Rev. Bras. Reumatol. vol.57 número6

w w w . r e u m a t o l o g i a . c o m . b r

REVISTA

BRASILEIRA

DE

REUMATOLOGIA

Comunicac¸ão

breve

Evidência

molecular

de

Borrelia

burgdorferi

sensu

lato

em

pacientes

no

centro-oeste

brasileiro

Fernando

Aguilar

Lopes

,

Jania

de

Rezende

,

Danielly

Beraldo

dos

Santos

Silva

,

Fernanda

de

Cássia

Gonc¸alves

Alves

_,

_Carina

_Elisei

_de

_Oliveira

e

Izaías

Pereira

da

Costa

a_{UniversidadeFederaldeMatoGrossodoSul(UFMS),FaculdadedeMedicina(Famed),ProgramadePós-Graduac¸ãoemSaúde}

eDesenvolvimentonaRegiãoCentro-Oeste,CampoGrande,MS,Brasil

b_{UniversidadeFederaldeMatoGrossodoSul(UFMS),HospitalUniversitárioMariaAparecidaPedrossian(Humap),CampoGrande,MS,}

Brasil

c_{UniversidadeCatólicaDomBosco(UCDB),ProgramadePós-Graduac¸ãoemBiotecnologia,CampoGrande,MS,Brasil} d_{UniversidadeEstadualPaulista(Unesp),FaculdadedeCiênciasAgráriaseVeterinárias(FCAV),ProgramadePós-Graduac¸ão}

emGenéticaeMelhoramentoAnimal,Jaboticabal,SP,Brasil

e_{UniversidadeCatólicaDomBosco(UCDB),ProgramaInstitucionaldeBolsasdeIniciac¸ãoCientífica(PIBIC),CampoGrande,MS,Brasil}

informações

sobre

o

artigo

Históricodoartigo:

Recebidoem22denovembrode 2016

Aceitoem14deabrilde2017

On-lineem5demaiode2017

Palavras-chave: Borreliaburgdorferi

Doenc¸adeLyme flgE

SíndromedeBaggio-Yoshinari Brasil

r

e

s

u

m

o

Esteestudopromoveuadetecc¸ãodeDNAdeBorreliaburgdorferisensulatoemamostrasde sangueesorodepacientescommanifestac¸õesclínicaseepidemiologiacompatíveiscom adoenc¸adeLyme-símilebrasileiraousíndromedeBaggio-Yoshinari.Paratanto,foifeita triagemsorológicapelosmétodosdeElisaeWesternblottingeaidentificac¸ãomolecularde

B.burgdorferipormeiodaamplificac¸ãodeumfragmentodogeneconservadoquesintetiza oganchoflagelar(flgE).Osresultadosdemonstraramsorologiapositivae,pelaprimeiravez, apresenc¸adeDNAdeBorreliaburgdorferisensulatoemhumanosnaRegiãoCentro-Oestedo Brasil.Aanálisegenéticadassequênciasdosisoladosmostrousimilaridadeàssequências disponíveisnoGenBank.Pelaanálisefilogenéticainferidapelasequênciaparcialdogene

flgE,acepabrasileiraagrupou-secomasequênciadeB.burgdorferisensulato.Esteestudo abreperspectivaspromissorasereforc¸aanecessidadedeestudosadicionaisafimde deter-minarascaracterísticasepidemiológicasdadoenc¸a,bemcomooimpactodaprevalênciada borreliosebrasileiranoEstadodeMatoGrossodoSul,Brasil.

©2017PublicadoporElsevierEditoraLtda.Este ´eumartigoOpenAccesssobuma licenc¸aCCBY-NC-ND(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

∗ _{Autorparacorrespondência.}

E-mail:[email protected](F.A.Lopes). http://dx.doi.org/10.1016/j.rbr.2017.04.001

Molecular

evidence

of

Borrelia

burgdorferi

sensu

lato

in

patients

in

Brazilian

central-western

region

Keywords: Borreliaburgdorferi

Lymedisease flgE

Baggio-Yoshinarisyndrome Brazil

a

b

s

t

r

a

c

t

WeaimedtodetectDNAofBorreliaburgdorferiinwholebloodandserumsamplesofpatients withclinicalsymptomsandepidemiologycompatiblewithBrazilianLyme-likedisease.Four patientswithpositiveepidemiologicalhistorieswererecruitedforthestudy.Bloodsamples werecollected,screenedbyserologictestingbyELISAandWesternblottingandmolecular identificationofB.burgdorferibyamplifyingafragmentoftheconservedgenethat synthe-sizesthehookflagellar(flgE).Theresultsshowedpositiveserologyandforthefirsttime,the presenceofBorreliaburgdorferisensulatoinhumansintheMidwestregionofBrazil.The resultingsequencesweresimilartoGenBankcorrespondingsequencesofBorreliaburgdorferi flgEgene.Byneighbor-joiningthephylogeneticanalysis,theflgEsequenceoftheBrazilian strainclusteredinamonophyleticgroupwiththesequenceofBorreliaburgdorferisensulato

under100%bootstrapsupport.Thisstudyopensuppromisingperspectivesandreinforces theneedforadditionalstudiestodeterminetheepidemiologicalcharacteristicsofthe dise-ase,aswellastheimpactoftheprevalenceofBrazilianborreliosisinMatoGrossodoSul State,Brazil.

©2017PublishedbyElsevierEditoraLtda.ThisisanopenaccessarticleundertheCC BY-NC-NDlicense(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Introduc¸ão

Adoenc¸adeLyme(DL)éumazoonoseemergentedecaráter multissistêmico,causadaporespiroquetasdogrupoBorrelia burgdorferisensulatoetransmitidaporcarrapatosdocomplexo

Ixodesricinus.1

A distribuic¸ão geográfica da doenc¸a é ampla e as manifestac¸õesclínicas variamconformeaespéciedo com-plexo B. burgdorferi sensu lato encontrada em determinada localidadegeográfica.2,3_{Adiversidadeetiológicaeantigênica}

explicaoorganotropismoeoaparecimentodequadros clíni-coselaboratoriaisdistintosnasdiferentesregiõeserepresenta umcrescentedesafioaomanejodessazoonoseemergente.1

NoBrasil,os primeiroscasos foramdescritos noEstado deSãoPauloem19924_{e,desdeentão,outroscasostêmsido}

descritoscomtécnicas sorológicasemolecularesem diver-sosestados brasileiros:MatoGrosso doSul,5–7 _Amazonas,8

Tocantins9_eParaná,10

Diferenc¸as observadas nas características epidemioló-gicas, clínicas e laboratoriais em relac¸ão à DL descrita no hemisfério norte permitiram caracterizar a doenc¸a de Lyme-símile brasileira (DLSB) ou síndrome de Baggio--Yoshinari,11,12 _{que, apesar do clássico eritema}

migrató-rio e das habituais complicac¸ões sistêmicas encontradas na DL, cursa com grande frequência de recorrências e produc¸ão de autoanticorpos ao longo da prolongada evoluc¸ãoclínica.13

Estudos com métodos moleculares a partir de amos-tras de humanos com sintomatologia compatível com a DLSB têmreforc¸ado aexistência de casosde borrelioseno Brasil.10,14_{Dessaforma,opresenteestudoobjetivou}

investi-garapresenc¸adeDNAdeBorreliaburgdorferiemamostrasde pacientescomdiagnósticoclínicoesorológicodeborreliose noMatoGrossodoSul,Brasil.

Pacientes

e

métodos

Selecionamosquatropacientescommanifestac¸õesclínicase epidemiologiacompatívelcomaDLSBatendidospeloServic¸o de ReumatologiadoHospitalUniversitárioMariaAparecida Pedrossian da Universidade Federalde MatoGrossodoSul (Humap-UFMS). Todasaspacientes eramdosexofeminino com média de 33,3 (± 11,9) anos. Todas tinham histórico de picadasde carrapato evisitasa áreas de altorisco nas regiões Sudeste eCentro-Oeste doBrasile também preen-chiamoscritériosbrasileirosparaodiagnósticodeborreliose, talcomoadotadospeloLaboratóriodeInvestigac¸ãoem Reu-matologia, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, UniversidadedeSãoPaulo(LIM-17),centrodereferênciano Brasil.12,15

Uma das pacientes estava nafase aguda(diagnosticada dentro detrês meses doiníciodadoenc¸a) easoutras três estavam nafasetardia (diagnosticadosmaisdetrês meses apósoiníciodadoenc¸a)daborreliose.Apacientequeestava em fase de doenc¸a aguda apresentava sintomas flu-like, inclusivefebre,cefaleia,mialgiaeartralgia.Aspacientesque estavam no estágio tardioda doenc¸a tinham desenvolvido artriteeapresentavamdistúrbioscognitivos, manifestavam--secomsintomasinespecíficos,inclusiveperdadememória, alterac¸ões dosono e alterac¸õesdo humor,quadro depres-sivo com indiferenc¸a social e perda de apetite, além da recorrênciadesintomasflu-likeefadigacrônica.Todas apre-sentaramresultadospositivosnostestessorológicosparaB. burgdorferiG39/40,de origemamericana,commetodologias ElisaeWB16 _{deacordocomapadronizac¸ãoeinterpretac¸ão}

recomendadas pelo laboratório de referência nacional LIM-17.12,15

forneceramamostrasdesangueeforamincluídosnogrupo decontrole.Trinta indivíduoseram dosexofeminino(75%) edezeramdomasculino(25%).Amédiafoide34,6(±19,2) anos.

DNA foi extraído com kit QIAamp DNA Kit (QIAGEN®) a partir de amostras de 100␮L de sangue periférico e de soro, deacordo com asinstruc¸ões dofabricante. Apureza (260nm/280nm)eaconcentrac¸ão(ng/␮L)totaldeDNAforam determinadas por densidade óptica em espectrofotôme-tro (BioDrop® Touch Duo Spectrophotometer by BioDrop England).

Os iniciadores usados foram desenhados por Rezende

et al. (Instituto Nacional da Propriedade Industrial – INPI – Processo BR 10 2016 021522 6) para amplificac¸ãode um fragmentode262pbdaregiãodecodificac¸ãodogene con-servadoquesintetizaoganchoflagelar(flgE)deB.burgdorferi

descritoporSalet al.17 _{Foram usadosos seguintesprimers:}

flgE262FW(5′_{–TCCTCCGGGATTCATACAAG–3}′_)eflgE262Rev

(5′_{–TGGGTGCAAATGTAGGTGAA–3}′_).

Amplificac¸ãofoifeitaem25␮Ldevolumefinaldereac¸ão com17,55␮LdeH2OultrapuralivredeDNAse/RNAse,2,50␮L deTampãoPCR10x,0,75␮LdeMgCl2(1,5mM),0,50␮LdedNTP

mix(10mM), 0,25␮Lde cada primer (10 pmoles),0,2␮Lde PlatinumTM _{TaqDNAPolymerasee3␮LdeDNAextraído da}

amostra.

As condic¸ões de ciclos da PCR consistiram de uma desnaturac¸ão inicial durante 3 minutos a 95◦_{C, seguida}

de 45 ciclos repetitivos, consistiu emdesnaturac¸ão a 95◦_C

por 20 segundos, anelamento a 62◦_{C por 25 segundos,}

extensãoa72◦_{Cpor25segundos,seguidosporuma}

exten-são final durante 5 minutos a 72◦_{C. As boas práticas}

de laboratório foram seguidas para evitar a contaminac¸ão e, em cada reac¸ão, foi incluído um controle negativo (água) para descartar possibilidade de contaminac¸ão. Bor-relia anserina foi usada como um controle positivo em todas as reac¸ões. Os produtos de PCR foram analisados em eletroforese de gel de agarose a 1,5%, corado com SYBR Gold (Invitrogen) e analisados por transiluminac¸ão deUV.

As amostras positivas foram purificadas com QIAEX®II

Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH) e sequenciadas em sequenciador automáticode DNA ABI Prism 3130(Applied Biosystems®) em ambas as direc¸ões com BigDye Ready Reaction mix (ABI Corporation®). O alinhamento foi feito emsoftware Clustal W2® com as sequências obtidasneste estudo e a sequência disponível no GenBank (Número de Acesso:CP009656.1).Aanálisefilogenéticafoi inferidapara ogene flgEcom oprogramaMEGA 7.0® eumdendograma foi construído pelo método de Neighbor-Joining.18 _Valores

de confianc¸a para os ramos individuais da árvore resul-tante foram determinados pela análise de bootstrap com 100repetic¸ões.

OestudofoiaprovadopeloComitêdeÉticaemPesquisa (CEP)daUniversidadeFederaldeMatoGrossodoSul(UFMS) conformeindicadonoprotocolodepesquisanúmero1.065.681 de15demaiode2015–CAAE42325815.1.0000.0021.Todosos controlesepacientesassinaramotermo deconsentimento livreeesclarecido.

Tabela1–ResultadodasorologiaparaB.burgdorferi porElisaeWesternblottingedaPCRparaogeneflgE emamostrasdepacientes

Paciente Elisa Westernblotting PCR

IgM IgG IgM IgG flgE

1 Negativo Positivo Negativo Positivo Positivo 2 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 3 Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo 4 Negativo Positivo Negativo Positivo Positivo

Resultados

Apresenc¸adeanticorposanti-Borreliaeaamplificac¸ãodoDNA

deBorreliaburgdorferisensulatoparaogeneflgEforam

detec-tadasemtodasasamostrasanalisadas(tabela1).

Paraareac¸ãodePCRforamsubmetidasoitoamostras (qua-trosanguetotalequatrosoros)e100%(4/4)dasamostrasde sanguetotale25%(1/4)dasamostrasdesorohumanoforam positivas(fig.1).

Assequênciasobtidasnesteestudoapresentaram homo-logiacomsequênciasdeB.burgdorferisensulatodepositadas noGenBankepossibilitaramaidentificac¸ãoemnívelde espé-cie.AextensãosequenciadaeavaliadadogeneflgEdeacordo comassequênciasdisponíveisnoGenBankfoide228pb,que codificam76aminoácidos.

Assequênciasobtidasnesteestudoforamdepositadasno GenBank com os números de acesso KU712208,KU712209, KU712210,KY073265eKY073266.Assequênciasforam agru-padas emumgrupo monofilético pelaanálise filogenética, pelométododeNeighbor-Joining,com100%desuporte boots-trap(fig.2).

Discussão

NossosresultadosfornecemevidênciadeBorreliaburgdorferi sensulatoemamostrasdesanguetotaleainéditadetecc¸ãodo DNAdaespiroquetaamplificadaparaogeneflgEemamostra desorohumanoemnossaregião.

O geneque sintetizao ganchoflagelar(flgE)é umgene cromossômicoúnico,deaproximadamente1kb,eque codi-fica para a proteína flagelina (41kDa). Por ser altamente

PM C- 1 2 3 4 5 6 7 8 C+

262bp 300bp

200bp

72

LS1 sangue humano (KU712208)

LS2 sangue humano (KU712209)

LS2 soro humano (KU712210)

B31 (CP009656.1)

LS3 sangue humano (KY073265)

LS4 sangue humano (KY073266)

Figura2–Árvorefilogenéticabaseadanacomparac¸ãodaregiãocodificadoradogeneflgEdeBorreliaburgdorferi.

conservado,suadiversidadeévaliosaparadistinguiras espé-ciesdeBorrelia.19,20_{Aanálisefilogenéticacomasequênciade}

genesdaflagelinaconfirmouahomologiaentreosisolados. Todasasamostrasdesanguetotalanalisadas apresenta-rampositividade e apenasuma únicaamostra de soro foi positivanareac¸ãode PCR.Coburn etal.21 _{demonstraram a}

capacidadedeligac¸ãodeB.burgdorferiàsplaquetasdo hospe-deiroeGoodmanetal.22_{afirmamquetalvezessesejaomotivo}

damaiorconcentrac¸ãodeespiroquetasnoplasmaemrelac¸ão aosoroesugeremqueoplasmasejaaamostrapreferencial parapesquisa.

No Brasil, pacientes diagnosticados com características sugestivasdeborreliose apresentamhistóricodeexposic¸ão acarrapatos,quadroclínicosugestivocomfrequentes recor-rências,sorologia positiva mas com títulosbaixose pouco persistentes,inclusive avisualizac¸ãode estruturas sugesti-vasdeespiroquetasemamostrasdesanguedepacientescom perfilclínicocompatível.12,13

Apresenc¸a de anticorpos anti-Borrelia pelastécnicas de ElisaeWBtemsidodemonstradaempacientessintomáticos eassintomáticos,comepidemiologiapositivadecontatocom carrapato,emdiversasregiõesdoBrasil.5,6,8–10

Entretanto, a observac¸ão de um padrão de reatividade sorológica diferente da DL com baixa sensibilidade e títu-los variáveis levou à definic¸ão de critérios nacionais para interpretac¸ãodostestessorológicos.OLIM-17,centrode refe-rêncianoBrasil,adotaumcritériodeavaliac¸ãodoWBquese baseianãonapresenc¸adebandasespecíficas,masno quanti-tativodebandas,sendoconsideradotestepositivoapresenc¸a deduasbandasparaIgM,quatroparaIgGouaindaumpadrão combinadodeumabandaIgMeduasbandasIgG.12,15

Adescric¸ãodeespiroquetasnasuaformaL,conhecidas comobactérias deficientesemparede celularequepodem alterarsuamorfologiaquandoascondic¸ões de sobrevivên-cianão são favoráveis,12 _{ea posteriordetecc¸ão de Borrelia}

burgdorferisensustricto porMantovanietal.14 _auxiliaramno

entendimentoda maioriadas controvérsiasdaDLSB:longa permanência das espiroquetas no hospedeiro devido aos mecanismosdeevasãodasdefesasdohospedeiro,23

dificul-dadespara cultivá-las nosmeios tradicionais como o BSK, emboradescrevamavisualizac¸ãodeestruturassugestivasde espiroquetasemamostrasdesanguehumanodepacientes comperfilclínicocompatível12_{,baixarespostaimunológica}

contraabactériaqueocasionatítulosbaixosepouco persis-tentesdeanticorpos,desenvolvimentodeautoimunidade12_e

resistênciaàsuaeliminac¸ãodoshospedeiros,ocorrem recidi-vasclínicasesorológicas.13,23–25

Essesresultadosconfirmamaexistênciadeborreliose cau-sadaporB.burgdorferisensulatonoEstadodeMatoGrossodo

Sul,Brasil,comsintomassemelhantesaDLclássicaesugerem anecessidadedeprosseguircomosestudosepidemiológicos, sorológicosemolecularesafimdemelhorcaracterizaressa zoonoseemergentenaregião,queraramenteéfatal,porém degrandemorbidadequandonãoadequadamente diagnosti-cadaetratada,devidoàsrecorrênciasecomplicac¸õesclínicas progressivas.

Financiamento

Conselho Nacionalde Desenvolvimento Científicoe Tecno-lógico(CNPq)eFundac¸ãodeApoio aoDesenvolvimentodo Ensino,CiênciaeTecnologiadoEstadodeMatoGrossodoSul (Fundect).

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

Agradecimentos

ÀequipedoLIM-17pelotreinamentoeacooperac¸ãodurante este estudo e aos professores Dra. Susana Elisa Moreno (UCDB),Dra.AnaRitaCoimbraMottadeCastro(UFMS)eDr. CristianoMarceloEspinolaCarvalho(UCDB)pelainestimável colaborac¸ão.

r

e

f

e

r

ê

n

c

i

a

s

1.SteereAC.LymeDisease.NEnglJMed.2001;345:115–25. 2.QiuWG,BrunoJF,McCaigWD,XuY,LiveyI,SchrieferME,

etal.Widedistributionofahigh-virulenceBorreliaburgdorferi cloneinEuropeandNorthAmerica.EmergInfectDis. 2008;14:1097–104.

3.RudenkoN,GolovchenkoaM,GrubhofferaL,OliverJHJr. UpdatesonBorreliaburgdorferisensulatocomplexwith respecttopublichealth.TicksTickBorneDis.2011;2:123–8. 4.YoshinariNH,OyafosoLK,MonteiroFGV,BarrosPJL,Cruz

FCM,FerreiraLGE,etal.Doenc¸adeLyme:relatodeumcaso observadonoBrasil.RevHospClin.1993;48:170–4.

5.CostaIP,BonoldiVLN,YoshinariNH.Perfilclínicoe laboratorialdadoenc¸adeLyme-símilenoEstadodeMato GrossodoSul:análisede16pacientes.RevBrasReumatol. 2001;41:142–50.

7. RezendeJ,LopesFA,AlvesFCG,BrunoAR,MorenoSE,Costa IP,etal.DetectionofBorreliaburgdorferisensulatoinMato GrossodoSul,Brazil.JSMTropMedRes.2016;1:1003. 8. TalhariS,SantosMNS,TalhariC,deLimaFerreiraLC,Silva

RMJr,ZelgerB,etal.BorreliaburgdorferisensulatoinBrazil: occurrenceconfirmedbyimmunohistochemistryandfocus floatingmicroscopy.ActaTrop.2010;115:4–200.

9. Carranza-TamayoCO,CostaJNG,BastosWM.Lymedisease inthestateofTocantins,Brazil:reportofthefirstcases.BrazJ InfectDis.2012;16:586–9.

10.Gonc¸alvesDD,MouraRA,NunesM,CarreiraT,VidottoO, FreitasJC,etal.Borreliaburgdorferisensulatoinhumansina ruralareaofParanáState,Brazil.BrazJMicrobiol.

2015;46:571–5.

11.GauditanoG,BonoldiVLN,CostaIP,Barros-BattestiDM, BarrosPJL,FonsecaAH.SíndromedeLyme-símileou complexoinfecto-reacionaldocarrapato–Síndromede Baggio-Yoshinari.RevPaulReumatol.2005;4:16–7.

12.MantovaniE,CostaIP,GauditanoG,BonoldiVLN,HiguchiML, YoshinariNH.DescriptionofLymedisease-likesyndrome inBrazilIsitanewstickbornediseaseorLymedisease variation?BrazJMedBiolRes.2007;40:443–56.

13.YoshinariNH.UmalongajornadaparaentenderaBorrelia burgdorferinoBrasil.RevBrasReumatol.2009;49:483–6. 14.MantovaniE,MarangoniRG,GauditanoG,BonoldiVLN,

YoshinariNH.AmplificationoftheflgEgeneprovides evidencefortheexistenceofaBrazilianborreliosis.RevInst MedTropSãoPaulo.2012;54:153–7.

15.YoshinariNH,MantovaniE,BonoldiVL,MarangoniRG, GauditanoG.BrazilianLyme-likediseaseorBaggio-Yoshinari Syndrome:exoticandemergingBraziliantick-borne zoonosis.RevAssocMedBras.2010;56:363–9.

16.BarrosPJL.Caracterizac¸ãoclínicaelaboratorialdadoenc¸ade LymenoBrasil,atravésdemétodosimunológicosereac¸ão

emcadeiadepolimerase[PhDThesis].SãoPaulo: UniversidadedeSãoPaulo;2000.p.163.

17.SalMS,LiC,MotalabMA,ShibataS,AizawaSI,CharonNW. Borreliaburgdorferiuniquelyregulatesitsmotilitygenes andhasanintricateflagellarhookbasalbodystructure. JBacteriol.2008;190:1912–21.

18.SaitouN,NeiM.Theneighbor-joiningmethod:anewmethod forreconstructingphylogenetictrees.MolBiolEvol.

1987;4:406–25.

19.PickenRN.Polymerasechainreactionprimersandprobes derivedfromflagellingenesequencesforspecificdetectionof theagentsofLymeDiseaseandNorth-AmericanRelapsing Fever.JClinMicrobiol.1992;30:99–114.

20.FukunagaM,OkadaK,NakaoM,KonishiT,SatoY. PhylogeneticanalysisofBorreliaspeciesbasedonflagellin genesequencesanditsapplicationformoleculartypingof Lymediseaseborreliae.IntJSystBacteriol.1996;46:898–905. 21.CoburnJ,LeonhJM,ErbanJK.Integrin␣IIb␤3mediatesbinding

oftheLymediseaseagentBorreliaburgdorferitohuman platelets.ProcNatlAcadSci.1993;90:7059–63.

22.GoodmanJL,BradleyJF,RossAE,GoellnerP,LagusA,VitaleB, etal.BloodstreaminvasioninearlyLymedisease:results fromaprospective,controlled,blindedstudyusingthe polymerasechainreaction.AmJMed.1995;99:6–12. 23.BerendeA,OostingM,KullbergBJ,NeteaMG,JoostenLAB.

ActivationofinnatehostdefensemechanismsbyBorrelia. EurCytokineNetw.2010;21:7–18.

24.YoshinariNH,BonoldiVLN,Barros-BattestiDM,Schumaker TTS.Doenc¸adeLyme-símilenoBrasil.RevBrasReumatol. 1999;39:57–8.