AÇÃO ANTIESPASMÓDICA DO TRANS-CARIOFILENO E O BLOQUEIO DE CANAIS PARA Ca

LEIDIANE PINHO DA SILVA

AÇÃO ANTIESPASMÓDICA DO TRANS-

CARIOFILENO E O BLOQUEIO DE CANAIS PARA Ca

EM MÚSCULO LISO TRAQUEAL DE RATO.

FORTALEZA - CEARÁ

2010

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LEIDIANE PINHO DA SILVA

AÇÃO ANTIESPASMÓDICA DO TRANS-

CARIOFILENO E O BLOQUEIO DE CANAIS PARA Ca

EM MÚSCULO LISO TRAQUEAL DE RATO.

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Estadual do Ceará como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.

Orientador: Prof. Dr. José Henrique Leal Cardoso

FORTALEZA

2010

P654a Pinho-da-Silva, Leidiane

Ação antiespasmódica do trans-cariofileno e o bloqueio de canais para Ca²⁺ em músculo liso traqueal de rato/ Leidiane Pinho da Silva. – Fortaleza, 2010.

95p; il.

Orientador: Prof. Dr. José Henrique Leal Cardoso.

Dissertação (Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas) – Universidade Estadual do Ceará, Centro de Ciências da Saúde.

1. Ação antiespasmódica do trans-cariofileno 2.

Bloqueio de canais para Ca²⁺ 3. Músculo liso traqueal de rato. I. Universidade Estadual do Ceará, Centro de Ciências da Saúde.

CDD: 599.3233

LEIDIANE PINHO DA SILVA

AÇÃO ANTIESPASMÓDICA DO TRANS-CARIOFILENO E O BLOQUEIO DE CANAIS PARA Ca²⁺ EM MÚSCULO LISO TRAQUEAL DE RATO.

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas, Centro de Ciências da Saúde da Universidade Estadual do Ceará como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.

Aprovada em 12/03/2010

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________

Prof. Dr. José Henrique Leal Cardoso Universidade Estadual do Ceará – UECE

(Orientador)

_______________________________________

Profª. Dra. Roseli Barbosa

Universidade Estadual do Ceará – UECE

_____________________________________

Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães Universidade Federal do Ceará – UFC

A Deus, por tudo...

Aos meus pais

Aos meus irmãos

Dedico este trabalho.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais Jorge Silva Mota e Neuza Mesquita Mota pelo muito que sou hoje.

Aos meus irmãos Alexandrina Mesquita Mota, Izaura Mesquita Mota, Jorge Silva Mota Filho e Sebastião Mesquita Mota por toda a convivência e apoio.

Aos meus sobrinhos Ana Júlia Mota, Caio Abreu Mota, Estevão Mota Sousa, Gabriel Abreu Mota, João Tomé de Souza Neto, Jorge Alan Mota, Jorge Silva Mota Neto, Rebeca Mota Brito e Samara Mota Brito, minhas pedras preciosas.

Aos grandes amigos, Aline Sales de Paula Campelo, Flávio Henrique Pequeno de Macedo, Natália Veloso Fontenelle Camelo Rodrigues e Taylena Maria do Nascimento Garcia Teófilo as quais compõem os pilares de sustentação da minha vida e sem as quais eu não teria chegado até aqui.

Ao meu orientador Prof. Dr. José Henrique Leal Cardoso por me aceitar como orientanda e tornar possível a realização desta pesquisa e da minha formação como pesquisadora. Pela oportunidade, ensinamentos e incentivos nas horas que nem a mestranda acreditava que conseguiria. Muito obrigada por tudo.

Ao Dr. Jáder dos Santos Cruz por me aceitar no seu laboratório e por todas as suas contribuições.

Aos muitos amigos Adriana Silva, Ana Carolina, Angélica França, Ariadna Zambelli, Daiana Cardoso, Daniel Lobo, Denise Morais, Dieniffer Neves, Eduardo Augusto, Eugênio Pacelli, Felipe Crescêncio, Francisco Walber, Gabriela Marques, Graciana Costa, Humberto Cavalcante, Jones Baroni, Kerly Shamyra, Liza Aguiar, Luiza Michel, Márcia Zambelli, Paula Virgínia, Raquel Fontenelle, Rebeca Maia, Rebouças Júnior, Sandra Moraes, Sara Escudeiro, Thiago Coutinho, Tina Sousa, Vânia Cecatto, etc. que estiveram sempre comigo antes durante e depois da graduação e que muito contribuíram para a minha formação pessoal e intelectual.

A todos os membros do Laboratório de Eletrofisiologia que certamente contribuíram, direta ou indiretamente, para que esse trabalho desse certo.

Aos alunos de iniciação científica Andressa Rocha, Bruna Contarini, Carlos Nogueira, Christiane Freitas, Eduardo Augusto, Taylena Maria e Valéria Carneiro por toda a colaboração e convivência.

Às alunas especiais Ana Lucy, Priscila Jacely, Renata Trajano, Suliana Benevides e Valéria Carneiro por toda a interação, ensino e aprendizagem mútuos.

Aos colegas do Curso de Mestrado em Ciências Fisiológicas pela cumplicidade e troca de experiência.

A todos os professores do Curso de Mestrado em Ciências Fisiológicas por todas as contribuições.

A todos os membros do Laboratório de Membranas Excitáveis e de Biologia Cardiovascular, Laboratório de Eletrofisiologia Celular e Laboratório de Fisiologia Cardiovascular (Em especial à Profª. Dra Virgínia Soares Lemos e aos alunos José Felippe Pinho da Silva e Luciano dos Santos Aggum Capettini), que muito contribuíram para execução de parte do projeto.

Às Alunas da Universidade Federal da Paraíba Islânia Giselia Albuquerque e Dra. Darizy Flávia Silva.

Aos Professores Mohamed Saad Lahlou e Andrelina Noronha Coelho de Souza por terem participado da minha qualificação e muito contribuído com criteriosa avaliação.

Ao Francisco José Ferreira dos Santos, José Gladson Salima e Pedro Militão Albuquerque Neto e aos guardas: Albano Menezes, Hosternes Trindade, Ivan Menezes de Carvalho e Agamenon de Brito, pelo apoio e atenção no Instituto.

A Ecila Maria Barros Magalhães, Maria Lindalva Cruz Moura e José Honório Ferreira por todo o apoio cabível a eles.

A Universidade Estadual do Ceará pela oportunidade de realizar esta pesquisa.

A todos aqueles que de forma direta ou indireta fizeram parte deste trabalho, minha gratidão.

Vem, que a tempestade já não pode te abalar A segurança em meu barco encontrarás.

Confia em mim e o meu amor te abrigará.

Sei, que angustiado o coração se endureceu, Mas eu entendo tudo que te aconteceu, Ainda é tempo de voltar para o teu Deus.

Não tenhas medo, pois eu estou aqui

É o teu Senhor quem diz: quero guiar os passos teus.

Vem, entrega-te então, farei morada em teu coração, E quando anoitecer, cansado eu te encontrar,

No silêncio teu, eu irei te consolar.

Nos braços meus descansarás.

Forças te darei Forças te darei

Não tenhas medo, pois eu estou aqui

É o teu Senhor que Diz: Quero guiar os passos teus.

Vem entrega-te então, farei morada em teu coração, E quando anoitecer, cansado eu te encontrar,

No silêncio teu, eu irei te consolar.

Nos braços meus descansarás.

Forças te darei Forças te darei

Música Confia em Mim (Vida Reluz)

RESUMO

Trans-cariofileno é um constituinte importante em várias espécies de óleos essenciais de plantas medicinais usadas na medicina popular do Brasil, pertence à classe química dos sesquiterpenos e tem sido submetido a vários estudos. Aqui, o efeito deste constituinte foi avaliado no músculo liso da via aérea. As atividades biológicas do trans-cariofileno foram avaliadas em anéis de traquéia em banhos de órgãos isolados para investigar o seu efeito no tônus basal. Os acoplamentos eletromecânico e farmacomecânico foram avaliados através de respostas a despolarização por K⁺ e acetilcolina (ACh), respectivamente. Células isoladas do músculo liso traqueal de rato foram usadas para investigar o efeito do trans- cariofileno em canais para Ca²⁺ dependentes de voltagem na configuração “whole- cell” da técnica de patch-clamp. O trans-cariofileno apresentou uma eficiência maior no bloqueio do acoplamento eletromecânico, enquanto que no acoplamento farmacomecânico ele apresentou menor efeito inibitório. Curiosamente, a remoção do epitélio intensificou o relaxamento induzido por trans-cariofileno em músculo liso traqueal pré-contraído por 80 mM de KCl. A remoção do epitélio, ao contrário, não modificou a resposta obtida com o trans-cariofileno no acoplamento farmacomecânico e no tônus basal do músculo liso traqueal. Com o meio externo livre de Ca²⁺ a pré-exposição ao trans-cariofileno reduziu a contração induzida por ACh em músculo liso traqueal de rato isolado com o epitélio presente. Na configuração “whole-cell”, o trans-cariofileno (3mM) inibiu a corrente de entrada de Ba²⁺ (IBa) para aproximadamente 50% dos níveis controle. O trabalho demonstrou que o trans-cariofileno apresentou uma atividade anti-espasmódica no músculo liso traqueal de rato que pode ser explicada, pelo menos em parte, através do bloqueio de canais para Ca²⁺ dependentes de voltagem.

Palavras – chave: Trans-cariofileno; músculo liso traqueal de rato;

antiespasmódico; canais para Ca²⁺ dependentes de voltagem.

ABSTRACT

Trans-caryophyllene is a major component found in essential oils of various species of medicinal plants used in popular medicine in Brazil. It belongs to the chemical class of sesquiterpenes and has been the subject of a number of studies. Here, the effects of this compound were evaluated in airway smooth muscle. The biological activities of trans-caryophyllene were examined in isolated bath organs to investigate the effect in basal tonus. Electromechanical and pharmacomechanical couplings were evaluated through the responses to K⁺ depolarization and acetylcholine (ACh), respectively. Isolated cells of rat tracheal smooth muscle were used to investigate trans-caryophyllene effects on voltage-dependent Ca²⁺ channels by using the “whole- cell” voltage-clamp configuration of the patch-clamp technique. Trans-caryophyllene showed more efficiency in the blockade of electromechanical excitation-contraction coupling while it has only minor inhibitory effect on pharmacomechanical coupling.

Interestingly, epithelium removal amplifies trans-caryophyllene-induced relaxation on tracheal smooth muscle pre-contracted with high extracellular K⁺ concentration. On the contrary, epithelium removal does not modify tracheal smooth muscle response elicited by trans-caryophyllene in both the pharmacomechanical coupling and basal tonus. Under Ca²⁺-free conditions, pre-exposure to trans-caryophyllene reduced the contraction induced by ACh in isolated rat tracheal smooth muscle in the presence of intact epithelium. In the “whole-cell” configuration, trans-caryophyllene (3 mM), inhibited the inward Ba²⁺ current (IBa) to approximately 50% of control levels.

Altogether, our results demonstrate that trans-caryophyllene has anti-spasmodic activity on rat tracheal smooth muscle which could be explained, at least in part, by the voltage-dependent Ca²⁺ channels blockade.

Keywords: Trans-caryophyllene; rat tracheal smooth muscle; anti-spasmodic;

voltage-dependent Ca²⁺ channels.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS...14

ABREVIATURAS ... 16

1 INTRODUÇÃO ... 19

1.1 Plantas Medicinais ... 20

1.2 Óleos essenciais ... 23

1.3 Constituintes de óleos essenciais ... 27

1.4 Trans-cariofileno ... 32

1.5 Músculo liso traqueal ... 35

1.5.1 Contração do músculo liso traqueal ... 37

1.5.2 Relaxamento no músculo liso traqueal ... 44

1.5.3 Epitélio do músculo liso da via aérea ... 46

1.6 Problemas respiratórios ... 47

2 OBJETIVOS ... 49

2.1 Gerais ... 49

2.2 Específicos ... 49

3 MATERIAL E MÉTODOS ... 50

3.1 Sais e Fármacos ... 50

3.2 Animais ... 51

3.2.1 Preparação da traquéia de rato ... 51

3.2.2 Dissociação da célula do músculo liso traqueal ... 52

3.3 Registro de respostas de tecido isolado ... 53

3.4 Registro de respostas de miócito isolado ... 54

3.5 Protocolos experimentais ... 56

3.5.1 Contratilidade...56

3.5.2 Registros eletrofisiológicos...57

3.6 Análise estatística ... 58

4 RESULTADOS ... 59

4.1 Efeito do trans-cariofileno sobre o tônus basal de anéis de traquéia na presença e na ausência de epitélio ... 59

4.2 Efeito do trans-cariofileno em anéis de traquéia pré-contraídos por 80 mM de K⁺ na presença e na ausência de epitélio ... 60

4.3 Efeito do trans-cariofileno em contrações induzidas por ACh em anéis de traquéia na presença e na ausência de epitélio ... 62

4.4 Efeito da teofilina em contrações induzidas por Carbacol e K⁺ em anéis isolados de traquéia de rato ... 63

4.5 Efeito do trans-cariofileno em contrações induzidas por ACh em anéis isolados de traquéia de rato com e sem epitélio em solução livre de Ca²⁺ . 65

4.6 Avaliação da relação corrente x voltagem em miócito isolado da traquéia de rato ... 67

4.7 Efeito do Bay K 8644 sobre a corrente de Ba²⁺ em miócito isolado de traquéia de rato ... 68

4.8 Efeito do cádmio sobre as correntes de Bário em miócito isolado de traquéia de rato ... 69

4.9 Efeito da nifedipina sobre as correntes de Ba²⁺ de músculo liso isolado de traquéia de rato ... 70

4.10 Efeito do trans-cariofileno e Tween sobre a corrente de Ba²⁺ de miócitos isolados do músculo liso traqueal ... 71

4.11 Efeito do Tween sobre as correntes de Ba²⁺ em músculo liso isolado da traquéia de rato ... 72

4.12 Efeito do DMSO sobre a corrente de Ba²⁺ de miócito isolado do músculo liso traqueal de rato ... 73

4.13 Efeito do trans-cariofileno na presença e na ausência de Tween em segmentos traqueais ... 74

4.14 Efeito do trans-cariofileno em células isoladas do músculo liso traqueal 75

5 DISCUSSÃO ... 77

6 CONCLUSÃO ... 82

REFERÊNCIAS ... 83

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 01. Produtos químicos produzidos pelo metabolismo de substâncias

orgânicas ... 28

FIGURA 02. Formação de terpenos a partir de unidades isoprênicas ... 29

FIGURA 03. Fórmula estrutural do trans-cariofileno ... 32

FIGURA 04. Contração no músculo liso da via aérea ... 40

FIGURA 05. Ativação da proteína monomérica G ... 43

FIGURA 06. Relaxamento do músculo liso da via aérea ... 45

FIGURA 07. Sistema de registro das respostas musculares... 54

FIGURA 08. Sistema de registro das respostas de miócito isolado ... 55

FIGURA 09. Efeito do trans-cariofileno sobre o tônus basal de anéis de traquéia na presença e na ausência de epitélio ... 60

FIGURA 10. Efeito do trans-cariofileno em anéis de traquéia pré-contraídos por 80 mM de K⁺ na presença e na ausência de epitélio ... 62

FIGURA 11. Efeito do trans-cariofileno em contrações induzidas por ACh em anéis de traquéia na presença e na ausência de epitélio ... 63

FIGURA 12. Efeito da teofilina em contrações induzidas por Carbacol e K⁺ em anéis isolados de traquéia de rato ... 64

FIGURA 13. Efeito do trans-cariofileno em contrações induzidas por ACh em traquéia de rato com e sem epitélio em solução livre de Ca²⁺ ... 66

FIGURA 14. Avaliação da Relação Corrente x Voltagem em miócito isolado da traquéia de rato ... 67

FIGURA 15. Efeito do Bay K 8644 sobre a corrente de Ba²⁺ em miócito isolado de traquéia de rato ... 69

FIGURA 16. Efeito do Cádmio sobre as correntes de Bário em miócito isolado de traquéia de rato ... 70

FIGURA 17. Efeito da nifedipina em correntes de Ba²⁺ de músculo liso isolado da traquéia de rato ... 71

FIGURA 18. Efeito do trans-cariofileno e Tween sobre a corrente de Ba²⁺ de miócitos isolados do músculo liso traqueal ... 72

FIGURA 19. Efeito do Tween sobre as correntes de Ba²⁺ em músculo liso isolado da traquéia de rato ... 73 FIGURA 20. Efeito do DMSO sobre a corrente de Ba²⁺ de miócito isolado do

músculo liso traqueal de rato ... 74 FIGURA 21. Efeito do trans-cariofileno na presença e na ausência de Tween em

segmentos traqueais ... 75 FIGURA 22. Efeito do trans-cariofileno em células isoladas do músculo liso traqueal ... 76

ABREVIATURAS

[Ca²⁺]i – Concentração intracelular de Cálcio AA – Ácido araquidônico

AC – Adenilil ciclase ACh – Acetilcolina

ACh 10 – 10 μM de Acetilcolina ACh 60 – 60 μM de Acetilcolina

AMPc – 3'-5' adenosina monofosfato cíclico ATP – Trifosfato de adenosina

ANOVA – Análise de Variância

Bay K 8644 – Uma dihidropiridina que atua nos canais para Cálcio tipo L BSA – Albumina Sérica Bovina

Ca²⁺ ATPase – Cálcio adenosina trifosfatase CCh – Carbacol

CCa – Canais para Cálcio

CCE – Entrada de Cálcio capacitiva

CIRC – Liberação de Cálcio induzida por Cálcio

COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

DL50 – Dose capaz de promover 50 % de morte em uma população DPPH – 1,1-difenil-2-picrilhidrazil

EC50 – Concentração capaz de promover 50% do efeito máximo EGTA – Ácido etileno-bis (trans-amino-etil-éter)-N,N,N´,N´-tetracético Em – potencial transmembrana

EpDRF – Fatores Relaxantes derivados do epitélio GΩ – Gigaohm

HVA – Canais ativados por alta voltagem IBa – Corrente de Bário

ICa – Corrente de Cálcio IK – Corrente de potássio

IP3 –1,4,5-(tris-fosfatidil)-inositol

IP3R – Receptor de 1,4,5-(tris-fosfatidil)-inositol ISCB – Instituto Superior de Ciências Biomédicas

LVA – Canais ativados por baixa voltagem MAPK – Proteína cinase ativada por mitógeno Min – Minutos

Mg²⁺ ATPase – Magnésio adenosina trifosfatase MLCK – Quinase de cadeia leve da miosina MLCP – Fosfatase de cadeia leve de miosina MLT – Músculo liso traqueal

mV – Milivolt MΩ - Megaohm nA – Nanoampère

Na⁺-K⁺ ATPase – Sódio potássio adenosida trifosfatase NFP – Nifedipina

NO – Óxido nítrico

OECn – Óleo Essencial de Croton nepetaefolius OVO – Ovalbumina

OEPp – Óleo essencial de Pterodon polygalaeflorus pA – Picoampère

PGE2 – Prostaglandinas E2

PGF2– Prostaglandina F_2

PGs – Prostaglandinas

PIP2 – Fosfatidilinositol 4,5-difosfato PKA – Proteína quinase A

PKC – Proteína quinase C PLA2 – Fosfolipase A2

PMCA – Cálcio ATPase da membrana plasmática Rho – Proteína monomérica G

ROCC – Canais para Cálcio operados por receptor RS – Retículo Sarcoplasmático

RYR – Receptor de ryanodina

SERCA – bomba de Cálcio do retículo sarcoplasmático SOCC – Canais para Cálcio operados por estoque TEA – Tetraetilamônio

TW – Tween 80

UECE – Universidade Estadual do Ceará

UFC – Universidade Federal do Ceará

UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais VOCC – Canais para Cálcio operados por voltagem OMS – Organização Mundial de Saúde

μM – Micromolar μm – Micrômetro

1 INTRODUÇÃO

A grandeza da biodiversidade brasileira não é conhecida com precisão tal a sua complexidade, estimando-se a existência de mais de dois milhões de espécies distintas de plantas, animais e microorganismos. O Brasil é o país com maior diversidade genética vegetal do mundo, em torno de 15 a 20% do total mundial, com destaque para as plantas superiores, que possuem aproximadamente 24% da biodiversidade. (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).

A vegetação típica da maior parte do Nordeste é a Caatinga, que apresenta árvores geralmente de pequeno porte e a totalidade de arbustos e ervas perdem suas folhas no período de estiagem. Com a chegada da estação chuvosa a paisagem muda para um espetáculo verde multiflorido. Tal vegetação ocupa 850.000 km² e é muito rica em espécies medicinais e aromáticas (MAIA, 2004).

Acrescido à grande diversidade da flora nordestina temos a informação popular sobre o uso das plantas e o baixo custo do cultivo destas, o que constitui um dos mais importantes critérios de seleção desses materiais para estudos químicos, fisiológicos e farmacológicos, visando sua aplicação medicinal.

Esses produtos naturais já são alvos de pesquisa de diversos fatores agressivos à saúde, pois desempenham um papel dominante na descoberta de drogas para o tratamento de doenças humanas (NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2003).

Dentro da flora nordestina encontramos plantas medicinais pertencentes à família Euphorbiaceae, gênero Croton, que existem em grande quantidade e diversidade nesta região.

É dentro dessas plantas do gênero Croton que são produzidos óleos essenciais que contêm diversos constituintes, dentre os quais é destacado o trans- cariofileno que será usado no presente estudo. Suas atividades farmacológicas já são conhecidas como poderá ser comprovado a seguir, porém nenhum estudo foi

realizado sobre o efeito desse constituinte no músculo liso da via aérea. Haja vista que outros constituintes, como é o caso do 1,8 cineol, já apresentaram efeitos no músculo liso da via aérea (COELHO-DE-SOUZA et al., 2005; NASCIMENTO et al., 2009) e que o trans-cariofileno já tem efeitos registrados em outros tecidos (LEONHARDT et al., 2009), esse estudo avaliará o efeito do trans-cariofileno e os seus possíveis mecanismos de ação no músculo supracitado.

1.1 Plantas Medicinais

Plantas medicinais são plantas que têm atividade biológica, possuindo um ou mais princípios ativos, úteis à saúde humana. Muitas delas são hoje usadas em cosméticos e, neste caso, se denominam cosmocêuticos (do inglês, cosmetics + pharmaceuticals) pela comunidade científica (FERREIRA et al., 1998).

A recorrência às plantas medicinais como recurso terapêutico ocorre desde tempos imemoriais, tendo sofrido o impacto de diversas culturas, com seus mitos, credos e suas sabedorias (MOURA; FONSECA, 2002).

De acordo com as definições da Organização Mundial da Saúde (OMS) os princípios ativos responsáveis pelas ações farmacológicas ainda são desconhecidos, sendo uma característica básica dos agentes fitoterapêuticos o fato de normalmente não possuírem uma ação farmacológica potente e imediata. Por essa razão os agentes farmacológicos não são usados para tratamentos emergenciais, sendo frequentemente usados para doenças crônicas e são de grande aceitação pela população (BULLETIN OF OMS, 1993; 1998).

Para o eficaz estudo das plantas medicinais faz-se necessário uma extensa pesquisa a respeito destas, sejam em monografias, periódicos ou livros.

Para a flora cearense, o mais antigo e completo desses escritos é a “Colecção descriptiva das plantas da captania do Ceará” de autoria do naturalista João da Silva Feijó (MATOS, 2000).

A seleção das plantas é realizada segundo as recomendações da OMS que orienta, principalmente os países subdesenvolvidos, a procurarem ampliar o arsenal terapêutico para a saúde pública através do aproveitamento das práticas de medicina caseira empregadas pelo povo. Dentre essas recomendações temos o levantamento regional das plantas usadas nas práticas caseiras de medicina popular ou tradicional, identificação científica, apoio ao uso das práticas úteis selecionadas por sua eficácia e segurança terapêutica, suprimir o uso das práticas consideradas inúteis ou prejudiciais e desenvolver programas governamentais que permitam cultivar e utilizar as plantas selecionadas (MATOS, 2000).

A população costuma utilizar as plantas medicinais em preparações diversas para serem ingeridas, ditas de uso interno, e preparações para uso na pele ou nas mucosas naturais ditas de uso externo. No primeiro caso temos aluás, chás, inalações, lambedouros (xaropes), tinturas e vinho medicinal e no segundo caso temos cataplasmas, pós (por via oral) e sinapismo (um tipo especial de cataplasma, pois é misturado a outras substâncias) (MATOS, 2000).

De fato, o conhecimento sobre plantas medicinais representou e representa o único recurso terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos (DI STASI, 1996), como foi comprovado pela OMS e publicado por Akerele (1993) que cerca de 65 a 80% da população mundial habitante dos países em desenvolvimento depende essencialmente de plantas para os cuidados primários de saúde devido à pobreza e a falta de acesso à medicina moderna. Estas informações orientam os pesquisadores na busca de atividades biológicas destas plantas. Estima-se que cerca de 75% dos compostos puros naturais empregados na indústria farmacêutica foram isolados seguindo indicações da medicina popular (CECHINEL-FILHO;

YUNES, 1998).

Segundo Matos (2000), o emprego correto de plantas para fins terapêuticos pelos serviços de saúde pública requer o uso de plantas medicinais selecionadas por sua eficácia, segurança terapêutica e a escolha das fórmulas corretas de preparação e administração de seus produtos, sejam eles destinados para uso ambulatorial, hospitalar ou caseiro. Ele também considera importante a validação da resposta terapêutica da planta através de aplicações de um conjunto de ensaios que abrangem um estudo farmacológico pré-clínico com a avaliação da

toxicidade, seguido de um ensaio clínico. A validação de novas drogas vegetais através da pesquisa é, assim, o caminho para que se possa fazer o correto aproveitamento das plantas medicinais e seus derivados aplicados à fitoterapia.

A confirmação dos conhecimentos populares através de experimentação controlada, onde sejam confirmadas ou negadas atividades farmacológicas, nos permite quantificar a dose efetiva e a dose tóxica, a fim de que possamos analisar a relação risco benefício e concluirmos se a planta é ou não potencialmente medicinal.

Certamente após todo esse processo de análise das plantas, suas características são bem definidas, a fim de que elas possam ser utilizadas de forma segura pela população e para a produção de fármacos.

A influência das plantas medicinais na produção de fármacos tem sido de grande relevância e um exemplo são as drogas antitumorais e antimicrobianas as quais 60% atualmente disponíveis no mercado são derivados de produtos naturais (CRAGG; NEWMAN; SNADER, 1997).

Com todos esses avanços na área da pesquisa de plantas medicinais, observa-se que nos últimos 15 anos um grande crescimento do interesse mundial em plantas medicinais tem ocorrido tanto em países desenvolvidos quanto nos subdesenvolvidos. O crescimento do mercado de plantas tem atraído muito o interesse de companhias farmacêuticas que têm incentivado os estudos farmacológicos pré-clínicos e os testes clínicos randomizados para provar sua segurança e eficácia (CALIXTO, 2000).

Grande prioridade tem sido dada na domesticação, produção, estudos biotecnológicos e melhoria genética das plantas medicinais. A tendência à criação da domesticação e plantio de plantas medicinais em vez do uso de plantas coletadas do campo pode oferecer grandes vantagens, desde que seja possível providenciar material nativo de grande qualidade e uniforme. Tal cuidado permitirá o desenvolvimento de drogas derivadas de plantas com grande qualidade (CALIXTO, 2000).

Uma vantagem importante do processo de domesticação é a real e importante possibilidade de melhorar a qualidade de materiais nativos através de seleção genética para a formação e desenvolvimento de plantas medicinais resistentes a microorganismos indutores de doenças, livres dos indesejáveis metabólitos secundários ou ricos em constituintes bioativos (CALIXTO, 2000).

Um exemplo do uso dessas plantas medicinais é a espécie Lippia chevalieri que, na medicina popular da África, é usada pra o tratamento de doenças respiratórias (POUSSET, 1989).

É importante ressaltar que, em preparações de plantas medicinais nas formas citadas anteriormente, não se sabe ao certo quais os efeitos adversos que o uso delas pode desencadear sendo este um dos fatores que torna relevante maiores avaliações a respeito das propriedades das plantas em questão.

1.2 Óleos essenciais

O termo “óleo essencial” é empregado para designar líquidos voláteis, dotados de aroma forte quase sempre agradável. O conjunto dessas substâncias químicas voláteis, presentes nos óleos essenciais, é formado de classes de ésteres de ácidos graxos, mono e sesquiterpenos, fenilpropanonas, alcoóis, aldeídos e, em alguns casos, por hidrocarbonetos alifáticos, entre outros (CRAVEIRO et al., 1981).

O uso de produtos obtidos de partes de plantas é milenar. Óleos aromáticos de rosa e sândalo já eram utilizados por anciãos indianos, cerca de 1000 anos A.C., e nos escritos do grego Theophrastus, cerca de 287 anos A.C., está registrado o uso de plantas para a obtenção de óleos essenciais (MOOKHERJEE;

MUSSINAN, 1979).

Atualmente, o óleo é extraído de plantas por alguns métodos específicos.

Esses métodos de extração variam conforme a localização do óleo essencial na planta e com a finalidade de utilização do mesmo. Simões et al. (1999), citou em seu

trabalho cinco exemplos de métodos de extração de óleos essenciais, a saber, os métodos de enfloração, prensagem, extração com solventes orgânicos, extração por fluído supercrítico e extração por arraste de vapor d’água. Dentre esses, o método de maior aplicação é o de hidrodestilação que se divide em duas técnicas – arraste a vapor (CRAVEIRO et al., 1981) e coobação (SANTOS et al. 1998).

Segundo Craveiro et al. (1981), os óleos essenciais são usados em muitas indústrias para conferir aromas e odores especiais e inúmeros produtos tais como perfumes, cosméticos, sabonetes, desodorantes, condimentos, doces etc. São empregados também para mascarar odores desagradáveis em ambientes de trabalho e instalações sanitárias, além de serem usados como solventes e como insumos em produtos das indústrias de plásticos, tintas, borrachas, inseticidas e outras. Muitos fornecem compostos de partida para síntese de outras substâncias úteis nas indústrias química e farmacêutica. Outros componentes têm propriedades farmacológicas e são usados como antibacterianos, analgésicos, sedativos, expectorantes, estimulantes e estomáquicos na composição de diversos medicamentos.

Os óleos essenciais são encontrados nas partes aéreas (folhas e ramos finos), cascas, troncos, raízes, frutos, flores, sementes e resinas (ZOGHBI et al.

1998).

Embora os óleos essenciais ocorram em muitas plantas distribuídas em 60 famílias, apenas cerca de 150 espécies são exploradas comercialmente na produção de óleo (GUENTHER, 1972).

Dentre as diversas famílias existentes pode ser citada a Boraginaceae com a Cordia verbenacea da qual o óleo essencial foi extraído e estudado o que permitiu constatar que ele atuou inibindo o edema causado pelo veneno de Apis mellifera ou por ovalbumina (OVO) em ratos sensibilizados e a pleurisia alérgica provocada por OVO (PASSOS et al., 2006). Esteves et al. (2005) estudou o efeito do óleo da planta Casearia sylvestris, da família Flacourtiaceae em ratos e sugeriu uma atividade antiinflamatória e anti-ulcera desta espécie.

O óleo essencial do Eucalyptus tereticornis (família Mirtaceae) apresentou propriedades relaxantes em músculo liso traqueal de cobaio (COELHO-DE-SOUSA,

et al. 2005). Neste mesmo tecido Magalhães et al. (2003) testaram o óleo essencial de Croton nepetaefolius, da família Euforbiaceae, e observaram que o óleo exerceu atividade anti-espasmódica por mecanismos provavelmente miogênicos. Todas as espécies citadas anteriormente e os seus respectivos efeitos são apenas alguns exemplos que comprovam as diversas propriedades farmacológicas que as mais variadas famílias apresentam.

Muitas espécies de plantas encontradas no Nordeste, especialmente no Ceará, apresentam ampla distribuição geográfica e boa adaptação ao clima semi- árido. Estas características têm chamado a atenção de cientistas para o estudo de seus extratos e óleos essenciais, sob aspectos químico, farmacológico e terapêutico (LEAL-CARDOSO; FONTELES, 1999).

O estudo das plantas odoríferas do Nordeste resultou na descoberta de vários óleos essenciais de potencial importância econômica e alguns deles mostraram que podem ser importantes fontes de matérias-primas para a indústria química enquanto outros são dotados de propriedades aromatizantes, farmacológicas e anti-sépticas, dentre outras. Paralelamente, resultados de importância científica também foram alcançados, destacando-se entre eles o levantamento da flora odorífera do Nordeste, a identificação botânica de suas espécies e a determinação da composição química dos seus constituintes voláteis (CRAVEIRO et al., 1981).

Dentre as diversas famílias de plantas do nordeste é destacado a Euphorbiaceae a qual pertence o gênero Croton e é composta por 290 gêneros e 7.500 espécies, distribuídas principalmente nas regiões tropicais do mundo, sendo amplamente representada na flora brasileira. As plantas variam desde ervas até trepadeiras e árvores de grande porte, sendo estas geralmente laticíferas. As flores sempre são de sexo separado, o fruto é seco e em geral se separa em três pequenas cocas cada uma contendo uma semente oleaginosa (JOLY, 1966).

Os primeiros estudos com Euphorbiaceae, na região Nordeste, datam das décadas de 70 e 80, sendo muito mais direcionados à pesquisa de compostos químicos de algumas espécies. Entre estes, podemos destacar estudos realizados pela equipe do Professor Doutor Francisco José de Abreu Matos da Universidade

Federal do Ceará (UFC) com diversas espécies do gênero Croton (CRAVEIRO et al., 1981). Também na UFC, Dr. Afrânio Fernandes, em 1982, listou e descreveu as espécies de marmeleiros do Nordeste.

Grande número de espécies do gênero Croton são produtoras de óleo essencial (GUENTHER, 1972) e muitos estudos foram e estão sendo realizados para se detectar a atividade dos óleos essenciais das espécies deste gênero a fim de caracterizá-las.

Um exemplo é o estudo de Magalhães; Lalhou; Leal-Cardoso (2004) que avaliaram o efeito antiespasmódico do óleo essencial de Croton nepetaefolius (OECn) em preparações isoladas de íleo de cobaia e constataram o efeito relaxante do OECn capaz de inibir contrações dependentes e independentes de receptores.

Outros exemplos seriam Croton zehntneri e seu constituinte majoritário com atividade antiespasmódica em íleo de cobaios (COELHO-DE-SOUZA; CRIDDLE;

LEAL-CARDOSO, 1998), Croton cajucara Benth., apresentando efeito gastroprotetor em camundongos via administração oral (HIMURA-LIMA et al., 2000) e Croton sonderianus com sua atividade antiespasmódica em músculo liso traqueal de ratos (MENDES-MAIA, 2007).

Em estudos realizados por Abdon et al. (2002) foi comprovado que o óleo esencial de Croton nepetaefolius exerce efeitos antinociceptivos dose-dependentes em camundongos.

Batatinha; Sousa-Espinosa; Bernardi (1995) sugerem que o óleo essencial presente em folhas de Croton zehntneri pode ser responsável pelo uso dessa planta na medicina popular para tratamento de distúrbios nervosos, tais como irritabilidade, ansiedade e convulsões.

Estudos de plantas do gênero Croton também têm avançado em outros países como é o caso do trabalho de Guerrero et al. (2001) que comprovou a capacidade do extrato aquoso de Croton schiedeanus Schlecht de desempenhar efeito anti-hipertensivo e bradicárdico em ratos e exercer atividade vaso relaxante em anéis de aorta de ratos pré-contraídos com concentrações elevadas do íon K⁺.

1.3 Constituintes de óleos essenciais

Embora apenas cerca de 10% da biodiversidade mundial tenha sido estudada, 140 mil metabólitos intermediários, oriundos, sobretudo de plantas superiores e de microrganismos, foram isolados e caracterizados, mas ainda não foram avaliados biologicamente (VERPOORTE, 1998).

Curiosamente, apesar do uso de óleos essenciais datar de tempos antigos o uso de compostos isolados é bem recente. Eles começaram a ser isolados principalmente no século XIX. A primeira grande descoberta na área químico- farmacêutica foi realizada por Ezequiel Correia dos Santos que isolou o alcalóide pereirinha das cascas do pau-pereira (Geissospermum vellosii, Fr. All.) em 1833 (RAPOPORT et al. 1958), sendo comercializado na forma de cloridrato de pereirinha. Em 1870, Theodoro Peckolt isolou uma substância da Plumeria lancifolia M. Ar. que ele denominou agoniadina (MORS, 1997). Essas duas substâncias isoladas só tiveram suas estruturas químicas determinadas em 1958.

A identificação de constituintes, através de análise química, se dá por meio de uma destilação fracionada ou por cromatografia gasosa (CRAVEIRO et al., 1981).

A identificação dos compostos presentes no óleo essencial envolve o uso de técnicas espectrométricas dentre as quais as mais freqüentes são espectrometrias ultravioleta, infravermelho, de ressonância magnética nuclear de próton e de carbono-13 e espectrometria de massas (CRAVEIRO et al., 1981).

Os constituintes químicos mais comuns dos óleos essenciais são misturas de terpenos, geralmente monoterpenos, sesquiterpenos e arilpropanóides que podem apresentar uma grande variedade de funções químicas (Figura 01) de a cordo com estudos realizados por Wallach em 1887 (SCOTT, 1972).

Figura 01. Produtos químicos produzidos pelo metabolismo primário e secundário das substâncias orgânicas (TORSSEL, 1997).

A biossíntese destes terpenos foi estabelecida por uma proposta inicial de Wallach em 1887, consistindo no fato de serem formados por ligações de duas ou mais unidades de isopreno (C5H8 – 2-metil-1,3-butadieno). Duas unidades isoprênicas formam os monoterpenos (C10), três unidades os sesquiterpenos (C15), quatro unidades os diterpenos (C20) e assim por diante (Figura 02). Posteriormente, com o aprofundamento dos estudos, verificou-se que a unidade C5, precursora dos terpenos, se forma a partir do ácido mevalônico através da perda de CO2 e H2O (SCOTT, 1972).

Figura 02. Formação de terpenos a partir da junção das unidades isoprênicas (PINHO-DA-SILVA, L.).

Alguns constituintes específicos de óleos essenciais são utilizados como auxiliares na química orgânica sintética e nas transformações de estruturas comuns, visando à obtenção de substâncias altamente funcionais de reconhecido valor econômico (MIRAIS; BEAZ-FILHO, 2007). No esquema da figura 01, pode ser observado o trajeto desde o óleo essencial até a formação dos terpenos a partir de reações próprias do metabolismo primário.

Os terpenos, encontrados em óleos essenciais de diferentes plantas, são micro-constituintes mais comumente usados como aditivos, de sabor em comidas e de aromas para perfumes (CRAVEIRO et al., 1981). Estudos de diferentes grupos por todo o mundo têm mostrado que terpenos e terpenóides exercem diversos efeitos farmacológicos tais como antiespasmódico, analgésico, antiinflamatório etc.

(LEAL-CARDOSO; FONTELES, 1999).

É possível que óleo e constituintes promovam respostas semelhantes, o que pode levar os pesquisadores a acreditarem que o constituinte que apresentar

efeito muito semelhante ao do óleo é a sua substância ativa, podendo este ser ou não o constituinte de maior teor no respectivo óleo.

Em estudos realizados por Craveiro et al., (1981) observou-se que os principais constituintes encontrados em amostras do óleo essencial de Croton argyrophylloides, por exemplo, eram: o α-pineno, sabineno, 1,8-cineol, trans- elemeno (beta-elemeno), trans-cariofileno, α-humuleno, cadineno e γ-elemeno (gama-elemeno).

O percentual do constituinte no óleo essencial pode variar conforme o horário, a época e o local da colheita da planta. As condições do solo onde a planta foi encontrada, a parte da planta da qual o óleo foi extraído, o método de extração utilizado também são fatores que podem influenciar na composição química do óleo essencial (MORAIS; BRAZ-FILHO, 2007).

Um exemplo de variação na constituição é o óleo do Ocimum gratissimum que, na Índia, apresentou como principal constituinte o eugenol (56,0-74,5%) (CHOUDHURY; BORDOI, 1993). Na Tailândia, esta mesma espécie, apresentou como constituinte majoritário o timol (47,6%) seguido do p-cimeno (16,2%) (SAINSBURY; SOFOWORA, 1971) e no nordeste brasileiro a sua constituição majoritária era de 77,3% de 1,8-cineol (SILVA, 2003).

No que diz respeito à influência do horário, Pinho-da-Silva (2010) e colaboradores trabalharam com óleos essenciais da mesma espécie (óleo essencial de Croton sonderianus) e coletados na mesma região, porém em diferentes horários e obtiveram diferenças tanto na constituição química predominante (biciclogermacreno (16,29%) e espatulenol (18,32%) para óleos coletados às 13 e 21 horas respectivamente), quanto na potência em relaxar o músculo liso traqueal.

Muitos constituintes já apresentam algumas atividades caracterizadas, como é o exemplo do α-pineno. Seu principal uso é na síntese de borneol, cânfora e terpineol. É utilizado também como aromatizante em sais de banho, sprays de ambiente, desinfetantes, inseticidas, solvente industrial, na fabricação de tintas, etc.

(GUENTHER, 1972; WINDHOLZ, 1976).

As atividades farmacológicas eram, a princípio, avaliadas de forma associada com os óleos que os tinham como constituinte majoritário, porém, com os avanços nas pesquisas, começaram a ser estudados isoladamente.

Um dos exemplos é o estudo do efeito do óleo de Pimpinella anisum que apresentou relaxamento em preparações isoladas de músculo liso traqueal de cobaio (REITER; BRANDT, 1985). Nesse mesmo trabalho foi relatado o efeito contrátil do anetol, constituinte majoritário do óleo em questão, em músculo liso do íleo e da traquéia de cobaio.

Martin et al. (1993) investigaram o efeito antiinflamatório do óleo essencial de Bupleurum fruticescens e seus maiores constituintes em edema de pata de rato. Neste estudo, sugeriram que essa ação antiinflamatória foi devido à inibição da síntese e liberação de prostaglandinas (PGs). Este efeito foi atribuído aos seus principais constituintes, trans-cariofileno e α-pineno.

Albuquerque, Sorenson e Leal-Cardoso (1995) puderam observar que tanto o óleo essencial de Croton zehntneri quanto os seus constituintes anetol e estragol apresentaram efeitos no músculo esquelético de ratos e sapos, inibindo contrações induzidas pela estimulação elétrica direta, neuromuscular, de acetilcolina, porém potencializaram contrações induzidas pela cafeína.

Em estudos realizados por Juergens et al. (1998b) constituintes aromáticos dos monoterpenóides, como é o caso do eucaliptol (1,8-cineol), foram avaliados no tratamento para sintomas de infecções respiratórias. No trabalho em questão foi comprovado que o eucaliptol promoveu uma redução na produção de metabólitos do ácido araquidônico (AA) em vias aéreas de humanos.

Lahlou (2004; 2004) observou os efeitos vasodilatadores dos constituintes eugenol (em leito mesentérico) e metil-eugenol (em aorta torácica) em ratos normotensos, bem como o efeito do óleo de folhas de Alpinia zerumbet e seu componente majoritário, 4-terpineol, reduzindo a pressão sanguínea em ratos hipertensos (LAHLOU et al., 2002).

O α-pineno, monoterpeno muito presente em óleos essenciais de plantas como o Myroxylon balsamum, é uma alternativa interessante para o controle de

larvas de Aedes aegypti (SIMAS et al., 2004). Menezes et al. (2007) comprovaram que óleo essencial de Hyptis fruticosa, que também contém o α-pineno como um dos constituintes majoritários, apresentou efeito antiinflamatório e baixa toxicidade em camundongos.

No caso do diterpeno ácido (8)17,12 E,14-labdatrieno-18-óico, que foi isolado da planta Xylopia langsdorffiana, relaxou o músculo liso de anéis traqueais isolados de cobaio, tanto em seu tônus basal como sob estímulo contrátil, aparentemente sem a participação dos fatores relaxantes derivados do epitélio (EpDRF) e com uma possível participação dos canais para K⁺ (RIBEIRO et al., 2007) Sesquiterpenos também apresentam efeitos farmacológicos conhecidos nas vias aéreas, como é o caso de tratamentos terapêuticos preventivos com α- humuleno que aumentou significativamente a liberação de mediadores antiinflamatórios em modelos de inflamação alérgica das vias aéreas de camundongos (ROGÉRIO et al., 2009).

1.4 Trans-cariofileno

CH

CH

CH

CH

O trans-cariofileno (Figura 03) é um sesquiterpeno que está presente em diversas plantas e o seu percentual varia de acordo com a parte da planta em que foi retirado. Araújo, Lordello e Sales-Maia (2001) puderam comprovar os diferentes percentuais deste constituinte em galhos (14%) e folhas (31%) de Ocotea puberula.

Figura 03: Fórmula estrutural do trans-cariofileno (CRAVEIRO et al., 1981)

Muitos sesquiterpenos mostram estruturas químicas cíclicas e exibem uma gama de propriedades biológicas desde defesa contra herbívoros até informações químicas que sinalizem para que haja a interação planta-inseto (CHEN et al., 2003; DEGENHARDT et al., 2003; ENGELBERTH et al., 2004; KESSLER;

BALDWIN, 2001).

Trans-cariofileno é um constituinte largamente utilizado para dar aroma aos cosméticos e sabonetes, além de muitas outras preparações técnicas, podendo ser encontrado em muitas famílias (Anonaceae, Euforbiaceae, Verbenaceae, Anacardiaceae, Burseraceae, etc.) de plantas que contêm espécies com conhecidas propriedades terapêuticas na medicina popular (GUENTHER, 1972; WINDHOLZ, 1976).

Em amostras de óleo da Lippia chevalieri, cujo constituinte majoritário era o trans-cariofileno, 27% nas folhas e 30% nas flores, observou-se que o óleo das folhas apresentou atividade antibacteriana (para Staphylococcus aureus e Enterococcus hirae) e antifúngica (para Saccharomyces cerevisiae), e que o óleo das flores apresentou atividade semelhante. As únicas diferenças foram a ausência de efeito antibacteriano em Enterococcus hirae e presença de efeito antifúngico em Candida albicans. Vale ressaltar que a Lippia chevalieri já é utilizada tradicionalmente no tratamento de doenças respiratórias de origens bacterianas e fúngicas (MEVY et al., 2007).

A atividade antioxidante de plantas que contêm o trans-cariofileno como constituinte predominante foi comprovada pelo ensaio com DPPH (1,1-difenil-2- picrilhidrazil) nas diluições em éter etílico. (SOUZA et al., 2006).

O trans-cariofileno está presente no óleo essencial de Hyptis fruticosa, como um dos constituintes majoritários, que apresentou efeito antiinflamatório e baixa toxicidade em camundongos. (MENEZES et al., 2007). Também é um dos constituintes predominantes no óleo essencial de Croton nepetaefolius que apresentou efeito antiespasmódico em íleo isolado de cobaio (MAGALHÃES;

LAHLOU; LEAL-CARDOSO, 2004). Na Casearia sylvestris o trans-cariofileno também é predominante (13,8%) e o efeito anti-úlcera gástrica e a atividade antiinflamatória desta planta foram comprovados por Esteves et al. (2005).

Trans-cariofileno é o componente químico predominante (20,6%) do óleo essencial de Pterodon polygalaeflorus (OEPp.). Curiosamente, OEPp bloqueou o acoplamento excitação-contração eletromecânico sem afetar o acoplamento farmacomecânico (EVANGELISTA et al., 2007). É sugerido que o efeito bloqueador causado por OEPp pode ocorrer como resultado da inibição de canais para Ca²⁺

sensíveis a dihidropiridina (DHP).

O constituinte em questão é um dos constituintes predominantes, também, no extrato de Cordia verbenacea (obtido através de diferentes métodos), que apresenta forte atividade antibacteriana (MICHIELIN et al., 2009).

Efeitos farmacológicos do trans-cariofileno já foram publicados, como a promoção de um aumento da atividade de células natural killer (STANDEN;

CONNELLAN; LEACH, 2006) que são associadas com o aumento da sensibilidade a infecção (WHITESIDE; HERBERMAN, 1994; ANDERSEN et al., 1998).

Segundo Sensch et al. (2000), o efeito inotrópico negativo do trans- cariofileno e do eugenol sobre o músculo cardíaco em preparações com músculos papilares isolados e miócitos cardíacos de cobaios estão relacionados à inibição das correntes de Cálcio.

Em estudos realizados por Quintino-Farias (2006) o trans-cariofileno apresentou ação antiespasmódica em anéis de aorta de rato contraídos por fenilefrina (0,1 μM) e potássio (80 mM), sendo este efeito não dependente do endotélio. Nesse mesmo trabalho o trans-cariofileno foi identificado como o segundo constituinte majoritário do óleo essencial utilizado (óleo essencial de Croton argyrophylloides), e apresentou baixa toxicidade aguda em camundongos (DL50 = 9,84 ± 0,01 g/Kg) e artemia salina (DL50 = 274,53 μg/ml).

O trans-cariofileno também induziu atividade antimicrobiana em cultura de células de rim (RC-37) (ASTANI; REICHLING; SCHNITZLER, 2009) e analgésica (CHAVAN; WAKTE; SHINDE, 2009), ativou o sistema endocanabinóide (GERTSCH et al., 2008) e foi responsável por uma atividade antiinflamatória bem documentada por Fernandes et al. (2007) e Medeiros et al. (2007).

Adicionalmente, o trans-cariofileno apresentou efeitos no músculo liso intestinal de rato, bloqueando o acoplamento excitação-contração eletromecânico e farmacomecânico (LEONHARDT et al., 2009). Estes efeitos de certa forma nos levam a acreditar que o trans-cariofileno seja um possível agente antiasmático.

1.5 Músculo liso traqueal

O sistema respiratório de ratos é dividido em sistema respiratório inferior e superior, não diferindo muito do sistema típico dos outros mamíferos. É no sistema respiratório superior que as narinas externas são localizadas rostro-lateralmente e se abrem caudalmente através das narinas caudais dentro da nasofaringe (SUCKOW; WEISBROTH; FRANKLIN, 2006). A epiglote passa na orofaringe, onde ela se transforma na abertura da laringe. O início da traquéia é uma continuação da laringe e ela passa ventralmente ao esôfago e se estende caudalmente para formar os dois principais brônquios (os brônquios primários), cada um deles entrando no pulmão. O diâmetro da traquéia mede aproximadamente 1,6 a 1,7 mm no rato adulto e sua forma é mantida por 18 a 26 estruturas cartilaginosas rígidas em forma de C que formam a estrutura da traquéia (GATTO E HOUCK, 1989).

Devido a esses anéis cartilaginosos a extensão da cabeça do rato pode resultar em um alongamento de até 50% do tamanho da traquéia sem o decaimento do seu diâmetro luminal (GATTO E HOUCK, 1989). Dessa forma a traquéia age como a porção condutora inicial do trato respiratório que se ramifica em um sistema arborescente de túbulos que culminam nos bronquíolos terminais (FAWCETT, 1986).

As cartilagens em C são hialinas e suas extremidades livres estão voltadas para o lado posterior. Ligamentos fibroelásticos de colágeno e feixes de músculo liso prendem-se ao pericôndrio e unem às porções abertas das peças cartilaginosas em forma de C. Os ligamentos impedem a excessiva distensão do lúmen e os feixes musculares possibilitam sua regulação (JUNQUEIRA; CARNEIRO,

2004). O músculo liso é associado também à mucosa por tecido conectivo frouxo contínuo com a lâmina própria (FAWCETT, 1986).

Internamente a traquéia é revestida por epitélio do tipo respiratório. Ela apresenta uma barreira de muco e também um sistema de defesa representado pela barreira linfocitária, de função imunitária, que se distribui ao longo de toda sua estrutura (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).

Como em outras espécies, o tipo de epitélio traqueal do rato é predominantemente ciliado pseudo-estratificado, embora células basais e serosas também estejam presentes. Células globulares são encontradas em maior número no trato respiratório superior com relação a outras áreas do trato respiratório (SOUMA, 1987). Camadas de mucosa e submucosa são relativamente distintas e, juntas, têm uma largura de aproximadamente 27,5 μm em rato adulto. Glândulas seromucosas são abundantes, mas são limitadas à porção proximal da traquéia (BABERO et al., 1973)

A secreção da cobertura de muco dentro do epitélio da via aérea tem um importante papel em prender a poeira inalada e outros problemas particulares, e em proteger a porção respiratória e condutora dos pulmões contra danos potencialmente tóxicos de fumo. A cobertura de muco é constantemente movida por ação ciliar em direção à faringe, onde é engolida com a saliva. Quando a via aérea é exposta a algum tipo de irritante, a glândula submucosa aumenta de tamanho e as células globulares da traquéia e do epitélio bronquial aumentam de número. A composição de glicoproteínas secretadas também sofre algumas modificações.

Após a remoção do irritante essas mudanças são reversíveis em alguns meses (FAWCETT, 1986).

Os nervos para a traquéia surgem dos ramos recorrentes do vago e da cadeia simpática. Na parede posterior da traquéia o músculo liso recebe inervações das fibras provenientes de pequenos gânglios que constituem os nervos autonômicos. Nervos sensoriais são também associados com a mucosa e são vias aferentes para o reflexo da tosse (FAWCETT, 1986).

O tônus do músculo liso da via aérea representa um equilíbrio entre broncoconstrição e broncodilatação. O objetivo da terapia clínica de estados

fisiopatológicos tais como asma, alergia e inflamação, é prevenir a excessiva broncoconstrição, tanto na fase aguda como na crônica, e restaurar o equilíbrio através da produção de broncodilatação (AY et al., 2006).

1.5.1 Contração do músculo liso traqueal

O músculo liso traqueal utiliza fonte tanto extracelular quanto intracelular de Cálcio (Ca²⁺) para contração. Além disso, os canais existentes na membrana, através dos quais ocorre a entrada de Ca²⁺, do meio externo, foram subdivididos em canais para Ca²⁺ (CCa) operados por voltagem (VOCC) e CCa operados por receptor (ROCC). O recrutamento de fontes extracelulares e/ou intracelulares de Ca²⁺, bem como a ativação dos VOCCs e ROCCs, varia de acordo com o agonista utilizado para promover a contração, a sua concentração, o tipo e a localização do músculo liso a ser investigado, dentre outros fatores (RUSSEL, 1986).

O canal para Ca²⁺ compreende o poro formado pela subunidade α1 em um complexo com subunidades acessórias α2βδγ. A subunidade α1 contém fatores característicos de canais ativados por voltagem, é composta por 4 domínios repetidos e cada domínio contém seis segmentos transmembrana, incluindo o segmento S4, que é sensível a voltagem, e em cada repetição uma região P forma o poro (HILLE, 2001).

Além desses canais para Cálcio, existem canais catiônicos não seletivos permeáveis ao Cálcio. Entre eles temos os CCa operados por estoque (SOCC) ou entrada de Ca²⁺ capacitiva (PUTNEY et al, 2001) e os canais ativados por estresse mecânico. No músculo liso da via aérea, segundo Sweeney et al. (2002), existem pelo menos três classes de CCa no sarcolema: VOCCs, ROCCs e SOCCs.

O retículo sarcoplasmático (RS), presente dentro da célula muscular, constitui o principal participante no rápido aumento inicial da concentração intracelular de Ca²⁺ ([Ca²⁺]i), fornecendo-o através de dois tipos de receptores, o receptor de 1,4,5-(tris-fosfatidil)-inositol (IP3R) (acoplamento farmacomecânico) e o receptor de rianodina (RYR) (acoplamento eletromecânico). O RS também participa de uma subsequente diminuição da [Ca²⁺]i por remoção do Cálcio do citoplasma e

reposição dos seus estoques internos através da ação das bombas de Ca²⁺ no RS (SERCAs) e na membrana celular (RUEDA; GARCÍA; GUERRERO-HERNÁNDEZ, 2002a; FLYNN et al., 2001).

No que concerne ao acoplamento farmacomecânico, este ocorre de forma independente de mudanças no potencial transmembrana (Em), envolvendo mudanças secundárias na [Ca²⁺]i. Esse mecanismo ocorre a partir de um agonista que se liga aos receptores de membrana específicos que estão acoplados a uma proteína G. Quando o agonista se liga aos receptores de membrana, a proteína G é ativada em seguida uma subunidade desta proteína se desloca para atuar ativando a fosfolipase C (PLC) que irá clivar fosfatidilinositol 4,5-difosfato (PIP2), para formar 1,4,5-(tris-fosfatidil)inositol (IP3) que irá atuar no RS (BARANY, 1996).

A PLC contém quatro classes que incluem β, γ, δ e ϵ dentre as quais a PLC do tipo β (150-154 kDa) é o tipo que, quando ativada pela subunidade α da proteína G, cliva o PIP2 (BERRIDGE, 1993).

Os receptores de membrana acoplados a proteína G têm sete domínios transmembrana que atravessam a membrana de forma serpentina, contendo dois sitos: um extracelular que se liga ao agonista (ligando-se através de ativação por luz, pequenas moléculas, enzimas e peptídeos) e um intracelular acoplado à proteína G (HEDIN; DUERSON; CLAPHAM, 1993). No músculo liso esses receptores incluem os alfa adrenérgicos (norepinefrina), AT1 (angiotensina II), Hl (histamina), muscarínico M3 (acetilcolina - ACh) e receptor de trombina (EXTON, 1994). O receptor de ACh também é sensível ao carbacol, que apresenta a mesma ação da ACh, diferindo apenas por não ser degradado pela acetilcolinesterase, o que culmina em um estímulo mais prolongado (ROUX et al., 1997).

A proteína G é uma proteína de ligação de nucleotídeo de guanina que medeia a regulação de algumas moléculas efetoras por vários agonistas. É um heterotrímero, consistindo das subunidades α (35-52 kD), β (35-36 kD) e γ (8kD), e fica ancorado à superfície intracelular da membrana. No estado basal, a subunidade α contém guanosina difosfato (GDP) ligado e a sua ligação com as subunidades βγ é muito favorecida, mantendo a forma inativada da proteína G. No estado ativado o agonista, juntamente com o receptor de membrana, interage com o heterotrímero

αβγ que catalisa a troca de GDP por guanosina trifosfato (GTP). A partir de então α e βγ têm menor afinidade entre si formando o complexo α-GTP que se liga a PLC e a ativa (Figura 04). Após a hidrólise de α-GTP para α-GDP, este se reassocia com a subunidade βγ (STERNWEIS; SMRCKA, 1992; LOGOTHETIS et al., 1987;

BERSTEIN et al., 1992).

O IP3R é um complexo membranar glicoprotéico com proteínas de 260-kD constituído de uma condutância relativamente alta (γ=40 pS em 50 mM Ca²⁺), é catiônico, contém um poro e existem três isoformas para esse tipo de receptor (IP3R1, 2 e 3) (MIKOSHIBA, 1993). Para que haja a ativação do receptor de IP3R, receptores na membrana ativam uma proteína G heterotrimérica que está associada a eles. Após ativação da proteína G pelo receptor ocupado e a ativação da PLC, ocorre clivagem de PIP2, liberando IP3 e diacilglicerol (DAG) (Figura 04). A partir daí o IP3 se liga ao IP3R presente no RS ativando-o e o DAG permanece ligado à membrana e promove a translocação da proteína quinase C (PKC) do citoplasma para a membrana, onde a PKC é ativada (Figura 04) (BILLINGTON; PENN, 2003).

Uma vez que o IP3 se liga ao IP3R, ocorre liberação de Ca²⁺ induzida por IP3. O Ca²⁺ flui do RS para dentro do citoplasma a favor do gradiente de concentração (BERRIDGE, 1993).

A PKC, quando ativada, é capaz de reduzir a capacidade da calponina (proteína associada à actina) de inibir a actina-miosina ATPase através de uma fosforilação. A PKC também fosforila intermediários da via de sinalização da proteína cinase ativada por mitógeno (MAPK). Estes intermediários ativam vários fatores de transcrição de genes envolvidos na promoção do crescimento do músculo liso da via aérea. Ambos, PKC e MAPK do tipo p42 ou p44, estimulam a atividade catalítica da fosfolipase A2 (PLA2). A PLA2 se liga ao Ca²⁺ e esse complexo, seja na membrana plasmática ou nuclear, promovem uma clivagem e liberação de AA. Este é então convertido a PGs e tromboxanos com o auxílio da ciclooxigenase-2 que é uma enzima fortemente regulada por agentes pró-inflamatórios, incluindo lipopolissacarídeos, citocinas e fatores de crescimento (Figura 04) (BILLINGTON;

PENN, 2003).

Figura 04: Contração no músculo liso da via aérea (Ref: BILLINGTON; PENN, 2003).

A regulação da força contrátil no acoplamento eletromecânico ocorre através de mudanças no potencial de membrana (Em), sendo um sistema de regulação que envolve primariamente mudanças na [Ca²⁺]i (BARANY, 1996).

Despolarizações, seja por um potencial de ação ou por mudanças na concentração de K⁺ extracelular, aumentam primariamente a [Ca²⁺]i (Figura 04) através da ativação de VOCCs (HERMSMEYER; STUREK; RUSCH, 1988). Alguns músculos lisos já possuem evidências experimentais que comprovam a despolarização dependente de agonista, como é o caso da norepinefrina, histamina, 5-hidroxitriptamina e endotelina que despolarizam o tecido do músculo liso vascular aumentando o influxo de Ca²⁺ pelos VOCCs (BARANY, 1996).

Os canais do tipo VOCC podem ser divididos em dois grupos: ativados por alta voltagem (HVA), que envolvem os canais do tipo L (Cav 1.1, 1.2, 1.3 e 1.4), P/Q (Cav 2.1), N (Cav 2.2) e R (Cav 2.3) e ativados por baixa voltagem (LVA) podem