Curva de calibração do Trolox

(1)

ANEXOS

(2)

85 ANEXO A

1. Curvas de calibração usadas para o estudo da capacidade antioxidativa:

Figura A - Curva de calibração do Ácido Ascórbico utilizada na determinação da capacidade antioxidante pela captação do radical livre ABTS.

Figura B - Curva de calibração do Trolox utilizada na determinação da capacidade antioxidante pelo método de DPPH.

y = -0,0054x + 0,7049 R² = 0,9991

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

0 20 40 60 80 100 120 140

Abs

Concentração de Ácido Ascórbico (µg/ml)

Curva de calibração do Ácido Ascórbico

y = -0,0037x + 0,9271 R² = 0,9934

0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000

0 50 100 150 200 250 300

Abs

Concentração de Trolox (µg/ ml)

Curva de calibração do Trolox

Figura A - Curva de calibração do Ácido Ascórbico utilizada na determinação da capacidade antioxidante pela captação do radical livre ABTS.

Figura B - Curva de calibração do Trolox utilizada na determinação da capacidade antioxidante pelo método de DPPH.

(3)

86 2. Curvas de calibração usadas para o estudo das actividades enzimáticas:

y = 0,0028x - 0,03 R² = 0,9971

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

0 50 100 150 200 250 300

Abs

Concentração de Ácido Gálico (µg / ml)

Curva de calibração do Ácido Gálico

Figura C - Curva de calibração do Ácido Gálico utilizada na determinação dos compostos fenólicos pelo método de Folin-Ciocalteu.

y = 2,7395x - 0,0531 R² = 0,9992

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

Abs

Concentração de p-Nitrofenol (mM)

Curva de calibração do p-Nitrofenol

Figura D – Curva de calibração do p-Nitrofenol, utilizada para quantificação da actividade enzimática da β-Galactosidase e α-L-Arabinofuranosidase.

(4)

87

y = 0,0087x + 0,0065 R² = 0,994 0

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

0 10 20 30 40 50 60

Abs

Concentração do Ácido Galacturonico (mM)

Curva de calibração do Ácido Galacturónico

Figura E – Curva de calibração do Ácido Galacturónico, utilizada na determinação da actividade enzimática da Exo-poligalacturonase.

(5)

88 ANEXO B

1. Protocolo usado na extracção do RNA, seguindo o Mini Kit RNasey Plant (Qiagen) (o sublinhado indica alterações feitas ao protocolo) :

 Juntou-se a amostra (500 mg) a 450 µl RLT / β-ME;

 Vortexiou-se e colocou-se no gelo durante +/- 1 min;

 Colocou-se em seguida tudo na coluna lilas;

 Centrifugou-se a vmax, 2 min

 Retirou-se o sobrenadante para o tubo colector;

 Adicionou-se 50& do vol. total de EDTH;

 Transferiu-se para a coluna rosa;

 Centrifugou-se 15 s, 10,000 rpm;

 Adicionou-se 350 µl RW1;

 Centrifugou-se 15 s, 10.000 rpm;

 Adicionou-se 10 µl de DNAse com 70 µl RDD;

 Incubou-se a 37ºC, 45 min;

 Adicionou-se 350 µl RW1;

 Centrifugou-se 15 s, 10.000 rpm;

 Adicionou-se 500 µl RPE;

 Centrifugou-se a 15 s, 10.000 rpm;

 Adicionou-se 500 µl RPE;

 Centrifugou-se 2 min, 10.000 rpm;

 Centrifugou-se 1 min, vmax;

 Adicionou-se 30 µl H2O, centrifugou-se1 min, 10.000 rpm (1º eluição);

 Adicionou-se 30 µl H2O, centrifugou-se 1 min, 10.000 rpm (2º eluição);

(6)

89 ANEXO C

1. Comparação de valores de actividades enzimáticas quantificadas após 2 tempos de reacção. A existência de diferenças estatísticas entre tempos confirma que no 1º tempo investigado, as reacções ainda se encontravam na fase exponencial:

Figura F – Resultados da actividade da β-Galactosidase em pêras Rocha, 15 e 30 minutos após o início da reacção. H2O:

pêras em condições controlo; Pe, pêras inoculadas com P. expansum; Ap, pêras inoculadas com A. pullulans; e ApPe, pêras inoculadas com os dois fungos, A. pullulans e P. expansum. O * indica diferenças estatísticas entre tempos P< 0,05.

Os valores representam a média ± erro padrão. O tracejado e a linha é referente às amostras obtidas 12 e 24 horas após a inoculação, respectivamente.

Figura G – Resultados da actividade da Alfa-L-Arabinofuranosidase em pêras Rocha, 30 e 60 minutos após o início da reacção. H2O: pêras em condições controlo; Pe, pêras inoculadas com P. expansum; Ap, pêras inoculadas com A.

0 0,5 1 1,5 2

30 60

p-Nitrofenol µmol.min-1.µg-1

Tempo de actividade

Alfa-L-Arabinofuranosidase

H2O Pe Ap ApPe H2O Pe Ap ApPe

*

0 1 2 3 4 5 6

15 30

p-Nitrofenol µmol .min-1.µg-1

β - Galactosidase

*

(7)

90

pullulans; e ApPe, pêras inoculadas com os dois fungos, A. pullulans e P. expansum. O * indica diferenças estatísticas entre tempos P< 0,05. Os valores representam a média ± erro padrão. O tracejado e a linha é referente às amostras obtidas 12 e 24 horas após a inoculação, respectivamente.

Figura H – Resultados da actividade da Endo-Poligacturonase em pêras Rocha, 4 e 7 horas após o início da reacção. H2O:

Figura I – Resultados da actividade da Exo-Poligacturonase em pêras Rocha, 15 e 30 minutos após o início da reacção.

H2O: pêras em condições controlo; Pe, pêras inoculadas com P. expansum; Ap, pêras inoculadas com A. pullulans; e ApPe, pêras inoculadas com os dois fungos, A. pullulans e P. expansum. O * indica diferenças estatísticas entre tempos P< 0,05. Os valores representam a média ± erro padrão. O tracejado e a linha é referente às amostras obtidas 12 e 24 horas

0 20 40 60 80 100

4 7

% de redução da viscosidase . h-1

Endo-Poligalacturonase

*

0 10 20 30 40 50 60 70

15 30

Ac. Galacturonico (µmol/min/µg)

Exo-Poligalacturonase

*

(8)

91

após a inoculação, respectivamente.

Figura J – Resultados da actividade da Pectina metilesterase em pêras Rocha, 15 e 30 minutos após o início da reacção.

H2O: pêras em condições controlo; Pe, pêras inoculadas com P. expansum; Ap, pêras inoculadas com A. pullulans; e ApPe, pêras inoculadas com os dois fungos, A. pullulans e P. expansum. O * indica diferenças estatísticas entre tempos P< 0,05. Os valores representam a média ± erro padrão. O tracejado e a linha é referente às amostras obtidas 12 e 24 horas após a inoculação, respectivamente.

Figura K – Resultados da actividade da Endo-1,4-β-glucanase em pêras Rocha, 3 e 6 horas após o início da reacção. H2O:

*

0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03

15 30

Δ616.min-1.µg-1

Pectina metilesterase

*

0 20 40 60 80 100

3 6

% de redução da viscosidase . h-1

Endo-1,4-β-glucanase

*

(9)

92 ANEXO D

Tabela 3 - Resumo dos resultados obtidos nas diferentes abordagens realizadas.

H2O Pe Ap ApPe H2O Pe Ap ApPe H2O Pe Ap ApPe H2O Pe Ap ApPe

ABTS a b ↓ a a a c ↓ b ↓ b ↓ a b ↓ a b ↓

DPPH a b ↓ b ↓ b ↓

FOLIN a b ↓ b ↓ b ↓ a b ↓ b ↓ b ↓

β-Gal a a b ↓ ab ↓ a a ab ↑ b ↑

AFase a b ↓ b ↓ b ↓

Exo-PG a b ↑ b ↑ b ↑ a a b ↑ b ↑

Endo-PG a a ab ↑ b ↑

PME EGase

β-Gal a b ↓ c ↓ b ↓ a b ↓ b ↓ b ↓ a b ↓ b ↓ b ↓

PG1 a b ↓ c ↓ d ↓

PG2 a b ↓ b ↓ b ↓ a b ↓ c ↓ c ↓ a b ↓ c ↓ c ↓

PME1 a a a b ↓ a b ↓ b ↓ b ↓

XTH1 a b ↑ c ↓ c ↓ a b ↓ b ↓ b ↓ a b ↓ c ↓ c ↓

XTH2 a c ↓ b ↓ b ↓ a b ↓ c ↓ b ↓

EGase 2 a a c ↑ b ↑ a b ↓ b ↓ b ↓ a bc ↓ c ↓ b ↓

EXP1 a a b ↓ b ↓ a bc ↓ b ↓ c ↓ a c ↓ b ↓ b ↓ a b ↓ c ↓ c ↓

EXP2 a b ↑ c ↓ a a c ↓ b ↓ b ↓ a b ↑ c ↑ c ↑ a a b ↓ b ↓

48 72

Horas após inoculação Tratamento Capacidade Antioxidativa

Actividade Enzimática

Expressão génica

12 24

Não foi testado

Sem diferenças entre tratamentos

↓ Diminuição da actividade ou expressão

↑ Aumento da actividade ou expressão Sem significado biológico