTE pela simpatia e eficiência.

Ao Dr. Luis Sousa Lima de Souza Reis pela solidariedade e contribuições.

Ao Laboratório de Raiva do Instituto Butantan, em especial, à Drª. Neuza Maria Frazatti Gallina, pesquisadora da Seção de Raiva do Instituto Butantan.

A todos os colegas de Mestrado.

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RESUMO

Influência do levamisol na resposta imune humoral anti-rábica em bovinos

O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito do levamisol na resposta imune humoral anti-rábica de bovinos primovacinados contra a raiva. Quarenta e dois bovinos, com idade média de 12 meses, foram divididos aleatoriamente em três grupos. Os animais do grupo VL receberam uma dose de levamisol e vacina anti-rábica no dia zero. Nos bovinos do grupo V7L foi aplicada uma dose de vacina no dia zero e, no dia 7, uma dose de levamisol. Nos bovinos do grupo controle (GC), somente uma dose de vacina no dia zero. Utilizou-se uma vacina anti-rábica inativada, liofilizada, desenvolvida pelo Instituto Butantan. Colheram-se amostras de sangue nos dias zero, 30 e 60. Os títulos de anticorpos neutralizantes anti-rábicos foram determinados por meio da técnica de soroneutralização em células BHK21, baseado no Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT) e no Fluorescent Inhibition Microtest (FIMT). Os resultados obtidos mostraram que não houve diferença significativa nos títulos de anticorpos anti-rábicos e nem na freqüência de animais imunizados entre os grupos tratados ou não com levamisol 30 e 60 dias após a vacinação anti-rábica. Conclui-se que a administração de levamisol (6,0 mg/Kg de peso vivo) em bovinos primovacinados contra a raiva, não influenciou a resposta imune humoral anti-rábica.

Palavras-chave: Bovino. Raiva. Levamisol. Resposta imune humoral anti-rábica.

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ABSTRACT

Levamisole influence on the antirabies humoral immune response in bovines

The aim of this study was to evaluate the effect of levamisole on the antirabies humoral immune response in bovines primovaccinated against rabies. Forty-two bovines, about twelve months old, were randomly divided into three groups. Animals from VL group received one dose of levamisole and antirabies vaccine on day zero.

Cattle from group V7L received one dose of antirabies vaccine on day zero and, on day seven, one dose of levamisole. Bovines from control group (GC) were immunized with just one dose of antirabies vaccine on day zero. A lyophilized, inactivated rabies vaccine, developed at Instituto Butantan was used. Blood samples were taken on days zero, 30 and 60. The neutralizing antibody titers were determined by serum neutralization in BHK21 cells, based on the Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT) and on the Fluorescent Inhibition Microtest (FMIT). The results obtained showed that there was not significant difference in neutralizing- antibody titers and neither in the frequency of immunized animals between groups treated and not treated with levamisole 30 and 60 days after antirabies vaccination.

In conclusion, levamisole administration (6.0 mg/kg of body weight) in primovaccinated bovines against rabies did not influence the antirabies humoral immune response.

Key-words: Bovine. Rabies. Levamisole. Antirabies humoral immune response.

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ... 10

2 OBJETIVO ... 11

3 REVISÃO DE LITERATURA ... 12

3.1 Raiva ... 12

3.2 Levamisol ... 17

REFERÊNCIAS ... 19

EXPERIMENTO: Influência do levamisol na resposta imune humoral anti-rábica em bovinos ...27

ANEXO – Paper: Levamisole influence on the antirabies humoral immune response in bovines ………...……… 33

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1 INTRODUÇÃO

A raiva bovina é uma encefalite sem tratamento, causada por um vírus do gênero Lyssavirus (PÁEZ et al., 2003; GIOMETTI et al., 2006; ACHKAR et al., 2007), transmitida, principalmente, pelo morcego hematófago Desmodus rotundus (RIBAS et al., 2003; HANKINS; ROSEKRANS, 2004; VIEIRA, 2007).

Esta doença tem importância mundial por ser uma zoonose e por causar enormes prejuízos econômicos à pecuária (WRIGHT et al., 2002; ALBAS et al., 2006; VIEIRA, 2007). A forma clínica mais freqüente é a paralítica, com sinais de apatia, anorexia, tremores musculares, timpanismo, diminuição dos reflexos, paralisia e morte entre 6 a 8 dias (REIS et al., 2003; LIMA et al., 2005).

A vacinação contínua dos bovinos é a principal forma para controlá-la (AGUILAR-SETIÉN et al., 2002; ALBAS et al., 2005; ALBAS et al., 2006). Entretanto, há vários trabalhos que mostram uma elevada porcentagem de animais vacinados contra a raiva que não atinge títulos de anticorpos anti-rábicos mínimos considerados protetores, permanecendo exposta ao vírus (OLIVEIRA et al., 2000;

ALBAS et al., 2005; REIS, 2007).

O levamisol é um anti-helmíntico sintético, pertencente ao grupo dos imidazotiazóis, de amplo espectro (NAYLOR; HADDEN, 2003). Devido às suas propriedades imunoestimulantes, atribuídas ao incremento da imunidade mediada por células, caracterizadas pelo aumento na função de macrófagos, na diferenciação e proliferação dos linfócitos T (ANDRADE; SANTARÉM, 2002; QUINTERO et al., 2002; TIZARD, 2002), é indicado para aumentar o efeito protetor de algumas vacinas (MOJŽIŠOVÁ et al., 2004; RODRIGUES et al., 2005; MANRIQUE, 2006).

Porém, a influência deste fármaco tem sido pouco testada na resposta imune humoral anti-rábica em bovinos.

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2 OBJETIVO

O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito do levamisol na resposta imune humoral anti-rábica em bovinos primovacinados contra a raiva.

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3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1 Raiva

A raiva é uma doença infecciosa aguda, que causa danos irreparáveis ao sistema nervoso central, resultante principalmente da transmissão do vírus pela mordida de um mamífero contaminado. O agente etiológico da raiva pertence à ordem Mononegavirales, família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus (SOARES et al., 2002; UMEHARA et al., 2002; McGETTIGAN et al., 2003; NEL, 2003; PÁEZ et al., 2003; GIOMETTI et al., 2006; ACHKAR et al., 2007).

O vírus da raiva tem a forma de projétil de arma de fogo (AMASINO;

GARBI; AMASINO, 2002; WU et al., 2002), nucleocapsídeo helicoidal, genoma de RNA não-segmentado, de sentido negativo e simples fita (WUNNER, 2002), diâmetro de 75 nm e comprimento de 100 a 300 nm. As moléculas de proteínas virais estão organizadas formando um envoltório, que protege o ácido nucléico. Em torno deste, há uma membrana fosfolipídica, na qual há espículas de aproximadamente 9 nm, de composição glicoprotéica (AMABIS; MARTHO, 2002).

Estruturalmente, é composto por cinco proteínas: RNA polimerase RNA-dependente (L), glicoproteína de superfície (G), nucleoproteína (N), fosfoproteína (P) e proteína matriz (M) (ALVES et al., 2003; SATO et al., 2004). O antígeno não infeccioso N (nucleocapsídeo) e o G (fixado à membrana envolvente) são responsáveis pelas ações sorológicas do vírus rábico (BEER, 1988). A glicoproteína G, responsável pela ligação do vírus à superfície celular do hospedeiro (WUNNER, 2002) confere proteção à doença, induzindo síntese de anticorpos neutralizantes e resposta imune no hospedeiro (MAILLARD; GAUDIN, 2002; PIZA et al., 2002; GUYATT, 2003). O antígeno N confere bom nível de anticorpos e imunidade duradoura aos animais vacinados (ITO et al., 2001).

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O gênero Lyssavirus está dividido em sete genótipos, com base na seqüência do genoma do nucleocapsídeo: Rabies virus (RABV), compreende a amostra clássica de vírus da raiva, com distribuição mundial, exceto Antártica, Austrália e algumas ilhas; Lagos bat virus (LBV), Mokola virus (MOKV) e Duvenhage virus (DUVV), originários da África; European bat lyssavirus 1 (EBLV-1) e European Bat Lyssavirus 2 – (EBLV-2), originários da Europa; e Australian bat lyssavirus (ABLV), encontrado na Austrália (SERRA-COBO et al., 2002; VELASCO-VILLA et al., 2002; CONSALES; BOLZAN, 2007).

O vírus é mantido em uma ampla variedade de espécies de Carnivora e Microchiroptera (RADOSTITS et al., 2002; KREBS et al., 2005). Esses animais possuem características propícias para a perpetuação do vírus rábico, tais como alta densidade populacional, interações sociais intensas e grande capacidade de deslocamento (HANKINS; ROSEKRANS, 2004; LANGONI et al., 2005).

A via mais comum de transmissão é pela mordida (LANGONI et al., 2007). No entanto, os animais contaminados podem transmitir o vírus rábico pela saliva, outros fluídos e por via transplacentária, infectando seres humanos e animais, quando em contato com morcegos de qualquer espécie, mortos ou vivos, ou mesmo com urina e fezes (DOMINGUES; LANGONI, 2001; RIBAS et al., 2003; SCHEFFER et al., 2007). Em algumas situações, os portadores são inaparentes (DOMINGUES;

LANGONI, 2001).

A raiva foi relatada, no Brasil, em 30 das 138 espécies de morcegos (McCOLL; SETIEN, 2000). No Estado de São Paulo foram identificados por Scheffer et al. (2007), os seguintes gêneros de morcegos envolvidos na manuteção do ciclo da raiva: Artibeus, de hábito alimentar frugívoro; Desmodus (D. rotundus), hematófago; e, os insetívoros Myotis, Eptesicus, Lasiurus, Nyctinomops, Tadarida (T. brasiliensis), Histiotus, Molossus, e Eumops. O que reforça a necessidade de serem realizadas campanhas de vacinação anti-rábica e ações de vigilância para o controle da população quiróptera nos meios urbano e rural (FERRAZ; ACHKAR;

KOTAIT, 2007; LANGONI et al., 2007).

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Apenas as espécies Desmodus rotundus, Dyphilla ecaudata e Diaemus youngi possuem hábito hematófago (KAPLAN, 1985). Dentre as espécies de morcegos hematófagos, o Desmodus rotundus é o mais abundante nas Américas, e tem sido considerado o maior responsável pela transmissão da raiva aos herbívoros, embora haja relatos de isolamento positivo de vírus de morcegos D. ecaudata e D.

youngi (MARQUES, 2003).

O desenvolvimento da enfermidade é influenciado pelo ambiente intracelular, pela resposta imune do hospedeiro, velocidade de replicação e difusão do vírus (MARSCH; BRON, 1997). A replicação local do vírus ocorre quando este se liga aos receptores de acetilcolina (AchR) nos miócitos da área atingida (JUBB;

KENNEDY; PALMER, 1993). A seguir, o vírus invade os neurônios motores através dos neurônios sensoriais e segue via neurônios motores, chegando aos cornos ventrais da medula espinhal e núcleos motores do tronco encefálico, que compõem o sistema nervoso central (SNC). Os que progridem via neurônios sensoriais chegam aos gânglios crânio-espinhais, passando para o SNC. No SNC o vírus se dissemina rapidamente e se dirige para todo o organismo (JUBB; KENNEDY;

PALMER, 1993; MARQUES, 2003).

No local de inoculação, o vírus, face ao seu neurotropismo, amplifica- se em quantidade suficiente para chegar às terminações nervosas, porém insuficiente para ser antigênica. No sistema nervoso ultrapassa a barreira hemato- encefálica, ficando protegido do sistema imune. A produção de anticorpos neutralizantes ocorre somente após a infecção do sistema nervoso central, em resposta a grande quantidade de antígeno viral, atingindo o pico na fase terminal da doença (ZANETTI, 2003).

De acordo com Beer (1988), o período de incubação em bovinos oscila entre duas e oito semanas e a duração da doença é de um a sete dias. Lima et al.

(2005), constataram que a evolução clínica da doença variou de 2 a 8 dias. Marques (2003), afirma que o período de incubação é bastante variável, de semanas a meses e excepcionalmente ano, dependendo da localização do ponto de inoculação, da inervação, da virulência e da quantidade de vírus inoculado.

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Nos bovinos é mais freqüente a forma paralítica. Na raiva paralítica, com lesões principalmente da medula, tronco encefálico e cerebelo (LIMA et al., 2005), o animal se movimenta pouco, com andar cambaleante, pois os reflexos nos membros são reduzidos. Apresenta salivações, secreção nasal, tremores musculares, ranger de dentes. Em seguida entra em decúbito, paralisia e morte (MARQUES, 2003).

Na forma furiosa, com lesões principalmente no cérebro (LIMA et al., 2005), ocorrem alterações de comportamento, com extrema excitabilidade, medo, tremores musculares, timpanismo, agressividade, mugido rouco. Podem lamber e morder a si ou aos outros, apresentar salivação abundante. Deixam de comer e ruminar. Ao final entram em decúbito, com convulsões e morte (MARQUES, 2003).

Além de um exame clínico detalhado é necessário estudo histológico, realização de prova de Imunofluorescência Direta (IFD) e o teste de Inoculação em Camundongos (IC), de diversas regiões do sistema nervoso central (MARQUES, 2003; LIMA et al., 2005). O diagnóstico de laboratório baseia-se na pesquisa dos corpúsculos de Negri. Os quais são inclusões arredondadas ou ovais, de 1-27μm de diâmetro, de caráter protéico, contendo RNA. As cepas isoladas de animais infectados naturalmente são denominadas vírus “de rua”; ao contrário, o vírus cujas cepas são adaptadas a hospedeiros secundários em laboratório, recebe o nome de vírus “fixo” (RADOSTITS et al., 2002).

Os corpúsculos são encontrados no hipocampo, no córtex cerebral, no tronco do encéfalo, na medula espinhal, no cerebelo e nas células das glândulas salivares. A identificação de corpúsculos de Negri assegura o diagnóstico de raiva, mas sua ausência não exclui a doença, podendo estar ausentes em 10 a 25% dos casos (BEER, 1988; MARQUES, 2003). Lima et al. (2005), observaram a presença de 87% de corpúsculos intracitoplasmáticos em casos de raiva em bovinos. Tendo sido observados com maior freqüência e intensidade nos animais que sobreviveram por mais de quatro dias.

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Para realizar diagnóstico diferencial, devem ser considerados todos os processos inflamatórios do SNC, botulismo, poliencefalomalacia, tétano (MARQUES, 2003). Sintomas semelhantes à raiva podem ser observados em transtornos metabólicos, corpos estranhos na região bucofaringoesofágica, estados de dor na região abdominal, parasitismo intenso e intoxicações. Nos bovinos deve ser levada em consideração a obstrução esofágica, necrose do córtex cerebral e intoxicação por chumbo (BEER, 1988).

Devido ao perigo de infecção para outros animais e para o homem, os animais doentes de raiva costumam, em geral, ser sacrificados e eliminados (BEER, 1988). A vacinação é a melhor proteção contra a raiva bovina (RODRIGUES DA SILVA et al., 2000; AGUILAR-SETIÉN et al., 2002; PIZA et al., 2002; ALBAS et al., 2005; ALBAS et al., 2006). O controle da raiva se faz vacinando anualmente todo o rebanho, inclusive bezerros aos 3-4 meses de idade (LIMA et al., 2005). Albas et al., (1998); Oliveira et al., (2000); Rodrigues da Silva et al., (2000); Albas et al., (2005);

Albas et al., (2006), Reis (2007) recomendam a aplicação de dose de reforço de vacina anti-rábica para os animais primovacinados atingirem títulos de anticorpos considerados protetores e persistentes.

A titulação de anticorpos é usada como referência de proteção contra o vírus rábico. A Organização Mundial da Saúde considera como indicador para avaliar a eficácia da vacina e do tratamento em humanos e animais, a determinação de anticorpos neutralizantes contra o vírus da raiva, e como resposta de imunidade título igual ou acima de 0,5UI/ml (ALBAS et al., 2006; RIGO; HONER, 2006; WHO, 2006). O teste mais usado é o Rapid Fluorescent Focus Inibition Test (RFFIT) (RIGO; HONER, 2006; SMITH; YAGER; BAER, 2006).

A imunização pela vacina com microorganismos inativados pode ser ainda potencializada pela administração de um adjuvante que estabelece uma memória em longo prazo contra os antígenos solúveis (TIZARD, 2002).

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3.2 Levamisol

O levamisol é um anti-helmíntico sintético, pertencente ao grupo dos imidazotiazóis, de amplo espectro (GARFIAS, 1994; TIZARD, 2002; NAYLOR;

HADDEN, 2003), ativo contra nematódeos, comumente utilizado no controle de parasitoses em bovinos (MULCAHY; QUINN, 1986). É administrado por vias subcutânea e oral, com rápida absorção e excreção. Aproximadamente 2% do princípio são eliminados pela respiração e, 40%, na urina em 12 horas. Em oito dias, 41% são eliminados nas fezes, sendo que a maior parte é eliminada em 12 a 24 horas (McDONALD; BOOTH, 1992).

As propriedades imunoestimulantes deste fármaco são atribuídas ao incremento da imunidade mediada por células, caracterizadas pelo aumento da diferenciação e proliferação dos linfócitos T e da atividade dos linfócitos efetores (ANDRADE; SANTARÉM, 2002; QUINTERO et al., 2002; TIZARD, 2002; NAYLOR;

HADDEN, 2003). Além disso, aumenta a síntese protéica na atividade receptora da membrana para IgG e C3, a blastogênese e a fagocitose, por meio de células polimorfonucleares (CUESTA; ESTEBAN.; MESEGUER, 2002); potencializa a produção de interferons e aumenta a atividade fagocitária de macrófagos e neutrófilos (TIZARD, 2002; ZALDÍVAR et al., 2003), normalizando a resposta imunológica inadequada, restaurando o bom funcionamento dos mecanismos de defesa (CUESTA; ESTEBAN.; MESEGUER, 2002; QUINTERO et al., 2002).

Devido a sua capacidade de estimular a resposta aos antígenos, é indicado para aumentar o efeito protetor de algumas vacinas (MOJŽIŠOVÁ et al., 2004; RODRIGUES et al., 2005; MANRIQUE, 2006). Atua de forma inespecífica, restaurando a resposta imune humoral e celular. Os imunomoduladores de ação inespecífica são agentes que estimulam ou suprimem a resposta imune sem que a atividade das células estimuladas seja dirigida a um antígeno determinado (ZALDÍVAR et al., 2003; MANRIQUE, 2006; APPOLINÁRIO; MEGID, 2007).

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Em pacientes submetidos à hemodiálise e vacinados contra hepatite B, aumentou significativamente a quantidade e a persistência dos títulos de anticorpos por até seis meses (ARGANI; AKHTARISHOJAIE, 2006). Entretanto, verificou-se que em crianças, com idade entre 6 e 14 anos, com hepatite B que receberam três doses de vacina HBsAg e 2,5 mg/kg/dia de levamisol, três vezes por semana, durante três meses não houve diferença no tratamento quando comparadas com crianças que receberam apenas a vacina (DEMİRCİ et al., 2005).

No tratamento contra Leishmania (L.) Amazonensis em camundongos, o fármaco estimulou o sistema imunológico, aumentando os níveis da imunoglobulina IgG, atuando na ativação dos macrófagos e dos fagolisossomos, proporcionando melhora transitória no aspecto clínico da lesão (RODRIGUES, 2005).

Cães vacinados contra parvovirose e tratados com 3,5 mg/kg de levamisole apresentaram aumento significativo na produção de anticorpos que, consequentemente, elevou a eficácia da vacinação, comprovando o efeito imunoestimulante do levamisol (MOJŽIŠOVÁ et al., 2004).

Cáceres, Mc Gil e Peña (2001), verificaram que o levamisol estimulou o sistema imune em leitões com baixo peso ao nascimento e os protegeu em casos de estresse ambiental. Devido a uma maior resistência às enfermidades, os nutrientes podem ser mais bem utilizados e, portanto melhora o crescimento e o ganho de peso.

Administrada oralmente uma dose de 0,5 mg/kg de levamisol, 7 dias antes e novamente junto com a vacinação, aumentou a resposta de anticorpos ao vírus de febre aftosa em búfalas prenhes (QURESHI et al., 2000).

Bracamonte, Morales e Plaza (2007), relataram que ovelhas prenhes de três meses, vacinadas contra a raiva e desverminadas com levamisol simultaneamente, tiveram aumento na produção e na persistência de anticorpos anti-rábicos em relação ao grupo controle.

Babiuk e Misra (1982) observaram títulos de anticorpos mais elevados quando o levamisol foi administrado em bezerros, na dose de 6,0 mg/kg de peso corporal, sete dias após a vacinação contra rinotraqueíte infecciosa bovina.

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REFERÊNCIAS

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Experimento:

Influência do levamisol na resposta imune humoral anti-rábica em bovinos

Artigo enviado para publicação na revista:

The Veterinary Record – The British Veterinary Association, UK

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Influência do levamisol na resposta imune humoral anti-rábica em bovinos

L. N. CAZELLA, P. E. PARDO, N. M. FRAZATTI-GALINA, L. S. L. S. REIS

L. N. CAZELLA, estudante de mestrado, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE, Presidente Prudente, SP, Brasil.

P. E. PARDO, Ms, Ph.D, Departmento de Clínica Veterinária, Universidade do Oeste Paulista, UNOESTE, Presidente Prudente-SP, Brasil, CEP 19067-175.

N. M. FRAZATTI-GALLINA, Ph.D, Instituto Butantan, São Paulo-SP, Brasil, CEP 05503-900.

L. S. L. S. REIS, Ms, Ph.D, Médico Veterinário, Brasil.

O endereço atual de Cazella é Rodovia Raposo Tavares, km 572, Bairro Limoeiro, Presidente Prudente, SP, Brasil, CEP 19067-175. E-mail:

lucianecazella@gmail.com

A raiva bovina é uma encefalite fatal, causada por um vírus do gênero Lyssavirus, transmitida principalmente pelo morcego Desmodus rotundus (Achkar et al., 2007), sem tratamento, sendo a vacinação contínua dos animais a melhor forma de controlá-la (Albas et al., 2005).

O levamisol é um anti-helmíntico sintético, com propriedade imunoestimulante (Naylor; Hadden, 2003). Porém, a influência deste fármaco tem sido pouco testada na resposta imune humoral anti-rábica em bovinos.

Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito do levamisol na resposta imune humoral anti-rábica em bovinos primovacinados contra a raiva.

Quarenta e dois bezerros (raça Nelore), com idade aproximada de 12 meses, mantidos em uma fazenda em Presidente Bernardes, SP, Brasil, foram estudados.

Os animais foram distribuídos aleatoriamente, em três grupos experimentais (14 bovinos/grupo): o grupo controle (GC) recebeu uma dose de vacina anti-rábica no dia zero do experimento; o grupo VL recebeu no dia zero uma dose de vacina anti-

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rábica e uma dose de 6,0 mg de levamisol/Kg de peso vivo; e o grupo V7L recebeu uma dose de vacina anti-rábica no dia zero e 7 dias após a vacinação foi aplicada uma dose de 6,0 mg de levamisol/Kg de peso vivo.

Foi utilizado o levamisol Ripercol L 150F^®, produzido pela empresa Fort Dodge, e a vacina anti-rábica inativada e liofilizada desenvolvida pelo Instituto Butantan, SP, Brasil.

As amostras de sangue foram colhidas nos dias zero, 30 e 60 mediante punção na veia jugular, em tubos a vácuo sem anticoagulante e centrifugados por 10 minutos, a 2.500 rpm. As amostras dos soros foram acondicionadas em tubos de plásticos de 1,5 mL e mantidas em freezer a -20^oC para posterior determinação dos títulos de anticorpos neutralizantes anti-rábicos pelas técnicas Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT) (Smith et al., 1996) e Fluorescent Inhibition Microtest (FIMT RFFIT) (Zalan et al., 1979).

Os dados obtidos dos títulos de anticorpos anti-rábicos violaram a premissa da normalidade, teste de Shapro-Wilk (W<0,870). Assim, para comparar os títulos de anticorpos anti-rábicos entre os grupos experimentais aplicou-se a análise de variância de Kruskal-Wallis (H). Para comparar os dias de observação aplicou-se teste pareado de Wilcoxson (T) (Zar, 1999). E, para as comparações das freqüências de animais considerados imunizados entre os tratamentos no mesmo dia do experimento, e depois entre estes dias dentro de cada tratamento, utilizou-se o teste de proporções de Goodman (Curi; Moraes, 1981).

No dia zero, os soros dos animais foram não reativos para raiva, indicando que estes animais não haviam tido contato com o vírus rábico ou vacina anti-rábica.

Assim, as variações encontradas nos títulos de anticorpos anti-rábicos foram induzidas pelos tratamentos.

Observa-se na Tabela 1 que não houve diferença significativa (P>0,05) entre os títulos de anticorpos anti-rábicos entre os grupos experimentais nos dias 30 e 60.

Portanto, o levamisol (6,0 mg de levamisol/Kg de peso vivo) aplicado no momento da vacinação (grupo VL) ou 7 dias após a vacinação (V7L) não apresentou efeito imunoestimulante para os bovinos primovacinados contra a raiva. O que comprova a afirmação de Zaldívar et al. (2003), que relataram que este fármaco teve pouco ou nenhum efeito sobre o sistema imune de animais sadios. Mas, que diverge dos resultados obtidos por Babiuk e Misra (1982) que indicaram títulos de anticorpos mais elevados quando o levamisol foi administrado em bezerros, na dose de 6.0

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mg/kg de peso corporal, 7 dias após a vacinação contra rinotraqueíte infecciosa bovina.

A Organização Mundial de Saúde (OMS) recomenda, para que um indivíduo esteja protegido contra o vírus rábico, título de anticorpos anti-rábicos ≥ 0,5 UI/mL.

Em estudos realizados por Albas et al. (2005) e Reis et al. (2008), este título de anticorpos também foi considerado protetor para os bovinos.

A ausência do efeito imunoestimulante do levamisol (6,0 mg de levamisol/Kg de peso vivo) ficou comprovado pela baixa freqüência de bovinos considerados imunizados contra o vírus rábico (título de anticorpos ≥ 0,5 UI/mL) nos grupos VL e V7L (Tabela 1). Além disso, esta freqüência dos grupos VL e V7L é 27,3% e 54,5%

menor, respectivamente, em relação à do grupo GC. Fato que é insatisfatório para o controle da raiva em bovinos. Entretanto, o grupo controle (GC) apresentou freqüência satisfatória de bovinos considerados imunizados contra o vírus rábico no dia 60. Mesmo assim, não houve diferença significativa (P>0,05) entre as freqüências de bovinos considerados imunizados (Tabela 1).

Todos os grupos experimentais apresentaram redução significativa (P<0,05) nos títulos de anticorpos anti-rábicos, independente do tratamento ou não com o levamisol (grupos VL, V7L e GC) (Tabela 1). Desta forma, não houve persistência dos títulos de anticorpos após a primovacinação em bovinos. Isso indica a necessidade da aplicação de uma dose de reforço da vacina anti-rábica em bovinos primovacinados para obterem títulos de anticorpos considerados protetores e persistentes. Os resultados corroboram com Albas et al. (2005) e Reis et al. (2008) que recomendaram a vacinação anti-rábica de reforço em bovinos primovacinados.

Em conclusão, a administração de levamisol (6,0 de levamisol/Kg de peso vivo) em bovinos primovacinados contra a raiva não apresentou efeito imunoestimulante.

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Tabela 1- Médias (± dp) dos títulos de anticorpos anti-rábicos dos bovinos pertencentes aos grupos GC, VL e V7L.

Títulos de anticorpos anti- rábicos (UI/mL)

% de bovinos considerados imunizados*

Dias de observação Dias de observação Grupos

30 60 30 60 GC 1,30^a ± 1,27 0,78^b ± 0,55 85,71 78,57

VL 0,73^a ± 0,71 0,53^b ± 0,43 85,71 57,14 V7L 0,71^a ± 0,99 0,49^b ± 0,46 57,14 35,71

a,b indicam diferença significativa (P<0,05) entre os títulos de anti-corpos anti-rábicos entre os dias de observação em um mesmo grupo experimental.

*Considerou-se animais imunizados contra a raiva todos aqueles que apresentaram títulos de anticorpos anti-rábicos ≥ 0,5 UI/mL.

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Anexo – Paper:

Levamisole influence on the antirabies humoral immune response in bovines

L. N. CAZELLA, P. E. PARDO, N. M. FRAZATTI-GALINA, L. S. L. S. REIS

L. N. CAZELLA, master’s student, Program of Post-Graduation in Animal Science, Universidade do Oeste Paulista, UNOESTE, Presidente Prudente, SP, Brazil.

P. E. PARDO, Ms, Ph.D, Department of Veterinary Clinic, Universidade do Oeste Paulista, UNOESTE, Presidente Prudente, SP, Brazil, CEP 19067-175.

N. M. FRAZATTI-GALLINA, Ph.D, Instituto Butantan, São Paulo, SP, Brazil, CEP 05503-900.

L. S. L. S. REIS, Ms, Ph.D, Veterinarian, Brazil.

Cazella’s present address is Rodovia Raposo Tavares, km 572, Bairro Limoeiro, Presidente Prudente, SP, Brazil, CEP 19067-175. E-mail:

lucianecazella@gmail.com

Bovine rabies is a fatal encephalitis, caused by a virus of the genus Lyssavirus, transmitted mainly by the bat Desmodus rotundus (Achkar and others 2007), without treatment, being the continuous vaccination of the animals, the best way to control it (Albas and others 2005).

Levamisole is a synthetic anthelmintic with immunostimulant property (Naylor and Hadden, 2003). However, the influence of this drug has been little studied on the antirabies humoral immune response in bovines.

Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of levamisole on the antirabies humoral immune response in bovines primovaccinated against rabies.

Forty-two calves (breed Nelore), about 12 months old, maintained in a farm in Presidente Bernardes, SP, Brazil, were studied. Animals were randomly divided into 3 experimental groups (14 bovines/group): control group (GC) received one dose of rabies vaccine on day zero of the experiment; VL group received on day zero one

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dose of rabies vaccine and one dose of 6.0 mg of levamisole/kg of body weight; and the V7L group received one dose of rabies vaccine on day zero and, 7 days after vaccination, one dose of 6.0 mg of levamisole/kg of body weight.

It was utilized the levamisole Ripercol L 150F^®, produced by the company Fort Dodge, and the inactivated and lyophilized rabies vaccine developed at Instituto Butantan, Brazil.

Blood samples were collected on days 0, 30 and 60 from the jugular vein, in vacuum tubes with no anticoagulant and centrifuged 2500 rpm, 10 minutes. Serum samples were placed into plastic tubes of 1.5 mL and stored at -20^oC for further determination of rabies-neutralizing antibodies by the techniques Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT) (Smith and others 1996) and Fluorescent Inhibition Microtest (FIMT RFFIT) (Zalan and others 1979).

Data obtained from the antirabies antibodies titers violated the premise of the normality, Shapro-Wilk test (W<0.870). So, to compare the neutralizing antibodies titers between the experimental groups it was applied the analysis of variance of Kruskal-Wallis (H). To compare the observation days it was utilized the non parametric test of Wilcoxson (T) (ZAR, 1999). And, to the comparisons of the frequencies of immunized animals between the treatments at a same day of the experiment, and after between these days inside each treatment, it was utilized the Goodman proportions test (Curi and Moraes, 1981).

On day zero, serum was not reactive to rabies, indicating that none of the animals had contact with the rabies virus or rabies vaccine. Thus, the variations found on the antirabies antibodies titers were induced by the treatments.

Table 1 shows that there was not significant difference (P>0.05) on the antirabies antibodies titers between experimental groups on days 30 and 60. This way, levamisole (6.0 mg of levamisole/Kg of body weight) applied on the moment of the vaccination (VL group) or 7 days after vaccination (V7L) did not present immunostimulant effect to the bovines primovaccinated against rabies. Fact that proves Zaldívar and others (2003) statement, who related that this drug had little or no effect on the immune system of healthy animals. But, that diverges from the results obtained by Babiuk and Misra (1982) that indicated the highest antibodies titers when levamisole was administered in calves, on the dose of 6.0 mg of levamisole/kg of body weight, 7 days after infectious bovine rhinotracheitis vaccination.

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The World Health Organization (WHO) recommends, to the protection of an individual against rabies virus, antibodies titer ≥ 0.5 UI/mL. In studies realized by Albas and others (2005) and Reis and others (2008), this antibodies titer was also considered protective to bovines.

The absence of the levamisole immunostimulant effect (6.0 mg/Kg of body weight) was proved with the low frequency of bovines considered immunized against rabies virus (antibodies titer ≥ 0.5 UI/mL) on the groups VL and V7L (Table 1).

Beyond that, the frequency of the groups VL and V7L is 27.3% and 54.5% smaller than GC group, respectively. Fact that is unsatisfactory to the rabies control in bovines. However, control group (GC) presented satisfactory frequency of bovines considered immunized on day 60. Even so, there was not significant difference (P>0.05) between the frequencies of bovines considered immunized (Table 1).

All the experimental groups presented significant reduction (P<0.05) on the antirabies antibodies titers independent of the treatment or not with levamisole (groups VL, V7L and GC) (Table 1). Therefore, there was not persistence on the antibodies titers after primovaccination in bovines. This indicates the necessity of the application of a booster dose of the rabies vaccine in primovaccinated bovines to achieve antibodies titers considered protective and persistent. The results corroborate with Albas and others (2005) and Reis and others (2008) that recommend the application of booster dose of the rabies vaccine to the primovaccinated animals.

In conclusion, levamisole administration (6.0 mg of levamisole/Kg of body weight) in bovines primovaccinated against rabies, did not present immunostimulant effect.

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References