UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
GEORGE MEREDITE CUNHA DE CASTRO
OTIMIZAÇÃO DA HIDRÓLISE ÁCIDA DA MACROALGA VERMELHA Solieria filiformis VISANDO A GERAÇÃO DE ALTO TEOR DE
MONOSSACARÍDEOS TOTAIS
GEORGE MEREDITE CUNHA DE CASTRO
OTIMIZAÇÃO DA HIDRÓLISE ÁCIDA DA MACROALGA VERMELHA Solieria filiformis VISANDO A GERAÇÃO DE ALTO TEOR DE MONOSSACARÍDEOS
TOTAIS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Bioquímica do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal
Orientadora: Profª. Drª. Norma Maria Barros Benevides
Co-orientadora: Profª. Drª. Márjory Lima Holanda Araújo
Biblioteca Universitária
Gerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
C351o Castro, George Meredite Cunha de.
Otimização da hidrólise ácida da macroalga vermelha Solieria filiformis visando a geração de alto teor de
monossacarídeos totais / George Meredite Cunha de Castro. – 2016.
85 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Fortaleza, 2016.
Orientação: Prof. Dr. Norma Maria Barros Benevides. Coorientação: Profa. Dra. Márjory Lima Holanda Araújo.
1. Superfície de resposta. 2. Hidrólise. 3. Algas marinhas. I. Título.
GEORGE MEREDITE CUNHA DE CASTRO
OTIMIZAÇÃO DA HIDRÓLISE ÁCIDA DA MACROALGA VERMELHA Solieria filiformis VISANDO A GERAÇÃO DE ALTO TEOR DE MONOSSACARÍDEOS
TOTAIS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Bioquímica do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal
Aprovada em: 17/03/2016.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________ Profª. Drª Norma Maria Barros Benevides (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
____________________________________________ Profª. Drª Norma Maria Valderez Ponte Rocha
Universidade Federal do Ceará (UFC)
____________________________________________ Prof. Dr. Renato de Azevedo Moreira
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me capacitar, me dar a oportunidade de aprender e sempre me dar a força necessária para continuar.
Aos meus pais, Etelberto e Glícia, meus irmãos, Etelberto, Carlos Henrique e Gabriel, minha cunhada Marisa, minha tia e madrinha, Silvia Helena, e a toda a minha família, pelo apoio e incentivo, muito necessários.
À professora Drª. Norma Maria Barros Benevides pela orientação nesse mestrado, disponibilidade e pela confiança em mim depositada.
A todos os membros do Laboratório de Carboidratos e Lectinas (Carbolec), por toda a ajuda dada e por dividirem seu tempo comigo. Em especial à Ticiana Lima, Antônio Neto e Ticiana Abreu pela amizade que encontrei em vocês.
À professora Drª. Márjory Lima Holanda, por me acolher no laboratório mesmo sem pré-requisitos ou experiência; pela paciência e disponibilidade, mesmo “altas horas
da noite” e fora do ambiente de trabalho; também pela humildade como pessoa e alegria
no trabalho; finalmente, por ter me mostrado, sobretudo, que é possível ter sucesso
profissional sem esquecer da vida fora do “mundo acadêmico”.
Ao professor Dr. Hermógenes David de Oliveira, pelo acolhimento e boa-vontade de ensinar em todos os momentos.
A todos os membros do Laboratório de Aplicação Biotecnológica de Algas e Plantas (BioAP), convivência e companheirismo em laboratório.
À professora Maria Valderez, pela orientação acadêmica que permitiu me permitiu avançar em conhecimento.
Aos membros do Grupo de Pesquisa e Desenvolvimento de Bioprocessos, em especial, Jéssyca, pela ajuda e disponibilidade quando necessárias.
À todos os membros do Laboratório de Fisiologia Vegetal 1, em especial à Rafael Miranda, pela ajuda no uso do HPLC e da montagem das curvas-padrão, e toda a disponibilidade demonstrada.
À Larissa Fiúza e Vitória Oliveira, pela amizade incondicional que encontrei e por ter me ensinarem tantas coisas que sou incapaz de descrever ou enumerar, o meu muitíssimo obrigado.
“O que agrada à Deus em minha
pequena alma é que eu ame minha
pequenez e minha pobreza”
RESUMO
Com a Revolução Industrial, o uso de recursos fósseis possibilitou melhores eficiências produtivas e criação de novos produtos. Entretanto, esses recursos possuem uma quantidade limitada. Nesse cenário, as biomassas surgem como material renovável e vantajoso, devido suas características naturais e grande disponibilidade, para ser usado na produção de químicos de alto valor e combustíveis renováveis. Nesse contexto, esse trabalho objetivou otimizar a hidrólise ácida da macroalga vermelha Solieria filiformis utilizando Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) e Metodologia de Superfície de Resposta (MSR) para gerar um meio com alto teor de monossacarídeos totais e galactose total. O delineamento foi elaborado com o auxílio de Software Statistica com 17 experimentos independentes de hidrólise para o estudo três parâmetros (concentração de ácido sulfúrico, quantidade de biomassa e tempo de reação); foram analisadas quatro variáveis resposta (geração de Monossacarídeos totais, Fator de conversão de biomassa em monossacarídeos totais ( ), geração de Galactose total e Volume de hidrolisado recuperado). As algas foram colhidas de estruturas de cultivo e processadas. As hidrólises foram realizadas à 120 °C em autoclave com concentração de ácido, quantidade de alga e tempo de processo diferentes para cada experimento. Os resultados obtidos foram analisados pelo teste de variância (ANOVA). Foram gerados modelos matemáticos, superfícies de resposta e curvas de contorno para cada uma das respostas. Posteriormente, os parâmetros Monossacarídeos totais e Galactose total foram otimizados e foram construídos gráficos de comportamento de hidrólise para os parâmetros concentração de ácido e tempo de reação, avaliando as duas respostas otimizadas. Para a resposta Monossacarídeos totais, os parâmetros de concentração de ácido quadrático e quantidade de biomassa linear e quadrático foram significativos. Para a , os parâmetros de concentração de ácido quadrático e quantidade de biomassa linear foram significativos. Para Galactose total, os parâmetros de concentração de ácido quadrático e quantidade de biomassa linear e quadrático foram significativos. Para o Volume recuperado, os parâmetros de concentração de ácido linear e quadrático e quantidade de biomassa linear foram significativos. Os parâmetros tempo de hidrólise linear e quadrático bem como as interações entre os parâmetros não foram significativos para nenhuma das respostas estudadas. Modelos matemáticos foram gerados para as respostas Monossacarídeos totais, , Galactose total e Volume recuperado com valores de R2 igual à 0,88, 0,8, 0,89 e 0,8, respectivamente, para p = 0,05. A otimização de Monossacarídeos totais gerou resultados in silico de 174,06 g.L-1 de monossacarídeos totais para a utilização dos parâmetros de 1,8 M de ácido sulfúrico, 723,3 g,L-1 de biomassa e 36,8 min de reação e a otimização de Galactose total gerou resultados in silico de 154,74 g.L-1 de galactose total para a utilização dos parâmetros de 1,8 M de ácido sulfúrico, 665,7 g,L-1 de biomassa e 32,9 min de processo. A simulação do e Volume recuperado para os parâmetros do ponto ótimo de Monossacarídeos totais gerou 0,2515 e 89%, respectivamente. Dessa forma, conclui-se que foi possível otimizar a hidrólise ácida de S. filiformis para produção de altos teores de Monossacarídeos totais e Galactose total com conhecimento do e Volume recuperado, com a geração de modelos matemáticos preditivos com confiabilidade estatística para todas as respostas.
Palavras-chave: Otimização. Superfície de resposta. Hidrólise. Algas marinhas. Alto
ABSTRACT
With the Industrial revolution, the use of fossil resources made possible to reach better production efficiencies and to create new products, permanently redefining the society. However, this resources are limited and its use caused and still causing environmental problems due to CO2 emission. In this scenario, biomass emerge as a renewable and
advantageous material owing natural characteristics and high availability, to be used in chemical and renewable fuels production; among all biomass, seaweeds present characteristics that allows its application, as less recalcitrant structure when compared with terrestrial biomass. In this context, this work aimed to acid hydrolysis of red seaweed Solieria filiformis Central composite design (CCD) and Response surface methodology (RSM) to generate a high sugar concentration medium contend. The design elaborated with Statistica version 10.0 with 17 independent experiments of hydrolysis to study 3 parameters (sulfuric acid concentration, biomass load concentration and time of reaction); were analyzed 4 response variables (total sugar generation, biomass to sugar conversion yield ( ), Total galactose generation and recovered hydrolysis liquid). The seaweeds were harvested in farming structures located
in Flecheiras’ Beach, Trairi, Ceará, washed, dried at 25 °C and crushed in electric mill. Hydrolysis were conducted in autoclave at 120 °C with different acid concentration, biomass load and time of process for each experiment. The results obtained were analyzed by analysis of variance (ANOVA). The influence of each parameter over the responses was studied. Mathematical models, response surface plots or contour plots were created for each once on the responses. After, Total sugar and galactose were optimized and kinetic hydrolysis plots were created for each once on the parameters using the responses. To response Total sugar and galactose, the quadratic parameter of acid concentration and the linear and quadratic parameter of quantity of biomass were significant. For the response , the quadratic parameter of acid concentration and the linear parameter of loading of biomass were significant. To response Total galactose, the quadratic parameter of acid concentration and the linear and quadratic parameter of quantity of biomass were significant. For the response Recovered liquid, the linear and quadratic parameters of concentration of acid and the linear parameter of loading of biomass were significant. The linear and quadratic parameters of hydrolysis time and the interactions between parameters were not significant for any of the studied responses. Mathematical models were created for the three responses, Total sugar, , Total galactose and Recovered liquid, with R2values of 0.88, 0.8, 0.89 and 0,8, respectively for p = 0.05. The optimization of Total sugar generated in silico results of 174.06 g.L-1 of total sugars for using parameters of 1.8 M sulfuric acid, 723.3 g,L-1 of biomass and 36.8 min of reation. The optimization of Total galactose generated in silico results of 154.74 g.L-1 of total sugars for using parameters of 1.6 M sulfuric acid, 665.7 g,L-1 of biomass and 32.9 min of reaction. The simulation of and recovered liquid to the optimum parameters generated 0.2515 and 89%, respectively. Thus, it is concluded that it was possible to optimize the acid hydrolysis of S. filiformis to the production of high amount of total sugar and glactose with knowledge of the and recovered liquid, generating a predictive mathematical modeling with statistical confidence for the three answers.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Habitat natural de micro e macroalgas ... 18 Figura 2 – Estruturas químicas representando as unidades repetitivas de a) κ
-carragenana e b) ɩ-carragenana ... 21 Figura 3 – Alga marinha vermelha Solieria filiformis (Kützing) P.W. Gabrielson
(Rhodophyta, Gigartinales, Solieriaceae) ... 22 Figura 4 – Cortes histológicos de Solieria filiformis (Kützing) P.W. Gabrielson
(Rhodophyta, Gigartinales, Solieriaceae) ... 23 Figura 5 – Cultivo no mar da macroalga marinha vermelha Solieria filiformis ... 26 Figura 6 – Estrutura química dos monossacarídeos glucose e galactose, com os
carbonos enumerados em vermelho ... 27 Figura 7 – Princípios condensados da química verde ... 31 Figura 8 – Abordagem de biorrefinaria para a utilização de biomassa lignocelulósica
... 32 Figura 9 – Abordagem de biorrefinaria para a utilização de biomassa algácea ... 32 Figura 10 – Possíveis caminhos adotados para a resolução de problemas
experimentais no estudo de 3 parâmetros a) “One-at-a-time”, b) Matriz completa e c) Delineamento Composto Central Rotacional ...
38
Figura 11 – Fotografia de satélite mostrando a área de cultivo em mar aberto da macroalga vermelha S. filiformis em Fleicheiras, Trairi, Ceará ... 40 Figura 12 – Tubo autoclavável utilizado para a realização das hidrólises ácidas de S.
filiformis ... 41 Figura 13 – Planejamento fatorial completo 23, com cinco níveis ... 42 Figura 14 – Comparação visual entre a) solução ácida e b) meio hidrolisado de
Solieria filiformis ... 46
Figura 15 – Gráfico de Pareto representando os efeitos estimados que influenciam a geração de Monossacarídeos totais para p = 0,05 ... 48 Figura 16 – Correlação entre os valores preditos e observados experimentalmente
para a variável resposta Monossacarídeos totais ... 50 Figura 17 – Superfície de resposta (a) para a geração de Monossacarídeos totais e
Curva de contorno (b) em função da concentração de ácido e biomassa .. 51 Figura 18 – Gráfico de Pareto representando os efeitos estimados que influenciaram
hidrólise de S. filiformis para p = 0,05 ... 55 Figura 19 – Correlação entre os valores preditos e observados experimentalmente
para a variável resposta Fator de conversão de biomassa em Monossacarídeos totais ... 56 Figura 20 – Superfície de resposta (a) para o Fator de conversão de biomassa em
monossacarídeos totais e Curva de contorno (b) em função da concentração de ácido e biomassa ... 58 Figura 21 – Gráfico de Pareto representando os efeitos estimados que influenciam a
geração de Galactose total para p = 0,05 ... 62 Figura 22 – Correlação entre os resultados preditos e observados experimentalmente
para a variável resposta Galactose total ... 64 Figura 23 – Superfície de resposta (a) para a geração de Galactose total e Curva de
contorno (b) em função da concentração de ácido e da quantidade de biomassa ... 64 Figura 24 – Gráfico de Pareto representando os efeitos estimados que influenciam o
Volume recuperado para p = 0,05 ... 68 Figura 25 – Correlação entre os resultados preditos e observados experimentalmente
para a variável resposta Volume recuperado ... 69 Figura 26 – Efeito do tempo de processo sobre a geração de açúcar total, eficiência
de hidrólise e volume recuperado na hidrólise de Solieria filiformis nas condições de 1,8 M de ácido e 7,2 g de biomassa ... 71 Figura 27 – Comportamento de hidrólise substrato-dependente da hidrólise ácida de
Solieria filiformis: estudo da variação na concentração do ácido na geração de a) Monossacarídeos totais e b) Galactose total ... 72 Figura 28 – Comportamento de hidrólise substrato-dependente da hidrólise ácida de
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Composição química das macroalgas ... 27 Tabela 2 – Visão geral de produtos químicos atualmente produzidos, ou com
potencial de produção, a partir da biomassa em conjunto com o tipo e tamanho do mercado ... 30 Tabela 3 – Variáveis independentes, níveis e valores reais utilizados no
planejamento fatorial 23 para a hidrólise ácida de Solieria filiformis ... 43 Tabela 4 – Experimentos em ordem randômica, valores reais e codificados das
variáveis independentes do Delineamento Composto Central Rotacional utilizado para a hidrólise ácida da macroalga S. filiformis ... 43 Tabela 5 – Valores preditos e observados de Monossacarídeos totais obtidos
segundo o planejamento fatorial por DCCR ... 47 Tabela 6 – Análise de variância do modelo para a geração de Monossacarídeos totais 49 Tabela 7 – Valores preditos e observados do Fator de conversão de biomassa em
Monossacarídeos totais obtidos segundo o planejamento fatorial por DCCR ... 54 Tabela 8 – Análise de variância do modelo para o Fator de conversão de biomassa
em Monossacarídeos totais ... 56 Tabela 9 – Comparação da hidrólise ácida de diferentes algas vermelhas ... 59 Tabela 10 – Delineamento Composto Central completo na ordem padrão com valores
codificados e valores preditos e observados da variável resposta Galactose total ... 61 Tabela 11 – Análise de variância para o modelo quadrático de Superfície de Resposta
para a geração de Galactose total ... 63 Tabela 12 – Delineamento Composto Central completo na ordem padrão com valores
codificados e valores preditos e observados da variável resposta Volume recuperado ... 67 Tabela 13 – Análise de variância para o modelo quadrático de Superfície de Resposta
para o volume de hidrolisado recuperado ... 69 Tabela 14 – Comparação das variáveis respostas utilizadas em relação aos modelos
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA Análise de variância
CLAE Cromatrografia líquida de alta eficiência CO2 Dióxido de carbono
DCCR Delineamento Composto Central Rotacional
FAO Organização das nações unidas para alimentação e agricultura H2SO4 Ácido sulfúrico
MSR Metodologia de superfície de resposta X1 Concentração de H2SO4
X2 Quantidade de biomassa
X3 Tempo de processo
Fator de conversão de biomassa em monossacarídeos Y1 Monossacarídeos totais
Y3 Galactose total
Y4 Volume recuperado
LISTA DE SÍMBOLOS
Alfa Beta
Κ Kappa
ɩ Iota
µ m Micrômetro
Min Minutos
ºC graus centígrados
G Grama
gaçúcar/ galga grama de açúcar por grama de alga
M Molar
μM Milimolar
% por cento
L Litro
mL Mililitros g/L gramas por litro g.L-1 gramas por litro
15
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 17
1.1 IMPORTÂNCIA DA BIOMASSA COMO RECURSO RENOVÁVEL ... 17
1.2 MACROALGAS COMO BIOMASSA ... 17
1.2.1 Biologia e Composição Bioquímica das Macroalgas ... 17
1.2.2 Biomassa algácea versus biomassa lignocelulósica ... 23
1.3 CONVERSÃO DE BIOMASSA EM PRODUTO ... 33
1.3.1 Hidrólise ácida ... 35
1.4 METODOLOGIA DE SUPERFÍCIE DE RESPOSTA ... 37
2 OBJETIVOS ... 39
2.1 GERAL ... 39
2.2 ESPECÍFICOS ... 39
3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 40
3.1 COLHEITA DAS MACROALGAS ... 40
3.2 PROCESSAMENTO E PADRONIZAÇÃO DAS MACROALGAS ... 40
3.3 HIDRÓLISE ÁCIDA DA MACROALGA S. filiformis ... 41
3.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ... 42
3.5 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 44
3.6 ANÁLISES CINÉTICAS ... 44
3.7 DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA DOS HIDROLISADOS DE S. filiformis ... 45
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 46
4.1 OTIMIZAÇÃO DA HIDRÓLISE ÁCIDA DE S. filiformis PELA METODOLOGIA DE SUPERFÍCIE DE RESPOSTA (MSR) ... 46
4.1.1 Teor de Monossacarídeos totais ... 46
4.1.2 Fator de conversão de biomassa em Monossacarídeos totais ) ... 53
4.1.3 Teor de Galactose total ... 61
4.1.4 Volume de hidrolisado recuperado ... 66
4.2 ESTUDO DO COMPORTAMENTO DE HIDRÓLISE ... 71
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 75
6 CONCLUSÃO ... 77
APÊNDICE B - EFEITOS E TCAL PARA O FATOR DE CONVERSÃO DE
BIOMASSA EM MONOSSACARÍDEOS TOTAIS. ... 79
APÊNDICE C - EFEITOS E TCAL PARA A GERAÇÃO DE GALACTOSE
TOTAL. ... 80 APÊNDICE D - EFEITOS E TCAL PARA O VOLUME RECUPERADO. ... 81
1 INTRODUÇÃO
1.1 IMPORTÂNCIA DA BIOMASSA COMO RECURSO RENOVÁVEL
Desde a Revolução Industrial (séculos XVII e XVIII) os combustíveis fósseis vêm fomentando o progresso e o estabelecimento do estilo de vida contemporâneo. Isso ocorreu, principalmente, pelo fluxo constante e barato desses combustíveis (FONTECAVE, 2011). No entanto, como a sua utilização é baseada em reações químicas exotérmicas que geram calor e dióxido de carbono (CO2), a concentração
desse gás na atmosfera aumentou de 280 ppm para mais de 380 ppm até 2009. As estimativas são de mais de 30 bilhões de toneladas emitidas por ano. O CO2 se acumula
na atmosfera e nos oceanos e, embora esse acúmulo não influencie significativamente o clima global, recentemente foi percebido seu impacto negativo no planeta pela modificação de ecossistemas. Isso porque algumas espécies são mais sensíveis às concentrações elevadas de CO2 que outras. Além disso, aumentou-se a percepção de que
esses recursos fósseis não são inesgotáveis (FONTECAVE, 2011; HE; SUN; HAN, 2013).
As biomassas, por serem renováveis, estão entre as mais promissoras fontes sustentáveis de energia e carbono orgânico da sociedade industrial.
1.2 MACROALGAS COMO BIOMASSA
1.2.1 Biologia e Composição Bioquímica das Macroalgas
classes baseadas na presença de outros pigmentos além da clorofila: algas pardas (Phaeophyceae), algas verdes (Chlorophyceae) e algas vermelhas (Rhodophyceae) (WEI; QUARTERMAN; JIN, 2013)
Figura 1: Habitat natural de micro e macroalgas
Adaptado de TORTORA, FUNKE, & CASE (2012).
As macroalgas verdes compõem o grupo mais diversificado, com pelo menos 7.000 espécies. Além do ambiente aquático, onde se encontram a maioria das espécies, elas também podem ser encontradas em troncos de árvore, solo ou em associação com outros seres vivos. Pela sua maior necessidade de luz para a fotossíntese, elas vivem principalmente nas águas superficiais, incluindo as piscinas intertidais, que enchem e secam com as marés. Elas também são comuns em baías ou estuários e, na maioria dos casos, sua composição inclui clorofilas a e b, amido armazenado como reserva e paredes celulares rígidas, com celulose e pectina como o principal polissacarídeo estrutural (RAVEN; EVERT; EICHONNORN, 1996; WEI; QUARTERMAN; JIN, 2013).
As macroalgas vermelhas incluem quase 4.000 espécies e são abundantes em águas tropicais quentes, embora também sejam encontradas nas regiões mais frias do planeta. Existem pouco mais de 100 espécies encontradas em ambientes de água doce, entretamto, número de espécies marinhas é consideravelmente maior do que o de algas pardas e verdes juntas. Elas apresentam coloração característica vermelha ou rosa proveniente das ficoeritrinas, pigmentos solúveis em água encontrados dentro dos cloroplastos e que mascaram a cor da clorofila a permitindo a estes organismos estarem bem adaptados a absorver luz nos comprimentos de onda verde e azul-esverdeado, que penetram nas águas mais profundas, até 250 metros (RAVEN; EVERT; EICHONNORN, 1996; WEI; QUARTERMAN; JIN, 2013).
As macroalgas são conhecidas pelos altos teores de macromoléculas e micronutrientes, cuja concentração pode variar de acordo com cada espécie ou grupo (macroalgas verdes, pardas e vermelhas). As proteínas totais nas macroalgas podem variar de 10 a 30% nas algas verdes e vermelhas e de 5 a 15% nas algas pardas. Os teores de lipídeos são em geral baixos, podendo atingir até 5% da sua composição, e os minerais podem chegar a 40% da massa seca em algumas espécies. Elas também possuem vitaminas hidro e liposolúveis, como: vitaminas A (retinol), B1 (tiamina), B2
(riboflavina), B12 (cobalamina) e C (ácido ascórbico) e β-caroteno e tocoferóis. Por fim,
os polissacarídeos totais estão presentes em teores de 4 a 76% do seu peso seco, em diversas moléculas, i. g. celulose, ágar, carragenanas, alginato e fucoidanas, com diferentes composições, estruturas e propriedades físico-químicas (CIAN et al., 2014; ORTIZ et al., 2006; RODRIGUES et al., 2015).
florídeas) e solúveis, galactanas sulfatadas (RAVEN; EVERT; EICHONNORN, 1996; SAKTHIVEL; PANDIMA DEVI, 2015). A parede celular das macroalgas vermelhas inclui em sua maioria, um componente interno rígido formado por microfibrilas de celulose ou outros polissacarídeos e uma matriz mucilaginosa intercelular, geralmente um polímero de galactose sulfatada (ESTEVEZ; CIANCIA; CEREZO, 2008).
Estudos histológicos e imunológicos demonstraram diferenças na distribuição dos componentes rígidos e mucilaginosos na parede celular das macroalgas vermelhas. Em geral, os polissacarídeos mucilaginosos sulfatados estão presentes em teores crescentes na direção das camadas mais externas da superfície da parede celular. Além disso, essa matriz mucilaginosa possui pouca ou nenhuma organização esquelética (de sustentação), entretanto, ela exibe uma organização ultraestrutural decorrente dos polissacarídeos que a compõem. Assim, a matriz mucilaginosa intercelular pode ser considerada uma estrutura conectiva organizada entre as células algáceas (KLOAREG; QUATRANO, 1988).
São estas galactanas sulfatadas que conferem às algas vermelhas a estrutura escorregadia característica, além de flexibilidade, resistência ao estresse mecânico, hidratação e regulação iônica e osmótica no ambiente marinho. Além disso, algumas espécies também depositam carbonato de cálcio em suas paredes celulares (RAVEN; EVERT; EICHONNORN, 1996; WEI; QUARTERMAN; JIN, 2013).
As galactanas, classificadas como ágar e carragenanas, são polissacarídeos que compõem a matriz muscilaginosa das macroalgas e são sintetizadas unicamente pelas algas vermelhas. Na sua maioria, estes polissacarídeos estão dispostos em uma cadeia linear onde há alternância de unidades designadas por A e B (AB)n de acordo com a estrutura repetitiva esquematizada a seguir:
[(⟶3) – (β-D-galactopiranose – (1⟶4) –(α-galactopiranose – (1⟶)]n Unidade A Unidade B
Já as carragenanas são galactanas sulfatadas com unidades alternadas 3⟶β -D-galactose e 4⟶α-D-galactose ou 3,6-anidro-α-D-galactose, que são usualmente sulfatadas em posições específicas. Elas são classificadas em diferentes famílias de acordo com a posição da sulfatação nas unidades A e B, existindo pelo menos 16 diferentes tipos bem definidos, e com alguns deles com grande importância comercial. Neste contexto, os dois tipos de carragenanas industrialmente importantes, aplicados em geral como agentes espessantes são a kappa-carragenana (κ-carragenana), com 3,6- anidrogalactose 1⟶4 galactose 4-sulfato e a iota-carragenana (ɩ-carragenana), com estrutura repetitiva 3,6-anidrogalactose 2-sulfato 1⟶4 galactose-4-sulfato. As
estruturas da κ-carragenana e ɩ-carragenana estão mostradas na Figura 2 (MURANO et al., 1997).
Figura 2: Estruturas químicas representando as unidades repetitivas de a) κ-carragenana e b) ɩ-carragenana.
Autoria própria.
Assim, de acordo com o tipo de galactana, as macroalgas vermelhas são
divididas em “agarófitas”, quando produzem ágar, ou “carragenófitas”, quando produzem carragenanas. As macroalgas vermelhas Kappaphycus alvarezii e Eucheuma denticulatum são espécies carragenófitas que crescem no litoral das Filipinas e que biossintetizam duas carragenanas de importância comercial, κ-carragenana e ɩ -carragenana, respectivamente (VAN DE VELDE et al., 2002).
A macroalga marinha vermelha da espécie Solieria filiformis (Kützing) P.W. Gabrielson (Rhodophyta, Gigartinales, Solieriaceae), mostrada na Figura 3, é biossintetizadora de ɩ-carragenana (MURANO et al., 1997) e abundante no litoral cearense, com grande potencial de cultivo em sistemas de maricultura, sem depreciação do seu teor natural de carboidratos (LIMA, 2012).
Figura 3: Alga marinha vermelha Solieria filiformis (Kützing) P.W. Gabrielson (Rhodophyta, Gigartinales, Solieriaceae).
Filo: Rhodophyta
Classe: Florideophyceae Ordem: Gigartinales
Família: Solieriaceae Gênero: Solieria
Espécie: Solieria filiformis (Kützing) P.W. Gabrielson (Rhodophyta, Gigartinales, Solieriaceae)
Holanda (2007).
polissacarídeos aniônicos (galactoanas sulfatadas, 4a, b, c, d e g), polissacarídeos neutros (celulose, 4e e f e amido, 4h) além da ocorrência de proteínas (4i). Pode-se perceber a organização bem definida da parede celular dessa alga, assim como a presença de galactanas sulfatadas e da celulose na sua estrutura, como relatado na literatura.
Figura 4: Cortes histológicos de Solieria filiformis (Kützing) P.W. Gabrielson (Rhodophyta, Gigartinales, Solieriaceae).
(a e b) Cortes longitudinais com galactanas sulfatadas coradas; (c e d) Cortes transversais com galactanas sulfatadas coradas; (e e f) Cortes transversais com microfibrilas de celulose coradas; (g) Cortes longitudinal com galactanas sulfatadas coradas; (h) Corte transversal com grânulos de amido corados; (i) Corte transversal com proteínas coradas.
Castro (2013).
1.2.2 Biomassa algácea versus biomassa lignocelulósica
abundantes na natureza, como a luz solar, dióxido de carbono e nutrientes inorgânicos (WEI; QUARTERMAN; JIN, 2013).
Por definição, biomassa é todo material orgânico derivado de células ou organismos. A natureza produz uma grande quantidade de biomassa por fotossíntese e 75% dessa produção está na forma de carboidratos. Pelas reações da fotossíntese, esses carboidratos são gerados a partir da água, da luz e do CO2 do ar e constituem as
unidades estruturais e de reserva energética das células vegetais. Ela pode ser considerada como a matéria orgânica na qual a energia solar está armazenada na forma de ligações químicas dos componentes estruturais dos organismos. Quando estas ligações entre átomos de carbono, hidrogênio ou oxigênio são quebradas, seja por digestão, combustão ou decomposição, essa energia química armazenada é liberada. Entretanto, somente 3 a 4% dessa matéria é utilizada pelo homem, seja em atividades de alimentação ou outras (MCKENDRY, 2002; SINGHVI; GOKHALE, 2013).
O rendimento da produção de macroalgas por unidade de área é significativamente superior aos de biomassas terrestres. Além disso, as macroalgas marinhas têm uma maior taxa de fixação de dióxido de carbono em comparação com as biomassas terrestres. Portanto, elas podem ter maior potencial para remediação de dióxido de carbono (WEI; QUARTERMAN; JIN, 2013).
Os cultivos comerciais de macroalgas são compostos exclusivamente por macroalgas marinhas, não sendo produzidas espécies de água doce. Assim, o termo
“cultivo de macroalgas” é sinônimo de “cultivo de algas marinhas” também podendo ser
chamado de “ficocultura” ou “aquicultura” (LUCAS; SOUTHGATE, 2003). As
macroalgas não exigem terras aráveis e podem ser cultivadas numa variedade de ambientes marinhos, incluindo a água fresca salgada, ou provenientes de resíduos municipais (WEI; QUARTERMAN; JIN, 2013).
Dentre os grupos de macroalgas, as macroalgas pardas e vermelhas são mais produzidas e utilizadas do que as macroalgas verdes, principalmente, porque os cinco gêneros [de macroalgas pardas e vermelhas], Laminaria, Undaria, Porfíria, Euchema, e Gracilaria, compreendem 76% do valor total da produção de macroalgas (YUN et al., 2015).
carragenanas, são responsáveis pelo restante do percentual de produção (LUCAS; SOUTHGATE, 2003; WEI; QUARTERMAN; JIN, 2013).
A produção mundial de macroalgas marinhas se apresenta em um aumento constante, com uma produção de 3,8 milhões de toneladas em 1990, 19 milhões de toneladas em 2010 e 23,8 milhões de toneladas em 2012. O cultivo tem deixado em segundo plano a exploração de macroalgas coletadas na natureza, que reduziu sua participação na produção total de macroalgas de 28% em 1980 para somente 4,5% em 2010. Entretanto, essa produção de macroalgas é considerada de pequena escala na maior parte do mundo, sendo restrita à Ásia, que em 2012, foi responsável por 96% da produção global (FAO, 2012; VEERAGURUNATHAN et al., 2015; VILG et al., 2015).
Nas últimas décadas, o valor econômico obtido a partir do cultivo de macroalgas marinhas aumentou significativamente, passando de 200 milhões de dólares em 1990 para 500 milhões de dólares em 2000 e 800 milhões de dólares em 2010. Nesse mercado, a China é o principal exportador e o Japão o principal importador (Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura - FAO, 2012).
As características específicas do cultivo de macroalgas marinhas estão relacionadas à biologia desses seres. As macroalgas não necessitam de estruturas orgânicas de absorção, como raízes, pois os nutrientes em solução podem ser absorvidos por qualquer parte do organismo. A estrutura de apressório é suficiente para ancorar a alga no substrato, e como estas devem estar fixas a um substrato, o uso de substratos flutuantes permite o controle da profundidade do cultivo. Além disso, as macroalgas reproduzem-se sexuadamente através de esporos que são liberados na água e podem aderir a substratos artificiais localizados próximo a elas. Elas geralmente crescem de forma natural sobre rochas e troncos, que podem ser utilizados para cultivo, pois permitem o controle de profundidade e são possíveis locais para adesão de esporos (LUCAS; SOUTHGATE, 2003).
Segundo Lima (2012), a alga S. filiformis foi cultivada em cordas de nylon
dispostas na praia de Flecheiras, município de Trairi, Ceará, através da técnica de
Figura 5: Cultivo no mar da macroalga marinha vermelha Solieria
filiformis.
Adaptado de Lima (2012).
Existe uma vasta literatura relativa à utilização desses organismos como matéria prima para uso posterior e específico. Para tanto, vem sendo realizadas diversas abordagens, como: a extração de ficocolóides e a utilização de resíduos dessa extração (UJU et al., 2015); produção integrada de proteínas para a alimentação (HOU; HANSEN; BJERRE, 2015); produção de pigmentos, minerais, lipídeos e ficocolóides sob o conceito de biorrefinaria (BAGHEL; REDDY; JHA, 2014); além da utilização integral das macroalgas marinhas como fonte de carboidratos simples através da aplicação de um pré-tratamento ácido seguido de hidrólise enzimática (BORINES; DE LEON; CUELLO, 2013; CHOI et al., 2009; RA et al., 2015), somente tratamento ácido (MEINITA; HONG; JEONG, 2012; MEINITA et al., 2013) ou ainda hidrólises ácida e enzimática separadas (HARGREAVES et al., 2013).
As composições de carboidratos das algas pardas é mais complexa do que a das algas vermelhas, como pode ser visto na Tabela 1, umas vez que as algas vermelhas apresentam polissacarídeos à base de galactose (ágar ou galactanas) e glucose (celulose) (YUN et al., 2015).
As galactanas são polissacarídeos considerados não recalcitrantes ou de fácil hidrólise, como afirmam Ra et al. (2015) para o polissacarídeo da macroalga marinha vermelha Gracilaria verrucosa, hidrolisado quimicamente com ácido sulfúrico e utilizado para a produção de bioetanol.
Tabela 1: Composição química das macroalgas.
Macroalgas Verdes Pardas Vermelhas
Carboidratos
Manitol Manitol Galactose (anidro) Xilose Ácido glucurônico Glucose Glucose Ramnose
Galactose Xilose Glucose Arabinose Adaptado de Van Hal, Huijgen, & López-Contreras (2014)
Em resumo, esses dados demonstram a utilização das algas vermelhas como sendo vantajosa sobre os outros grupos de macroalgas em relação à sua aplicação em processos de hidrólise em virtude dos rendimentos a serem obtidos, mas também à maior simplicidade do hidrolisado gerado. Essa maior simplicidade está relacionada à ocorrência principal de somente dois monossacarídeos, a glucose decorrente da hidrolise da celulose e a galactose decorrente da hidrólise da galactana (Figura 6). Nesta figura, os carbonos estão enumerados para facilitar a visualização da diferença estrutural entre as duas moléculas no carbono 4.
Figura 6: Estrutura química dos monossacarídeos glucose e galactose, com os carbonos enumerados em vermelho.
Assim, esses hidrolisados poderiam ser mais facilmente aplicados em processos enzimáticos, fermentativos e de conversão química, visto que a maior simplicidade do meio não causaria redução da afinidade de enzimas, repressão catabólica de microorganismos ou contaminações/ impurezas em processos de conversão química.
O grupo de pesquisa composto pelo Laboratório de Aplicação Biotecnológica de Algas e Plantas e pelo Laboratório de Carboidratos e Lectinas (Carbolec) localizados na Universidade Federal do Ceará, Campus do Pici, trabalhando com o hidrolisado ácido de S. filiiformis com concentração de monossacarídeos totais de 20 g.L-1 conseguiram conduzir bioprocessos com a levedura Saccha romyces cerevisiae, Bacillus sp. e Lactobacilllus sp. Isso demonstra a potencialidade deste organismo na aplicação como matéria prima a ser utilizada na geração de hidrolisados ácidos para a condução de processos fermentativos, embora não tenham sido investigados processos enzimáticos.
A biomassa terrestre rica em carboidratos, ou lignocelulósica, é o recurso renovável mais abundante do planeta e é, atualmente, vista como matéria prima para a química verde no futuro. Ela possui uma estrutura complexa formada, geralmente, por celulose (40-50%), hemicelulose (25-35%) e lignina (15-35%), além de outros compostos como extrativos e diversos materiais inorgânicos. A lignina é um polímero aromático com ligações cruzadas com uma estrutura tridimensional que protege e recobre a celulose, dificultando a sua degradação. A hemicelulose é um polímero ramificado e amorfo, o que a faz menos resistente que a celulose; ela é composta por unidades de pentose e hexose dispostas de forma randômica. Já a celulose é um polímero linear, constituído por unidades de β-D-glucose, que pode formar fibrilas pela existência de pontes de hidrogênio intercadeia gerando uma estrutura conhecida como recalcitrante, devido a sua dificuldade de degradação (TRAVAINI et al., 2015).
A produção de combustíveis e de produtos químicos a partir da biomassa, tanto lignocelulósica quanto algácea, é benéfica em relação ao meio ambiente por estar associada à redução líquida das emissões de CO2 para a atmosfera. Em contraste aos
combustíveis fósseis, ela é considerada como “carbono neutro”, pois a quantidade de CO2 produzido durante a sua combustão ou uso é consumido por um novo crescimento
da biomassa a ser utilizada posteriormente (SINGHVI; GOKHALE, 2013).
Entretanto, é possível que uma crescente demanda industrial de biomassa possa causar sua escassez. Os estudos econômicos de viabilidade de processos baseados em biomassa geralmente utilizam o preço dessa matéria prima como zero ou mesmo negativo e são irreais se comparados com os atuais processos petroquímicos. Em um planejamento à longo prazo, não haverá biomassas residuais, mas somente recursos de biomassa. Isso porque com o seu uso em larga escala, o que é considerado biomassa residual poderá se tornar matéria prima valorizada, já que as quantidades disponíveis não conseguirão saturar o mercado (VENNESTRØM et al., 2011).
Além disso, as biomassas têm um teor duas vezes menor de carbono e em alguns casos, uma matéria prima mais adequada do que os recursos fósseis, como na produção de químicos que necessitam de reações de oxigenação, não requerida no uso de biomassas. As reações de oxigenação de hidrocarbonetos, derivados de recursos fósseis, acarretam a perda de produtos por superoxigenação. Compostos químicos ricos em oxigênio, como o etilenoglicol, ácido acético, etanol e butanol são exemplos de produtos que podem ser obtidos de maneira mais eficiente a partir de biomassa do que de recursos fósseis. Uma lista mais elaborada de produtos químicos obtidos a partir de biomassas pode ser vista na Tabela 2. Entretanto, deve-se salientar que compostos como etanol e butanol são atualmente considerados combustíveis renováveis com potencial para substituir, pelo menos parcialmente, o uso de combustíveis fósseis (VENNESTRØM et al., 2011).
Tabela 2: Visão geral de produtos químicos atualmente produzidos, ou com potencial de produção, a partir da biomassa em conjunto com o tipo e tamanho do mercado.
Produtos químicos Tipo de mercado
Tamanho do mercado[a] (Mt. ano-1)
Matéria prima
Ácido acético Existente 9,0 Etanol
Ácido acrílico Existente 4,2 Glicerol/ Glucose
Diácidos C4 Emergente (0,1-0,5) Glucose
Epicloroidrina Existente 1,0 Glicerol
Etanol Existente 60,0 Glucose
Etileno Existente 110,0 Etanol
Etilenoglicol Existente 20,0 Glucose ou Xilitol
Glicerol Existente 1,5 Óleo vegetal
5-hidroximetilfurfural Emergente - Glucose/frutose
Ácido 3-hidroxipropiônico Emergente (≥0,5) Glucose
Isopreno Existente/ emergente 0,1 (0,1-0,5) Glucose Ácido lático Existente/ emergente 0,3 (0,3-0,5) Glucose
Ácido levulínico Emergente (≥0,5) Glucose
Óleo químicos Existente 10,0-15,0 Óleo vegetal/ Gordura
1,3-propanodiol Emergente (0,1-0,5) Glucose
Propileno Existente/ emergente 80,0 Glucose
Propilenoglicol Emergente 1,4 (≥2,0) Glicerol ou Sorbitol Polihidroxialcanoato Emergente (0,1-0,5) Glucose
[a]
O tamanho de mercado de mercados existentes é dado como o tamanho do mercado atual, incluindo a produção a partir de recursos fósseis; para mercados emergentes, o tamanho esperado do mercado é dado em parênteses.
Adaptado de Vennestrøm et al. (2011).
Figura 7: Princípios condensados da química verde.
Adaptado de He et al. (2013).
Figura 8: Abordagem de biorrefinaria para a utilização de biomassa lignocelulósica.
Elementos em verde representam matéria prima, em cinza representam intermediários e em azul representam produtos finais.
Adaptado de He et al. (2013).
Da mesma forma que as biomassas terrestres, a biomassa algácea também pode ser utilizada para produzir combustíveis e produtos químicos, como mostrado na Figura 9.
Figura 9: Abordagem de biorrefinaria para a utilização de biomassa algácea.
Elementos em vermelho representam matéria prima, em cinza representam intermediários e em azul representam produtos finais.
Comparativamente, pela análise das Figuras 8 e 9, pode-se perceber a maior gama de produtos finais que podem ser gerados pela utilização de biomassa algácea como matéria prima. Além disso, os processos utilizados na conversão da biomassa algácea são mais simples e com maior adequação aos princípios da química verde (como a utilização de temperaturas e pressões ambientes) que os utilizados na conversão da biomassa lignocelulósica.
Porém, como pode ser visto nas Figuras 8 e 9, a conversão de biomassa lignocelulósica ou algácea em combustíveis ou produtos químicos exige um tratamento prévio a fim de viabilizar essa utilização.
1.3 CONVERSÃO DE BIOMASSA EM PRODUTO
A conversão de qualquer biomassa em produto necessita de etapas químicas ou físicas para modificar a estrutura biológica em moléculas mais simples, acessíveis a enzimas e microrganismos (SINGH et al., 2013). Para tanto, são necessários tratamentos severos que exigem condições drásticas de hidrólise, como altas concentrações de ácidos e temperaturas que não só aumentam os custos de produção, mas geram altas taxas de compostos tóxicos oriundos da degradação de açúcares, e. g. furfural, 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) e ácidos orgânicos. Isso se deve, principalmente, à presença de lignina na biomassa lignocelulósica, (PARK et al., 2012, 2014).
Dessa forma, sua aplicação como biomassa visa a geração de meios ricos em monossacarídeos, sobretudo utilizando a hidrólise ácida. A ausência de lignina na estrutura celular das macroalgas facilita a despolimerização dos polissacarídeos e a geração de monossacarídeos, em comparação com a biomassa lignocelulósica (WEI; QUARTERMAN; JIN, 2013).
Em suma, as tecnologias de tratamento de biomassa têm como objetivo a liberação de sacarídeos aprisionados na matriz recalcitrante de materiais lignocelulósicos e, também, atingir taxas de conversão eficientes de hexoses e pentoses para produzir moléculas alvo com altos rendimentos e produtividades. Entretanto, em alguns casos, isso ainda se apresenta como um obstáculo significativo que precisa ser superado (WEI; QUARTERMAN; JIN, 2013).
elevada capacidade de formação de monossacarídeos ou de formá-los posteriormente por hidrólises adicionais, evitar a degradação ou perda de carboidratos, evitar a formação de subprodutos que são inibitórios para posteriores hidrólises ou utilizações e a rentabilidade econômica (KUMAR et al., 2009). Além desses parâmetros, podem ser adicionados outros, como: baixos custos operacionais e de capital, eficácia de hidrólise sobre uma vasta gama de materiais e cargas, possibilidade de recuperação da maioria dos componentes lignocelulósicos numa forma utilizável, minimizada necessidade de preparação e manipulação ou ações de pré-condicionamento, e. g. redução de tamanho. Todas essas características são consideradas já que os resultados de tratamento resultam em um balanço trade-off (fatores contrários) entre o impacto de seus custos sobre o processamento downstream (recuperação) e com os custos operacional, de capital e de biomassa (AGBOR et al., 2011).
Em uma abordagem econômica um pouco mais avançada, são necessárias análises rigorosas para determinar o melhor tratamento sobre uma matéria prima específica. As análises econômicas identificam fatores com grande impacto sobre a economia global do processo. A adição de etapas de processo e a utilização de insumos de alto custo em unidades produtivas têm grande importância nessa análise, como por exemplo, a digestão enzimática em pré-tratados sólidos. A análise econômica também possibilita estimar o custo absoluto de produção de um produto e nesse sentido, modelos econômicos consideram balanços de massa e energia baseados em dados de propriedades termodinâmicas e físico-químicas para cada tecnologia de tratamento utilizada/estudada (MOSIER et al., 2005).
hidrólise, ou a utilização direta de enzimas com a mesma finalidade (AGBOR et al., 2011; SHIRKAVAND et al., 2016).
Além das possibilidades elencadas anteriormente, também podem ser realizadas a combinação entre dois ou mais métodos de tratamento, como a moagem seguida de tratamento com ácido, pré-tratamento com ácido seguido da utilização de enzimas, crescimento fúngico seguido de tratamento ácido ou tratamento básico seguido de crescimento fúngico, dentre outras combinações possíveis (AGBOR et al., 2011; SHIRKAVAND et al., 2016). Certamente, a necessidade de acréscimo de cada tratamento adicional acarretará na elevação final dos custos do processo desenvolvido ou utilizado.
A hidrólise química é favorável pelo seu baixo custo, embora seja muito complexa, sobretudo porque o substrato da reação se encontra na fase sólida, enquanto o catalisador se encontra na fase líquida. Existem diversos parâmetros que afetam a produtividade de açúcares na hidrólise ácida, tais como: tipo de ácido usado como catalisador, proporção de substrato, concentração de ácido e tempo e temperatura de reação (MEINITA; HONG; JEONG, 2012).
1.3.1 Hidrólise ácida
Esse processo envolve o tratamento da biomassa com diferentes tipos de ácidos (e. g. sulfúrico, oxálico, peracético, hidroclorídrico, nítrico, fosfórico), em altos ou baixos teores e sob elevadas ou baixas temperaturas (CHATURVEDI; VERMA, 2013).
Nos processos de hidrólise para a conversão de material lignocelulósico em diversos produtos, a matéria prima é primeiramente separada em carboidratos e lignina. Esses carboidratos são utilizados como material de partida para a produção de combustíveis e químicos por vias biológicas ou químicas. As principais vantagens dos métodos de hidrólise sob a ótica da química verde é a sua condução em condições mais amenas e a possibilidade de um melhor controle da seletividade de conversão. (HE; SUN; HAN, 2013).
(m/v). Assim, as hidrólises com ácidos diluídos têm sido preferidas devido ao menor consumo de ácido (KUMAR et al., 2015).
A principal vantagem da hidrólise com ácidos diluídos é que a recuperação de ácido não é necessária e não apresenta perdas significativas de ácido. Entretanto, nesse tipo de processo a reação deve ser conduzida sob altas temperaturas (em torno de 160 °C) e pressões (em torno de 10 atm) e resulta em baixa produção de glucose a partir de celulose na etapa de hidrólise. Dentre outras opções, o tratamento com ácidos diluídos é considerado um método barato, efetivo e de fácil disponibilidade (CHATURVEDI; VERMA, 2013; IRANMAHBOOB; NADIM; MONEMI, 2002).
Em relação ao processo de hidrólise com ácidos concentrados, apesar de utilizar menores temperaturas e requerer poucas operações unitárias e resultar no rendimento de glucose próximo à 100% a partir de celulose, exige maiores tempos de retenção, necessidade de diversos maquinários industriais e um processo de recuperação de ácido (IRANMAHBOOB; NADIM; MONEMI, 2002).
A hidrólise ácida também pode ser conduzida em um ou dois estágios. Quando é escolhido um processo com duas etapas de hidrólise, a biomassa é tratada primeiramente com ácido diluído e posteriormente com ácido concentrado. No primeiro estágio, o ácido diluído hidrolisa principalmente a hemicelulose, solubilizada em condições mais brandas quando comparada à celulose. A celulose residual é, então, hidrolisada com ácido concentrado no segundo estágio. No processo de dois estágios o tempo de hidrólise é aumentado em relação ao de um único estágio com ácido diluído, sendo a hidrólise de estágio único mais reportada na literatura (KUMAR et al., 2015)
O principal papel do ácido é alterar a matriz estrutural de polissacarídeos componentes das biomassas para obter oligômeros ou carboidratos simples. Assim, o ácido, no tratamento diluído, libera oligossacarídeos ou monossacarídeos por afetar a integridade dos polissacarídeos da biomassa. Entretanto, a depender da severidade combinada do tratamento, os carboidratos podem ser convertidos em aldeídos e até mesmo furfural ou 5-hidroximetilfurfural. Os tratamentos ácidos estão ganhando posição como processos de sacarificação viáveis e, nesse contexto, achar as melhores condições de produção de meios ricos em carboidratos fermentescíveis é necessário, mas sem a geração de compostos de degradação ou tóxicos (AGBOR et al., 2011; MATEO et al., 2014).
tanto algáceos (HARGREAVES et al., 2013; HII et al., 2014; LEE et al., 2016) quanto lignocelulósicos (CANETTIERI et al., 2007; COTANA et al., 2015; KORADIYA et al., 2015) para a geração da maior concentração possível de monossacarídeos.
1.4 METODOLOGIA DE SUPERFÍCIE DE RESPOSTA
A Metodologia de Superfície de Resposta (MSR) é uma ferramenta estatística baseada na construção de modelos matemáticos empíricos e é capaz de mapear uma superfície de resposta baseado nestes modelos, dentro de uma região de interesse. Ela tem o objetivo de descrever o sistema estudado e, geralmente, emprega funções polinomiais que podem ser lineares ou quadráticas. Estes modelos permitem modelar e controlar o sistema até sua otimização, isto é, encontrar os valores das variáveis que irão produzir a melhor resposta desejada (TEÓFILO, 2006). Assim, a MSR é uma ferramenta estatística capaz de construir modelos e avaliar os efeitos de diversos fatores na busca das melhores condições para as respostas desejadas (WANG et al., 2007).
A MSR pode ser usada com base em diferentes dados, que podem ser adquiridos a partir de diferentes modelos de delineamento de experimentos, como: Box-Behnken (BB), Fatorial, “d-optimal” e Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) (GHAZANFARI; KASHEFI; JAAFARI, 2016).
De acordo com Haaland (1989), podem ser adotados três caminhos para a resolução de um problema experimental, exemplificadas na Figura 10 (RODRIGUES e IEMMA, 2014):
1. O “one-at-a-time” ou “um fator por vez” (Figura 10a) é o procedimento experimental mais difundido e utiliza uma variação independente de parâmetros ou variáveis. Nela, um parâmetro é estudado em diferentes condições e os demais são fixados. Essa metodologia, embora mais utilizada, é bastante ineficiente, pois não considera interação entre os parâmetros avaliados e não explora completamente a região de interesse.
3. O DCCR (Figura 10c) investiga a resolução de um problema experimental com um menor número de medidas e explorando toda a região de interesse. Pelo exemplo mostrado, no qual são estudados três parâmetros, apenas 17 experimentos precisam ser realizados para o estudo, sendo possível calcular, ainda, o erro experimental.
Figura 10: Possíveis caminhos adotados para a resolução de problemas experimentais
no estudo de 3 parâmetros a) “One-at-a-time”, b) Matriz completa e c) Delineamento Composto Central Rotacional.
Autoria própria.
O DCCR foi apresentado por Box e Wilson em 1951, e combina um delineamento completo ou fracionado em dois níveis (2k), com pontos axiais adicionais e pelo menos um ponto no centro da região experimental. O número total de experimentos nesta metodologia deve considerar a combinação fatorial dos parâmetros (2k) e dos pontos axiais (2k) e centrais (C0) adicionados, onde k é o número de fatores e C0 é o número de
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Avaliar o processo de hidrólise ácida da macroalga vermelha Solieria filiformis utilizando metodologias estatísticas de Delineamento Composto Central Rotacional e Metodologia de Superfície de Reposta a fim de obter condições otimizadas para a geração de teores elevados dos monossacarídeos glucose e galactose.
2.2 ESPECÍFICOS
Utilizar a técnica de Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) com três variáveis independentes, três repetições no ponto central e seis pontos axiais para avaliar a hidrólise ácida da alga marinha S. filiformis, variando as concentrações de ácido, de biomassa e tempo de reação.
Determinar qual desses parâmetros exerce maior influência sobre o teor de monossacarídeos totais, fator de conversão de biomassa em monossacarídeos totais, teor de galactose e volume recuperado de hidrolisado ácido de S. filiformis.
Determinar as condições ideais do processo de hidrólise da alga S. filiformis aplicando a MSR e o ajuste dos modelos por análise de variância (ANOVA); Construir gráficos da cinética do processo de hidrólise para compreender a3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 COLHEITA DAS MACROALGAS
As algas marinhas da espécie S. filiformis (Kützing) P.W. Gabrielson (Rhodophyta, Gigartinales, Solieriaceae), foram colhidas em cordas de cultivo localizadas a aproximadamente 300 metros da costa, como mostrado na Figura 11, na praia de Flecheiras (03°13’06”S –39°16’47” W), município de Trairi, Ceará, mantidas pela Associação de Produtores de Algas de Flecheiras e Guajiru (APAFG) em parceria com o Laboratório de Lectinas e Carboidratos (CARBOLEC) e o Laboratório de Aplicação Biotecnológica de Algas e Plantas (BioAP), ambos localizados no Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular (DBBM), da Universidade Federal do Ceará (UFC).
Figura 11: Fotografia de satélite mostrando a área de cultivo em mar aberto da macroalga vermelha S. filiformis em Fleicheiras, Trairi, Ceará.
c
Google Maps.
3.2 PROCESSAMENTO E PADRONIZAÇÃO DAS MACROALGAS
As macroalgas colhidas foram transportadas ao BioAP e após sucessivas lavagens com água corrente seguida de água destilada, retiradas as epífitas e secas a 25 °C foram trituradas em moinho elétrico e padronizadas quanto ao tamanho das partículas no intervalo entre 0,8 e 0,2 mm (20 a 80 mesh).
3.3 HIDRÓLISE ÁCIDA DA MACROALGA S. filiformis
As hidrólises foram conduzidas em tubos de vidro cilíndricos autoclaváveis de 7,0 cm de altura X 2,5 cm de diâmetro (Figura 12), com ácido sulfúrico (H2SO4) como
ácido escolhido para a realização das hidrólises. Os valores de concentração do ácido e biomassa e tempo de reação utilizados em cada hidrólise foram determinados mediante metodologia presente na secção 2.5 deste trabalho. Cada hidrólise, com sistema composto por 10 mL de solução ácida e biomassa algácea, foi conduzida separadamente à temperatura de 120 °C em autoclave.
Figura 12: Tubo autoclavável utilizado para a realização das hidrólises ácidas de S. filiformis.
Autoria própria.
Após o processo de hidrólise, cada sistema (n = 17) foi filtrado utilizando tecido nylon, para separação do resíduo da hidrólise (posteriormente descartado) do volume recuperado. Após a filtração, o volume recuperado foi medido em proveta e o resultado expresso em porcentagem seguindo a Equação 1:
(1)
onde o percentual de volume recuperado, é o volume recuperado após filtração, é o volume inicial de hidrólise.
(2)
onde é a concentração de monossacarídeos totais obtido (g.L-1) e é a concentração inicial de biomassa utilizada (g.L-1).
3.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
O Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR)foi utilizado para analisar a influência dos fatores (variáveis independentes) sobre a hidrólise da alga S. filiformis: concentração do ácido sulfúrico (X1, M), concentração de biomassa (X2, g.L-1) e tempo
de reação (X3, min). Como variáveis resposta foram analisadas a concentração de
Monossacarídeos totais (Y1, g.L-1), o Fator de conversão de biomassa em
monossacarídeos ( , g.L-1), a concentração de Galactose total (Y3, g.L-1), e o
volume de hidrolisado recuperado (Y4, %). Para isso, foi utilizado um planejamento
fatorial 23, estudado em 5 níveis (-α, -1, 0, 1, e + α), com 8 pontos fatoriais, 6 pontos axiais e 3 pontos centrais, que resultou em 17 experimentos. A Figura 13 ilustra o planejamento fatorial com cinco níveis, onde formam o modelo linear (L), composto pelos níveis –1, +1 e 0 e o modelo quadrático (Q), composto pelos os níveis –1,68, –1, 0, +1 e +1,68, resultando em uma distribuição ortogonal.
Os valores codificados e reais para as vaiáveis analisadas estão apresentadas na Tabela 3.
Tabela 3: Variáveis independentes, níveis e valores reais utilizados no planejamento fatorial 23 para a hidrólise ácida de Solieria filiformis.
Variáveis independentes Unidade Variáveis codificadas
Níveis codificados e reais
-α -1 0 +1 + α
Concentração de H2SO4 (M) X1 0,12 0,60 1,30 2,00 2,48
Concentração de
biomassa (g.L
-1
) X2 64 200 400 600 736
Tempo de processo (min) X3 3,18 10,00 20,00 30,00 36,82
A Tabela 4 mostra o planejamento com as variáveis independentes apresentadas nas formas real e codificada e os experimentos executados em ordem randômica, a fim de minimizar o efeito de fatores externos.
Tabela 4: Experimentos em ordem randômica, valores reais e codificados das variáveis independentes do Delineamento Composto Central Rotacional utilizado para a hidrólise ácida da macroalga S. filiformis.
Experimento
Variáveis Independentes
Valores reais Valores Codificados Concentração
de H2SO4
(M)
Concentração de Biomassa
(g.L-1)
Tempo de reação
(min)
X1 X2 X3
5 2,00 200 10,00 1,00 -1,00 -1,00
11 1,30 064 20,00 0,00 -1,68 0,00
8 2,00 600 30,00 1,00 1,00 1,00
1 0,60 200 10,00 -1,00 -1,00 -1,00
10 2,48 400 20,00 1,68 0,00 0,00
3 0,60 600 10,00 -1,00 1,00 -1,00
15 1,30 400 20,00 0,00 0,00 0,00
2 0,60 200 30,00 -1,00 -1,00 1,00
16 1,30 400 20,00 0,00 0,00 0,00
7 2,00 600 10,00 1,00 1,00 -1,00
14 1,30 400 36,82 0,00 0,00 1,68
12 1,30 736 20,00 0,00 1,68 0,00
17 1,30 400 20,00 0,00 0,00 0,00
9 0,12 400 20,00 -1,68 0,00 0,00
4 0,60 600 30,00 -1,00 1,00 1,00
6 2,00 200 20,00 1,00 -1,00 1,00
Os resultados foram avaliados através da aplicação de Metodologia de Superfície de Resposta (MSR) e Análise de Resíduos. A relação matemática entre variáveis independentes e as variáveis resposta foi estimada pela equação polinomial quadrática (Equação 5) a seguir: :
(5)
onde Yi é a resposta predita, β0 é o coeficiente constante, XiXj são os as variáveis
independentes que influenciam as variáveis resposta Y; βi é o coeficiente linear relativo
à i, βiié o coeficiente quadrático relativo à i e βij é o coeficiente de interação relativo à
ij, k é o número de fatores.
3.5 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Para o planejamento fatorial, as análises estatísticas dos dados e a obtenção dos modelos que descreveram os efeitos e as regiões estudadas por MSR utilizando erro residual, com o auxílio do software Statistica 10.0 (StatSoft, Inc.). Neste trabalho, as avaliações de significância para a decisão estatística, tanto para os efeitos como para os coeficientes dos modelos, foram realizadas empregando o teste t (distribuição de Student). A qualidade do ajuste dos modelos gerados foi avaliada pela análise de variância (ANOVA) e a significância estatística de cada equação de modelo polinomial obtido foi avaliada por meio do coeficiente de determinação R2 e validada pelo teste F (distribuição de Fisher).
3.6 ANÁLISES CINÉTICAS
função do aumento de um parâmetro, com os outros dois fixos com a estrapolação da área experimental do delineamento. Para quantificar a influência dos parâmetros de concentração de ácido e tempo de reação nas respostas estudadas, a razão entre o pico de concentração e a concentração na menor condição de concentração de H2SO4 foi
calculada.
3.7 DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA DOS HIDROLISADOS DE S. filiformis
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 OTIMIZAÇÃO DA HIDRÓLISE ÁCIDA DE S. filiformis PELA METODOLOGIA DE SUPERFÍCIE DE RESPOSTA (MSR)
4.1.1 Teor de Monossacarídeos totais
A Figura 14 mostra a comparação entre a solução ácida na qual foi realizada a hidrólise e o hidrolisado ácido após filtração dos resíduos da biomassa de S. filiformis.
Figura 14: Comparação visual entre a) solução ácida e b) meio hidrolisado de Solieria filiformis.
Autoria própria.
A análise por CLAE indicou a presença dos monossacarídeos galactose e glucose nos hidrolisados ácidos de S. filiformes, sendo a galactose o monossacarídeo mais abundante.
A Tabela 5 mostra os valores preditos e observados experimentalmente com relação à variável resposta Monossacarídeos totais. Pode-se observar que os resultados obtidos estão, em geral, próximos dos preditos, com exceção dos experimentos 2 (combinação dos níveis -1 de concentração de ácido e quantidade de biomassa), 9 (nível
–α da concentração de ácido) e 11 (nível –α da quantidade de biomassa).
Tabela 5: Valores preditos e observados de Monossacarídeos totais obtidos segundo o planejamento fatorial por DCCR.
Experimento
Variáveis independentes reais (e codificadas)
Teores de Monossacarídeos
totais (g.L-1) Concentração
de Ácido (M; X1)
Concentração de Biomassa
(g.L-1; X2)
Tempo de reação (min; X3)
Predito Observado 1 0,60 (-1,00) 200 (-1,00) 10,00 (-1,00) 74,74 85,03 2 0,60 (-1,00) 200 (-1,00) 30,00 (1,00) 49,09 76,08 3 0,60 (-1,00) 600 (1,00) 10,00 (-1,00) 91,58 100,21 4 0,60 (-1,00) 600 (1,00) 30,00 (1,00) 112,64 123,61 5 2,00 (1,00) 200 (-1,00) 10,00 (-1,00) 63,63 61,14 6 2,00 (1,00) 200 (-1,00) 30,00 (1,00) 60,30 60,14 7 2,00 (1,00) 600 (1,00) 10,00 (-1,00) 119,86 101,34 8 2,00 (1,00) 600 (1,00) 30,00 (1,00) 163,24 161,43 9 0,12 (-1,68) 400 (0,00) 20,00 (0,00) 54,83 25,46 10 2,48 (1,68) 400 (0,00) 20,00 (0,00) 88,11 106,15 11 1,30 (0,00) 64 (-1,68) 20,00 (0,00) 40,34 23,67 12 1,30 (0,00) 736 (1,68) 20,00 (0,00) 147,70 145,42 13 1,30 (0,00) 400 (0,00) 3,18 (-1,68) 114,52 119,85 14 1,30 (0,00) 400 (0,00) 36,82 (1,68) 129,43 112,11 15 1,30 (0,00) 400 (0,00) 20,00 (0,00) 142,38 145,84 16 1,30 (0,00) 400 (0,00) 20,00 (0,00) 142,38 146,49 17 1,30 (0,00) 400 (0,00) 20,00 (0,00) 142,38 136,87
A análise de regressão foi realizada, na qual os efeitos e coeficientes de regressão das variáveis independentes e suas interações foram obtidos e avaliados pelo teste “t de
Student” e os valores de “p” menores que 0,05, ao nível de significância de 95%, foram estatisticamente significativos. Todos os efeitos, coeficientes de regressão e valores de p podem ser vistos no Apêndice A.
O teste “t de Student” indicou os efeitos da concentração de biomassa no modo
linear (X2) e das concentrações de ácido (X12) e biomassa no modo quadrático (X22),
nesta ordem, como significativos para a geração de Monossacarídeos totais pelo processo de hidrólise da macroalga S. filiformis. O Gráfico de Pareto (Figura 15) mostra a representação gráfica do teste “t de Student”, como os valores de tcalculados para todas as
variáveis independentes e interações e as variáveis independentes significativas ultrapassam a linha vermelha, que indica p = 0,05.
Figura 15: Gráfico de Pareto representando os efeitos estimados que influenciam a geração de Monossacarídeos totais para p = 0,05.
As variáveis independentes que apresentaram valores positivos indicam que o aumento de seus níveis proporciona um maior teor de Monossacarídeos totais, e os valores negativos de forma inversa. Dessa forma, no modelo linear, o fator que mais afetou, de forma positiva, a geração de Monossacarídeos totais foi a concentração de
0,7304874 0,7583229
-1,11971 1,289284
1,529239 1,688915
-2,84768
-3,87749
5,122301
p = 0,05 1L*3L
(3) Tempo (L) Tempo (Q) 1L*2L 2L*3L (1) Ácido (L) Biomassa (Q) Ácido (Q) (2) Biomassa (L)
0,7304874 0,7583229
-1,11971 1,289284
