UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho”
PROGRAMA INTERINSTITUCIONAL DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
PIPGCF UFSCar/UNESP
MIGUEL FURTADO MENEZES
PARTICIPAÇÃO DOS RECEPTORES PURINÉRGICOS DO NÚCLEO PARABRAQUIAL LATERAL NAS RESPOSTAS CARDIORRESPIRATÓRIAS INDUZIDAS PELA HIPÓXIA AGUDA E HIPÓXIA CRÔNICA INTERMITENTE
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho”
PROGRAMA INTERINSTITUCIONAL DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
PIPGCF UFSCar/UNESP
MIGUEL FURTADO MENEZES
PARTICIPAÇÃO DOS RECEPTORES PURINÉRGICOS DO NÚCLEO PARABRAQUIAL LATERAL NAS RESPOSTAS CARDIORRESPIRATÓRIAS INDUZIDAS PELA HIPÓXIA AGUDA E HIPÓXIA CRÔNICA INTERMITENTE
ARARAQUARA 2015
Tese apresentada ao Programa Interinstitucional de
Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade
Federal de São Carlos/Universidade Estadual Paulista “Júlio
de Mesquita Filho”
- PIPGCF UFSCar/UNESP, como parte
dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em
Ciências, área de concentração: Fisiologia.
Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária/UFSCar
M543pr
Menezes, Miguel Furtado.
Participação dos receptores purinérgicos do núcleo parabraquial lateral nas respostas cardiorrespiratórias induzidas pela hipóxia aguda e hipóxia crônica intermitente / Miguel Furtado Menezes. -- São Carlos : UFSCar, 2015. 106 f.
Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos, 2015.
1. Fisiologia. 2. Núcleo parabraquial lateral. 3. Adenosina trifosfato. 4. Receptores purinérgicos. 5. Hipóxia. I. Título.
DADOS CURRICULARES
Ms. MIGUEL FURTADO MENEZES
NASCIMENTO 19.02.1977 – Araraquara/SP
FILIAÇÃO Joaquim Carlos de Oliveira Menezes
Rosana da Cunha Rudge Furtado
2010/2015 Curso de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, nível de Doutorado, na Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP (Programa Interinstitucional de Pós-Graduação PIPGCF- UFSCar/UNESP).
2008/2010 Curso de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, nível de Mestrado, na Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP (Programa Interinstitucional de Pós-Graduação PIPGCF- UFSCar/UNESP).
A MINHA ESPOSA, MICHELE
A MINHA FILHA ANA LUÍZA
Agradecimentos
Dedico este trabalho em memória de minha avó, Professora Aída Leite da Cunha Rudge Furtado.
Agradeço especialmente a Profª.Drª. Patrícia Maria de Paula, pela orientação, apoio e dedicação e excelentes condições de trabalho. Desde minha iniciação científica tive o privilégio de tê-la como orientadora.
Agradeço ao Prof. José Vanderlei Menani, pela colaboração e apoio a esse trabalho.
Ao Professor Dr. Steve Mifflin, pela orientação e dedicação dispensada durante o período que trabalhamos juntos.
Aos demais colaboradores do projeto, doutoranda Michele Thaís Fávero, Doutor Richard Boarato David e ao Dr. Kenta Yamamoto.
A minha filha Ana Luíza, que fez com que tudo valesse a pena.
A minha esposa Michele, a você agradeço por todo o amor, carinho e compreensão em todos os momentos bons e difíceis.
A minha mãe, Rosana, pelo apoio, amor e carinho e pela educação que me foi dada.
Agradeço aos professores do Departamento de Fisiologia da UNESP – Araraquara e do Programa Interinstitucional de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, pelos ensinamentos transmitidos.
Agradeço aos meus irmãos, amigos e colegas pelo apoio.
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia da UNESP – Araraquara pelo auxílio na execução deste trabalho.
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Anatomia da Universidade Do Norte do Texas-UNT – Fort Worth, Texas, USA, pelo auxílio na execução deste trabalho.
Aos órgãos de fomento FAPESP, CAPES e CNPq por tornarem possível a realização deste trabalho. Especialmente agradeço à FAPESP e Capes pela concessão das bolsas.
Resumo
O núcleo parabraquial lateral (NPBL) é uma importante área da circuitaria do tronco encefálico envolvida no controle cardiorrespiratório. A adenosina trifosfato (ATP) é considerada um importante neurotransmissor e os receptores purinérgicos estão presentes no NPBL. O envolvimento de mecanismos purinérgicos do NPBL no controle cardiorrespiratório durante a hipóxia ainda é desconhecido. No presente estudo, investigamos os efeitos do alfa, beta-metileno ATP (alfa, beta-me ATP, agonista purinérgico P2X) sozinho ou combinado com PPADS (antagonista dos receptores purinérgicos P2) injetado no NPBL sobre as respostas cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia aguda (7% O2 por 60 min) em ratos não anestesiados e hipóxia crônica intermitente
(HCI, 10% de O2, 8 horas/7 dias) em ratos anestesiados. Além disso, em um outro grupo de
ratos não anestesiados, investigamos o efeito da hipóxia aguda (7% de O2, durante 60 min)
sobre a atividade dos neurônios do NPBL e também o efeito da injeção de alfa, beta-me ATP no NPBL sobre a imunorreatividade à proteína Fos no NTS induzido por hipóxia aguda. No grupo de ratos não anestesiados, foram utilizados ratos Holtzman (290-310 g, n = 8/ grupo) com cânulas de aço inoxidável implantadas bilateralmente no NPBL. Um tubo de polietileno foi inserido na aorta abdominal através da artéria femoral para registro da pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC). A frequência respiratória (fR), volume corrente (VC) e ventilação (VE) foram registrados através da pletismografia de corpo inteiro. Os ratos não anestesiados receberam injeções bilaterais de PPADS (4 nmol/0,2 µL) no NPBL 10 minutos antes da injeção de alfa, beta-me ATP (2 nmol/0,2 µL) ou salina no NPBL. Dez minutos após as injeções no NPBL, uma mistura de gás hipóxico (7% de O2) foi ventilado na câmara, durante 60 minutos. No grupo de ratos anestesiado,
HCI (alternando períodos de 6 minutos de 10% de O2 e 4 min de 21% O2 entre as
08:00-16:00 hs; e exposição contínua à normóxia em 21% O2 entre as 08:00-16:00 hs). PAM, FC,
atividade nervosa simpática renal (ANSR) e atividade do nervo frênico (ANF) foram registradas em ratos anestesiados com uretana e alfa cloralose, vagotomizados e ventilados mecanicamente. Os animais anestesiados receberam injeções unilaterais de alfa, beta-me ATP (2,0 nmol/50 nL) antes, 10 e 30 minutos após PPADS (0,125 nmol/50 nL) no NPBL. Para o grupo de imunohistoquímica, foram utilizados ratos Holtzman, onde estudamos a expressão da proteína Fos no NBPL e núcleo parabraquial medial (NPBM) de ratos não anestesiados submetidos a 1 h de hipóxia aguda. Em um outro grupo, os animais receberam injeções bilaterais no NPBL de alfa, beta-me ATP ou salina (n = 5/grupo) 10 minutos antes da hipóxia aguda durante 1 h. Após este período, os ratos foram anestesiados profundamente e perfundidos para a remoção dos encéfalos e realização de procedimentos de imunohistoquímica. Nos ratos não anestesiados as injeções bilaterais de alfa, beta-me ATP no NPBL potencializou o aumento no VC (= 4,0 ± 0,3 ml/kg, vs. salina: 2,2 ± 0,2 mL/kg, ou 81% de aumento, p = 0,005) e VE (= 871 ± 55 mL/kg/min, vs. salina: 598 ± 60 ml/kg/min, ou seja 45% de aumento, p = 0,009), sem alterar taquipneia (fR = 49 ± 5 cpm, vs. salina: 48 ± 5 cpm) induzida por hipóxia aguda. O pré-tratamento com PPADS no NPBL aboliu as respostas de alfa, beta-me ATP. Injeções bilaterais de alfa, beta-me ATP no NPBL não afetou a hipotensão e taquicardia induzidos pela hipóxia aguda. Em ratos anestesiados expostos a normóxia por 7 dias, as injeções unilaterais de alfa, beta-me ATP (2,0 nmol/50 nL) aumentou a PAM (Δ = 10 ± 2 mmHg, vs. salina: 0 ± 1 mmHg, p <0,05), ANSR (Δ = 40 ± 12%, vs. salina: 1 ± 1%) e frequência da ANF (Δ = 17 ± 5 cpm, vs. salina:
(0,125 nmol/50 nL) no NPBL aboliu o aumento da PAM (Δ = 0 ± 1 mmHg), ANSR (Δ = 3 ± 3,1%) e a frequência da ANF (Δ = 1 ± 1 cpm) produzidos pela injeção de alfa, beta-me ATP. Em ratos anestesiados expostos à HCI, a injeção de alfa, beta-me ATP no NPBL aumentou ainda mais PAM (Δ = 20 ± 2, vs. salina: -1 ± 1 mmHg), FC (Δ = 25 ± 5 bpm, vs.
salina: -1 ± 1 bpm) e a amplitude da ANF (Δ = 87 ± 31%, vs. salina: 2 ± 1%), além de ter aumentado também a freqüência da ANF (Δ = 17 ± 5 cpm, vs. salina: -1 ± 1 cpm, p <0,05). No grupo imunohistoquímica, a hipóxia aguda produziu a ativação dos neurônios do NPBL (93 ± 8, normóxia, vs. 22 ± 8 células), enquanto que a injeção de alfa, beta-me ATP no NPBL potencializou a expressão de Fos no NTS caudal (NTSc; 88 ± 4, vs. salina: 42 ± 8 células) e rostral (NTSr, 62 ± 8, vs. salina: 38 ± 4 células). Concluindo, nossos resultados sugerem que os receptores P2 do NPBL estão envolvidos nas respostas cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia aguda e hipóxia crônica intermitente e essas respostas ativam neurônios no NTS, sugerindo possíveis projeções diretas ou indiretas entre o NPBL e o NTS.
Abstract
The lateral parabrachial nucleus (LPBN) is an important area of the hindbrain circuitry involved in cardiorespiratory control. Adenosine triphosphate (ATP) is considered an important central neurotransmitter and purinergic receptors are present in the LPBN. The involvement of purinergic mechanisms of the LPBN in the cardiorespiratory control during hypoxia is still unknown. In the present study, we investigated the effects of alpha, beta-me ATP (P2X purinergic agonist) alone or combined with PPADS (P2 purinergic receptor antagonist) injected into the LPBN on cardiorespiratory responses induced by acute hypoxia (7% O2 for 60 min) in unanesthetized rats and chronic intermittent hypoxia
(CIH) (10% O2, 8 hours/7 days) in anesthetized rats. Additionally, in another
unanesthetized rats group, we investigated the effect of acute hypoxia (7% O2 for 60
minutes) on the activity of LPBN neurons and also the effect of alpha, beta-me ATP injected into the LPBN on Fos immunoreactivity at NTS induced by acute hypoxia (7% O2
for 60 min). In unanesthetized group, we used male Holtzman rats (290-310 g, n=8/group) with stainless steel cannulas implanted bilaterally into the LPBN. A polyethylene tubing was inserted into abdominal aorta through femoral artery for recording mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR). Respiratory frequency (fR), tidal volume (VT) and ventilation (VE) were recorded by whole-body plethysmography. The unanesthetized rats received bilateral injections of PPADS (4 nmol/0.2 µL) into the LPBN 10 minutes before injections of alpha, beta-me ATP (2 nmol/0.2 µL) or saline into the LPBN. Ten minutes after the LPBN injections, a hypoxic gas mixture (7% O2) was ventilated in the chamber for
60 minutes. In anesthetized group, we used Sprague Dawley rats (300-400 g, n=7) were exposed for 7 days to CIH (alternating 6 min periods of 10% O2 and 4 min of 21% O2 from
phrequency PNA (Δ = 1±1 cpm) produced by alpha, beta-me ATP injected into LPBN. In anesthetized CIH rats, the injection of alpha, beta-me ATP into the LPBN increased even more MAP (Δ = 20±2, vs. saline: -1±1 mmHg), HR (Δ = 25±5 bpm, vs. saline: -1±1 bpm) and amplitude PNA (Δ = 87±31%, vs. saline: 2±1%), in addition to have increased also frequency PNA (Δ = 17±5 cpm, vs. saline: -1±1 cpm). In immunohistochemistry group the acute hypoxia produces activation of the LPBN neurons (93 ± 8, vs. normoxic 22 ± 8 cells), while the injection of alpha, beta-me ATP into the LPBN potentiated the Fos expression in caudal NTS (NTSc; 88 ± 4, vs. saline: 42 ± 8 cells) and rostral NTS (NTSr, 62 ± 8, vs. saline: 38 ± 4 cells). In conclusion, our data suggest that the P2 receptors into the LPBN are involved in the cardiorespiratory responses induced by acute hypoxia and chronic intermittent hypoxia and these responses activate neurons in the NTS, suggesting possible direct or indirect projections between the LPBN and the NTS.
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ADH- área de defesa hipotalâmica ATP- Adenosina 5′-trifosfato; ANF- atividade do nervo frênico;
ANSR- atividade do nervo simpático renal; bpm- batimentos por minuto;
cc- canal central;
CeA- núcleo central da amígdala; CO2- dióxido de carbono;
cpm- ciclos por minuto; E.P.M.- erro padrão da média;
ET CO2- porcentagem de CO2 expirada;
FC- frequência cardíaca; fR- frequência respiratória; g- grama(s);
GABA- ácido γ-aminobutírico; Glu- glutamato;
Gr- grácilis;
GRVLc- Grupamento respiratório ventrolateral caudal; GRVLr - Grupamento respiratório ventrolateral rostral; h- hora (s);
Hz-hertz;
iANF- atividade integrada do nervo frênico; iANSR- atividade integrada do nervo renal; i.c.v.- intracerebroventricular;
KCN- cianeto de potássio; KF-Kölliker-Fuse;
kg - quilograma; LC- Locus Coerulus; M- molar;
mg - miligrama(s); min - minuto(s); N2- nitrogênio;
nL- nanolitros;
NPBL- núcleo parabraquial lateral; NPBM- múcleo parabraquial medial; NPB-núcleo parabraquial;
NRT- núcleo retrotrapezóide; NTS- núcleo do trato solitário;
NTSc- núcleo do trato solitário caudal; NTSi- núcleo do trato solitário intermediário; NTSr- núcleo do trato solitário rostral; O2- oxigênio;
PaCO2- pressão parcial de gás carbônico;
PaO2- pressão parcial de oxigênio;
pcs- pedúnculo cerebelar superior; pF- grupamento respiratório parafacial; pH- potencial hidrogênionico ;
PPADS- pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2',4'-disulfonic acid; RVL- rostroventrolateral do bulbo;
s.c.- subcutânea;
SNA- sistema nervoso autônomo; SNC- sistema nervoso central; VC- volume corrente;
VE- ventilação; VL- ventrículo lateral; μg- micrograma(s); μL- microlitro(s);
μm- micrometro(s);
α- alfa; β- beta;
ºC- grau Celsius; %- porcentagem; < - menor;
> - maior;
Sumário
1-INTRODUÇÃO ... 17
1.1 Neurotransmissão Purinérgica ... 22
2- OBJETIVOS ... 25
3-MATERIAL E MÉTODOS ... 26
3.1. Material e métodos utilizados para os experimentos em ratos não anestesiados ... 26
3.1.1-Animais ... 26
3.1.2-Implante de cânulas no NPBL ... 26
3.1.3- Medidas da ventilação pulmonar(VE) ... 28
3.1.4- Medida da pressão arterial e freqüência cardíaca ... 30
3.1.5-Injeções no NPBL ... 30
3.1.6- Histologia ... 31
3.1.7-Coleta e determinações gasométricas de sangue arterial ... 31
3.1.8-Imunohistoquímica para c-Fos ... 31
3.1.9- Análise estatística ... 33
3.2- Material e métodos utilizados para os experimentos em animais não anestesiados ... 33
3.2.1- Animais ... 33
3.2.2- Hipóxia Crônica Intermitente (HCI) ... 34
3.2.3- Registro da pressão arterial e da freqüência cardíaca ... 35
3.2.4- Medida da atividade do nervo frênico ... 35
3.2.5- Medida da atividade do nervo simpático renal ... 36
3.2.6- Drogas ... 37
3.2.7- Procedimentos cirúrgicos e anestesia ... 37
3.2.8- Injeções no NPBL ... 38
3.2.9- Perfusão e histologia ... 39
3.2.10- Análise estatística ... 39
4-Protocolos experimentais ... 40
4.1-Protocolos experimentais realizados em ratos não anestesiados... 40
4.2- Protocolos experimentais realizados em ratos anestesiados. ... 42
5-Resultados ... 44
5.1-Análise Histológica (animais não anestesiados) ... 44
5.3- Efeito das injeções de PPADS no NPBL nas respostas cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia aguda. ... 48 5.4- Efeito das injeções de alfa, beta-me ATP no NPBL sobre as respostas cardiorrespiratórias em condição de normóxia. ... 51 5.5- Efeito das injeções de alfa, beta- me ATP no NPBL nas respostas cardiorrespiratórias
induzidas por hipóxia aguda. ... 54 5.6- Efeito das injeções bilaterais de alfa, beta-me ATP sozinho ou combinado com o PPADS no NPBL nas respostas cardiorespiratórias durante a hipóxia aguda. ... 57 5.7- Análise gasométrica após ativação purinérgica no NPBL em ratos não anestesiados
submetidos a hipóxia aguda ou normóxia. ... 61 5.8-Análise Histológica (animais anestesiados) ... 62 5.9- Efeito das injeções unilaterais de alfa, beta-metileno ATP sozinho, 10 e 30 minutos após o PPADS no NPBL nas respostas cardiorespiratórias em ratos anestesiados após a hipóxia crônica intermitente ou normóxia. ... 63 5.10- Análise gasométrica após a exposição a hipóxia crônica intermitente (HCI) ou normóxia em ratos anestesiados. ... 69 5.11-Estudo da expressão da proteína c-Fos no núcleo parabraquial lateral e núcleo parabraquial medial em ratos expostos a hipóxia aguda ou normóxia. ... 70 5.12-Estudo da expressão da proteína c-Fos no núcleo do trato solitário em ratos expostos a hipóxia aguda que receberam injeção bilateral de alfa, beta-me ATP ou salina no NPBL ... 73 6-Discussão ... 78
17
1-INTRODUÇÃO
Uma das funções mais importantes do encéfalo é o controle da ventilação pulmonar (VE). O sistema respiratório possui diversas funções, dentre elas, podemos destacar a manutenção da temperatura, a fonação e principalmente o processo de trocas gasosas pulmonares, com o intuito de manter o fornecimento adequado de oxigênio (O2), remoção
do dióxido de carbono (CO2) e estabelecer o potencial hidrogeniônico (pH) do sangue, às
condições mecânicas (como mudanças de postura) e aos comportamentos (como falar, comer, cheirar) (Boron e Boulpaep, 2005). A musculatura respiratória trabalha de forma coordenada para garantir o fluxo de ar adequado nos pulmões e para que isso ocorra, existem sensores neurais especializados chamados de quimiorreceptores periféricos e centrais. Os quimiorreceptores periféricos encontram-se distribuídos nos corpúsculos carotídeos e aórticos, localizados bilateralmente na bifurcação da carótida comum (quimiorreceptores carotídeos) ou em pequenos corpúsculos espalhados na curvatura da artéria aorta (quimiorreceptores aórticos) (Comroe, 1939). Esses receptores detectam principalmente variações na pressão parcial de oxigênio (PaO2) e na pressão parcial de gás
carbônico (PaCO2, Biscoe, 1971; Biscoe e Duchen, 1990), enquanto que os
quimiorreceptores centrais estão localizados principalmente na superfície ventral do bulbo (Mitchell, et al., 1963; Schlafke, 1981; Loeschcke, 1982) e tem como função predominante detectar alterações do PaCO2/pH (Gelfand & Lambertsen, 1973).
18 especificamente na região bulbar, destacam-se algumas estruturas localizadas na superfície ventral atuando tanto como geradoras e moduladoras do ritmo respiratório (Cezario et al., 2008; Guyenet et al., 2010; Swanson, 2000). Os principais núcleos respiratórios da superfície ventral são: núcleo retrotrapezóide/grupamento respiratório parafacial (RTN/pF) (Mulkey et al, 2004; Guyenet et al, 2005; Takakura et al., 2006), complexo Bötzinger (Schreihofer e Guyenet, 1997; Ezure, 1990), complexo pré-Bötzinger (Rekling e Feldman, 1998; Feldman e Del negro, 2006), grupamento respiratório ventrolateral rostral (GRVLr) (Stornetta et al., 2003), grupamento respiratório ventrolateral caudal (GRVLc) (Fortuna et al., 2008; Ezure, 1990). Além dos núcleos da superfície ventral do bulbo que controlam a respiração, a ponte e a região dorsal do bulbo também participam do controle respiratório. Na ponte, existem núcleos específicos, como os núcleos parabraquial lateral (NPBL), medial (NPBM) e o Kölliker-Fuse (KF), que possuem neurônios pós-inspiratórios importantes para o encerramento da inspiração e para a manutenção do ritmo respiratório (Smith et al., 2007). No entanto, ainda não está bem estabelecido o exato papel e a importância fisiológica de algumas estruturas no controle e na geração do ritmo e padrão respiratório.
O ritmo e o padrão respiratório normal pode ser afetado por algumas situações, como por exemplo, a hipóxia. A hipóxia é um estímulo classicamente conhecido por causar uma série de respostas compensatórias, incluindo aumento imediato da ventilação pulmonar (VE) (West, 1985). A queda PaO2 provocada pela hipóxia aguda aumenta as
19 Além da hipóxia, vários estudos demonstraram que a estimulação ou lesão de áreas no SNC, especificamente áreas pontinas, também podem afetar o ritmo e o padrão ventilatório (Cohen, 1971, Chamberlin and Saper, 1994; Mutolo et al., 1998; Okazaki et al., 2002, von Euler et al., 1976), dentre essas áreas destaca-se NPBL. O núcleo parabraquial (NPB) é composto de neurônios que circundam o pedúnculo cerebelar superior (pcs) ao longo da ponte dorsolateral (Fulwiler e Saper, 1984). Este núcleo é dividido em medial, lateral e extensão ventrolateral (núcleo Kölliker-fuse, KF); sendo que o NPB é subdividido em 10 grupos de subnúcleos distintos pela sua citoarquitetura (Fulwiler e Saper, 1984). Cada subnúcleo está associado a um grupo específico de aferências e eferências, e diferentes neurotransmissores atuam nessa região (Fulwiler e Saper, 1984; Hebert e Saper, 1990; Hebert et al., 1990; Chamberlin e Saper, 1995).
20 Projeções eferentes do complexo parabraquial, região que inclui o NPBL inervam diversos neurônios envolvidos no controle respiratório, incluindo a área A5, toda a coluna respiratória ventral, o NTS e o núcleo ambíguo (Dobbins, et al., 1994). Um recente trabalho de Damasceno et al, 2014, demostraram que no complexo parabraquial, mais especificamente o núcleo Kölliker-Fuse (KF) a injeção bilateral de muscimol (100 e 200 pmol/100 nl) no KF reduziu ventilação basal sem alterar a PAM e a FC basal, e, além disso, foi capaz de reduzir o aumento da ventilação e a taquicardia, sem alterar a hipotensão produzidos pela hipóxia (8% O2 - 10 min) e hipercapnia (7% CO2 - 10 min) em ratos não
anestesiados. No entanto, quando a injeção de muscimol atingiu o NPBL não houve alteração na ventilação basal. Por outro lado, a injeção bilateral de muscimol no NPBL promoveu um aumento de PAM, mas sem alteração na FC basal. A injeção bilateral de muscimol no NPBL não foi capaz de alterar o aumento da atividade respiratória produzida por hipóxia e hipercapnia em ratos não anestesiados. Dessa maneira, os autores sugerem que a região KF e não o NPBL estão envolvidos com o controle respiratório eupneico e durante a ativação do quimiorreflexo periférico e central em animais não anestesiados, ressaltando a importância de núcleos pontinos no controle cardiorrespiratório.
Estudos usando a proteína Fos como marcador de atividade neuronal revelou intensa ativação dos neurônios do NPBL após hipóxia e hipercapnia (Tepema et al., 1997). Além disso, Song et al, 2012, demonstraram que durante a hipóxia os neurônios do NTS medial e comissural que se projetam para o complexo parabraquial estão ativos. Assim, torna-se interessante investigar a possível contribuição do NPBL durante a ativação dos quimiorreceptores periféricos e/ou centrais.
21 respiratório pontino (Feldman, 1986) ou centro pneumotáxico (Lumsden, 1923; Cohen e Wang, 1959). Ainda nesse contexto, estudos de Song e Poon 2009 a, b, têm demonstrado que a lesão do NPBL produziu uma diminuição do tempo de expiração, durante hipóxia e hipercapnia, sugerindo que este núcleo pode ser o local de integração na ponte entre os quimiorreceptores centrais e periféricos controlando o tempo de expiração e inspiração.
Além da hipóxia aguda, um outro modelo experimental de hipóxia tem sido foco de diversos estudos, a hipóxia crônica intermitente (HCI) que é um modelo experimental utilizado para estudar a hipóxemia que ocorre durante a apnea obstrutiva do sono. Estudos clínicos e experimentais têm demonstrado que as condições causadas pela HCI e pela apnea obstrutiva do sono que resultam na ativação de quimiorreceptores periféricos, podem alterar mecanismos de controle da atividade respiratória, atividade autonômica simpática e resultam no desenvolvimento da hipertensão arterial (Fletcher e cols, 2001; Leuenberger e cols, 2005; McGuire e cols, 2003; Narkiewicz e cols, 2005; Zoccal e cols, 2007).
22
1.1 Neurotransmissão Purinérgica
23 agonista o 2-metilthio-ATP (2meSATP). O agonista alfa,beta-me-ATP e o alfa-gama-metileno-ATP são inativos para os receptores P2Y.
Atualmente vários estudos sugerem o envolvimento da neurotransmissão purinérgica, que utiliza o ATP e a adenosina como um neurotransmissor, no controle da quimiorrecepção central e periférica (Phillis et al, 1997, Ralevic et al, 1999, Paton et al, 2002, Rong et al, 2003, de Paula et al,2004; Antunes et al. 2005, Gourine et al, 2005, Spyer, 2009, Zoccal et al., 2011).
Dentre esses trabalhos, Antunes et al. 2005 observaram que o ATP quando injetado no NTS intermediário de ratos não anestesiados produzia respostas bradicárdicas, redução na atividade no nervo frênico e simpatoinibição, enquanto que no NTS caudal, a injeção de ATP causou respostas bradicárdicas e aumento na atividade do nervo frênico, sem alterações autonômicas, sugerindo que os mecanismos purinérgicos do NTS estão envolvidos com o controle cardiorrespiratório. Além do NTS, na região rostroventrolateral do bulbo (RVL) também foi observado o envolvimento de mecanismos purinérgicos durante a hipóxia (Zoccal et al, 2011, Zhang et al, 2012). Nesse trabalho de Zoccal et al, 2011, a resposta simpato-excitatória produzida pela hipóxia está aumentada após a injeção de ATP no RVL, enquanto que Zhang et al, 2012, observaram que o aumento na atividade do nervo frênico é potencializada após a injeção de ATP no RVL. Além disso, Gourine et al, 2005, observaram que durante a hipóxia ocorre um aumento na liberação de ATP na superfície ventral do bulbo.
24 estes receptores do NPBL estejam envolvidos com as respostas cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia aguda e/ou HCI.
25
2- OBJETIVOS
O objetivo do presente estudo foi verificar o possível envolvimento de receptores purinérgicos P2 do NPBL no controle das respostas cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia aguda e hipóxia crônica intermitente (HCI) em ratos não anestesiados e anestesiados, respectivamente. Para isso, avaliamos:
1) os efeitos das injeções bilaterais do agonista dos receptores P2X (alfa, beta-me ATP) e do antagonista dos receptores P2 (PPADS) no NPBL de ratos não anestesiados sobre as respostas cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia aguda e determinação dos gases sanguíneos e pH arteriais em condição de hipóxia aguda;
2) os efeitos das injeções unilaterais do agonista dos receptores P2X (alfa, beta-me ATP) e do antagonista dos receptores P2 (PPADS) no NPBL de ratos anestesiados sobre as respostas cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia crônica intermitente (HCI) e determinação dos gases sanguíneos e pH arteriais em condição de HCI;
3) a expressão da proteína Fos no NPBL e NPBM após 1 h hipóxia aguda;
26
3-MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Material e métodos utilizados para os experimentos em ratos não
anestesiados
3.1.1-Animais
Foram utilizados ratos adultos Holtzman com peso entre 290-310 g, fornecidos pelo Biotério do Campus de Araraquara, UNESP. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais de aço inoxidável, com livre acesso a ração Bio Base (Águas Frias, SC, Brasil), e água, permaneceram em salas climatizadas (temperatura de 23 ± 2º C e umidade de 50 ± 10%) com ciclo claro-escuro de 12 h no Laboratório de Fisiologia do Departamento de Fisiologia e Patologia da Faculdade de Odontologia de Araraquara (FOAr), UNESP. Os protocolos experimentais aos quais os animais foram submetidos foram aprovados e autorizados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal - CEEA (Proc. CEEA nº 04/2011) da FOAr, UNESP.
3.1.2-Implante de cânulas no NPBL
28
3.1.3- Drogas e soluções utilizadas
- Solução fisiológica (NaCl 0,9% - veículo), foi utilizada nos experimentos controle; - ácido piridoxal Fosfato-6-azofenil-2',4'-disulfônico (PPADS 4,0 nmol/0,2 μl, antagonista dos receptores purinérgicos P2), Sigma Chemical, St Louis, MO, EUA;
- alfa, beta-metileneadenosine 5’ trifosfato sal de lítio (α,β-metileno ATP (2,0 nmol/0,2 μl, agonista dos receptores purinérgicos P2X), Sigma Chemical, St Louis, MO, EUA;
As doses das drogas foram escolhidas com base em experimentos pilotos e estudos anteriores (de Paula et al., 2004, Menezes et al., 2011).
3.1.4- Medidas da ventilação pulmonar (VE)
29 medida através de um termômetro retal no início, durante a hipóxia ou normóxia e ao término do experimento.
Durante as medidas de ventilação, o fluxo é interrompido e a câmara selada por curtos períodos de tempo (~ 2 min) e as oscilações na temperatura do ar causadas pela respiração podem ser medidas como oscilações na pressão. Os sinais detectados pelo transdutor diferencial de pressão são coletados por um registrador o qual está conectado a um conversor analógico-digital. Isto permite a digitalização dos sinais em um microcomputador, utilizando um programa de aquisição de dados. Os dados são analisados através de um programa de cálculos, permitindo a obtenção da frequência respiratória (fR) e da amplitude do sinal (PT). O volume corrente (VC) é calculado através da fórmula abaixo (Bartlett e Tenney, 1970). A calibração do volume é feita antes e durante cada experimento por injeção na câmara de uma quantidade conhecida de ar (1 ml) usando uma seringa graduada. A VE é calculada multiplicando o VC pela fR. Segundo Bartlett e Tenney (1970) medidas diretas de VE por pneumotacografia resultam em valores bastante próximos daqueles obtidos por pletismografia.
VC = PT x VK x TC x (PB - PC) . PK TR (PB-PC) – TC x (PB-PR) Tb
Definição dos símbolos da equação: VC: Volume de ar corrente.
30 Tb: Temperatura corporal (em Kelvin)
TC: Temperatura do ar dentro da câmara do animal. PB: Pressão barométrica.
PR: pressão de vapor de água a temperatura corporal. PC: pressão de vapor de água na camara do animal. TR: temperatura ambiente.
3.1.5- Medida da pressão arterial e freqüência cardíaca
A pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) foram registrados em ratos não anestesiados. Sob a anestesia com cloridrato de cetamina (80 mg/kg) combinada com xilazina (7 mg/kg) ip, um tubo de polietileno (PE 10 soldado ao PE 50) foi inserido na aorta abdominal através da artéria femoral do rato um dia antes dos experimentos. A cânula foi conduzida subcutaneamente e exteriorizada pelo dorso do animal. No dia seguinte, para o registro da pressão arterial pulsátil a cânula foi conectada ao transdutor de pressão (Stathan P23 Db) acoplado a um pré-amplificador (modelo ETH-200 Bridge Bio Amplifier) que foi conectado ao sistema de aquisição de dados Power Lab (modelo Power Lab 16/30, ADInstruments) que fornecia os sinais para o computador.
3.1.6-Injeções no NPBL
31 fixadas no encéfalo. A agulha injetora (14 x 0,3 mm d.i.) era 2 mm mais longa que a cânula-guia. O volume de injeção foi de 0,2 L (em cada lado).
3.1.7- Histologia
No final dos experimentos, os animais receberam injecções bilaterais de 2% de solução de azul de Evans (0,2 L) no NPBL. Eles foram então profundamente anestesiados com tiopental sódico (80 mg/kg de peso corporal) e perfundidos transcardiacamente com solução salina seguida por formalina a 10%. Os encéfalos foram removidos, fixados em formalina a 10%, congelados, cortados em secções de 50 M, coradas com Giemsa, e analisados por microscopia de luz para confirmar os locais de injeção no NPBL.
3.1.8-Coleta e determinações gasométricas de sangue arterial
Após as microinjeções no NPBL e a exposição dos animais à hipóxia, foi realizado remoção de sangue arterial (0,5 mL) da artéria femoral dos animais. As amostras de sangue retiradas foram colocadas em um cartucho (CG3+, I-Stat) e inseridos num aparelho de gasometria (I-Stat, Abbott Laboratory, NJ, USA) para a análise gasométrica da PaCO2,
PaO2, saturação de O2, pH e HCO3-.
3.1.9-Imunohistoquímica para Fos
Os ratos foram submetidos à hipóxia (7% de O2) ou normóxia (21% de O2) durante
32 foram anestesiados com solução de tiopental sódico (80 mg/kg de peso corpóreo). A expressão de Fos foi estudada no NPBL e NPBM.
33 As células com imunorreatividade positiva para a proteína Fos foram quantificadas usando um programa de análise de imagens Image Pro Plus. As regiões quantificadas
foram padronizadas da seguinte maneira: todas as seções marcadas foram contadas para o NPBL, NPBM e NTS. Células marcadas positivamente foram contadas utilizando um microscópio de luz (Olympus BX50) com aumento de 10x e 40x.
3.1.10- Análise estatística
Os resultados estão apresentados como média ± E.P.M. Análise de variância (ANOVA) de duas vias, seguida de pós-teste de Newman-Keuls foram utilizados para comparação entre os diferentes tratamentos, o teste t de Student não pareado foi utilizado para a comparação entre os dados de gasometria. Diferenças foram consideradas significantes para p < 0,05.
3.2- Material e métodos utilizados para os experimentos em animais
anestesiados
3.2.1- Animais
34 ciclo claro/escuro. Os protocolos experimentais aos quais os animais foram submetidos foram aprovados e autorizados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
3.2.2- Hipóxia Crônica Intermitente (HCI)
Os animais dos grupos controle e HCI foram acondicionados em caixas coletivas (máximo de 10 animais por caixa) e mantidos em câmaras (volume de 210 L) equipadas com injetores de gases bem como sensores de O2, CO2, temperatura e umidade. O grupo
HCI foi exposto aos episódios de hipóxia intermitente, os quais consistiam em 5 minutos de normóxia (fração de oxigênio inspirado, FiO2, de 20,8%) procedido de um período de 4
minutos de injeção de nitrogênio (N2) para reduzir a FiO2 de 20,8% para 10%,
permanecendo neste nível por 30 a 40 segundos. Neste nível, verificamos se a PaO2, a qual
foi medida por meio de um analisador de gases sanguíneos (2000SA, Nonim, Medical, Inc) que estava aproximadamente em torno 20 mmHg. Em seguida, o O2 foi injetado dentro da
câmara para retornar a FiO2 para 20,8%. Desta forma, os ratos do grupo HCI foram
submetidos a uma FiO2 de 10% por 30-40 segundos a cada 9 minutos. Este protocolo de
HCI foi repetido 8 horas por dia (das 9:30 hs à 17:30 hs) durante 7 dias. Nas 16 horas remanescentes (das 17:30 hs às 9:30 hs), os animais foram mantidos em condições de normóxia. A injeção de N2 e O2 dentro das câmaras foi regulada por um conjunto de
35 24h por dia, durante 7 dias. De modo semelhante ao grupo HCI, os ratos do grupo controle foram também expostos a ruídos de injeção de gases dentro da câmara devido a freqüente injeção de N2 e O2 para manter a FiO2 em 20,8%. Em ambas as câmaras de ratos controle e
HCI, a injeção de gases ocorreu na parte superior das câmaras, para evitar jatos de ar diretamente sobre os animais, os quais causariam estresse aos mesmos.
3.2.3- Registro da pressão arterial e da frequência cardíaca
Para o registro das variáveis cardiovasculares, os animais foram submetidos à canulação da artéria femoral com tubo de polietileno (PE-10 conectado a um PE-50) para registro da PAM. A cânula da artéria femoral foi conectada a um transdutor de pressão (Physiological Pressure Transducer mod. MLT844, ADInstruments) acoplado a um pré-amplificador (Bridge Bio Amplifier mod. ML221, ADInstruments) e ao sistema de registro computadorizado Cambridge Electronic Design (CED-1401) de 8 canais. Foram registradas, simultaneamente, a pressão arterial pulsátil (PAP) e a PAM. Os animais tiveram a veia femoral canulada com tubo de polietileno (PE-10 conectado a um PE-50) para a infusão de drogas sistêmicas.
3.2.4- Medida da atividade do nervo frênico
36 filtrada de 100 a 3000 Hz. O nervo e eletrodos foram fixados com cola de silicone (Kwik-Sil, World Precision Instruments, FL, EUA).
O eletrodo bipolar em que o nervo foi colocado estava conectado a um conversor analógico-digital (modelo CED-1401) da Cambridge Electronics Design (CED, Cambridge, UK) de 8 canais. Este aparelho possui filtro passa-baixo, ligação AC-DC (corrente direta-alternada), filtro de corte, permite variação do ganho e possibilita correção da linha de base. A partir deste aparelho, o sinal foi copiado para um sistema de aquisição de dados versão 6 do Spike 2 software (CED). Os resultados foram gravados em DVD e posteriormente analisados.
3.2.5- Medida da atividade do nervo simpático renal
37
3.2.6- Drogas (animais anestesiados)
- Solução fisiológica (NaCl 0,9% - veículo), foi utilizada nos experimentos controle; - ácido piridoxalFosfato-6-azofenil-2',4'-disulfônico (PPADS 0,125 nmol/50 nL, antagonista dos receptores purinérgicos P2), Sigma Chemical, St Louis, MO, EUA; - alfa,beta-metileneadenosine 5’ trifosfato sal de lítio (α,β-metileno ATP (2,0 nmol/50 nL, agonista dos receptores purinérgicos P2X), Sigma Chemical, St Louis, MO, EUA;
As doses das drogas foram escolhidas com base em experimentos pilotos e estudos anteriores (de Paula et al., 2004, Menezes et al., 2011).
3.2.7- Procedimentos cirúrgicos e anestesia
Inicialmente os animais foram anestesiados com isoflurano 5% em 100% de oxigênio. Posteriormente foram traqueostomizados e colocados em ventilação artificial com 1,5 - 2,0% de isoflurano em 100% de oxigênio para continuação dos procedimentos cirúrgicos. Em todos experimentos foram realizados os seguintes procedimentos cirúrgicos: 1) canulação da artéria femoral para registro de pressão arterial média (PAM) e canulação da veia femoral para administração de drogas;
2) estereotaxia utilizando um aparelho estereotáxico (modelo Kopf 1760); 3) localização e exposição do nervo simpático renal (Yamamoto et al., 2012)
4) localização e exposição do nervo frênico via posição dorsolateral (Moreira et al., 2011; Takakura et al., 2011)
38 Após a finalização dos procedimentos cirúrgicos, o anestésico isoflurano foi substituído pelo anestésico endovenoso uretano (1,5 g/kg de peso corporal) e alfa-cloralose (40mg/kg de peso corporal).
Os animais foram ventilados com 100% de oxigênio durante todo o período experimental. Os animais receberam uma sonda retal para monitorização da temperatura corpórea e sua temperatura foi mantida em 37ºC, utilizando-se um colchão com resistência interna para aquecimento. O índice de CO2-expirado foi monitorado durante todo o experimento por meio de um capnômetro (Columbus Instruments, Ohio, USA). O nível da anestesia foi sempre monitorado testando-se a ausência de efeitos no reflexo de retirada, ausência de mudanças na pressão arterial e na atividade do nervo simpático renal e do nervo frênico após o pinçamento da pata do animal. Satisfeitos esses critérios, o relaxante muscular (Gallamine triethiodide Flaxedil 5 mg/kg/hora) foi administrado endovenosamente.
3.2.8- Injeções no NPBL
As injeções no NPBL em animais anestesiados foram realizadas sob pressão com nitrogênio, utilizando-se pipetas de vidro (diâmetro interno 25-30 μm, Sutter Instrument Co, CA) acopladas ao aparelho PicoSpritzer III (General Valve Corporation, NJ). O volume das injeções foi de 50 nL.
39
3.2.9- Perfusão e histologia
Ao término dos experimentos, os animais receberam injeções bilaterais de 2% de solução de azul de Evans (50 nL) no NPBL, ainda sob efeito de anestesia foram perfundidos através do ventrículo cardíaco esquerdo com solução salina 0,9 % seguido de formaldeído (4% em 0,1 M de solução de tampão Fosfato, pH 7,4). Os encéfalos foram removidos e armazenados durante 2 h nesse fixador a 4°C para pós-fixação, e, então, transferidos para solução crio-protetora de sacarose a 20% diluída em tampão Fosfato de potássio (0,2 M), onde permaneceram durante aproximadamente 12h também a 4°C. Em seguida, cortes coronais de 50 μm foram obtidos através de micrótomo de congelamento.
Uma série de cortes histológicos foi montada em lâminas gelatinizadas. Depois de finalizados os tratamentos histológicos, os cortes cerebrais foram analisados num microscópio (Olympus regular scope) para conferir os locais das injeções. Toda a nomenclatura anatômica foi baseada no Atlas Paxinos e Watson (2007).
3.2.10- Análise estatística
40
4-Protocolos experimentais
4.1-Protocolos experimentais realizados em ratos não anestesiados
4.1.1-Protocolo 1: Participação dos receptores P2 do NPBL sobre a
pressão arterial, frequência cardíaca e ventilação em condições de hipóxia
aguda e normóxia.
Cada animal foi colocado em uma câmara de pletismografia e submetido aos registros de PA, FC e VE. A câmara foi ventilada por ar atmosférico umedecido. Num período exploratório, que variou entre 30-60 minutos até que o animal estivesse aclimatizado e a PA, FC e VE se estabilizassem, a medida de ventilação basal foi efetuada. Após estes procedimentos os animais foram divididos em 3 grupos:
Grupo 1: Os animais receberam no NPBL microinjeções de alfa, beta- me ATP (agonista dos receptores purinérgicos P2X) na dose de 2 nmol/0,2 l. Após as microinjeções, a PA, FC e VE dos animais foram medidas aos 5, 15, 30, 45 e 60 minutos em hipóxia (7% de O2)
ou normóxia (21% de O2).
Grupo 2: Os animais receberam no NPBL microinjeções de PPADS (antagonista específico dos receptores purinérgicos P2) na dose de 4 nmol/0,2 l. Após as microinjeções, a PA, FC e VE dos animais foram medidas aos 5, 15, 30, 45 e 60 minutos em hipóxia (7% de O2) ou
normóxia (21% de O2).
41
4.1.2- Protocolo 2: Participação dos receptores P2 do NPBL sobre a
pressão arterial, frequência cardíaca e a ventilação em condições de
hipóxia, após as injeções bilaterais de alfa, beta- me ATP sozinho ou
combinado com PPADS
Cada animal foi colocado individualmente na câmara de pletismografia que foi ventilada com ar umedecido. Após o animal permanecer na câmara por um período exploratório e de aclimatação de (∼30 min) a VE, PAM e FC foram registradas. Subsequentemente, os ratos receberam uma injeção de PPADS (4 nmol/0,2 µL) bilateralmente no NPBL 10 minutos antes de alfa, beta- me ATP (2 nmol/0,2 µL) ou de salina no NPBL. Cinco minutos após as injeções, uma mistura com gás hipóxico (7% O2
inspirado) foi ventilado na câmara por 60 minutos. VE, PAM e FC foram registradas após 5, 15, 30, 45 e 60 minutos após as injeções. Finalmente, após a hipóxia os animais foram expostos à condição de normóxia por 60 minutos, onde a VE, PAM e FC foram registradas novamente após 15, 30, 45 e 60 minutos.
4.1.3-Protocolo 3: Análise gasométrica após ativação purinérgica no
NPBL em ratos não anestesiados submetidos a hipóxia aguda.
Ao término dos procedimentos do protocolo 1, onde os animais foram submetidos a normóxia e hipóxia, foi realizada a retirada de amostras do sangue arterial destes animais para a análise gasométrica da PaCO2, PaO2, saturação de O2, pH e HCO3-, segundo a
42
4.2- Protocolos experimentais realizados em ratos anestesiados.
4.2.1-Protocolo 4: Participação dos receptores P2 do NPBL sobre a
pressão arterial, frequência cardíaca, atividade simpática renal e
atividade do nervo frênico em condições de hipóxia crônica intermitente
ou normóxia, após as injeções bilaterais de alfa, beta- me ATP sozinho ou
combinado com PPADS
Os experimentos foram realizados em ratos que foram divididos em dois grupos, grupo 1: hipóxia crônica intermitente (HCI) e grupo 2: normóxia (controle). Os animais de ambos os grupos foram anestesiados com uretano (1,5 g/kg de peso corporal) e alfa-cloralose (40 mg/kg de peso corporal), traqueostomizados, vagotomizados, ventilados artificialmente (100% O2), a artéria e veia femoral foram canuladas (para registro de PAM
e infusão de substâncias), o nervo simpático renal foi dissecado (para registro da atividade simpática) e o nervo frênico foi dissecado (para registro da atividade respiratória). Antes do início do experimento, foi realizada a retirada de amostras do sangue arterial destes animais para a análise gasométrica da PaCO2, PaO2, saturação de O2, pH e
HCO3-, segundo a metodologia descrita no item 3.1.7. Salina (controle - 50 nL) foi injetado
43 final dos experimentos realizamos o bloqueio ganglionar com a injeção i.v. de hexametônio (60 mg/kg de peso corporal), para quantificar a atividade simpática renal.
4.2.2- Protocolo 5: Expressão da proteína Fos no núcleo parabraquial
lateral e núcleo parabraquial medial em ratos expostos a hipóxia aguda.
A expressão da proteína Fos foi estudada no núcleo parabraquial lateral (NBPL) e núcleo parabraquial medial (NPBM) de ratos não anestesiados submetidos a 1 hora de hipóxia aguda. Após a hipóxia, os animais foram expostos à condição de normóxia por 1 hora. Após este período os animais foram profundamente anestesiados e perfundidos para a retirada dos encéfalos e realização dos procedimentos de imunohistoquímica (de acordo com item 3.1.8).
4.2.3- Protocolo 6: Expressão da proteína Fos no núcleo do trato solitário
após ativação purinérgica do NPBL em ratos não anestesiados
submetidos a hipóxia aguda.
A expressão da proteína Fos foi estudada no NTS [subregiões caudal (NTSc), intermediário (NTSi) e rostral (NTSr)] de ratos não anestesiados submetidos a hipóxia aguda que receberam injeções bilaterais de salina ou alfa, beta- me ATP (2,0 nmol/0,2 μl) no NPBL. Após as injeções no NPBL, os animais ficaram 1 hora em hipóxia (7% de O2).
44
5-Resultados
5.1-Análise Histológica (animais não anestesiados)
A Figura 1 mostra injeções bilaterais típicas no NPBL. Os pontos de injeção foram localizados principalmente na porção lateral dorsal e central do NPBL de um rato não anestesiado. (vide Fulwiler e Saper para definições dos subnúcleos do NPBL).
Figura 1: Fotomicrografia mostrando os sítios das microinjeções bilaterais no NPBL
45
5.2- Efeito das injeções de PPADS no NPBL sobre as respostas
cardiorrespiratórias em condição de normóxia.
Em condição de normóxia (21% de O2, durante 150 min) as injeções bilaterais de
46 Figura 2: Efeito das injeções bilaterais de PPADS (4,0 nmol/0,2 µL) no NPBL sobre o
volume corrente (VC), frequência respiratória (fR) e ventilação (VE) de ratos expostos a normóxia (21% O2). A seta indica o momento da injeção. Os valores estão expressos pela
47 Figura 3: Efeito das injeções bilaterais de PPADS (4,0 nmol/0,2 µL) no NPBL sobre a
pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) de ratos expostos a normóxia (21% O2). A seta indica o momento da injeção. Os valores estão expressos pela média ±
48
5.3- Efeito das injeções de PPADS no NPBL nas respostas
cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia aguda.
As Figuras 4 e 5 mostram o efeito da injeção bilateral de PPADS ou salina no NPBL na VE, PAM e FC durante a exposição a hipóxia aguda (7% O2). Tipicamente a
49 Figura 4: Efeito das injeções bilaterais de PPADS (4,0 nmol/0,2 µL) no NPBL sobre o
volume corrente (VC), frequência respiratória (fR) e ventilação (VE) de ratos expostos a hipóxia aguda (7% O2). A seta indica o momento da injeção. Os valores estão expressos
50 Figura 5: Efeito das injeções bilaterais de PPADS (4,0 nmol/0,2 µL) no NPBL sobre a pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) de ratos expostos a hipóxia aguda (7% O2). A seta indica o momento da injeção. Os valores estão expressos pela média ±
51
5.4- Efeito das injeções de alfa, beta-me ATP no NPBL sobre as respostas
cardiorrespiratórias em condição de normóxia.
Em condição de normóxia (21% de O2, durante 150 min) as injeções bilaterais de
52 Figura 6: Efeito das injeções bilaterais de alfa, beta-me ATP (2,0 nmol/0,2 µL) o NPBL
sobre o volume corrente (VC), frequência respiratória (fR) e ventilação (VE) de ratos expostos a normóxia (21% O2). A seta indica o momento da injeção. Os valores estão
53 Figura 7: Efeito das injeções bilaterais de alfa, beta-me ATP (2,0 nmol/0,2 µL) no NPBL
sobre a pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) de ratos expostos a normóxia (21% O2). A seta indica o momento da injeção. Os valores estão expressos pela
54
5.5- Efeito das injeções de alfa, beta-me ATP no NPBL nas respostas
cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia aguda.
As figuras 8 e 9 mostram o efeito da injeção bilateral de alfa, beta-me ATP ou salina no NPBL sobre a VE, PAM e FC durante a exposição a hipóxia aguda (7% 02).
55 Figura 8: Efeito das injeções bilaterais de alfa, beta-me ATP (2,0 nmol/0,2 µL) no NPBL
sobre o volume corrente (VC), frequência respiratória (fR) e ventilação (VE) de ratos expostos a hipóxia aguda (7% O2). A seta indica o momento da injeção. Os valores estão
56 Figura 9: Efeito das injeções bilaterais de alfa, beta-me ATP (2,0 nmol/0,2 µL) no NPBL
sobre a pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) de ratos expostos a hipóxia aguda (7% O2). A seta indica o momento da injeção. Os valores estão expressos
57
5.6- Efeito das injeções bilaterais de alfa, beta-me ATP sozinho ou
combinado com o PPADS no NPBL nas respostas cardiorrespiratórias
durante a hipóxia aguda.
As figuras 10 e 11 mostram os efeitos das injeções de alfa, beta-me ATP sozinho ou combinado com PPADS no NPBL na VE, PAM e FC durante a hipóxia aguda. Tipicamente a hipóxia aguda produz aumento na ventilação (1121±66 mL/kg/min, vs. normóxia: 523±15 mL/kg/min), hipotensão (96 ±2 mmHg, vs. normóxia: 106 ±3 mmHg) e taquicardia (485±10 bpm, vs. normóxia: 386±10 bpm). A ativação dos receptores purinérgicos P2X com alfa, beta-me ATP no NPBL potencializou o aumento no volume corrente (VC, 4,0±0,3 mL/kg, vs. salina: 2,2±0,2 mL/kg, ou 81% de aumento, p = 0,005, fig. 10A), sem significantes alterações na resposta de taquipnéia (fR, 49±5 cpm, vs. salina: 48±5 com, fig. 10B), resultando em um aumento na ventilação (VE, 871±55 mL/kg/min, vs. salina: 598±60 mL/kg/min, ou 45% de aumento, p = 0,009, fig. 10C) em condições de hipóxia. Injeções bilaterais de alfa, beta-me ATP no NPBL não modificaram a hipotensão (PAM -2±2 mmHg, vs. salina: -10±3 mmHg, fig. 11A) e taquicardia (FC 118±6 bpm, vs. salina 99±13 bpm, fig. 11B) induzida por hipóxia aguda.
59 Figura 10: Efeito das injeções bilaterais de alfa, beta-me ATP (2,0 nmol/0,2 µL) sozinho
ou combinado com PPADS (4,0 nmol/0,2 µL) no NPBL sobre o volume corrente (VC), frequência respiratória (fR) e ventilação (VE) de ratos expostos a hipóxia (7% O2). Os
60 Figura 11: Efeito das injeções bilaterais de alfa, beta-me ATP (2,0 nmol/0,2 µL) sozinho
ou combinado com PPADS (4,0 nmol/0,2 µL) no NPBL sobre a pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) de ratos expostos a hipóxia (7% O2). Os triângulos
61
5.7- Análise gasométrica após ativação purinérgica no NPBL em ratos
não anestesiados submetidos a hipóxia aguda ou normóxia.
A hipóxia aguda produziu aumento no pH (pHa) e hematócrito (Hct) (p<0,05), enquanto que diminui a pressão parcial de gás carbônico (PaCO2), pressão parcial de
oxigênio (PaO2), bicarbonato plasmático (HCO3-) (p<0,05) arterial em ratos Holtzman não
62
5.8-Análise Histológica (animais anestesiados)
A Figura 12 mostra a injeção unilateral no NPBL de um rato anestesiado (vide Fulwiler e Saper para definições dos sub núcleos do NPBL).
63
5.9- Efeito das injeções unilaterais de alfa, beta-metileno ATP antes, 10 e
30 minutos após o PPADS no NPBL nas respostas cardiorespiratórias em
ratos anestesiados após a hipóxia crônica intermitente ou normóxia.
Em ratos controles, que foram submetidos a normóxia (21%O2 por 7 dias), as
injeções unilaterais de alfa, beta-me ATP (2,0 nmol/50 nl) no NPBL aumentaram a PAM (Δ =10 ± 2 mmHg, vs. salina: 0 ± 1 mmHg, p <0,05) (fig. 13 e 15A), a atividade do nevo
simpático renal (ANSR, Δ=40 ± 12%, vs. salina: 1 ± 1%, p <0,05) (fig. 13 e 15C), e a freqüência do nervo frênico (ANF, Δ = 17 ± 5 cpm, vs. salina: 0 ± 1 cpm, p <0,05), (fig. 13
e 16B) sem alterar a FC e a amplitude do ANF. A injeção unilateral de PPADS (0,125 nmol/50 nl) no NPBL não modificou a PAM, FC, ASNR e a frequência e amplitude da ANF, no entanto, as injeções de PPADS no NPBL aboliu o aumento da PAM (Δ = 0 ± 1
mmHg), ANSR (Δ = 3 ± 3,1%) e ANF (Δ = 1 ± 1 cpm) produzido pela injeção de alfa, beta-me ATP no NPBL (fig. 13, 15-16).
Os ratos submetidos a hipóxia crônica intermitente (HCI, 10%O2 por 7 dias)
apresentaram um aumento na PAM basal (113± 4 mmHg, vs. normóxia (controle): 93 ± 4 mmHg, p <0,05), sem alterações na FC (329± 12 bpm, vs. normóxia (controle): 350 ± 11 bpm), de acordo com estudos prévios realizados em animais não anestesiados ou anestesiados (Fletcher et al., 1992, Silva e schreihofer, 2011).
64 beta-me ATP também aumentou a amplitude de disparos do nervo frênico (Δ = 87 ± 31%, vs. salina: 2 ± 1%, p <0,05), (fig. 14 e 16A). Por outro lado, a injeção de alfa, beta-me ATP no NPBL produziu um aumento na atividade simpática renal, porém não foi estatisticamente significante comparado com a injeção de salina (ANSR, Δ = 24,4 ± 10%,
vs. salina: 1,8 ± 1,2%, p 0,05) (fig. 14 e 15C). Da mesma forma que no grupo controle em normóxia, a injeção de PPADS não modificou nenhum dos parâmetros analisados, porém foi eficiente em bloquear os efeitos do alfa, beta-me ATP sobre a PAM (Δ= -0,7 ± 0,7 mmHg), FC (Δ 0,9±0,8 bpm), ANSR (Δ = 0,5 ± 0,8%), frequência de ANF (Δ= -0,08±0,8cpm) e amplitude do nervo frênico (Δ = -29±18 %) (fig. 14-16). Porém, aos 30 minutos após a injeção de PPADS, a ativação dos receptores P2X de ratos submetidos a hipóxia voltou a produzir aumento na PAM (Δ =14±1 mmHg, vs. salina: 0 ± 1 mmHg, p
67 Figura 15:Variações na PAM, FC e ANSR em resposta à injeção de salina ou alfa, beta-me
68 intermitente (HCI, barras brancas) anestesiados. * Diferente de salina no NPBL, P0,05. # diferente de normóxia, p0,05.
Figura 16:Variações na amplitude (A) e frequência (B) da atividade nervosa do nervo
69 (normóxia, barras pretas) e ratos submetidos a hipóxia crônica intermitente (HCI, barras brancas) anestesiados. * Diferente de salina no NPBL, P0,05. # diferente de normóxia, p0,05.
5.10- Análise gasométrica após a exposição a hipóxia crônica intermitente
(HCI) ou normóxia em ratos anestesiados.
Os animais que foram expostos a HCI por uma semana apresentaram um aumento no pH e hematócrito (Hct) (p<0,05), enquanto ocorreu uma diminuição na pressão parcial de gás carbônico (PaCO2), sem alteração na pressão parcial de oxigênio (PaO2) e
70
5.11-Estudo da expressão da proteína Fos no núcleo parabraquial lateral
e núcleo parabraquial medial em ratos expostos a hipóxia aguda ou
normóxia.
A figura 17 apresenta fotomicrografias representativas da imunorreatividade à proteína Fos nas áreas estudadas: NPBL e NPBM. A hipóxia aguda (7% O2) por uma hora
71 Figura 17: (A) Representação esquemática de um corte tranversal do tronco encefálico (região da ponte) de um rato (adaptado de Paxinos e Watson, 1997) mostrando em destaque os núcleos parabraquial lateral (NPBL) e medial (NPBM). (B e C) Fotomicrografias (10) e (D) fotomicrografia (40) de cortes transversais do tronco encefálico (região da ponte) mostrando as marcações de imunorreatividade à proteína Fos no núcleo parabraquial lateral (NPBL) e núcleo parabraquial medial (NPBM) em condição de normóxia (B) e hipóxia
72 Figura 18: Imunorreatividade à proteína Fos nos núcleos parabraquial lateral (NPBL) e
medial (NPBM) de ratos submetidos a normóxia (grupo controle, 21% O2, barras pretas) ou
hipóxia aguda (7% O2, barras brancas) por 1 hora. Resultados expressos como média ±
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5.12-Estudo da expressão da proteína Fos no núcleo do trato solitário em
ratos expostos a hipóxia aguda que receberam injeção bilateral de alfa,
beta-me ATP ou salina no NPBL
77 Figura 22: Imunorreatividade à proteína Fos no núcleo do trato solitário caudal (NTSc), núcleo do trato solitário intermediário (NTSi) e núcleo do trato solitário rostral (NTSr) de ratos submetidos a hipóxia aguda (7%O2) por 1 hora que receberam injeções bilaterais de
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6-Discussão
79 A hipóxia aguda provoca uma série de respostas compensatórias, incluindo aumento da ventilação (West, 1985; Steiner e Branco, 2002). Sabe-se que o aumento na ventilação induzida por hipóxia resulta principalmente na despolarização de quimiorreceptores periféricos, localizados nos corpúsculos aórticos e carotídeos, e o processamento subsequente dessas informações ocorrem em áreas específicas no sistema nervoso central (Taylor et al., 1999). A primeira estação sináptica a receber as informações dos quimiorreceptores periféricos é o NTS (Mifflin, 1992) que está localizado na porção dorsolateral do bulbo. A partir do NTS, potenciais de ação trafegam para diversas outras áreas que participam do controle cardiorrespiratório, dentre essas áreas podemos destacar o núcleo retrotrapezóide (RTN) e o complexo de pré-Botzinger (Fong e Potts, 2008; Takakura, 2007). No tronco encefálico, além de áreas bulbares quimiossenssíveis, as regiões pontinas também são ativadas durante o quimiorreflexo periférico, por exemplo as áreas conhecidas por fazer parte do complexo parabraquial, principalmente os núcleos NPBL e o KF (Song & Poon, 2011; Miller et al., 2012).
80 um grupo específico de aferências e eferências, onde atuam diferentes neurotransmissores (Fulwiler e Saper, 1984; Hebert e Saper, 1990; Hebert e cols., 1990; Chamberlin e Saper, 1995).
O complexo parabraquial, região que inclui o NPBL, está envolvido no controle respiratório, cardiovascular, regulação do equilíbrio hidroeletrolítico e no processamento dos estímulos nociceptivos (Chamberlin et al., 2004; Callera et al., 2005; Bruinstroop et al., 2012).
82 dos receptores não modificam os parâmetros basais cardiorrespiratórios, sugerindo que os mecanismos purinérgicos e gabaérgicos do complexo parabraquial não tem ação tônica.
6.1- Envolvimento dos mecanismos purinérgicos do NPBL na hipóxia
crônica intermitente (HCI).
83 com os dados de Gourine, 2005 onde foi verificada uma maior liberação de ATP durante a hipóxia na superfície ventral do bulbo. Assim, uma possível explicação para o aumento das respostas pressora, taquicardia e respiratórias após a ativação dos receptores P2X do NPBL nos animais HCI seria porque esses animais já possuem uma maior liberação de ATP devido à exposição a hipóxia e então a injeção exógena de ATP promove respostas cardiorrespiratórias exacerbadas. Além disso, esses dados também estão de acordo com os nossos resultados obtidos nos animais não anestesiados submetidos à hipóxia aguda, onde a ativação dos receptores P2 potencializou o aumento no volume corrente e a hiperpneia induzida por hipóxia aguda.
Em relação a atividade simpática renal, diferentemente do grupo normóxia, os animais HCI não apresentaram aumento na atividade simpática renal acompanhado da resposta pressora após a injeção de alfa, beta-me ATP no NPBL. Esse resultado foi inesperado, porém, sabendo que o sistema nervoso autônomo simpático inerva vários leitos vasculares e que a HCI produz aumentos na atividade do SNA simpático (Fletcher, 1992), é possível que a HCI ative o SNA simpático de forma seletiva causando uma maior atividade em outros leitos vasculares, como por exemplo, o lombar e/ou esplâncnico. No entanto, mais estudos são necessários para que possamos confirmar tal hipótese. Dessa forma, parece que a resposta pressora observada após a ativação dos receptores purinérgicos do NPBL ocorre devido a um aumento da atividade simpática, que nos animais em normóxia foi um aumento da atividade simpática do leito renal e nos animais HCI provavelmente outro leito vascular não registrado.
84 respiratória, essas mudanças de frequência respiratória foram devido a uma significativa redução no tempo de expiração, além disso as injeções de glutamato aumentaram o tempo inspiratório e o pico de atividade do frênico, essas respostas respiratórias foram sempre acompanhadas por um aumento da pressão e taquicardia.
85
6.2- A expressão da proteína Fos como marcador da atividade neuronal
em áreas pontinas e bulbares durante a hipóxia aguda.
Nossos dados demonstraram que a exposição a hipóxia aguda de 7% O2 por uma
hora promoveu um aumento na atividade neuronal dos neurônios do NPBL observada pelo aumento na expressão da proteína Fos. Nossos dados também demonstraram que em outro sub-núcleo do complexo parabraquial, no NPBM, a hipóxia aguda 7% por uma hora não induziu a expressão da proteína Fos, sugerindo uma especificidade da porção lateral do complexo parabraquial durante a hipóxia aguda. Teppema et al., 1997 já haviam descrito que o NPBL era ativado por hipóxia (8% O2) e hipercapnia (8-15% CO2) utilizando a
proteína Fos como um marcador da atividade neuronal, no entanto nesse trabalho os animais foram submetidos a 2 horas de exposição a hipóxia ou hipercapnia. Esse conjunto de dados reforça a importância do NPBL nos mecanismos de controle dos ajustes cardiorrepsiratórios que ocorrem durante a hipóxia aguda. Porém, ainda não sabemos se esses neurônios do NPBL que são ativados durante a hipóxia aguda expressam receptores purinérgicos e nossos dados funcionais sugerem uma participação desses receptores nas respostas cariorrespiratórias induzidas por hipóxia aguda. Desta forma, estudos de imunohistoquimica com dupla marcação serão necessários para esclarecer esta questão. Também ainda não avaliamos o papel dos receptores purinérgicos do NPBL durante a ativação do quimiorreflexo central, dessa forma seria interessante avaliar o papel desses receptores durante a hipercapnia.
