UNI V E R S I D A D E F E D E R A L D O C E A R Á F A C UL D A DE D E M E D I C I NA
D E PA R T A M E NT O D E PA T O L O G I A E M E D I C I NA L E G A L PR O G R A M A D E PÓS -G R A D UA Ç Ã O E M M I C R O B I O L O G I A M É D I C A
J A NI C E O L I V E I R A S I L V A
S E NS I B I L I D A DE A A NT I M I C R O B I A NO S D E B A C T E R O I D A L E S D E M I C R O B I O T A I NT E S T I NA L D E C Ã E S E O E F E I T O D E C O NC E NT R A Ç Õ E S S UB I NI B I T ÓR I A S D E A NT I M I C R O B I A NO S NA F O R M A Ç Ã O D E B I O F I L M E in
vitro
J A NI C E O L I V E I R A S I L V A
S E NS I B I L I D A DE A A NT I M I C R O B I A NO S D E B A C T E R O I D A L E S D E M I C R O B I O T A I NT E S T I NA L D E C Ã E S E O E F E I T O D E C O NC E NT R A Ç Õ E S S UB I NI B I T ÓR I A S D E A NT I M I C R O B I A NO S NA F O R M A Ç Ã O D E B I O F I L M E in
vitro
D issertaçã o apresentada ao Programa Pó s-Graduaçã o em Microbiologia Médica da F aculdade de Medicina da Universidade F ederal do C eará, como requisito parcial para obtençã o do titulo de Mestreem Microbiologia Médica.
Orientador: Prof. a
D r. a
C ibele B arreto Mano de C arvalho
D ados Internacionais de C atalogaçã o na Publicaçã o Universidade F ederal do C eará
B iblioteca de C iê ncias da S aúde S D8s S ilva, J anice Oliveira.
S ensibilidade a antimicrobianos de B acteroidales de microbiota intestinal de cã es e o efeito de concentrações subinibitórias de antimicrobianos na formaçã o de biofilme in vitro. / J anice Oliveira S ilva. – 2012.
71f.: il. color., enc.; 30 cm.
D issertaçã o (mestrado) – Universidade F ederal do C eará, F aculdade de Medicina, D epartamento de Patologia e Medicina L egal, Programa de Pó s-Graduaçã o em Microbiologia Médica, Mestrado em Microbiologia Médica, F ortaleza, 2012.
Á rea de C oncentraçã o: C iê ncias B iológicas.
Orientaçã o: Profa. D ra. C ibele B arreto Mano de C arvalho.
A G R A D E C I M E NT O
E ste trabalho nã o é resultado apenas de um esforço individual. E le nasce de significativas contribuições que recolhi durante minha trajetória profissional, acadê mica e como cidadã , ao lidar com pessoas e instituições que foram fundamentais a essa construçã o. A gradeço a Universidade F ederal do C eará e Universidade E stadual do C eará pela estrutura na qual pude desenvolver esse trabalho.
A gradeço profundamente à D ireçã o e meus professores do Programa de Pós-Graduaçã o em Microbiologia da Universidade F ederal do C eará pelos ensinamentos, empenho e dedicaçã o.
Meu agradecimento e minha homenagem carinhosa a C ibele B arreto Mano de C arvalho. Mais que minha professora e orientadora no Mestrado, agradeço por sua cumplicidade e responsabilidade direta na construçã o desta dissertaçã o.
A os funcionários da Universidade F ederal do C eará, especialmente ao J osé Olavo Moraes pela agilidade no apoio técnico e pelas palavras de carinho.
A secretária do Programa de Pós Graduaçã o em Microbiologia Médica, C arolinda V ilma S oares de Oliveira pela paciê ncia, atendimento e esclarecimentos prestados.
A C línica V eterinária da Universidade E stadual do C eará, ao D r. R eginaldo Pereira e a D ra. É rica C arvalho, pois sem eles este trabalho nã o teria acontecido.
A o Prof. R einaldo B arreto Oriá, seu aluno T iê B ezerra C osta e R osemary S ouza F reire pela ajuda no manuseio do microscópio confocal.
A banca formada por Prof. A driana Queiroz Pinheiro, Prof R ossana A guiar e Prof. Maria F átima da S ilva T eixeira pelas correções deste trabalho.
A os meus irmã os e principalmente a minha irmã J amile Oliveira S ilva pela força diária que tem me dado, que foi essencial para a minha trajetória.
C arlos E duardo T eixeira, C ecília C osta L eite, Nayara S antos de Oliveira, T hially B raga Gonçalves e R amila B rito Macedo, agradeço e homenageio a todos.
A F UNC A P pelo apoio financeiro.
R E S UM O
Os gê neros Bacteroides e Parabacteroides estã o envolvidos em doenças graves como abscessos e bacteremia em humanos e animais. E stas bactérias sã o caracterizadas pela resistê ncia antimicrobiana e B. fragilis é a principal bactéria anaeróbica isolada do intestino que pode formar biofilme. O objetivo deste trabalho foi isolar Bacteroides e Parabacteroides do trato intestinal de cã es, para avaliar a sensibilidade antimicrobiana e a açã o de concentrações subinibitórias de antimicrobianos sobre a formaçã o de biofilme. Um total de 30 amostras foram avaliadas neste estudo. Os ensaios foram realizados de acordo com os métodos e as diretrizes de C línicals L aboratory S tandards Institute (C L S I) e outras metodologias estabelecidas. Os antimicrobianos testados contra Bacteroides e Parabacteroides foram: penicilina, amoxicilina-ácido clavulânico, cefoxitina, imipenem, clindamicina, ciprofloxacina, enrofloxacina, tetraciclina, cloranfenicol e metronidazol. Quinze cepas de B. fragilis foram testadas para a formaçã o de biofilme e as quatro cepas mais produtoras de biofilmes foram escolhidas para avaliar o efeito de concentrações subinibitórias (1/2 e 1/4C IM) de seis antimicrobianos sobre a formaçã o de biofilme. B. fragilis foi a bactéria mais frequentemente isolada seguida por P. distasonis e B. vulgatus. Os isolados foram uniformemente sensíveis ao metronidazol, imipenem e cloranfenicol e foram resistentes à penicilina. T etraciclina e clindamicina foram ativas contra D0% e 33% das cepas, respectivamente. A produçã o de biofilme de todas as quatro cepas foi uniforme e significativamente menor (P <0,0D) após crescimento com ½ e ¼ C IM de imipenem e metronidazol. A induçã o da formaçã o de biofilme foi observada em duas cepas com ½ e ¼ C IM de enrofloxacina.
A B S T R A C T
T he Bacteroides and Parabacteroides spp are involved in serious diseases like abscesses and bacteremia in humans and animals. T hese bacteria are characterized by antimicrobial resistance and B. fragilis is the main anaerobic bacteria isolated from the intestine which can form biofilm. T he aim of this study was to isolate Bacteroides and Parabacteroides strains from dogs intestinal tract, to investigate the antimicrobial susceptibility and to evaluate the action of antimicrobials subinhibitory concentrations on biofilm formation. A total of 30 strains were evaluated in this study. T he assays were performed in accordance with the C linical and L aboratory S tandards Institute (C L S I) guidelines and other established methods. A ntimicrobial susceptibility was observed against penicillin, amoxicillin-clavulanic acid, cefoxitin, imipenem, clindamycin, ciprofloxacin, enrofloxacin, tetracycline, chloramphenicol and metronidazole. F ifteen B. fragilis strains were tested for biofilm formation and the stronger four biofilm producer strains were chosen to evaluate the effect of subinhibitory concentrations (1/2 and 1/4MIC ) of six antimicrobials on biofilm formation. B. fragilis was the most frequentl y isolated anaerobic bacteria followed by P. distasonis and B. vulgatus. T he isolates were uniformly susceptible to metronidazole, imipenem and chloramphenicol and were penicillin resistant. T etracycline and clindamycin were active against D0% and 33% of the strains respectively. T he biofilm production of all four strains was uniformly and significantly lower (P<0.0D) after growth with ½ MIC and ¼ MIC of imipenem and metronidazole. T he induction of biofilm formation was observed in two isolates at ½ MIC and ¼ MIC of enrofloxacin.
L I S T A D E I L UST R A Ç Õ E S
F igura 1. Morfologia da espécie B. fragilis observada pela coloraçã o de Gram ( bacilos curtos pleomórficos
Gram-negativos) . F oto obtida por meio de microscopia óptica em um aumento de 100x
... 18
F igura 2. C ápsulas ( A = grande, B = pequena e C = eletrodensa) estudadas na espécie B. fragilis
... 19
F igura 3. Morfologia colonial da espécie B. fragilis semeada em A gar Bacteroides B ile E sculina
... 21
F igura 4. E tapas de formaçã o do biofilme ... 28
F igura D. F ormaçã o de biofilme por cepas de B. fragilis sobre a açã o de concentraçã o subinibitória de
antibióticos ... 47
F igura 6. A çã o de 1/2 C IM de antibióticos sobre a formaçã o de biofilme de quatro cepas da espécie B.
L I S T A D E T A B E L A S
T abela 1 – C oncentraçã o inibitória mínima dos antimicrobianos para espécies dos gê neros Bacteroides e
Parabacteroides isoladas de microbiota normal de cã es ... D0
T abela 2. F ormaçã o de biofilme de cepas B. fragilis sobre a açã o concentraçã o subinibitória de diferentes
L I S T A D E A B R E V I A T UR A S E S I G L A S A HL - N-A cilhomoserina L actona
B B E - A gar Bacteroides B ile E sculina
B HI - Brain Heart Infusion
C E UA - C omitê de É tica para o Uso de A nimais
C IM - C oncentraçã o Inibitória Mínima
C L S I - C linical and L aboratory Standards Institute
D NA – Á cido desoxirribonucleico
E PS - S ubstância Polimérica E xtracelular
L PS - L ipopolissacarídeo
MA T E - Multidrug and T oxic C ompound E xtrusion
MIC - Minimum Inhibitory C oncentration
tampã o fosfato (PB S )
PB S - T ampã o F osfato
R ND - Resistence-Nodulation-D ivision
R NA r – Á cido ribonucleiro ribossômico
sp. - E spécie
spp. – E spécies
UE C E - Universidade E stadual do C eará
UF C – Universidade F ederal do C eará
L I S T A D E S ÍM B OL O S
% - Porcentagem
® - Marca registrada
< - Menor
S UM Á R I O
1. I NT R O D UÇ Ã O 14
2. R E V I S Ã O D E L I T E R A T UR A 1D
2.1 C ar acter ísticas ger ais dos gê ner os B acteroides e Parabacteroides 1D
2.1.1 Histórico e características taxonômicas 1D
2.1.2 C aracterísticas morfológicas e fisiológicas 16
2.1.3 Microbiota do trato gastrointestinal em cã es 20
2.1.4 F atores de virulê ncia 21
2.1.D Patogenicidade para o homem e cã es 24
2.2 B iofilme 26
2.2.1 C aracterísticas gerais do biofilme 26
2.2.2 B iofilme, bactérias anaeróbias e Medicina V eterinária 30
2.3 S ensibilidade bacteriana a antimicr obianos 32
2.3.1 S ensibilidade bacteriana a antimicrobianos de bactérias anaeróbias 32 2.3.2 S ensibilidade bacteriana a antimicrobianos de bactérias anaeróbias isoladas de
cã es
37
2.4 R elevâ ncia do estudo 38
3. H I PÓT E S E S 40
4. O B J E T I V O G E R A L 41
4.1 O bj etivos E specíficos 41
D. M A T E R I A I S E M E T O D O S 42
6. R E S UL T A DO S 48
7. D I S C US S Ã O D2
8. C O NC L US Ã O DD
9. R E F E R ÊNC I A S B I B L I O G R A F I C A S D7
I NT R O D UÇ Ã O
O grupo Bacteroides fragilis possui micro-organismos que sã o normalmente comensais da flora intestinal de cã es e sã o descritos como anaeróbicos, resistentes a bile, nã o formadores de esporos e bacilos Gram-negativos (HIR S H et al., 2004). E sses micro-organismos podem ser responsáveis por infecções com significante morbidade e mortalidade em cã es, como infecções de cavidade oral, abscessos e infecções de ferida (S IL L E Y et al., 2007; W A GNE R et al., 2007; L E D B E T T E R e S C A R L E T T , 2008).
Numerosos fatores contribuem para a habilidade de B. fragilis persistir como comensal no intestino, como a capacidade de usar uma ampla variedade de polissacarídeos da dieta, alta tolerância a bile, formaçã o de cápsula, a presença de diferentes antígenos em sua superfície que permite a evasã o das respostas imunes do hospedeiro, adesã o e formaçã o de biofilme (W E X L E R , 2007).
2 R E V I S Ã O D A L I T E R A T UR A
2.1 C ar acter ísticas ger ais dos gê ner os Bacteroides e Parabacteroides
2.1.1 Histórico e características taxonômicas
O trato gastrointestinal alberga o maior número e a maior diversidade de espécies de bactérias que colonizam o corpo humano. A populaçã o microbiana do cólon alcança 10
10 a 10
12
micro-organismos por grama de conteúdo luminal e supera em número o total das células eucarióticas presentes no corpo humano. E studos moleculares mais recentes apontam para um número de cerca de 1000 espécies bacterianas habitando este ecossistema. D ois filos bacterianos, predominam neste sitio, B acteroidetes e F irmicutes. C ompondo o filo B acteroidetes, predominam bactérias pertencentes à ordem B acteroidales, que sã o as bactérias G ram-negativas mais abundantes deste ecossistema. E spécies da ordem B acteroidales comumente isoladas de fezes humanas sã o: Bacteroides fragilis, B. thetaiotaomicron, B. ovatus, B. caccae, B. vulgatus, B. uniformis, Parabacteroides merdae, P. distasonis, Prevotella tanaerae, Odoribacterium splanchnicus e espécies do gê nero Alistipes. A s espécies mais estudadas sã o as pertencentes aos gê neros Bacteroides e Parabacteroides e pouco se sabe sobre a biologia e a importância, para o homem, das espécies dos outros gê neros (Z IT OME R S K Y ; C OY NE ; C OMS T OC K , 2011; K UL A G INA et al., 2012).
Bacteroides fragilis foi a primeira espécie descrita do gê nero Bacteroides, descrita em 1898. F oi nomeada de Bacillus fragilis, tendo sua renomeaçã o para Bacteroides fragilis ocorrida em 1919. D esde entã o, o gê nero Bacteroides passou por muitas mudanças taxonômicas (C A T O; J OHNS ON, 1976).
Holdeman e Moore (197D) estudaram 326 espécies de bactérias com características que se encaixavam nas descrições iniciais de B. fragilis e agruparam as espécies que eram semelhantes em um grupo chamado B. fragilis. E ssas espécies eram: B. fragilis, B. thetaiotaomicron, B. distasonis, B. ovatus e B. vulgatus. A s bactérias do grupo B. fragilis foram classificadas como: bacilos Gram-negativos, bile-resistentes, sacarolíticos e produtores de ácido acético e succínico como principais produtos do metabolismo de glicose. Mais espécies foram sendo adicionadas ao grupo ao longo dos anos. E m 1986, foi sugerida a adiçã o de trê s novas espécies: B. caccae, B. merdae e B. stercoris. E m 200D várias espécies foram incorporadas ao gê nero Bacteroides, incluindo B. goldsteinii, B. nordii, B. salyersai, B. plebeius, B. coprocola, B. massiliensis (W E X L E R , 2007).
Posteriormente, a análise da sequê ncia do gene 16S R NA r (ácido ribonucléico ribossômico) de B. distasonis e B. merdae mostrou que essas espécies eram filogeneticamente distintas das espécies do gê nero Bacteroides. E ssas espécies foram relacionadas, primeiramente, como membros do gê nero Porphyromonas, com similaridade de 84% na sequê ncia do gene 16S R NA r. E m adiçã o, essas espécies foram reclassificadas para o gê nero T anerella, em virtude da próxima associaçã o filogenética ( cerca de 90% de similaridade) (S A K A MOT O et al., 2002). E m 200D, S ong et al., propuseram uma nova espécie do gê nero Bacteroides, B. goldisteinii. E ssa espécie foi relacionada com B. distasonis e B. merdae, com 93% de similaridade na sequê ncia gene 16S R NA r, e B. goldisteinii foi também reclassificada para o gê nero T anerella, com cerca de 90% de similaridade (SONG et al, 200D).
E m 2006, essas trê s espécies foram reclassificadas para o novo gê nero Parabacteroides e foram renomeadas como Parabacteroides distasonis, Parabacteroides merdae e Parabacteroides goldisteinii (S A K A MOT O; B E NNO, 2006).
2.1.2 C aracterísticas morfológicas e fisiológicas
formadas por proteínas que sã o distribuídas por toda a bactéria e estã o envolvidas com o processo de adesã o e hemaglutinaçã o (PUMB W E ; S K IL B E C K ; W E X L E R , 2006).
F igura 1. Morfologia da espécie B. fragilis observada pela coloraçã o de G ram ( bacilos curtos
pleomórficos Gram-negativos) . F oto obtida por meio de microscopia óptica em um aumento de 100x
E ssas bactérias podem sobreviver à exposiçã o ao oxigê nio em um período de até quatro horas em razã o de enzimas, como superóxido dismutase e catalase, que lhes conferem alta resistê ncia à oxidaçã o. D urante o estabelecimento da infecçã o, a habilidade de crescer na presença de pequenas concentrações de oxigê nio permite a proliferaçã o em tecidos do hospedeiro, antes mesmo do abscesso anaeróbio ser formado (R OC HA et al.,1996; B A UGHN; MA L A MY , 2004).
B. fragilis pode possuir trê s tipos de cápsulas: grande, pequena e eletrodensa (F igura 2) (PA T R IC K ; GIL PIN; S T E V E NS ON, 1999). E studos mostram que as cepas com cápsula eletrodensa sã o antigenicamente diferentes de cepas com cápsulas pequenas, mas apresentam epítopos compartilhados com bactérias de cápsula grande (PA T R IC K ; L UT T ON, 1990; PUMB W E ; S K IL B E C K ; W E X L E R , 2006).
F igura 2. C ápsulas ( A = grande, B = pequena e C = eletrodensa) estudadas na espécie B. fragilis
PA T R IC K ; L UT T ON, 1990
E spécies dos gê neros Bacteroides e Parabacteroides residem, principalmente, no cólon, sã o quimio-heterotróficas, sacarolíticas e sã o seus principais produtos de fermentaçã o acetato, succinato, lactato e propionato (SA L Y E R S , 1984). E ssas bactérias podem fermentar carboidratos com a produçã o de ácidos graxos voláteis que sã o absorvidos através da parede intestinal e sã o utilizados pelo hospedeiro como fonte de energia. E ssas bactérias podem usar desde açúcares simples a complexos e polissacarídeos como nutrientes para seu crescimento ( HOOPE R ; MID T V E D T ; G OR D ON, 2002). A espécie B. thetaiotaomicron possui a capacidade de clivar a maioria das ligações glicosídicas encontradas na natureza, podendo utilizar diferentes fontes de nutrientes para seu crescimento (G IL MOR E ; F E R R E T T I, 2003) . A lguns autores descrevem uma relaçã o de mutualismo entre o ser humano e Bacteroides, pois ambos sã o beneficiados como resultado desta relaçã o ( W E X L E R , 2007).
Os produtos de fermentaçã o produzidos pelas bactérias com origem em compostos orgânicos, como ácido pirúvico, variam entre os diferentes gê neros e espécies de anaeróbias. Pela mediçã o da acidificaçã o do meio, ou pela detecçã o dos ácidos graxos
voláteis resultantes do processo fermentativo desses micro-organismos, pode ser realizada a identificaçã o da bactéria mediante a utilizaçã o de provas bioquímicas ou por meio de cromatografia gasosa. A identificaçã o por prova bioquímica envolve a utilizaçã o de um meio com glicose e outro carboidrato (que poderá ser ou nã o fermentado pela bactéria) e a medida da mudança de pH. A cromatografia gasosa é uma técnica mais sensível e utiliza os produtos metabólicos (ácidos graxos voláteis) liberados no meio de cultura em caldo durante o crescimento em condições anaeróbicas. C om essas técnicas, as bactérias anaeróbias, como as dos gê neros Bacteroides e Parabacteroides, podem ser identificadas definitivamente até o nível de espécie (K ONE MA N et al., 2008).
A s espécies do gê nero Bacteroides também contribuem para o hospedeiro, limitando a colonizaçã o de patógenos no trato gastrintestinal (G IL MOR E ; F E R R E T T I, 2003). E sse fato sucede em decorrê ncia da alta produçã o de proteína bacteriocina no intestino, que sã o substâncias antibacterianas cuja açã o é reduzir por competiçã o de bactérias que ocupam o mesmo nicho ecológico ( W E X L E R , 2007).
F igura 3. Morfologia colonial da espécie B. fragilis semeada em A gar Bacteroides B ile E sculina
Para o cultivo dessas bactérias, é necessário um ambiente de anaerobiose, que pode ser obtido mediante a modificaçã o da atmosfera interna ou por intermédio da retirada e reposiçã o de atmosferas de um ambiente (jarra de anaerobiose, capela de anaerobiose). A modificaçã o da atmosfera interna do ambiente é feita com a aplicaçã o de um método químico que consiste na remoçã o do oxigê nio usando geradores de gás ( H2 e C O2) e um catalisador (remove o oxigê nio do ambiente por acelerar a reaçã o do oxigê nio com o hidrogê nio produzido). D entro de aproximadamente 100 minutos, a quantidade de O2 chega a menos de 0,2%. O procedimento de retirada e reposiçã o de atmosferas é um método físico em que o ar da jarra é removido e substituído por uma mistura de 8D% de N2, 10% de H2 e D% de C O2, permitindo o estabelecimento mais rápido das condições de anaerobiose. Para as duas técnicas, as condições anaeróbias devem sempre ser controladas
com a inclusã o de um indicador de oxirreduçã o, como tiras de azul de metileno (K ONE MA N et al., 2008).
2.1.3 Microbiota do trato gastrointestinal em cã es
A superfície bucal, a língua e os dentes desses animais sã o habitados por bactérias anaeróbias facultativas e aeróbias obrigatórias, ao passo que e a microbiota gengival é composta quase inteiramente por bactérias anaeróbias obrigatórias, tendo como destaque os gê neros Bacteroides, F usobacterium, Peptostreptococcus, Porphyromonas e Prevotella. A saliva contém uma mistura de bactérias anaeróbias facultativas e espécies de bactérias anaeróbias e aeróbias obrigatórias. O esôfago possui uma microbiota transitória composta por micro-organismos encontrados na saliva. A microbiota dos intestinos delgado e grosso varia significativamente entre os diferentes animais (HIR S H; MA C L A C HL A N; W A L K E R , 2004).
A microbiota do trato gastrintestinal de cã es se assemelha ao do homem, com as bactérias anaeróbias obrigatórias predominando na regiã o superior do intestino delgado, ceco e fezes (H IR S H; MA C L A C HL A N; W A L K E R , 2004).
Mentula et al. (200D) realizaram uma pesquisa que teve como objetivo identificar espécies bacterianas anaeróbias e aeróbias isoladas do jejuno e fezes coletadas de 22 cã es. Nesse estudo, foi observado que os grupos isolados em maior quantidade foram Bacteroides spp, C lostridium spp e L actobacillus. A s espécies prevalentes do gê nero Bacteroides foram B. vulgatus e B. fragilis.
J ia et al. (2009) realizaram um estudo com o objetivo de isolar bactérias aeróbias e anaeróbias da microbiota intestinal em cã es com idade de quatro a 13 anos. E sses animais apresentavam diarreia crônica e na análise das amostras foi observada a prevalê ncia de bactérias do gê nero Bacteroides.
2.1.4 F atores de virulê ncia
infecções, se tornou a mais pesquisada e, em sua maioria, os ensaios sobre virulê ncia em Bacteroides sã o realizados com esta espécie (W E X L E R , 2007).
D e maneira geral, os fatores de virulê ncia podem ser divididos em trê s categorias: os envolvidos na adesã o, os envolvidos na evasã o à resposta imune do hospedeiro e os envolvidos na destruiçã o dos tecidos. A s cepas do gê nero Bacteroides exibem fatores de virulê ncia que se enquadram nas categorias há pouco mencionadas, como fímbrias, implicadas na adesã o, cápsula, lipopolissacarídeos e catalase na evasã o à resposta imune e enzimas histolíticas que atuam na destruiçã o tecidual (W E X L E R , 2007).
B. fragilis é uma bactéria capaz de induzir a formaçã o de abscesso como único organismo infectante. A formaçã o de abscessos é claramente ligada à cápsula de B. fragilis, como demonstrado em modelos animais. A administraçã o de cápsulas (mesmo purificadas, administrando apenas polissacarídeos PS -A e PS -B) na regiã o intra-abdominal provou ser suficiente para induzir a formaçã o de abscesso. A cápsula coexpressa dois polissacarídeos antigenicamente distintos de alto peso molecular, PS -A composto por tetrassacarídeos repetidos e PS -B composto por hexassacarídeos repetidos, cada unidade repetida tem grupos aminos carregados positivamente e carboxilas carregadas negativamente ou grupos fosfatos. A análise destes polissacarídeos, antes e depois de modificações químicas, revelou que essas cargas opostas sã o necessárias para a induçã o de abscessos intra-abdominais em ratos (T Z IA NA B OS et al., 1993).
A lém da funçã o de proteger a bactéria contra a fagocitose, a cápsula também está envolvida no processo de hemaglutinaçã o. E studos determinam que a hemaglutinaçã o parece ser causada por mais de uma adesina: cápsula e fimbria estariam assumindo o papel em cepas nã o encapsuladas (BE E NA ; S HIV A NA ND A , 1997).
A s espécies do gê nero Bacteroides se ligam à s células epiteliais por meio de adesinas, tais como fímbrias. E ssas estruturas de adesã o podem estar envolvidas na hemaglutinaçã o, comum em espécies do grupo B. fragilis, de tal forma que, a adesã o é avaliada por meio de testes de aglutinaçã o em eritrócitos e em células, verificando-se que as cepas mais virulentas sã o mais hemaglutinantes (NA MA V A R ; V UGHT ; MA C L A R E N, 1991).
sulfatase (R UD E K ; HA QUE , 1976). A lgumas espécies do gê nero Bacteroides podem produzir hemolisinas, que sã o proteínas citotóxicas que causam danos na integridade da membrana de hemácias. F oram descritas duas hemolisinas em B. fragilis - HlyA e HlyB -, que atuam juntas na hemólise dos eritrócitos (R OB E R T S ON et al., 2006). A β-lactamase produzida por essas bactérias é em sua maioria do tipo cefalosporinases, que hidrolisam cefalosporinas e penicilinas, sendo este o principal mecanismo de resistê ncia a antibióticos β-lactâmicos (R OGE R S ; PA R K E R ; S MIT H,1993; E D W A R D , 1997).
A neuraminidase possui a capacidade de clivar o complexo de glicoproteinas e polissacarídeos presente na superfície das células do hospedeiro ou mucina ricas em ácido siálico presente no lúmen intestinal, aumentando o crescimento dessas bactérias mediante a geraçã o de glicose (GOD OY et al., 1993) A neuraminidase também tem a funçã o de remover a parte terminal do ácido siálico, expondo o sitio de adesã o para as adesinas e, em alguns casos, as adesinas do tipo lectina só conseguem se ligar ao receptor (ácido siálico e outros açúcares) após esse tratamento (PUMB W E ; S K IL B E C K ; W E X L E R , 2006). E ssas bactérias contém vesículas na membrana externa, que mostra funçã o hemaglutinante e atividade sialidase podendo estar relacionada com a virulê ncia (D OMINGUE S et al., 1997).
B. fragilis exerce um importante papel na circulaçã o enterohepática da bile auxiliando no processo de biotransformaçã o destes sais, que por sua vez, auxiliam a digestã o de lipídeos no intestino do homem. E sta bactéria possui muitas enzimas que sã o ativas nesta reaçã o, como a hidrolase. Por outro lado, este micro-organismo tolera grande concentraçã o de sais biliares, o que permite que a bactéria permaneça no intestino, um dos mecanismos envolvidos na tolerância a bile é a presença de bomba de efluxo (W E X L E R , 2007).
S OUZ A ; S C A R C E L L I, 2000; W E X L E R , 2007; K ONE MA N et al., 2008).
A lgumas cepas de B. fragilis enterotoxigê nica possuem a capacidade de produzir uma enterotoxina chamada de fragilisina, uma metaloprotease de zinco com a capacidade de destruir zonas de aderê ncia na junçã o do epitélio intestinal por clivagem da E -caderina, resultando no rearranjo do citoesqueleto de actina das células epiteliais e perda da junçã o do epitélio. A perda de eletrólitos por intermédio do desequilíbrio ocasionado pela fragilisina finaliza em diarreia (W U et al., 1998). A fragilisina também estimula células epiteliais intestinais (HT 29, T 84 e C aco-2) a secretarem interleucina-8 ( IL -8), iniciando o recrutamento de leucócitos polimorfonucleares para a submucosa intestinal, resultando em resposta inflamatória que aumenta a secreçã o de fluido intestinal (S A NF IL IPPO et al., 2000). B. fragilis enterotoxigê nica tem possível papel carcinogê nico em câncer colorretal (T OPR A K et al., 2006).
2.1.D Patogenicidade para o homem e cã es
A pesar do número de isolados de B. fragilis ser de dez a 100 vezes menor do que outras espécies de Bacteroides intestinais, B. fragilis é, ainda, o anaeróbio mais frequentemente isolado de espécimes clínicos de pacientes doentes, sendo considerado como a espécie do gê nero Bacteroides mais virulenta. E sses organismos escapam do intestino geralmente em consequê ncia da ruptura do trato gastrintestinal ou de cirurgia intestinal, podendo causar sérias patologias, incluindo formaçã o de abscesso em vários locais no organismo (ex: cérebro, cavidade abdominal, fígado e pulmã o) como também bacteremias (W E X L E R , 2007).
(W E X L E R , 2007). E ssas bactérias também podem causar infecções ginecológicas, que geralmente acompanham a formaçã o de abscesso e podem causar infecções em tecidos moles, mas nã o é a bactéria anaeróbia mais frequente (W E X L E R et al., 1998; OS B OR NE , 2006).
A s bactérias anaeróbias sã o responsáveis por até 17% das culturas de sangue positivas. A proximadamente D0% dessas culturas sã o causadas por espécies do grupo B. fragilis (B R OOK , 2010). O aumento do número de idosos e de pacientes comprometidos (como pacientes que fazem quimioterapia) sã o as principais causas para a crescente frequê ncia de bacteremias por anaeróbios. Pesquisadores assumiram que o tratamento quimioterápico do câncer causa danos à mucosa gastrintestinal, permitindo que as bactérias anaeróbias do intestino atinjam a corrente sanguínea, fenômeno conhecido por translocaçã o bacteriana ( L A S S MA NN et al., 2007).
Na Medicina V eterinária, relativamente poucos artigos relatando o isolamento de Bacteroides e Parabacteroides, com origem nas infecções em cã es, sã o publicados. E m uma busca ativa realizada por meio do PubMed® e periódicos C apes, no dia 28 de novembro de 2012, utilizando as palavras-chave anaeróbios e cã o, existem 69 artigos publicados nos últimos dez anos. D estes trabalhos veiculados, a maioria é relacionada a infecções orais e apenas cinco versam sobre a prevalê ncia de Bacteroides em microbiota intestinal de cã es e infecções. Quando se compara com o que é descrito para o homem, vê -se que, para este grupo, o número de publicações é bem maior, como também a frequê ncia de estudos multicê ntricos.
D entre os poucos relatos descritos na literatura, S oki et al. (2002) realizaram um estudo em que isolaram uma cepa de B. fragilis resistente a imipenem de um abscesso prostático em um cã o.
Na E uropa, S illey et al. ( 2007) isolaram 141 cepas de anaeróbios de infecções orais, abscessos, infecções de feridas, e também da flora fecal de cã es e gatos, e, destas, 28 cepas foram identificadas como pertencentes ao grupo B. fragilis.
L edbetter e S carlett (2008) estudaram a frequê ncia de bactérias anaeróbias obrigatórias isoladas de amostras da córnea de animais domésticos com ceratite ulcerativa. B actérias anaeróbias foram isoladas em 14% dos cã es e os isolados mais frequentes foram C lostridium, Peptostreptococcus, Actinomyces, F usobacterium e espécies do gê nero Bacteroides. E sse estudo ressalta a importância de bactérias anaeróbias obrigatórias como Bacteroides na microbiota de ceratite ulcerativa de animais domésticos.
W ang et al. (2009) determinaram a populaçã o bacteriana em cã es e gatos com abscesso orbital. C omo resultado, as bactérias isoladas mais frequentemente nos abscessos orbitais foram Staphylococcus, E scherichia, Bacteroides, C lostridium e Pasteurella.
A brahamanian e Goldstein (2011) publicaram um arti go de revisã o sobre a microbiologia das infecções de feridas em humanos que se seguem à mordedura de cã es, gatos e outros animais. C om suporte na infecçã o provocada pela mordedura de cã es, é relatado o isolamento, em ordem decrescente de freqüê ncia, dos anaeróbios F usobacterium sp., Porphyromonas sp., Prevotella sp., Propionibacterium sp., Bacteroides sp. e Peptostreptococcus sp. A inda segundo os autores, B. fragilis pode ser isolado nestes casos, mas numa frequê ncia menor (< 4%), já que a cavidade oral nã o é o sitio onde esta espécie predomina.
Numerosos ensaios envolvendo anaeróbios e doenças relacionadas à cavidade oral de cã es, especialmente doença periodontal, sã o realizados, mas, como dito anteriormente, espécies dos gê neros Bacteroides e Parabacteroides nã o sã o frequentemente descritas neste sítio como patógenos oportunistas (D OMINGUE S et al, 1999; S E NHOR INHO et al., 2011; D A HL E Net al., 2012).
2.2 B iofilme
impacto sobre a humanidade de várias maneiras, à medida que podem formar em ambientes naturais, aparatos médicos e industriais e em tecidos vivos, participando de processos infecciosos no homem e animais (POS T et al., 2007).
2.2.1 C aracterísticas gerais do biofilme
B iofilme pode ser definido como uma comunidade multicelular altamente organizada de micro-organismos, entre eles as bactérias, envolvidos numa matriz de polímero extracelular, onde se concentram produtos de seu metabolismo juntamente com íons e nutrientes sequestrados do ambiente ecológico e em adesã o a uma superfície biótica ou abiótica (C OS T E R T ON et al., 199D).
S ã o descritas várias etapas na formaçã o do biofilme (F igura 4) e esta se inicia com a adesã o do micro-organismo em uma dada superfície que pode ser biótica ou abiótica. Uma vez que as bactérias se ligam a uma superfície, inicia uma autoagregaçã o entre as bactérias, resultando na formaçã o de microcolônias. A pós a formaçã o da microcolônia, o biofilme começa a se tomar maduro. D urante a maturaçã o, a comunidade bacteriana produz substância polimérica extracelular (E PS ), que a circunda e se liga à comunidade bacteriana. A s bactérias no biofilme podem coordenar o seu comportamento, resultando na formaçã o de complexos de estruturas tridimensionais. A estrutura tridimensional do biofilme pode ser plana ou em forma de cogumelo. A pesar da coordenaçã o presente no biofilme, essa comunidade bacteriana exibe uma heterogeneidade funcional. O passo final da maturaçã o do biofilme é a dispersã o de bactérias do biofilme, as quais podem colonizar novas superfícies e formar outros biofilmes. A dispersã o pode ser influenciada por vários fatores, incluindo degradaçã o enzimática da matriz do biofilme (por exemplo, alginato liase), degradaçã o enzimática do E PS do biofilme (por exemplo, hialuronidase) e lise celular (J A C K E S ; A R A GON; T R E MB L A Y , 2010).
O alto nível de organizaçã o das bactérias no biofilme produz uma comunidade funcional coordenada, muito mais eficiente do que as populações mistas de organismos planctônicos. A s células crescem, predominantemente, nesta matriz fechada, em que sã o protegidas das condições ambientais adversas e de agentes antibacterianos biológicos e químicos (C OS T E R T ON et al., 199D).
Os biofilmes sã o compostos, principalmente, por células microbianas e E PS. A E PS do biofilme nã o é geralmente uniforme. L eriche et al. (2000) utilizaram a especificidade de ligaçã o de lectinas para açúcares simples para avaliar o biofilme bacteriano produzido por diferentes organismos. C omo resultado, os pesquisadores mostraram que diferentes organismos produzem quantidades variadas de E PS e que a quantidade de E PS aumenta com a idade do biofilme.
Os biofilmes sã o heterogê neos, possuem em sua estrutura microcolônias compostas por células bacterianas revestidas por uma matriz de E PS e separadas das outras microcolônias por canais de água. O fluxo de líquido ocorre nestes canais de água, o que permite difusã o de nutrientes, oxigê nio e agentes antimicrobianos. E ste conceito de heterogeneidade é descritivo, nã o só para biofilmes de cultura mista ( como pode ser encontrado em biofilmes ambientais) , mas também para biofilmes de culturas puras,
A daptado de J A C K E S; A R A GON; T R E MB L A Y , 2010 1
2
3
4
comuns em dispositivos médicos e associados com doenças infecciosas ( L E W A ND OW S K I, 2000).
A E PS pode associar-se com os íons metálicos, cátions divalentes e outras macromoléculas, tais como proteínas, polissacarídeos e D NA . A E PS também é altamente hidratada porque pode incorporar grandes quantidades de água em sua estrutura através de pontes de hidrogê nio (D ONL A N, 2002; F L E MMING; W INGE ND E R , 2010).
A formaçã o do biofilme, como ocorre com eventos no seu interior, é orquestrada por comunicações químicas, essenciais para o adequado crescimento e para o desenvolvimento dos organismos que vivem em biofilme. E ssa comunicaçã o sucede dependente da densidade populacional ( e da concentraçã o de sinais) e o sistema é ativado em resposta a pequenos ferormônios produzidos pelas bactérias (moléculas bioquímicas) chamados de autoindutores. E ste sistema é denominado de quorum sensing. É uma comunicaçã o sofisticada usada para propagar várias atividades biológicas, incluindo a produçã o de fatores de virulê ncia, iniciaçã o e crescimento na comunidade do biofilme (F UQUA ; W INA NS; GR E E NB E R G, 1994; MIL L E R ; B A S S L E R , 2001).
O sistema quorum sensing pode ser dividido em quatro etapas: produçã o de moléculas sinalizadoras pelas células bacterianas, liberaçã o dessas moléculas, reconhecimento dessas moléculas sinalizadoras por receptores específicos e, ao ultrapassar o limiar de concentraçã o, resulta na mudança do gene regulador. Uma consequê ncia comum da induçã o do sistema quorum sensing na expressã o do gene é o aumento da síntese de proteínas envolvidas na produçã o de moléculas sinalizadoras. E sse aumento da síntese de moléculas sinalizadoras cria um feedback positivo, razã o por que os sinais moleculares sã o comumente chamados de autoindutores (S IF R I, 2008).
oligopeptídeos modificados, chamados peptídeos autoindutores ( F UQUA ; PA R S E K ; GR E E NB E R G, 2001; S IF R I, 2008).
Os biofilmes também proporcionam um ambiente ideal para a troca de D NA extracromossômico (plasmídeos). A conjugaçã o (o mecanismo de transferê ncia de plasmídeo entre bactérias) ocorre em maior quantidade entre as células em biofilmes do que entre as células na forma planctônicas ( E HL E R S ; B OUW E R , 1999). A razã o provável para o aumento da conjugaçã o é que o ambiente do biofilme proporciona o contato mais próximo entre as células. Uma vez que os plasmídeos podem codificar resistê ncia para múltiplos agentes antimicrobianos, a associaçã o de células do biofilme também fornece um mecanismo para promover e propagar a resistê ncia bacteriana aos agentes antimicrobianos (HA US NE R ; W UE R T Z , 1999; GHIGO, 2001).
B actérias crescendo em biofilme podem causar infecções crônicas, caracterizadas por inflamaçã o persistente e dano tecidual. Infecções crônicas sã o infecções que persistem, a despeito de antibioticoterapia, sistema imune inato e adaptativo e resposta inflamatória do hospedeiro (HOIB Y A et al., 2010).
O estádio maduro do biofilme mostra o máximo de tolerância a antibióticos. Nessa fase existem diferentes concentrações de nutrientes e oxigê nio da superfície para o interior do biofilme. No interior do biofilme, onde há menor quantidade destes elementos, ocorrem uma diminuiçã o da atividade metabólica e o aumento do tempo de duplicaçã o das bactérias. A s células com baixa atividade metabólica sã o as responsáveis pela tolerância do biofilme aos antibióticos. Monoterapia com antibióticos, tais como β-lactâmicos, que sã o ativos apenas contra células se dividindo, nã o sã o, portanto, eficiente na erradicaçã o de infecções causadas por biofilme. Mecanismos convencionais de resistê ncia, tais como produçã o de enzimas que degradam antibióticos, bombas de efluxo e mutações em moléculas-alvo de antibióticos em bactérias no biofilme, também, contribuem para a sobrevivê ncia do biofilme (HOIB Y A et al., 2010) .
subinibitórias de alguns antibióticos β-lactâmicos em cepas de S. aureus e tiveram como resultado o aumento de formaçã o de biofilme por essas cepas.
A s concentrações subinibitória de tobramicina, um antibiótico da classe aminoglicosídeo, induz a formaçã o de biofilme em Pseudomonas aeruginosa e E scherichia coli. Para a maioria das bactérias, o tratamento com a concentraçã o subinibitória de alguns antibióticos pode estimular a produçã o de exopolissacarídeo. A concentraçã o subinibitória de imipenem aumenta a produçã o do exopolissacarídeo alginato em P. aeruginosa e, consequentemente, aumenta a produçã o de biofilme (HOF F MA N et al., 200D).
C osta et al. (2012) estudaram a formaçã o de biofilme sob a açã o de concentrações subinibitórias de enrofloxacina em cepas de E . coli isoladas de mastite bovina. A densidade óptica do biofilme foi lida no espectrofotômetro e foi observado que houve o aumento da densidade óptica nas cepas tratadas com o antibiótico, quando comparada com as cepas nã o tratadas. E sse estudo sugere que a enrofloxacina pode agir induzindo a formaçã o de biofilme e esse fenômeno aumenta a presença de mastite persistente, uma vez que a concentraçã o subinibitória de enrofloxacina pode ocorrer em virtude da presença de edema na regiã o úbere causada pela mastite clínica, que impede parcialmente a distribuiçã o do agente antimicrobiano para os sítios de infecçã o.
2.2.2 B iofilme, bactérias anaeróbias e Medicina V eterinária
B. fragilis é a principal bactéria anaeróbia isolada do intestino em seres humanos que pode formar biofilme. Por meio da adesã o à parede intestinal do hospedeiro como mecanismo de sobrevivê ncia, a espécie B. fragilis se torna parte da microbiota normal. O mecanismo de aderê ncia de B. fragilis nas células do epitélio ocorre por diferentes tipos de interaçã o fimbria, adesinas e formaçã o de biofilme (PUMB W E et al., 2007).
bactérias G ram-negativas por meio da produçã o de sinais de A HL s, onde L uxR e L uxI sã o genes reguladores envolvidos com a produçã o e detecçã o desses sinais. Homólogos de L uxR controlam a ativaçã o de vários genes em resposta a sinais de moléculas autoindutoras (PUMB W E ; S K IL B E C K ; W E X L E R , 2008).
No que concerne à formaçã o de biofilme por bactérias anaeróbias, o que mais tem sido estudado sã o os biofilmes da cavidade oral. A pesar de possuir grande quantidade de oxigê nio na boca, este oxigê nio é rapidamente consumido por bactérias aeróbias (por exemplo, Neisseria spp.) ou anaeróbias facultativas (por exemplo, Streptococcus e Actinomyces spp.) e outros gases ( como: C O2, H2) sã o libertados, resultando na reduçã o do potencial redox. E specialmente os biofilmes, tais como placa dentária, criam as condições adequadas para desenvolvimento de bactérias anaeróbias obrigatórias na cavidade oral (MA R S H; MOT E R ; D E V INE , 2011). B actérias orais em humanos, em sua maioria, sã o anaeróbias, vivem em comunidades de multiespécies no biofilme conhecido como placa dental. A s comunidades microbianas que formam as superfícies dos dentes sã o constituídas por várias espécies, das quais os colonizadores iniciais sã o Streptococcus, Actinomyces e V eillonella e o colonizador tardio é F usobacterium (K OL E NB R A ND E R et al., 2006).
E xiste uma diversidade de micro-organismos patogê nicos Gram-negativos e positivos de importância veterinária que podem formar biofilme. Os biofilmes constituidos por esses patógenos sã o resistentes aos antibióticos comumente usados na Medicina V eterinária. D entre os micro-organismos mais estudados que formam biofilme na Medicina V eterinária estã o: Actinobacillus, grupo Bacillus cereus, Burkholderia, E scherichia coli, Mycobacterium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonela, Staphylococcus, Streptococcus e Y ersinia (J A C K E S; A R A GON; T R E MB L A Y , 2010). Moreira et al. (2012) estudaram espécies do gê nero Staphylococcus, isoladas de D4 animais com otite e a sua capacidade de produzir biofilme. A s espécies isoladas com maior frequê ncia foram S. intermedius e S. simulans e em 30% as cepas foram produtoras de biofilme.
2.3 S ensibilidade bacteriana a antimicr obianos
O desenvolvimento de resistê ncia antimicrobiana entre micro-organismos comensais e patógenos representa uma grande ameaça para a saúde pública humana e animal. A tualmente a preocupaçã o está muito relacionada ao rápido desenvolvimento de resistê ncia bacteriana e à demora ocorrente a introduçã o de novos grupos de antibióticos na prática clínica. O desenvolvimento da resistê ncia é acelerada e deve-se à capacidade das bactérias adquirirem genes de múltipla resistê ncia, pelo uso excessivo de antibióticos na Medicina Humana e V eterinária, na agricultura e em alimentos, aumentando o risco de disseminaçã o de genes de bactérias multirresistentes para os seres humanos. O contato do homem com animais domésticos pode servir como uma fonte de infecçã o para o humano, em especial no que diz respeito à resistê ncia antimicrobiana (C L A R K E , 2006).
2.3.1 S ensibilidade bacteriana a antimicrobianos de bactérias anaeróbias
Quatro drogas ou grupos de drogas sã o ativas contra a maioria das bactérias anaeróbias de significância clínica: nitroimidazois como metronidazol, carbapenê micos como o imipenem, cloranfenicol e combinações de drogas β-lactâmicas com inibidores de β-lactamase. Outras trê s drogas também sã o eficazes contra anaeróbios, mas sã o menos ativas do que os grupos mencionados há pouco. E sses agentes sã o cefoxitina, clindamicina e penicilinas de largo espectro, como ticarcilina ou piperacilina. C epas do grupo B. fragilis apresentam de 1D% a 2D% de resistê ncia a essas drogas na maioria dos hospitais dos E stados Unidos (F INE G OL D ; W E X L E R , 1996; S NY DMA N et al., 2007) .
Muitos agentes antimicrobianos, incluindo aminoglicosídeos, sulfametoxazol-trimetoprim, a maioria das quinolonas, e monobâmicos, tê m fraca atividade contra muitos ou a maioria dos anaeróbios (F INE G OL D ; W E X L E R , 1996).
maioria, as infecções anaeróbias sã o mistas, envolvendo bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas, e sendo geralmente necessário adicionar outros antimicrobianos na terapia antimicrobiana para que todos os micro-organismos da infecçã o sejam tratados (F INE GOL D ; W E X L E R , 1996).
A s taxas de resistê ncia podem variar entre as espécies do grupo B. fragilis. A resistê ncia, mesmo para drogas mais ativas - como imipenem, piperacilina-subactam e metronidazol - tem aparecido em algumas cepas ocasionais (S C HA R PIR O et al., 2004; PUMB W E et al., 2007).
A s espécies do gê nero Bacteroides contê m os mais diversos mecanismos de resistê ncia e maiores taxas de resistê ncias de todas as bactérias anaeróbias (SÓK I et al., 2006). A resistê ncia a alguns agentes antimicrobianos decorre, pelo menos, de um dos seguintes mecanismos: alteraçã o de afinidade do alvo, reduçã o da penetraçã o do antibiótico em virtude de permeabilidade ou bomba de efluxo ou presença de enzimas inativadoras (S NY D MA N et al., 2002).
O mecanismo comum de resistê ncia aos antibióticos β-lactâmicos é a produçã o da enzima β-lactamase, que quebra o anel β-lactâmico, inativando o antimicrobiano. Quatro tipos de β-lactamases sã o encontrados no grupo B. fragilis, sendo a mais comum a do tipo cefalosporinase, que nã o tem açã o sobre cefoxitina ou imipenem (R OGE R S ; PA R K E R ; S MIT H, 1993). Os carbapenê micos sã o degradados por enzimas ( classe B de metallo-β-lactamase) produzidas por dois genes, cfiA e ccrA. E ssas enzimas conferem resistê ncia a carbapenê micos, β-lactâmicos e inibidores de β-lactamase. A resistê ncia aos carbapenê micos também pode ser mediada por bomba de efluxo (PUMB W E ; C HA NG, et al., 2006; PUMB W E ; W A R E HA N et al., 2007)
A lém de poder inativar enzimaticamente antibióticos β-lactâmicos, esses micro-organismos possuem a capacidade de modificar as proteínas ligadoras de penicilina, essas proteínas estã o envolvidas na formaçã o de parede celular sã o alvo de penicilinas e outros β-lactâmicos que atuam na parede celular, fazendo com que essas drogas percam sua açã o (E D W A R D S , 1997).
aeróbio dependente de energia, de modo que as bactérias anaeróbias sã o resistentes aos aminoglicosídeos ( B R Y A N; K OW A ND; E L Z E N, 1979).
Os macrolídeos (como azitromicina) e a lincosamina (como clindamicina) inibem a síntese de proteína, por se ligar em à subunidade D0S do ribossomo bacteriano, bloqueando a saída da cadeia peptídica em crescimento. A resistê ncia à clindamicina, um antibiótico usado comumente durante as ultimas décadas para infecções causadas por bactérias anaeróbias, tem aumentado consideravelmente. A resistê ncia à clindamicina e à azitromicina ocorre por meio da metilaçã o do alvo de ligaçã o dessas drogas no ribossomo (R OB E R T S , 2003).
O cloranfenicol se liga à peptidil-transferase do ribossomo na bactéria, prevenindo a biossintese de proteína. A resistê ncia ocorre em razã o da enzima cloranfenicol acetiltransferase, que acetila o antimicrobiano, impedindo a sua ligaçã o ao ribossomo e, consequentemente, o seu efeito ( B R IT Z ; W IL K INS ON, 1978).
O grupo das tetraciclinas se liga à subunidade 30S do ribossomo inibindo a síntese de proteína. E sse agente foi a primeira linha de antibiótico usada para tratar infecções anaeróbias e permaneceu indicado até próximo à década de 1970. A tualmente, quase todos os isolados de B. fragilis sã o resistentes (80 a 90%) à s tetraciclinas. O gene tetQ é um de vários que codificam um proteína citoplasmática que interage com o ribossomo, bloqueando o sitio de ligaçã o da tetraciclina (SA L Y E R S ; S PE E R ; S HOE MA K E R , 1990). A resistê ncia em Bacteroides a tetraciclina também é descrita por bomba de efluxo (PUMB W E et al., 2006).
maioria das vezes, é a causa mais comum de resistê ncia à s quinolonas (R IC C I et al., 2004). A resistê ncia à s quinolonas também pode ocorrer por meio do aumento da atividade de bombas de efluxo (PUMB W E ; C HA NG et al., 2006; R IC C I et al., 2004).
A transferê ncia horizontal de genes (plasmídeos e transposons) por meio da conjugaçã o em procariontes lidera a variaçã o genética e aquisiçã o de genes de resistê ncia. E spécies de Bacteroides intestinais apresentam trê s tipos de plasmídeos - pB F 4, pB F T M10 e pB I136 - que codificam altos níveis de resistê ncia a macrolídeo, lincosamida e estreptogramina por meio do gene erm conservado. Os transposons conjugativos (C T n) no gê nero Bacteroides exercem papel central na disseminaçã o de genes de resistê ncia a antibióticos; o principal transposon conjugativo identificado em Bacteroides é C T nD OT . C T nD OT carrega resistê ncia a tetraciclina, tetQ, e ao gene de resistê ncia a eritromicina, ermF . O alto nível de resistê ncia a antibióticos nas espécies do gê nero Bacteroides é preocupante, pois este pode ser um reservatório de resistê ncia para outras bactérias altamente patogê nicas (QUE S A D A , 2011).
A s bombas de efluxo contribuem para resistê ncia a várias drogas em Bacteroides. E ssas bombas exibem uma ampla especificidade e podem agir sinergicamente como barreira permeável e resultar em significante resistê ncia intrínseca a muitos antibióticos (NIK A ID O, 2001). S ã o identificados 16 tipos de bombas de efluxo de resistê ncia a multidrogas da família R esistence-Nodulation-D ivision (R ND ) em B. fragilis, nomeadas de bmeABC 1 – 16 (UE D A et al., 200D). A bomba de efluxo da família Multidrug and T oxic C ompound E xtrusion (MA T E ) também foi descrita em B. thetaiotaomicron (nomeada de BexA) (MIY A MA E et al., 2001).
E studos multicê ntricos de monitoraçã o de sensibilidade a antimicrobianos em Bacteroides isolados de espécimes clínicos ou microbiota intestinal normal do homem sã o efetuados em vários países.
imipenem, 11% a moxifloxacina, 33% a clindamicina e sensibilidade absoluta para cloranfenicol e metronidazol ( L E E et al., 2010).
C arvalho et al. (1996), em F ortaleza, realizaram um estudo com o objetivo de analisar a resistê ncia de espécies do grupo B. fragilis de amostras clínicas e microbiota intestinal a antimicrobianos. A espécie B. fragilis representou 68% das espécies do grupo B. fragilis encontradas nas amostras clínicas e D1% nas amostras fecais. T odas as amostras estudadas foram sensíveis ao cloranfenicol e ao metronidazol. A resistê ncia a penicilina, tetraciclina, clindamicina e cefoxitina em espécimes clínicos foi de: 93,D%, 80,D%, 21,7% e 10,9%, respectivamente, e, em amostras fecais, de 78,4%, 73%, 19% e D,4% respectivamente.
No B rasil, em S ã o Paulo, no ano de 2011, a resistê ncia de espécies dos gê neros Bacteroides e Parabacteroides isolados de microbiota intestinal de crianças para cefoxitina foi de 23%, clindamicina 34,2%; amoxicilina+ ácido clavulânico foi de 47,3%, tetraciclina D3,D% e penicilina 99% ( NA K A NO et al., 2011).
W areham et al. (200D), pela primeira vez, reportaram cepas de B. fragilis multirresistentes. Os autores analisaram cepas de B. fragilis isoladas de um paciente com sepse por bactérias anaeróbias, simultaneamente resistentes a carbapenê micos, β-lactâmicos associados a inibidores de β-lactamase e metronidazol. E studos posteriores entre a variedade de mecanismos de resistê ncia confirmaram a presença do gene carbapenemase (cfiA), resistê ncia estreptogramina, lincosamina e macrolideo associado ao gene erm, plasmídeo localizado no gene tetQ com resistê ncia a tetraciclina e genes com o aumento da expressã o para bomba de efluxo (PUMB W E ; C HA NG et al., 2007).
A s espécies dos gê neros Bacteroides e Parabacteroides, quando comparadas a outras bactérias anaeróbias, sã o caracterizadas pela alta resistê ncia à s drogas antimicrobianas utilizadas na clinica médica humana e veterinária (Á V IL A et al., 1991). No B rasil, a análise microbiológica e de sensibilidade à s drogas anti microbianas de bactérias anaeróbias nã o constitui uma rotina nas clínicas laboratoriais, em decorrê ncia de limitações, como o lento crescimento dos micro-organismos, a natureza polimicrobianas em infecções por anaeróbios, a complexidade, os custos dos métodos de cultivo e a carê ncia de técnicos especializados. E sse fato dificulta o conhecimento dos padrões de sensibilidade desses micro-organismos.
2.3.2S ensibilidade bacteriana a antimicrobianos de bactérias anaeróbias isoladas de cã es
Há poucos estudos sobre resistê ncia a antimicrobianos em bactérias anaeróbias e menos ainda é conhecido sobre espécies dos gê neros Bacteroides e Parabacteroides.
S illey et al. (2007) compararam a açã o da pradofloxacina, uma nova fluoroquinolona desenvolvida para uso veterinário, com outras fluoroquinolonas contra bactérias anaeróbias isoladas de cã es e gatos. Os autores isolaram 141 cepas de anaeróbios de infecções orais, abscessos, infecções de feridas e também da microbiota fecal de cã es e gatos e, destas, 28 cepas pertenciam ao grupo B. fragilis. C omo resultado do teste de sensibilidade, detectaram maior atividade da pradofloxacina, seguida da marbofloxacina, enrofloxacina e outras contra bactérias anaeróbias.
S tegemann et al. (2006) estudaram a açã o de cefovecina, uma nova cefalosporina, em 2.641 isolados clínicos (por exemplo: ferida, pele, cavidade oral, abscesso, trato urinário, ouvido e olho) de cã es e gatos nos E stados Unidos e em países da E uropa. F oram isoladas 32 cepas do gê nero Bacteroides em um total de 286 patógenos anaeróbios. C omo resultado do teste de sensibilidade, todas as bactérias anaeróbias foram sensíveis a cefovecina.
tratado com cotrimoxazol em virtude da nova formaçã o do abscesso na próstata. B. fragilis foi isolado e foi feito o tratamento com metronidazol por sete semanas. F oram realizados testes de sensibilidade em B. fragilis, identificando resistê ncia a penicilina, amoxicilina+ ácido clavulânico, cefoxitina, meropenem e imipenem. E sse achado prova que cepas de B. fragilis resistente a imipenem estã o também presentes em animais domésticos, apesar de os carbapenê micos serem raramente usados no tratamento de infecções em animais. E ssas cepas podem causar infecções endógenas no próprio animal e também podem ser transmitidas para a populaçã o humana (S ÓK I et al., 2002).
Nos últimos dez anos, atençã o é dirigida à possibilidade de transferê ncia direta de micro-organismos resistentes entre animais de estimaçã o e as pessoas, pois existe o contato físico em ambientes domésticos e uso dos mesmos agentes antibacterianos em seres humanos e animais. Na revisã o sobre o papel dos animais de estimaçã o como reservatórios de bactérias resistentes a antimicrobianos, os veterinários usam frequentemente, como primeira linha de antibacterianos, amoxicilina+ clavulanato, cefalosporinas e fluoroquinolonas em animais de companhia. A resistê ncia tanto em bactérias patogê nicas como em bactérias comensais apresenta um significante risco de transferê ncia zoonótica entre animais e pessoas ( GUA R D A B A S S I; S C HW A R Z ; L L OY D , 2004). C epas resistentes a antimicrobianos isoladas de animais de pequeno porte, muitas vezes, sã o indistinguíveis de cepas isoladas de pessoas que cuidam destes animais (C L A R K E , 2006).
2.4 R elevâ ncia do estudo
C epas isoladas de amostras intestinais normais sã o importantes, pois a microbiota endógena pode desempenhar um papel protagonista na disseminaçã o de resistê ncia (B. fragilis é considerado reservatório de genes de resistê ncia no intestino) e pode se tornar patógeno oportunista, causando infecçã o no próprio animal (GUA R D A B A S S I; S C HW A R Z ; L L OY D , 2004).
3. H I PÓT E S E S
1. B. fragilis e B. vulgatusdevem constituir as espécies mais frequentemente isoladas da microbiota intestinal de cã es.
2. A sensibilidade das cepas a maioria dos antibióticos será baixa dado ao amplo uso de alguns destes antimicrobianos na clínica veterinária.
4. O B J E T I V O G E R A L
D eterminar a frequê ncia de isolamento e a sensibilidade aos antimicrobianos de cepas de Bacteroides e Parabacteroides isoladas de cã es
4.1 O bj etivos E specíficos
1. Identificar as espécies dos gê neros Bacteroides e Parabacteroides em de amostras fecais de cã es;
2. A valiar o perfil de sensibilidade dessas bactérias a diferentes classes de antibióticos; 3. A nalisar a formaçã o de biofilme de cepas da espécie B. fragilis na presença de
concentrações subinibitórias de diferentes antimicrobianos;
D. M A T E R I A I S E M É T O D O S
D.1 A spectos éticos
O presente trabalho faz parte de um projeto colaborativo UF C /UE C E denominado “Perfil de resistê ncia a antimicrobianos de bactérias anaeróbias e facultativas isoladas da microbiota normal e de infecçã o em animais” o qual foi submetido ao C omitê de É tica para o uso de animais (C E UA ) da Universidade E stadual do C eará (UE C E ) e aprovado (número do protocolo: 10610110-2/D7, A PÊND IC E I).
D.2 A nimais utilizados
F oram analisadas amostras fecais de cã es saudáveis, com idade limitada até um ano e sem distinçã o de sexo e raça, os animais que estavam fazendo o uso de antimicrobianos foram excluídos da pesquisa. F oi realizada a coleta no período de fevereiro a junho do ano de 2011, após a autorizaçã o dos proprietários dos animais (A PÊND IC E II) e da C línica V eterinária da UE C E . F oi aplicado um questionário onde foram coletados os dados do animal como: raça, idade, uso de antimicrobianos e outras informações (A PE ND IC E III).
D.3 C oleta dos espécimes clínicos
F oram analisadas D0 amostras da microbiota intestinal que foram coletadas através de swab retal e em seguida colocadas em meio para transporte (C ary & B lair modificado/D IF C O® ). A pós a coleta, as amostras foram encaminhadas ao laboratório dentro do período de até 4 horas e entã o foram processadas imediatamente (OPL UST IL et al., 2010).
A s amostras coletadas foram semeadas em meio seletivo A gar Bacteroides B ile E sculina (B B E /D IF C O® ) e incubadas em condições de anaerobiose à 37 °C , por 48 horas. A anaerobiose foi obtida pela adiçã o do envelope gerador de anaerobiose/A naerobac (PR OB A C ® ) em jarra de anaerobiose (PR OB A C /D IF C O® ). A pós o tempo de incubaçã o, as colônias foram observadas e as colônias escuras (devido à hidrólise de esculina) foram examinadas quanto à s suas características morfo-tintoriais pela coloraçã o de Gram. E las foram também inoculadas em caldo B rain Heart Infusion (B HI/D IF C O® ) e incubadas em atmosfera convencional por 24/48 horas. T odos os meios de cultura foram suplementados com hemina (D mg/ml) , menadione (1 mg/ml) e cisteína (0,D mg/ml) ( OPL US T IL et al., 2010).
Primeiramente foi realizado o teste de aerotolerância para confirmar que o micro-organismo suspeito se tratava de uma bactéria anaeróbia. E sse teste consiste em repicar cada colônia isolada de placa em anaerobiose em uma placa de agar sangue e incubar em aerobiose, microaerofilia e anaerobiose. S e o micro-organismo crescer apenas na atmosfera anaeróbia, confirma a presença de uma bactéria anaeróbia. E m seguida a identificaçã o presuntiva foi realizada determinando-se a produçã o de catalase, hidrólise da esculina, produçã o de indol e crescimento em meio com bile. A identificaçã o definitiva da espécie foi realizada pelas reações de fermentaçã o dos açúcares arabinose, ramnose, celobiose, trealose e xilose em meio enriquecido com peptona. T odos os isolados identificados em cultura pura foram estocados em B HI com glicerol (20 %) a -20 °C (K ONE MA N et al., 2008).
D.D C romatografia gasosa
K /hemina e incubadas nas mesmas condições por 6 a 8 horas. A pós o crescimento, cada cepa foi centrifugada e o sobrenadante foi descartado. No sedimento foi adicionado hidróxido de sódio, água destilada, metanol e colocado em banho maria à 100 °C durante 30 minutos. D epois do aquecimento, ácido clorídrico, metanol, ácido sulfúrico e metanol foram adicionados, a amostra foi colocada novamente em banho maria à 80 °C durante 10 minutos e em seguida num banho de gelo. F oi adicionado éter e metil-terbutil-éter, a soluçã o foi entã o homogeneizada durante 10 minutos e a fase inferior foi removida. Na parte superior foi adicionada água destilada e hidróxido de sódio e foi misturado durante D minutos. E m seguida, a parte superior ( ácidos graxos) foi colocada num frasco especial para cromatografia. A cromatografia foi feita num cromatógrafo gasoso (Modelo 68D0, A gilent T echnologies® ) e a análises dos padrões de ácidos graxos foi feito pelo software MID I S herlock (A gilent T echnologies® ) ( K ONE MA N et al., 2008).
D.6 D eterminaçã o da C oncentraçã o Inibitória Mínima (técnica de microdiluiçã o em caldo)
Para a determinaçã o da C oncentraçã o Inibitória Mínima (C IM) de diferentes drogas das cepas de Bacteroides e Parabacteroides isoladas foi utilizada a técnica de microdiluiçã o em caldo, padronizada pelo C linical and L aboratory S tandards Institute - C L S I. C omo controle foi empregado uma cepa padrã o de Bacteroides fragilis (A T C C 2D28D) cuja sensibilidade é conhecida (C L S I, 2007, M11-S 1, 2011).
D.6.1 A ntimicrobiano, meio de cultura e inóculo
metronidazol foi dimetil sulfóxido e cloranfenicol foi utilizado etanol 9D%. O diluente utilizado para cefoxitina, clindamicina, penicilina, tetraciclina, ciprofloxacina, enrofloxacina, cloranfenicol e metronidazol foi água destilada e para amoxicilina-ácido clavulânico e imipenem foi tampã o fosfato com pH 6 e 7,2 respectivamente.
Para a padronizaçã o do inóculo, partimos do crescimento recente do micro-organismo em meio de cultura liquido (24 horas). E ssa suspensã o foi diluída em caldo B rucella, até atingir a turvaçã o equiv alente a 0,D da escala McF arland, em seguida essa suspensã o foi diluída em 1D vezes em caldo B rucella para atingir a concentraçã o de 1x10
7
UF C /mL . O inóculo (10 µ L ) foi adicionado nas microplacas para atingir a concentraçã o final 1x10
6 UF C /mL . A s microplacas com as microdiluições dos antimicrobianos e o micro-organismo foram incubadas durante 48 horas à 37 °C em jarras de anaerobiose (C L S I, 2007).
D.6.2 L eitura e interpretaçã o dos resultados
A pós a incubaçã o, foi feita a leitura das microplacas, utilizando como padrã o de crescimento os controles das cepas cultivadas em caldo B rucella sem adiçã o de antibióticos. F oi considerada a C IM do antimicrobiano para cada cepa testada, a menor concentraçã o de cada agente antimicrobiano capaz de inibir crescimento bacteriano visível (C L S I, 2007).
D.7 A çã o de concentrações subinibitórias de antibióticos sobre formaçã o de biofilme de cepas B. fragilis
